JP5594838B2 - Oligonucleotide structure and gene expression control method - Google Patents
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Description
本発明は、ＲＮＡ干渉、ＲＮＡ干渉阻害、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害、デコイ核酸、ＳＮＰ検出などに有効に使用できる、オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現制御方法に関する。 The present invention relates to an oligonucleotide structure and a gene expression control method that can be effectively used for RNA interference, RNA interference inhibition, miRNA, miRNA inhibition, decoy nucleic acid, SNP detection, and the like.
ガンやエイズなどの難病を効率的に治療する医薬の開発は、ライフサイエンスの分野における大きな課題の一つである。ポストゲノム時代において、遺伝子の発現を制御することが新たな難病の治療法として着目されている。 The development of a medicine that efficiently treats intractable diseases such as cancer and AIDS is one of the major challenges in the field of life science. In the post-genomic era, controlling gene expression has attracted attention as a new treatment method for intractable diseases.
遺伝子治療としては、従来、アンチセンスやデコイでタンパク質の発現を制御したり、ゲノムの修復を行ったり、欠損もしくは損傷している遺伝情報を外来遺伝子の形で入れて、タンパク質の発現を誘発することが行われてきた。また、最近では、遺伝情報の発現をコントロールするＲＮＡ、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）やｍｉＲＮＡを利用した遺伝子治療も注目を集めている。 For gene therapy, conventionally, protein expression is controlled by antisense or decoy, genome repair is performed, or defective or damaged genetic information is put in the form of foreign genes to induce protein expression. Things have been done. Recently, gene therapy using RNA that controls the expression of genetic information, so-called RNA interference (RNAi) or miRNA, has attracted attention.
ＲＮＡｉやｍｉＲＮＡは、ガイド鎖ＲＮＡとパッセンジャー鎖ＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ＊とが互いに結合して形成されたｄｓＲＮＡを、細胞内へ導入することによって、当該ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つｍＲＮＡが分解されるなどして、遺伝子の発現を抑制するという現象をいう（例えば、非特許文献１〜４参照）。In RNAi and miRNA, mRNA having a sequence homologous to the dsRNA is degraded by introducing dsRNA formed by combining guide strand RNA and passenger strand RNA or miRNA and miRNA * into each other. Thus, it refers to a phenomenon of suppressing gene expression (see, for example, Non-Patent Documents 1 to 4).
しかし、ＲＮＡｉやｍｉＲＮＡを用いて発現抑制する場合には、以下のような問題がある。ＲＮＡｉやｍｉＲＮＡは、原理的には、ｄｓＲＮＡと相同な配列を持つｍＲＮＡに結合する。しかし、一塩基置換がされたｍＲＮＡに対しても、同様に結合する。このため、正常遺伝子と異常遺伝子との配列差がわずかしかない場合には、正常細胞中で正常なｍＲＮＡを分解などしてしまうという問題がある。このように、ＲＮＡｉ／ｍｉＲＮＡ医薬は副作用が大きいという問題がある。 However, when RNAi or miRNA is used to suppress expression, there are the following problems. In principle, RNAi and miRNA bind to mRNA having a sequence homologous to dsRNA. However, it also binds similarly to mRNA with a single base substitution. For this reason, when there is only a slight sequence difference between the normal gene and the abnormal gene, there is a problem that normal mRNA is degraded in normal cells. Thus, RNAi / miRNA pharmaceuticals have a problem of large side effects.
また、ＲＮＡｉ効率を上げるために、修飾したポリヌクレオチドを用いるなどが行われている（例えば、特許文献１参照）。 In order to increase RNAi efficiency, a modified polynucleotide is used (for example, see Patent Document 1).
近年の研究から、短いＲＮＡが２本鎖ｓｉＲＮＡとして機能する以外に、1本鎖のままダイサーに取込まれたり、1本鎖として別の機能を持つことが知られつつある（例えば、非特許文献５参照）。 Recent studies have shown that short RNAs can be incorporated into dicers as single strands or have other functions as single strands in addition to functioning as double-stranded siRNAs (for example, non-patented) Reference 5).
さらに、近年ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）などの幹細胞を用いて、臓器・組織などを分化させる再生医療が注目されている。しかし、全てのｉＰＳ細胞やＥＳ細胞が所望の細胞に分化するわけではない。分化・誘導された細胞群には、未分化の幹細胞や所望の細胞に分化しなかった細胞が含まれている。多種の細胞が存在することで、最終的に癌化するなどの問題を生ずるおそれがある。例えば、再生医療で移植される細胞群中に未分化の細胞が０．０１％混入すると、腫瘍を形成する可能性が指摘されている。このため、幹細胞から分化・誘導された細胞群から未分化の幹細胞や所望の細胞に分化しなかった細胞を除去することが試みられている。 Furthermore, in recent years, regenerative medicine that differentiates organs and tissues using stem cells such as iPS cells (artificial pluripotent stem cells) and ES cells (embryonic stem cells) has attracted attention. However, not all iPS cells and ES cells differentiate into desired cells. The differentiated and induced cell group includes undifferentiated stem cells and cells that have not differentiated into desired cells. The presence of various types of cells may cause problems such as canceration. For example, it has been pointed out that a tumor may be formed when 0.01% of undifferentiated cells are mixed in a cell group transplanted by regenerative medicine. For this reason, attempts have been made to remove undifferentiated stem cells and cells that have not differentiated into desired cells from a group of cells that have been differentiated and induced from stem cells.
例えば、分化・誘導された細胞群に含まれる所望の細胞の細胞表層抗原マーカーに蛍光標識抗体でラベルしたものを、セルソーターによって分離することが試みられている。しかし、この方法では、セルソーターが高価である、目的細胞を選別するための細胞表層抗原マーカーが容易に見つからないなどの問題がある。このため、分化・誘導された細胞群から所望の細胞を容易に分離することができる方法を開発することが望まれている。
すなわち、本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、正常細胞と癌細胞などの異常細胞とを区別して異常細胞内あるいは正常細胞内でのみ機能する、オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現制御方法を提供することを目的とする。 That is, the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to distinguish between normal cells and abnormal cells such as cancer cells and function only in abnormal cells or normal cells, and oligonucleotide structures and An object of the present invention is to provide a gene expression control method.
また、本発明の別の目的は、多種類の細胞が含まれる細胞群から所望の細胞を容易に選択・分離することができる、オリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現制御方法を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide an oligonucleotide structure and a gene expression control method capable of easily selecting and separating desired cells from a group of cells containing many types of cells. To do.
