JP5596444B2

JP5596444B2 - 抗炎症剤の評価又は選択方法

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Publication number: JP5596444B2
Application number: JP2010155087A
Authority: JP
Inventors: うらら横瀬; 輝八谷
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2010-07-07
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2030-07-07
Also published as: JP2012018061A

Description

本発明は、抗炎症剤を評価又は選択する方法に関する。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）は主に活性化単球又はマクロファージから産生されるエンドトキシン誘導性血清タンパクの一つで、細胞接着分子の発現やアポトーシスの誘導、炎症メディエーター（ＩＬ−１、ＩＬ−６、プロスタグランジンＥ２等）産生の誘導、形質細胞による抗体産生亢進等によって感染防御作用や腫瘍壊死作用を示す。一方で、その過剰産生は、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、喘息、気管支炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、クローン病等のアレルギー性疾患、炎症性疾患及び自己免疫性疾患の原因の一つと考えられている。
ＴＮＦ−αは、炎症或いは免疫反応の極めて初期の段階で分泌され、免疫能力を持つ細胞を刺激し一連の反応を惹起し、或いはまた発熱を誘導することから、ＴＮＦ−α産生を抑制する物質は、より初期の炎症反応に働きかけ、広範囲の炎症を制御する抗炎症剤として期待される。

一方、ＴＩＭＰ（ｔｉｓｓｕｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ＭＭＰ）の生体内インヒビターで、現在までにＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３及びＴＩＭＰ−４のタイプが知られている。炎症反応後期におけるＭＭＰとＴＩＭＰの不均衡はＭＭＰの産生を亢進させ、細胞外マトリックス、結合組織の破壊を引き起こすことが知られている（非特許文献１）。ＭＭＰの産生亢進は、炎症性疾患の治癒を遅延させる主な原因の一つと考えられており、実際にＭＭＰの阻害やＴＩＭＰによる抗炎症効果が報告されている（特許文献１及び２）。このＴＩＭＰの抗炎症効果はＭＭＰの阻害作用によるものとされている。

ＴＮＦ−αとの関連では、ＴＩＭＰ−３が特異的に膜結合型のＴＮＦ−αの切断に関わるＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）を阻害することが報告されており、ＴＮＦ-αの産生調節に寄与していることが知られている（非特許文献２）。
しかしながら、これまでに炎症カスケード上流でのＴＩＭＰ−１の関与は報告されていなく、ＴＩＭＰ−１がＴＮＦ−α産生に与える影響も明らかにされていない。

特開２０００−８６５３３号公報特開２０００−７５７５号公報

ＳｋｉｌｅｓＪＷｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＭｅｄＣｈｅｍ．２００４ＡｕｇｕｓｔｉｎＡｍｏｕｒｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ１９９８

本発明は、抗炎症剤を確実且つ効率良くスクリーニングすることができる評価又は選択方法を提供することに関する。

本発明者らは、表皮細胞におけるＵＶＢ照射時のＴＮＦ−α産生とＴＩＭＰ−１との関連について検討したところ、ヒト組換えＴＩＭＰ−１（ｒｈＴＩＭＰ−１）により濃度依存的にＴＮＦ−αの産生が抑制されることを見出した。また、ＴＩＭＰ−１産生を増加させる物質によってＵＶＢ照射時のＴＮＦ−α産生が抑制されたことから、ＴＩＭＰ−１の発現上昇とＵＶＢ照射時のＴＮＦ−α産生と間には負の相関関係があり、ＴＩＭＰ−１の産生増加作用を指標として、ＴＮＦ−α産生抑制を介した抗炎症剤の評価又は選択が可能となることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）当該細胞におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で算出された発現量を、被験物質をＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞に接触させない対照群におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を増加させる被験物質を抗炎症剤として評価又は選択する工程、
を含む、抗炎症剤の評価又は選択方法を提供するものである。

本発明によれば、各種物質の抗炎症効果をより正確に且つ簡便に評価することができ、当該効果を有する物質をより効率よく選択することが可能となる。

培養表皮細胞におけるＵＶＢ照射及びｒｈＴＩＭＰ−１添加時のＴＮＦ−α産生量の変化を示す図である。シソエキスの培養表皮細胞におけるＴＩＭＰ−１産生に与える影響を示す図である。シソエキスのＵＶＢ照射時のＴＮＦ−α産生に与える影響を示す図である。