さらに、本発明の別の目的は、一塩基置換体の検出をする新たな一塩基置換体の検出方法を提供することを目的とする。 Furthermore, another object of the present invention is to provide a novel method for detecting a single base substitution product that detects a single base substitution product.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、以下のオリゴヌクレオチド構造体および遺伝子発現制御方法を見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found the following oligonucleotide structure and gene expression control method, and completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する。 The oligonucleotide structure of the present invention is composed of three oligonucleotides, a trigger strand, an effector strand, and a support strand, and each of the three oligonucleotides is composed of the other two strands. The trigger strand has a site for recognizing the sequence of another polynucleotide outside the site to which the support strand is bonded.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、上記のような三方向ジョイント（Ｔｈｒｅｅ Ｗａｙ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、以下、「ＴＷＪ」ということもある）構造を有する。また、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有している。前記トリガー鎖が、他のポリヌクレオチドの配列を認識すると、サポート鎖と他のポリヌクレオチドの交換反応を生ずる。この交換反応により、前記三方向ジョイント構造は崩壊して、オリゴヌクレオチド構造体は、トリガー鎖と他のポリヌクレオチドの結合体、エフェクター鎖と、サポート鎖とに分割される。 The oligonucleotide structure of the present invention has a three-way joint (Three Way Junction, hereinafter sometimes referred to as “TWJ”) structure. The trigger strand has a site for recognizing the sequence of another polynucleotide outside the site to which the support strand is bonded. When the trigger strand recognizes the sequence of another polynucleotide, an exchange reaction between the support strand and the other polynucleotide occurs. By this exchange reaction, the three-way joint structure collapses, and the oligonucleotide structure is divided into a trigger strand, a conjugate of another polynucleotide, an effector strand, and a support strand.
ここで、エフェクター鎖を標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するように設計しておく。例えばＲＮＡｉにおいて、ガイド鎖ＲＮＡになる鎖とするなどである。これにより、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物と結合できるエフェクター鎖を細胞内で得ることができる。 Here, the effector chain is designed so as to have substantially the same base sequence as the base sequence of at least a part of the target gene or target gene transcript. For example, in RNAi, the strand becomes a guide strand RNA. Thereby, the effector chain | strand which can be couple | bonded with a target gene or a target gene transcription product can be obtained in a cell.
なお、本明細書中で、「実質的に同一の塩基配列」には、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と完全に相補的な塩基配列、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列の変異鎖などを含む。 In the present specification, the “substantially identical base sequence” includes a base sequence that is completely complementary to the base sequence of at least a part of the target gene or target gene transcript, a DNA sequence and an RNA sequence, a target It includes a mutated chain of at least a part of the base sequence of the gene or target gene transcript.
また、上記したようにトリガー鎖は、他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する。さらに、トリガー鎖とサポート鎖とが結合している部分の塩基配列は、他のポリヌクレオチドにより鎖の交換反応が生ずる部分である。したがって、トリガー鎖の一部を、例えば癌細胞などの異常細胞内で発現し、正常細胞内で発現しない遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するように設計しておく。このような構成とすることで、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を所望の細胞内でのみ崩壊させることができる。一方、トリガー鎖の一部を、正常細胞内または幹細胞から分化した細胞群中の所望の細胞内で発現し、異常細胞内または所望の細胞に分化していない細胞内で発現しない遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有するように設計しておいてもよい。このような構成とすることで、正常細胞または幹細胞から分化した細胞群中の所望の細胞のみを生存させることができる。 In addition, as described above, the trigger chain has a site that recognizes the sequence of another polynucleotide. Furthermore, the base sequence of the portion where the trigger strand and the support strand are bonded is the portion where a strand exchange reaction occurs due to another polynucleotide. Therefore, a part of the trigger strand is designed to have a base sequence that is substantially the same as the base sequence of at least a part of a gene that is expressed in abnormal cells such as cancer cells and not expressed in normal cells. deep. By setting it as such a structure, the oligonucleotide structure of this invention can be disintegrated only in a desired cell. On the other hand, a part of the trigger strand is expressed in a desired cell in a normal cell or a group of cells differentiated from a stem cell, and at least one of genes not expressed in an abnormal cell or a cell that has not differentiated into a desired cell. You may design so that it may have the substantially same base sequence as the base sequence of a part. By setting it as such a structure, only the desired cell in the cell group differentiated from the normal cell or the stem cell can be made to survive.
この構造によれば、例えばトリガー鎖に結合するオリゴヌクレオチドが、異常細胞内で特異的に発現するものであれば、異常細胞内でのみ三方向ジョイント構造を分解させて、エフェクター鎖が１本鎖となる。エフェクター鎖は、１本鎖のままであっても、例えばアンチセンスや１本鎖機能性ＲＮＡとして機能させることができる。また、エフェクター鎖に相補的に結合する他の１本鎖が存在すれば、２本鎖となり、例えばＲＮＡｉとして機能する。また、トリガー鎖結合する他の１本鎖は、トリガー鎖と、相同でなければ鎖の交換反応は起こらない。すなわち、三方向ジョイント構造を分解しない。このため、正常なポリヌクレオチドと異常なポリヌクレオチドとの塩基配列の差が一塩基置換であっても、両者を区別できる。また、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いれば、ＳＮＰｓなどの検出にも用いることができる。 According to this structure, for example, if the oligonucleotide that binds to the trigger chain is specifically expressed in the abnormal cell, the three-way joint structure is decomposed only in the abnormal cell, and the single effector chain is formed. It becomes. Even if the effector chain remains single-stranded, it can function as, for example, antisense or single-stranded functional RNA. If there is another single strand that complementarily binds to the effector strand, it becomes a double strand, for example, functions as RNAi. In addition, the other single strand that binds to the trigger strand does not undergo a chain exchange reaction unless it is homologous with the trigger strand. That is, the three-way joint structure is not disassembled. For this reason, even if the base sequence difference between the normal polynucleotide and the abnormal polynucleotide is a single base substitution, the two can be distinguished. Moreover, if the oligonucleotide structure of this invention is used, it can be used also for detection of SNPs.
前記エフェクター鎖は、相補性を有するオリゴヌクレオチドと二本鎖を形成するとよい。前記トリガー鎖が結合する他のポリヌクレオチドの配列がそれぞれ異なるトリガー鎖を有する二種のオリゴヌクレオチド構造体から、得られるエフェクター鎖同士から二本鎖を形成するとよい。特に、前記他のポリヌクレオチドの配列が、異なる遺伝子由来のものであると好ましい。 The effector strand may form a double strand with a complementary oligonucleotide. It is good to form a double strand from the effector strands obtained from two types of oligonucleotide structures having trigger strands different in sequence of other polynucleotides to which the trigger strand binds. In particular, the sequence of the other polynucleotide is preferably derived from a different gene.
また、本発明の遺伝子発現抑制方法は、トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体を細胞、あるいは組織に導入し、他のポリヌクレオチドが存在する細胞、あるいは組織においてのみ、前記三方向ジョイント構造の崩壊を生じさせ、１本鎖エフェクター鎖を得る、ことにより行う。 The gene expression suppression method of the present invention is composed of three oligonucleotides, a trigger strand, an effector strand, and a support strand, and each of the three oligonucleotides has two other strands. An oligonucleotide structure having a site for recognizing the sequence of another polynucleotide outside the site to which the support strand is bonded; Or it introduce | transduces into a structure | tissue and it produces | generates collapse of the said three-way joint structure only in the cell in which another polynucleotide exists, or a structure | tissue, and obtains a single stranded effector chain | strand.