後記実施例に示すとおり、ＴＩＭＰ−１が表皮細胞におけるＵＶＢ照射時のＴＮＦ−α産生に与える影響を検討したところ、ＵＶＢ照射により上昇したＴＮＦ−α産生が、ヒト組換えＴＩＭＰ−１（ｒｈＴＩＭＰ−１）により濃度依存的に抑制された（実施例１）。また、ＴＩＭＰ−１の産生を増加させるシソエキスにより、ＵＶＢ照射時のＴＮＦ−αの産生が抑制された（実施例２）。
これらの結果は、ＴＩＭＰ−１がＵＶＢ照射時のＴＮＦ−α産生に関与していること、すなわち、ＴＩＭＰ−１の発現上昇とＵＶＢ照射時のＴＮＦ−α産生との間には負の相関関係があることを示している。また、ＴＩＭＰ−１が炎症カスケードの初期（上流）に関与していることを示唆している。ＴＮＦ−αは前駆体タンパクである膜結合型ＴＮＦ−α（ｍＴＮＦα）として産生され、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）によりその細胞外に存在するカルボキシル基側末端ドメインの切断を受けて可溶性ＴＮＦ−α（ｓＴＮＦα）蛋白となり、さらにホモ３量体を形成して血液中を循環するが、ＴＩＭＰ−１はＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）に対して不活性であることが報告されている（前記非特許文献２及びＲｏｙＡＢｌａｃｋｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｉｓＲｅｓＣｏｍ１９９６）。そのため、ＴＩＭＰ−１のＴＮＦ−α産生への関与が認められたことは意外である。
従って、ＴＩＭＰ−１の産生を増加させる物質は、ＴＮＦ−α産生抑制剤として、また抗炎症剤として有用である。また、ＴＩＭＰ−１の産生増加作用を指標として抗炎症剤の評価又は選択が可能である。ＴＮＦ−αは、一連のカスケードの上流に位置するサイトカインであることから、本発明の抗炎症剤は特にＴＮＦ−αが関与する初期炎症反応の抑制に有用である。

本発明の方法は、具体的には以下（Ａ）〜（Ｄ）のように行われる。
（Ａ）ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）当該細胞におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で算出された発現量を、被験物質をＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞に接触させない対照群におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を増加させる被験物質を抗炎症剤として評価又は選択する工程。

本発明方法において用いられるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞としては、哺乳動物の皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞、歯肉線維芽細胞等の線維芽細胞、軟骨滑膜細胞、表皮細胞、平滑筋細胞、赤芽球系前駆細胞等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等が挙げられるが、ヒトであるのが好ましい。これらの細胞は、初代培養のものでも継代を繰り返したあとのin vitro老化させた細胞であってもよく、また、胎児由来のものであっても老齢者由来のものであってもよい。また、これらの細胞は組織より公知の方法により採取して用いてもよく、又は市販品を購入して用いてもよい。
表皮細胞及び皮膚線維芽細胞は、皮膚組織中に存在するものでも、組織から単離したものでもよい。また、正常表皮細胞の他に、不死化した表皮細胞の細胞株（ＨａＣａＴ）を使用することもできる。当該表皮細胞及び当該皮膚線維芽細胞の由来組織としては、生体から外科的に切除した皮膚組織、それを免疫不全マウス等に移植した皮膚組織、培養皮膚モデル、再構成皮膚等を使用することもできる。

当該ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞と被験物質との接触は、例えば被験物質を所定の濃度になるように予め培養液中に添加した後、細胞を培養液に載置すること、或いは、細胞が載置された培養液に、被験物質を所定の濃度になるように添加することにより行うことができる。
ここで、ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞の播種時の細胞濃度は、６Ｗｅｌｌプレートを使用した場合、１．０×１０³〜８．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのが好ましく、特に１．０×１０⁴〜５．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとするのが好ましい。また、被験物質の添加濃度は、０．００００１〜１０質量％（固形残分）とするのが好ましく、特に０．０００１〜３質量％（固形残分）とするのが好ましい。

被験物質としては、特に限定されない。例えば、動植物抽出物、化合物、化学物質等を用いることができる。

ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞を培養する培地は、当該細胞を培養できる常用の培地を用いることができ、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地(ＭＥＭ)、表皮角化細胞用基礎培地（ＨｕＭｅｄｉａＫＢ２）等が挙げられる。細胞継代、増殖時にはこれらの培地に、３−１５％、好ましくは５−１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ，ＦＣＳ）や、増殖因子、抗菌剤、インスリン、ハイドロコーチゾン等の増殖添加剤を添加することが好ましい。
培養は、被験物質と接触後、室温（２５℃）〜３７℃で通常３時間〜９６時間程度、好ましくは１２〜７６時間程度行うのが好ましい。
次いで、培養上清を回収してＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を測定する。