前記エフェクター鎖は、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の塩基配列を有する。 The effector chain has a base sequence substantially identical to at least a part of the base sequence of the target gene or target gene transcript.
前記オリゴヌクレオチド構造体と共に、このオリゴヌクレオチド構造体のエフェクター鎖と相補的に結合するオリゴヌクレオチドを導入し、前記三方向ジョイント構造の崩壊を生じた細胞、あるいは組織内で、生じた１本鎖エフェクター鎖とオリゴヌクレオチドとが二本鎖を形成するものであってもよい。 An oligonucleotide that binds complementarily to the effector strand of the oligonucleotide structure is introduced together with the oligonucleotide structure, and the single-stranded effector produced in the cell or tissue in which the collapse of the three-way joint structure has occurred The strand and the oligonucleotide may form a double strand.
エフェクター鎖の塩基配列が同一で、トリガー鎖が認識する他のポリヌクレオチドが異なる二種類のオリゴヌクレオチド構造体を細胞、あるいは組織に導入し、前記トリガー鎖が認識する他のポリヌクレオチドが二種類存在する細胞、あるいは組織においてのみ、前記二種類のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させ、生じたエフェクター鎖同士が二本鎖を形成するものであってもよい。 Two types of oligonucleotide structures that have the same base sequence of the effector chain and different oligonucleotides recognized by the trigger strand are introduced into cells or tissues, and the other polynucleotides recognized by the trigger strand exist. Only in the cells or tissues to be treated, the three-way joint structure of the two types of oligonucleotide structures may be disrupted, and the resulting effector strands may form a double strand.
本発明の一塩基置換体の検出方法は、トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体と、他のポリヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドの一塩基置換体とを混合し、前記オリゴヌクレオチド構造体の崩壊の有無により、他のポリヌクレオチドの一塩基置換体を検出する。 The method for detecting a single base substitution product of the present invention is composed of three oligonucleotides, a trigger strand, an effector strand, and a support strand, and each of the three oligonucleotides is composed of two other strands. An oligonucleotide structure having a site for recognizing the sequence of another polynucleotide outside the site to which the support strand is bound, Another polynucleotide or a single nucleotide substitution product of another polynucleotide is mixed, and a single nucleotide substitution product of another polynucleotide is detected based on the presence or absence of the collapse of the oligonucleotide structure.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いると、トリガー鎖の前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位に同一な他のポリヌクレオチドが存在すれば、オリゴヌクレオチド構造体が崩壊する。一方、他のポリヌクレオチドの一塩基置換体の場合は、トリガー鎖に結合できないので、オリゴヌクレオチド構造体が崩壊しない。したがって、オリゴヌクレオチド構造体の崩壊の有無を確認することで、一塩基置換体を検出することができる。 When the oligonucleotide structure of the present invention is used, if there is another polynucleotide identical to the site that recognizes the sequence of another polynucleotide outside the site where the support strand of the trigger strand is bound, the oligonucleotide The structure collapses. On the other hand, in the case of a single nucleotide substitution product of another polynucleotide, since it cannot bind to the trigger strand, the oligonucleotide structure does not collapse. Therefore, a single-base substitution product can be detected by confirming the presence or absence of the collapse of the oligonucleotide structure.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、トリガー鎖と、エフェクター鎖と、サポート鎖との３本のオリゴヌクレオチドで構成され、前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する。この構造により、正常細胞または幹細胞から分化した細胞群中の所望の細胞と、異常細胞または所望の細胞に分化していない細胞などとを区別していずれかの細胞内でのみ三方向ジョイント構造を分解させ、エフェクター鎖を得ることができる。 The oligonucleotide structure of the present invention is composed of three oligonucleotides, a trigger strand, an effector strand, and a support strand, and each of the three oligonucleotides is composed of the other two strands. The trigger strand has a site for recognizing the sequence of another polynucleotide outside the site to which the support strand is bonded. This structure distinguishes between desired cells in a group of cells differentiated from normal cells or stem cells and abnormal cells or cells that have not differentiated into desired cells, and decomposes the three-way joint structure only in one of the cells. Effector chains can be obtained.
以下に、本発明を詳細に説明する。
図１は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の概念を説明する図である。The present invention is described in detail below.
FIG. 1 is a diagram for explaining the concept of the oligonucleotide structure of the present invention.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体を構成するオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡのいずれでもよく、またＤＮＡとＲＮＡのキメラであっても、さらに化学修飾をしたものであってもよい。 The oligonucleotide constituting the oligonucleotide structure of the present invention may be either DNA or RNA, and may be a chimera of DNA and RNA, or may be further chemically modified.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、トリガー鎖１と、エフェクター鎖２と、サポート鎖３との３本のオリゴヌクレオチドで構成されている。図１に示すように、トリガー鎖１と、エフェクター鎖２と、サポート鎖３鎖とは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と相補的に結合して三方向ジョイント構造を形成している。具体的には、トリガー鎖１のｔ２部位とエフェクター鎖２のｅ２部位とが、エフェクター鎖２のｅ１部位とサポート鎖３のｓ２部位とが、サポート鎖３のｓ１部位とトリガー鎖１のｔ１−１部位とがそれぞれ結合している。これらの結合は、相補的な結合でなくてもよく、その一部が結合したものであればよい。 The oligonucleotide structure of the present invention is composed of three oligonucleotides, a trigger strand 1, an effector strand 2, and a support strand 3. As shown in FIG. 1, the trigger chain 1, the effector chain 2, and the support chain 3 chain each form a three-way joint structure by complementary binding to the other two chains. Yes. Specifically, the t2 site of the trigger chain 1 and the e2 site of the effector chain 2 are the e1 site of the effector chain 2 and the s2 site of the support chain 3, and the s1 site of the support chain 3 and the t1 of the trigger chain 1 One site is bonded to each other. These bonds do not have to be complementary bonds, but may be any bonds as long as part of them is bonded.
トリガー鎖のｔ１部位は、他のポリヌクレオチドと相同配列を有する。この配列により、他のポリヌクレオチドが相補的に結合し、オリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させることができる。また、トリガー鎖１のｔ１部位には、サポート鎖３と結合せず、他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位ｔ１−２が存在する。このｔ１−２に特定のポリヌクレオチドが結合することで、鎖の交換反応が起こり、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造が崩壊する。 The t1 site of the trigger strand has a homologous sequence with other polynucleotides. This sequence allows other polynucleotides to bind complementarily and disrupt the three-way joint structure of the oligonucleotide structure. Further, at the t1 site of the trigger chain 1, there is a site t1-2 that does not bind to the support chain 3 and recognizes the sequence of another polynucleotide. When a specific polynucleotide is bound to t1-2, a chain exchange reaction occurs, and the three-way joint structure of the oligonucleotide structure of the present invention is destroyed.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させるためには、トリガー鎖１のｔ１部位は、ガン細胞などの異常細胞内で特異的に発現するｍＲＮＡの一部と相補的に結合する塩基配列を有する。あるいは、正常細胞内または幹細胞から分化した細胞群中の所望の細胞内で発現するｍＲＮＡの一部と相補的に結合する塩基配列を有するものであってもよい。また、このようなｍＲＮＡが、トリガー鎖１のｔ１部位を認識し、オリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を完全に崩壊させるためには、ｔ１−２部位は、６〜２０塩基の配列であればよい。一方、オリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造の崩壊をコントロールさせるためには、ｔ１−２部位は、４塩基程度であればよい。あるいは、トリガー鎖と相補的に結合するｍＲＮＡ塩基配列を調整して上記範囲にしてもよい。トリガー鎖１のｔ１部位に結合するｍＲＮＡは、後述するエフェクター鎖２が結合するｍＲＮＡと同一のｍＲＮＡであってもよく、異なるｍＲＮＡであってもよい。同一のｍＲＮＡである場合には、トリガー鎖１のｔ１部位に結合するｍＲＮＡの部位と、エフェクター鎖２が結合するｍＲＮＡの部位が異なるように、塩基配列を決定すればよい。 In order to disrupt the three-way joint structure of the oligonucleotide structure of the present invention, the t1 site of the trigger strand 1 binds complementarily to a part of mRNA specifically expressed in abnormal cells such as cancer cells. It has a base sequence. Or you may have a base sequence couple | bonded complementarily with a part of mRNA expressed in the desired cell in the cell group differentiated from the normal cell or the stem cell. In addition, in order for such mRNA to recognize the t1 site of the trigger strand 1 and completely destroy the three-way joint structure of the oligonucleotide structure, the t1-2 site should be a 6-20 base sequence. That's fine. On the other hand, in order to control the collapse of the three-way joint structure of the oligonucleotide structure, the t1-2 site may be about 4 bases. Or you may adjust the mRNA base sequence couple | bonded complementarily with a trigger chain | strand and make it the said range. The mRNA that binds to the t1 site of the trigger chain 1 may be the same mRNA as the mRNA that the effector chain 2 described later binds, or may be a different mRNA. In the case of the same mRNA, the base sequence may be determined so that the mRNA site binding to the t1 site of the trigger chain 1 and the mRNA site binding to the effector chain 2 are different.
エフェクター鎖２は、オリゴヌクレオチド構造体の崩壊後にＲＮＡｉなどの機能を奏する元となるオリゴヌクレオチドである。エフェクター鎖２は、全体で（ｅ１部位＋ｅ２部位）２１〜３０塩基程度のオリゴヌクレオチドである。エフェクター鎖２のｅ１部位またはｅ２部位は、６〜７塩基以上であればよい。エフェクター鎖２とトリガー鎖１との結合は、上記トリガー鎖１と特定のオリゴヌクレオチドとの結合により分解する程度の弱い結合になるように、エフェクター鎖２のｅ２部位の配列に対して、トリガー鎖１のｔ２部位を設計すればよい。 The effector strand 2 is an oligonucleotide that is a source of functions such as RNAi after the oligonucleotide structure is disrupted. The effector chain 2 is an oligonucleotide of about 21 to 30 bases as a whole (e1 site + e2 site). The e1 site or e2 site of the effector chain 2 may be 6 to 7 bases or more. The trigger chain is compared with the sequence of the e2 site of the effector chain 2 so that the bond between the effector chain 2 and the trigger chain 1 is weak enough to be decomposed by the bond between the trigger chain 1 and the specific oligonucleotide. What is necessary is just to design 1 t2 site | part.
エフェクター鎖２は、オリゴヌクレオチド構造体の崩壊後に標的遺伝子または標的遺伝子転写産物に対して何らかの機能を奏する配列である。このため、エフェクター鎖２は、標的遺伝子または標的遺伝子転写産物の少なくとも一部の実質的に同一の塩基配列を有する必要がある。標的遺伝子または標的遺伝子転写産物は、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を使用する目的に応じて適宜選択すればよい。例えば、ガン細胞で特異的に発現しているガン遺伝子などである。あるいは、正常細胞内のみ発現している遺伝子や幹細胞から分化した細胞群中の所望の細胞内でのみ発現している遺伝子などであってもよい。 The effector chain 2 is a sequence that performs some function on the target gene or target gene transcript after the oligonucleotide structure is disrupted. For this reason, the effector chain 2 needs to have a substantially identical base sequence of at least a part of the target gene or the target gene transcript. The target gene or target gene transcript may be appropriately selected depending on the purpose of using the oligonucleotide structure of the present invention. For example, an oncogene specifically expressed in cancer cells. Alternatively, it may be a gene that is expressed only in normal cells or a gene that is expressed only in desired cells in a group of cells differentiated from stem cells.
サポート鎖３は、上記エフェクター鎖２とトリガー鎖１とにそれぞれ結合をし、三方向ジョイント構造を形成する。サポート鎖３のｓ１部位は、三方向ジョイント構造を維持する程度以上に相補的にトリガー鎖１のｔ１−１部位に結合している。また、サポート鎖３とエフェクター鎖２との間の結合は、三方向ジョイント構造の崩壊に伴い、分裂できる程度の弱さを有する結合である。 The support chain 3 is bonded to the effector chain 2 and the trigger chain 1 to form a three-way joint structure. The s1 portion of the support strand 3 is complementarily bound to the t1-1 portion of the trigger strand 1 to the extent that the three-way joint structure is maintained. Further, the bond between the support chain 3 and the effector chain 2 is a bond having such a weakness that it can be split with the collapse of the three-way joint structure.
次に、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の崩壊の機構を図２を用いて説明する。
図２（ａ）に示すように、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の近傍に上記トリガー鎖１と相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチド４（図２の例では、ｍＲＮＡ）が存在すると、トリガー鎖１の他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位ｔ１−２を認識し、サポート鎖３との間で交換反応が起こる。この交換反応により、三方向ジョイント構造が崩壊する。Next, the mechanism of the collapse of the oligonucleotide structure of the present invention will be described with reference to FIG.
As shown in FIG. 2 (a), when a polynucleotide 4 (mRNA in the example of FIG. 2) having a site that binds complementarily to the trigger strand 1 is present in the vicinity of the oligonucleotide structure of the present invention, the trigger The site t1-2 that recognizes the sequence of the other polynucleotide in the strand 1 is recognized, and an exchange reaction occurs with the support strand 3. This exchange reaction causes the three-way joint structure to collapse.