ＴＩＭＰ−１遺伝子の発現量の測定は、ｍＲＮＡレベルで検出する場合は、例えば細胞からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、或いはノーザンブロット解析法等を利用して、ＴＩＭＰ−１遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出定量すればよい。

また、ＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量の測定は、通常の免疫測定法により行うことができ、例えばＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ法、ウェスタンブロット等により行うことができるが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットが安価・簡便で望ましい。

抗炎症剤の評価は、被験物質と接触させたＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を、被験物質に接触させない対照群（対照細胞）における発現量と比較し、その発現量が増加した場合、被験物質には抗炎症効果があると評価でき、斯かる物質を選択することができる。評価に際しては、必ずしも統計学的な手法を用いる必要はないが、統計学的に有意差の有無を検定して評価することが好ましい。

このようにして選択された抗炎症剤は、ＴＮＦ−α産生を抑制する物質であり、ヒトを含む動物におけるＴＮＦ−αの過剰産生に起因する疾患、例えば慢性関節リウマチ、変形性関節炎、喘息、気管支炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、クローン病等のアレルギー性疾患、炎症性疾患及び自己免疫性疾患の予防、治療又は改善のための医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品に有効成分として配合して使用するための素材となり得るものである。

実施例１
１）方法
細胞培養：培養ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ（Ｆ）新生児包皮由来、クラボウ社）を２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で６ウェルプレートに播種し、表皮角化細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２）に増殖添加剤（インスリン０．５ｍＬ，ｈＥＧＦ０．５ｍＬ，ハイドロコーチゾン０．５ｍＬ，抗菌剤０．５ｍＬ，ＢＰＥ２ｍＬ）を添加したもので２４時間培養した。継代には、０．５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を用いた。

ＵＶＢ照射：ＵＶＢの照射は、ＵＶランプ（ＦＬ２０ＳＥ、東芝）を使用してＵＶＢ照射量３０ｍＪ／ｃｍ²となるよう照射時間を設定し、ＵＶＢを照射した。照射時は、細胞培地を除き、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＰＢＳ（−）を０．５ｍｌ加えた後、ＵＶＢを照射した。未照射コントロールは照射処理と同様にＰＢＳ（−）で洗浄後、ＰＢＳ（−）を０．５ｍｌ添加した状態でクリーンベンチ内に放置する処理を行った。
照射した直後に０ｎＭ、５ｎＭ又は１０ｎＭｒｈＴＩＭＰ−１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれ添加した。さらに４８時間培養後、同様に３０ｍＪ／ｃｍ²のＵＶＢを照射した。

培養上清中のＴＮＦ−α産生量の測定：ＵＶＢ照射後１２時間培養した上清（２ｍＬ）を回収し、スピンカラム（アミコンウルトラ−４、１０Ｋ、ミリポア）を用いて限外ろ過濃縮を行った後、ＴＮＦ−α産生量をＥＬＩＳＡキット（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＨｕｍａｎＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定を行った。測定方法は添付のプロトコールにしたがった。

２）結果
図１に示すように、ＵＶＢ照射により上昇したＴＮＦ−α産生が、ｒｈＴＩＭＰ−１により濃度依存的に抑制された。

実施例２
１）方法
細胞培養：培養ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ（Ｆ）新生児包皮由来、クラボウ社）を２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で３５ｍｍディッシュに播種し、表皮角化細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２）に増殖添加剤（インスリン０．５ｍＬ，ｈＥＧＦ０．５ｍＬ，ハイドロコーチゾン０．５ｍＬ，抗菌剤０．５ｍＬ，ＢＰＥ２ｍＬ）を添加したもので培養した。継代には、０．５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を用いた。

シソエキス添加：シソ葉（新和物産）４０ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液４００ｍＬを加え、常温で１５日間抽出後ろ過し、シソエキスを得た（固形分４．８９ｇ）。得られたエキスを濃縮し、以下評価サンプルとして用いた（固形分１．８（ｗ／ｖ）％）。
２４時間細胞培養後、新鮮な培地に交換し、同時に評価サンプルを添加した。評価サンプルの添加濃度は０．００１％（固形残分濃度）とし、コントロールとして、等量の５０（ｖ／ｖ）％ＥｔＯＨを添加したものを用いた。