上記した三方向ジョイント構造の崩壊により、トリガー鎖１と、エフェクター鎖２と、サポート鎖３とは、それぞれ分離する。これにより、１本鎖のエフェクター鎖が得られる。１本鎖のエフェクター鎖は、このままで、例えばアンチセンスや１本鎖機能性ＲＮＡとして機能させることができる。また、一塩基置換体を検出する場合は、エフェクター鎖は特に機能を有しない。 Due to the collapse of the above-described three-way joint structure, the trigger chain 1, the effector chain 2, and the support chain 3 are separated from each other. Thereby, a single-chain effector chain is obtained. The single-stranded effector strand can be used as it is, for example, as an antisense or single-stranded functional RNA. In addition, when detecting a single base substitution product, the effector chain has no particular function.
三方向ジョイント構造の崩壊後に、１本鎖のエフェクター鎖２と相補的なオリゴヌクレオチド２’が存在すると、エフェクター鎖２と相補的なオリゴヌクレオチド２’とは二本鎖を形成する。エフェクター鎖がＲＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡとのキメラの場合は、形成された２本鎖オリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡとしてＲＮＡｉ機構を介してこれと相同な配列を持つｍＲＮＡを分解する。 If there is an oligonucleotide 2 'complementary to the single-stranded effector strand 2 after the collapse of the three-way joint structure, the effector strand 2 and the complementary oligonucleotide 2' form a double strand. When the effector chain is a chimera of RNA or RNA and DNA, the formed double-stranded oligonucleotide degrades mRNA having a sequence homologous to it through the RNAi mechanism as siRNA.
この１本鎖のエフェクター鎖２と相補的に結合する他のオリゴヌクレオチド２’は、オリゴヌクレオチド構造体と同時に加えたものでも、細胞内に存在するオリゴヌクレオチドでもよい。好ましくは、エフェクター鎖２と相補的に結合するオリゴヌクレオチド２’は、別のオリゴヌクレオチド構造体のエフェクター鎖２由来のものであればよい。細胞内でのＲＮＡｉなどをより効果的に行うことができるからである。 The other oligonucleotide 2 'that binds complementarily to the single-stranded effector strand 2 may be added simultaneously with the oligonucleotide structure or may be an oligonucleotide present in the cell. Preferably, the oligonucleotide 2 ′ that binds complementarily to the effector strand 2 may be derived from the effector strand 2 of another oligonucleotide structure. This is because intracellular RNAi and the like can be performed more effectively.
一方、図２（ｂ）に示すように、上記トリガー鎖１と相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチドが存在しないと、三方向ジョイント構造は崩壊しない。したがって、本発明では、トリガー鎖１およびこのトリガー鎖と相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチドの選択が重要となる。トリガー鎖と相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチドが、例えばガン細胞など特定の細胞内にのみ存在するものを選択することにより、特定の細胞内でのみ、三方向ジョイント構造を崩壊させることができる。また、一塩基置換されたポリヌクレオチドの場合には、鎖の交換反応が生じないので、三方向ジョイント構造は崩壊しない。 On the other hand, as shown in FIG. 2 (b), the three-way joint structure does not collapse unless there is a polynucleotide having a site that binds complementarily to the trigger strand 1. Therefore, in the present invention, it is important to select a polynucleotide having a trigger strand 1 and a site that complementarily binds to the trigger strand. By selecting a polynucleotide having a site that binds complementarily to the trigger strand, for example, only in a specific cell such as a cancer cell, the three-way joint structure can be disrupted only in the specific cell. it can. In addition, in the case of a polynucleotide with a single base substitution, since a chain exchange reaction does not occur, the three-way joint structure does not collapse.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、１種類で使用してもよいが、複数種のオリゴヌクレオチド構造体を使用してもよい。特に、鎖の交換反応によりトリガー鎖に結合する前記他のポリヌクレオチドの塩基配列が異なるものを用いると好ましい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させたい細胞内で特異的に発現する、異なる遺伝子Ａ、Ｂが存在する場合に、一のオリゴヌクレオチド構造体のトリガー鎖に遺伝子ＡのｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する配列を設け、他のオリゴヌクレオチド構造体のトリガー鎖に遺伝子ＢのｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的に結合する配列を設けるなどである。この構成により、遺伝子Ａ、Ｂが発現している場合にのみ、エフェクター鎖から２本鎖を形成することができる。 One type of oligonucleotide structure of the present invention may be used, but a plurality of types of oligonucleotide structures may be used. In particular, it is preferable to use a different base sequence of the other polynucleotide that binds to the trigger chain by a chain exchange reaction. For example, when there are different genes A and B that are specifically expressed in a cell in which the three-way joint structure of the oligonucleotide structure of the present invention is desired to be disrupted, the gene A is included in the trigger strand of one oligonucleotide structure. For example, a sequence that complementarily binds to at least a part of mRNA is provided, and a sequence that complementarily binds to at least a part of mRNA of gene B is provided on the trigger strand of another oligonucleotide structure. With this configuration, a duplex can be formed from the effector chain only when genes A and B are expressed.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体の細胞、組織、あるいは個体への導入する対象となるのは、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳され得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、本発明の対象となる被導入体は、細胞、組織、あるいは個体を意味する。本発明に用いられる細胞としては、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不滅化細胞、または形質転換細胞等何れのものであってもよい。具体的には、例えば、幹細胞のような未分化細胞、幹細胞から分化・誘導された細胞群、器官または組織由来の細胞あるいはその分化細胞等が挙げられる。組織としては、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚、胎児組織等を含む。また、上記分化細胞としては、例えば、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌線または外分泌腺の細胞等が挙げられる。 The oligonucleotide structure of the present invention can be introduced into a cell, tissue, or individual as long as the target gene can be transcribed into RNA or translated into protein within the cell. Also good. Specifically, the introducer that is the subject of the present invention means a cell, tissue, or individual. Examples of the cells used in the present invention include germline cells, somatic cells, differentiated totipotent cells, multipotent cells, divided cells, non-divided cells, parenchymal tissue cells, epithelial cells, immortalized cells, and transformed cells. It may be. Specific examples include undifferentiated cells such as stem cells, cell groups differentiated and derived from stem cells, cells derived from organs or tissues, or differentiated cells thereof. Tissues include single-cell embryos or constitutive cells, multi-cell embryos, fetal tissues and the like. Examples of the differentiated cells include adipocytes, fibroblasts, muscle cells, cardiomyocytes, endothelial cells, neurons, glia, blood cells, megakaryocytes, lymphocytes, macrophages, neutrophils, eosinophils, Examples include basophils, mast cells, leukocytes, granulocytes, keratinocytes, chondrocytes, osteoblasts, osteoclasts, hepatocytes, and endocrine or exocrine gland cells.
本発明で被導入体として用いられる個体として、具体的には、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、または真菌種に属するもの等が挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。本発明の被導入体として好ましい微生物は、農業で、または工業によって使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビ及び酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、サル及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類及び他の虫類、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、および他の昆虫が含まれる。 Specific examples of the individual to be used as the recipient in the present invention include those belonging to plants, animals, protozoa, viruses, bacteria, or fungal species. The plant may be monocotyledonous, dicotyledonous or gymnosperm, and the animal may be a vertebrate or invertebrate. Preferred microorganisms as recipients of the present invention are those used in agriculture or by industry and are pathogenic to plants or animals. Fungi include organisms in both mold and yeast forms. Examples of vertebrates include mammals including fish, cattle, goats, pigs, sheep, hamsters, mice, rats, monkeys and humans, and invertebrates include nematodes and other reptiles, gyro Drosophila, and other insects are included.
被導入体へのオリゴヌクレオチド構造体の導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィルス感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウィルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、オリゴヌクレオチド構造体を生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、オリゴヌクレオチド構造体を導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。 As a method for introducing an oligonucleotide structure into a recipient, when the recipient is a cell or tissue, a calcium phosphate method, an electroporation method, a lipofection method, a virus infection, or a double-stranded polynucleotide solution. Soaking or transformation method is used. Examples of the method for introduction into an embryo include microinjection, electroporation, and virus infection. When the recipient is a plant, a method by injection or perfusion into the body cavity or stromal cells of the plant or spraying is used. In the case of an animal individual, it is introduced systemically by oral, topical, parenteral (including subcutaneous, intramuscular and intravenous administration), vaginal, rectal, nasal, ophthalmic, intraperitoneal administration, etc. The method, electroporation method, virus infection or the like is used. For methods for oral introduction, the oligonucleotide structure can be mixed directly with the biological food. Furthermore, when introduced into an individual, it can be administered, for example, as an implanted long-term release preparation or by ingesting an introduced body into which an oligonucleotide structure has been introduced.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いると、所定の場所で、所望のオリゴヌクレオチドを得て、所望のオリゴヌクレオチドを利用するものであれば、いかなる目的にも使用できる。例えば、以下の目的に使用できる。 When the oligonucleotide structure of the present invention is used, it can be used for any purpose as long as the desired oligonucleotide is obtained at a predetermined location and the desired oligonucleotide is used. For example, it can be used for the following purposes.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、得られる１本鎖のエフェクター鎖２が、ＲＮＡの場合は、相補的に結合する他のオリゴヌクレオチド２’がＲＮＡの場合は、２本鎖ＲＮＡとしてＲＮＡｉを引き起こすことができる。 In the oligonucleotide structure of the present invention, when the obtained single-stranded effector strand 2 is RNA, when the other oligonucleotide 2 'that binds complementarily is RNA, RNAi is caused as double-stranded RNA. be able to.
または、本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、得られる１本鎖のエフェクター鎖２が、修飾ＲＮＡの場合は、１本鎖修飾ＲＮＡとして、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの機能を阻害することができる。 Alternatively, in the oligonucleotide structure of the present invention, when the obtained single-stranded effector strand 2 is a modified RNA, the function of siRNA or miRNA can be inhibited as a single-stranded modified RNA.
または、本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、得られる１本鎖のエフェクター鎖２が、ＤＮＡの場合は、２本鎖ＤＮＡとしてデコイ核酸として機能させることができる。 Alternatively, in the oligonucleotide structure of the present invention, when the obtained single-stranded effector strand 2 is DNA, it can function as a decoy nucleic acid as double-stranded DNA.
あるいは、本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、エフェクター鎖、サポート鎖の末端に、三方向ジョイント構造が崩壊した際に発色する蛍光色素などを付加しておいて、一塩基置換の検出に用いることもできる。あるいは、電気泳動などで三方向ジョイント構造の崩壊の有無を確認することで、一塩基置換の検出に用いることもできる。 Alternatively, in the oligonucleotide structure of the present invention, a fluorescent dye that develops color when the three-way joint structure collapses may be added to the end of the effector chain or support chain, and used for detection of single base substitution. it can. Or it can also be used for the detection of single base substitution by confirming the presence or absence of collapse of the three-way joint structure by electrophoresis or the like.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、一塩基置換されたオリゴヌクレオチドでは、三方向ジョイント構造が崩壊しない。これにより、特定のオリゴヌクレオチドを所望の細胞内でのみ機能させることができる。このように、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いると、正常細胞と異常細胞とを区別できる。あるいは、幹細胞から分化・誘導された細胞群から所望の細胞に分化した細胞のみを選択することができる。 In the oligonucleotide structure of the present invention, the three-way joint structure does not collapse in the oligonucleotide with a single base substitution. Thereby, a specific oligonucleotide can be functioned only in a desired cell. Thus, when the oligonucleotide structure of the present invention is used, normal cells and abnormal cells can be distinguished. Alternatively, only cells differentiated into desired cells from a group of cells differentiated / derived from stem cells can be selected.
しかも、本発明のオリゴヌクレオチド構造体は、単純な３本の短い配列が結合した構造をしている。この結果、毒性はないと考えられる。 Moreover, the oligonucleotide structure of the present invention has a structure in which three simple short sequences are combined. As a result, it is considered non-toxic.
また、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いれば、正常細胞内での三方向ジョイント構造の崩壊を抑制できる。このため、従来問題とされたＲＮＡｉ医薬の副作用を軽減できる。 Moreover, if the oligonucleotide structure of this invention is used, collapse of the three-way joint structure in normal cells can be suppressed. For this reason, the side effect of the RNAi medicine considered as a conventional problem can be reduced.
本発明のオリゴヌクレオチド構造体において、有効なトリガー鎖と、エフェクター鎖とを選択し、これと結合できるサポート鎖を設計することで、遺伝子が関与する疾病や個人の遺伝型が影響する疾病に対しても柔軟に対応できる。 In the oligonucleotide structure of the present invention, by selecting an effective trigger chain and an effector chain and designing a support chain that can bind to this, it is possible to prevent diseases involving genes and diseases affected by individual genotypes. But it can respond flexibly.
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げて説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
（実施例１）
［細胞内におけるＲＮＡｉの発生の評価］
ヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７細胞）におけるＲＮＡｉの発生を評価した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡの一部に対応するＤＮＡを用い、トリガー鎖として、ＶＥＧＦの受容体の一つであるＫＤＲ（２型受容体）のＤＮＡを用いた。ＶＥＧＦは、多くのガン細胞が産生しており、血管をガン組織に誘導する因子である。さらに、ガン細胞自身がこの増殖因子に反応して、増殖することが知られている。ＫＤＲは、血管内皮細胞やガン細胞などの細胞表面などにあり、ＶＥＧＦと結合する。Example 1
[Evaluation of RNAi generation in cells]
The occurrence of RNAi in human breast cancer-derived cells (MCF-7 cells) was evaluated. Specifically, a DNA corresponding to a part of mRNA of vascular endothelial growth factor (VEGF) is used as an effector chain, and KDR (2), which is one of VEGF receptors, is used as a trigger chain. Type receptor) DNA was used. VEGF is a factor that is produced by many cancer cells and induces blood vessels to cancer tissue. Furthermore, it is known that cancer cells themselves proliferate in response to this growth factor. KDR is present on the surface of cells such as vascular endothelial cells and cancer cells, and binds to VEGF.