培養上清中のＴＮＦ−α量の測定：サンプル添加培地で４８時間培養後、上清（２ｍＬ）を回収してＴＮＦ−α産生量をＥＬＩＳＡキット（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＨｕｍａｎＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定を行った。測定方法は添付のプロトコールにしたがった。
また、スピンカラム（アミコンウルトラ−４、１０Ｋ、ミリポア）を用いて限外ろ過濃縮を行った後、濃縮した上清のタンパク質量をＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙにより常法に従って測定した。５ｘＳＤＳＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加して濃度を揃えた後、１００℃で５分加熱、変性させたものをウエスタンブロット用サンプルとして調製した。１２．５％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで培地中の蛋白質を分離し、一次抗体：Ａｎｔｉ−ＴＩＭＰ−１（ＲａｂｂｉｔＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙ，ＧｅｎｅＴｅｘ：１０００倍希釈）、二次抗体：ＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ：１０００倍希釈）を用いたウェスタンブロッティング法によりＴＩＭＰ−１を検出した。検出試薬には化学発光法であるＥＣＬＰｌｕｓウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用い、ＬＡＳ４０００Ｓｙｓｔｅｍ（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）により検出を行った。

２）結果
図２Ａ及びＢに示すように、シソエキスにおいてＴＩＭＰ−１発現量がコントロール（対照群）に対する相対値で約１．５倍増加していた。なお、コントロールに対してタンパク質量比が０．５以下になるものは排除した。

実施例３
１）方法
細胞培養：培養ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ（Ｆ）新生児包皮由来、クラボウ社）を２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で３５ｍｍディッシュに播種し、表皮角化細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２）に増殖添加剤（インスリン０．５ｍＬ，ｈＥＧＦ０．５ｍＬ，ハイドロコーチゾン０．５ｍＬ，抗菌剤０．５ｍＬ，ＢＰＥ２ｍＬ）を添加したもので２４時間培養した。継代には、０．５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を用いた。

ＵＶＢ照射：実施例１と同様にＵＶＢ照射量３０ｍＪ／ｃｍ²となるよう照射時間を設定し、ＵＶＢを照射した。照射時は、細胞培地を除き、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＰＢＳ（−）を０．５ｍｌ加えた後、ＵＶＢを照射した。未照射コントロールは照射処理と同様にＰＢＳ（−）で洗浄後、ＰＢＳ（−）を０．５ｍｌ添加した状態でクリーンベンチ内に放置する処理を行った。

シソエキス添加：ＵＶＢ照射後に新鮮な培地に交換し、同時に評価サンプル（シソエキス）を添加した。評価サンプルの添加濃度は０．００１％（固形残分濃度）とし、コントロールとして、等量の５０（ｖ／ｖ）％ＥｔＯＨを添加したものを用いた。

ＵＶＢ照射：サンプル添加培地で２４時間培養後、上記と同様にＵＶＢ照射量３０ｍＪ／ｃｍ²となるよう照射時間を設定し、ＵＶＢを照射した。

培養上清中のＴＮＦ−α量の測定：ＵＶＢ照射後２４時間培養し、上清（２ｍＬ）を回収して限外ろ過濃縮後（アミコンウルトラ−４、１０Ｋ）、ＴＮＦ−α量をＥＬＩＳＡキット（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＨｕｍａｎＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定を行った。測定方法は添付のプロトコールにしたがった。

２）結果
図３に示すように、ＵＶＢ照射により表皮角化細胞からのＴＮＦ−α産生が増加したが、シソエキスは当該ＴＮＦ−α産生を顕著に抑制した。なお、今回評価を行ったシソエキスは、既に抗炎症効果が知られている（特開２００５−１３９０７０号公報、特開２００６−４５１８１号公報）。
これらの結果は、被験物質の抗炎症効果が、ＴＩＭＰ−１の産生レベルの測定によって評価可能であることを示している。従って、本発明方法は、抗炎症剤の評価又は選択方法として妥当な方法であると考えられる。

Claims

以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な表皮細胞に、被験物質を接触させる工程、
（Ｂ）当該表皮細胞におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で算出された発現量を、被験物質をＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な表皮細胞に接触させない対照群におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を増加させる被験物質を表皮細胞におけるＴＮＦ−α産生を抑制する抗炎症剤として評価又は選択する工程、
を含む、表皮細胞におけるＴＮＦ−α産生を抑制する抗炎症剤の評価又は選択方法。
ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な表皮細胞がヒト表皮角化細胞である請求項１記載の表皮細胞におけるＴＮＦ−α産生を抑制する抗炎症剤の評価又は選択方法。