図１に示す三方向ジョイント構造を有するオリゴヌクレオチド構造体（以下、「ＴＷＪ構造体」という）、およびオリゴヌクレオチド構造体がトリガー鎖を認識する部位ｔ１−２の配列がトリガー鎖を認識できない配列にした、三方向ジョイント構造を有するオリゴヌクレオチド構造体（以下、「ＴＷＪ ｍｕｔａｎｔ ｔａｉｌ」という）、オリゴヌクレオチド構造体がトリガー鎖を認識する部位ｔ１−２を有さない三方向ジョイント構造を有するオリゴヌクレオチド構造体（以下、「ＴＷＪ ｎｏ ｔａｉｌ」という）を作製した。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表１に示す。
上記作製したオリゴヌクレオチド構造体及びエフェクター鎖（配列番号１）と、配列番号４で示すＲＮＡを用いて作製したｓｉＲＮＡ（以下、「ｓｉＲＮＡ」という）と、をそれぞれヒト乳がん由来細胞（ＭＣＦ−７細胞）に導入した。２４時間後、全ＲＮＡを抽出した。ＫＤＲのｃＤＮＡを作製し、リアルタイムＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）により、ｍＲＮＡの相対量を調べた。結果を図３に示す。図３は、ＴＷＪ、ＴＷＪ ｎｏ ｔａｉｌ、ＴＷＪ ｍｕｔａｎｔ ｔａｉｌ、ｓｉＲＮＡ、核酸成分を導入していない（図中、「ｎｏｎｅ」）ものの、ＫＤＲのｍＲＮＡの相対量を示すグラフである。 The above-prepared oligonucleotide structure and effector chain (SEQ ID NO: 1) and siRNA prepared using the RNA shown in SEQ ID NO: 4 (hereinafter referred to as “siRNA”) are each human breast cancer-derived cells (MCF-7 cells) ). After 24 hours, total RNA was extracted. KDR cDNA was prepared, and the relative amount of mRNA was examined by real-time PCR (polymerase chain reaction, polymerase chain reaction). The results are shown in FIG. FIG. 3 is a graph showing the relative amount of mRNA of KDR, although TWJ, TWJ no tail, TWJ mutant tail, siRNA, and nucleic acid component were not introduced (“none” in the figure).
図３から、ＴＷＪは明らかにＲＮＡｉを引き起こし、ＫＤＲのｍＲＮＡを減少させていることがわかる。一方、ＴＷＪ ｎｏ ｔａｉｌおよびＴＷＪ ｍｕｔａｎｔ ｔａｉｌは、これらはＫＤＲのｍＲＮＡを減少させておらず、ＲＮＡｉをほとんど引き起こしていないことがわかる。このことから、本発明のオリゴヌクレオチド構造体を用いると、ＲＮＡｉを引き起こすことができることがわかった。 FIG. 3 clearly shows that TWJ causes RNAi and decreases KDR mRNA. On the other hand, it can be seen that TWJ no tail and TWJ mutant tail do not reduce KDR mRNA and hardly cause RNAi. From this, it was found that RNAi can be caused by using the oligonucleotide structure of the present invention.
（実施例２）
［電気泳動におけるオリゴヌクレオチド構造体の崩壊の評価］
図１に示す三方向ジョイント構造を有するオリゴヌクレオチド構造体（以下、「ＴＷＪ構造体」という）が出来ているかどうか、およびｍＲＮＡ相当配列によって、その構造が崩壊しているかどうか検討をした。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表２に示す。
[Evaluation of decay of oligonucleotide structure in electrophoresis]
Whether or not the oligonucleotide structure having the three-way joint structure shown in FIG. 1 (hereinafter referred to as “TWJ structure”) was made and whether or not the structure was destroyed were examined. Table 2 shows the sequences of the prepared oligonucleotides.
実験は、エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖、構造体を崩壊させる鎖（ｍＲＮＡ相当鎖）、エフェクター鎖に相補的な鎖（エフェクター鎖とともにｓｉＲＮＡ相当二本鎖を生成する鎖）うちから以下のような組み合わせを混合し、３０分後Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって分析した。結果を、図４に示す。図４は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 The experiment is as follows from the effector chain, support chain, trigger chain, chain that disrupts the structure (corresponding to mRNA), and chain complementary to the effector chain (strand that generates siRNA-corresponding duplex together with the effector chain) The combinations were mixed and analyzed by Native-PAGE after 30 minutes. The results are shown in FIG. FIG. 4 is a photograph showing the results of Native-PAGE.
図４において、各レーンは以下のものを示す。
ａのレーン： エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖
ｂのレーン： エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖、ｍＲＮＡ相当鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖
ｃのレーン： エフェクター鎖、サポート鎖、トリガー鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖
ｄのレーン： エフェクター鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖In FIG. 4, each lane shows the following.
Lane a: Effector chain, support chain, trigger chain b Lane: Effector chain, support chain, trigger chain, mRNA equivalent chain, Lane c complementary to effector chain: Effector chain, support chain, trigger chain, effector Strand d lane complementary to strand: effector strand, strand complementary to effector strand
図４から、ａのレーンでは１００ｂｐ超の位置にＴＷＪのバンドが確認された。構造体が生成していることがわかった。 From FIG. 4, a TWJ band was confirmed at a position exceeding 100 bp in the lane a. It was found that a structure was generated.
また、ｂのレーンではｍＲＮＡ相当鎖の添加により、ｍＲＮＡ相当鎖とトリガー鎖からなるバンドがＣの位置（図中、白い楕円で囲んだ領域）に強く検出され、構造体が崩壊していることがわかった。同時に、放出されたエフェクター鎖とエフェクター鎖に相補的な鎖からなるｓｉＲＮＡ相当二本鎖がＡの位置（図中、白い楕円で囲んだ領域）に強く検出された。 In addition, in the lane b, by adding the mRNA equivalent chain, the band consisting of the mRNA equivalent chain and the trigger chain is strongly detected at the position of C (region surrounded by a white ellipse in the figure), and the structure is collapsed. I understood. At the same time, a siRNA-equivalent duplex consisting of the released effector strand and a strand complementary to the effector strand was strongly detected at the position A (region surrounded by a white ellipse in the figure).
ｃのレーンではｍＲＮＡ相当鎖を加えていないので、ＴＷＪ構造体がほとんど残っていた。また、ｂのレーンと同量のエフェクター鎖に相補的な鎖を加えているにも関わらず、ｓｉＲＮＡ相当二本鎖はほとんど検出されず（Ｂの位置（図中、白い楕円で囲んだ領域））、エフェクター鎖がＴＷＪ構造体から放出されていないことがわかった。 In the lane c, since no mRNA equivalent chain was added, the TWJ structure remained almost. In addition, even though a complementary strand was added to the same amount of effector strand as in lane b, almost no siRNA equivalent duplex was detected (position B (region surrounded by a white ellipse in the figure)). ), It was found that the effector chain was not released from the TWJ structure.
ｄのレーンはｂ及びｃのレーンで加えたエフェクター鎖、エフェクター鎖に相補的な鎖が全量ｓｉＲＮＡ相当二本鎖を生成した場合のポジティブコントロールを示す。 Lane d shows the positive control when the effector strand added in lanes b and c and a strand complementary to the effector strand produce a total amount of siRNA equivalent duplex.
（実施例３）
［ＴＷＪ構造のトリガー鎖に結合するポリヌクレオチドの長さの評価］
図１に示す三方向ジョイント構造を有するＴＷＪ構造体を作製し、ｍＲＮＡ相当配列の長さが、ＴＷＪ構造体の崩壊に対する、ｍＲＮＡ相当配列の長さの影響を検討した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡの一部に対応するＤＮＡを用い、トリガー鎖として、ＶＥＧＦの受容体の一つであるＫＤＲ（２型受容体）のＤＮＡを用いた。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表３に示す。各配列中のアンダーラインは、ＴＷＪ構造体の１本鎖の部分または１本鎖の部分の相補鎖を意味する。
[Evaluation of length of polynucleotide binding to trigger strand of TWJ structure]
A TWJ structure having a three-way joint structure shown in FIG. 1 was prepared, and the influence of the length of the mRNA equivalent sequence on the decay of the TWJ structure was examined. Specifically, a DNA corresponding to a part of mRNA of vascular endothelial growth factor (VEGF) is used as an effector chain, and KDR (2), which is one of VEGF receptors, is used as a trigger chain. Type receptor) DNA was used. Table 3 shows the sequences of the prepared oligonucleotides. The underline in each sequence means a single strand part of the TWJ structure or a complementary strand of the single strand part.
図５は、長さの異なるｍＲＮＡ相当配列が、ＴＷＪ構造体の崩壊に及ぼす影響を評価した結果を示す図である。まず、図５に示すように、ｍＲＮＡ相当配列の長さｎが異なる（ｎ＝０、４、８、１２、１６）ｍＲＮＡ相当配列とＴＷＪ構造体とを１μＭずつ混合し、３０分後Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって分析した。図５は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図中、Ｍレーンは標準物質を、ＴＷＪレーンは、ＴＷＪ構造体自体を、ｎ＝０、４、８、１２、１６レーンはそれぞれｍＲＮＡ相当配列の長さが異なるものとＴＷＪ構造体とを混合して反応させたものを電気泳動させた結果を示す。 FIG. 5 is a diagram showing the results of evaluating the influence of mRNA-corresponding sequences having different lengths on the collapse of the TWJ structure. First, as shown in FIG. 5, mRNA equivalent sequences differing in length n (n = 0, 4, 8, 12, 16) and TWJ structures were mixed 1 μM at a time, and 30 minutes later, Native- Analyzed by PAGE. FIG. 5 is a photograph showing the results of Native-PAGE. In the figure, M lane is a standard substance, TWJ lane is a TWJ structure itself, and n = 0, 4, 8, 12, and 16 lanes are mixed with a TWJ structure having different mRNA-corresponding sequence lengths. The result of having electrophoresed what was made to react is shown.
図５から、ｎ＝０のときは、ＴＷＪ構造体が全く崩壊しなかったことがわかる。すなわち、ｍＲＮＡ相当鎖が、トリガー鎖の有する、サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を認識できないため、ＴＷＪ構造体が全く崩壊しなかった。 FIG. 5 shows that when n = 0, the TWJ structure did not collapse at all. That is, the TWJ structure did not collapse at all because the mRNA-corresponding chain could not recognize the part of the trigger chain that recognizes the sequence of another polynucleotide outside the part where the support chain is bound.
図５から、ｎ＝４のときは、ＴＷＪ構造体（図中、「Ａ」で示す）とＴＷＪ構造体の崩壊断片（図中、「Ｂ」で示す）の両方のバンドが観察された。このことから、ｎ＝４のときは、ＴＷＪ構造体のトリガー鎖とｍＲＮＡ相当鎖との結合が十分でなく、ＴＷＪ構造体を完全に崩壊することができないことがわかった。この結果、ｎ＝４程度であれば、ＴＷＪ構造体の崩壊をコントロールすることができることがわかる。
図５から、ｎ＝８以上のときは、ＴＷＪ構造体は完全に崩壊していることがわかる。From FIG. 5, when n = 4, both bands of a TWJ structure (indicated by “A” in the figure) and a collapsed fragment of the TWJ structure (indicated by “B” in the figure) were observed. From this, it was found that when n = 4, the binding between the trigger chain of the TWJ structure and the mRNA-corresponding chain is not sufficient, and the TWJ structure cannot be completely destroyed. As a result, it can be seen that if n = 4, the collapse of the TWJ structure can be controlled.
FIG. 5 shows that the TWJ structure is completely collapsed when n = 8 or more.
（実施例４）
［一塩基置換認識能の評価］
図１に示す三方向ジョイント構造を有するＴＷＪ構造体を作製し、ｍＲＮＡ相当配列の長さが、一塩基置換認識能に対する、ｍＲＮＡ相当配列の長さの影響を検討した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡの一部に対応するＤＮＡを用い、トリガー鎖として、ＶＥＧＦの受容体の一つであるＫＤＲ（２型受容体）のＤＮＡを用いた。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表４に示す。各配列中のアンダーラインは、ＴＷＪ構造体の１本鎖の部分または１本鎖の部分の相補鎖を意味する。
[Evaluation of single base substitution recognition ability]
A TWJ structure having a three-way joint structure shown in FIG. 1 was prepared, and the influence of the length of the mRNA-corresponding sequence on the ability to recognize a single base substitution was examined. Specifically, a DNA corresponding to a part of mRNA of vascular endothelial growth factor (VEGF) is used as an effector chain, and KDR (2), which is one of VEGF receptors, is used as a trigger chain. Type receptor) DNA was used. Table 4 shows the sequences of the prepared oligonucleotides. The underline in each sequence means a single strand part of the TWJ structure or a complementary strand of the single strand part.
図６は、長さの異なるｍＲＮＡ相当配列が、一塩基置換認識能に及ぼす影響を評価した結果を示す写真である。まず、図６に示すように、ｍＲＮＡ相当配列の長さｎ（ｎは、トリガー鎖１のｔ１−２部位に結合するｍＲＮＡの部位）と一塩基置換の位置が異なるｍＲＮＡ相当配列とＴＷＪ構造体とを１μＭずつ混合し、３０分後Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって分析した。結果を、図６に示す。図６は、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図中、Ｍレーンは標準物質を、ＴＷＪレーンは、ＴＷＪ構造体自体を、各レーンにおいて、上側の数字は、ｎの長さを、下側の数字は、一塩基置換の位置を示す。また、「−」は、一塩基置換を含まないものを示す。一塩基置換の位置を示す数字で、正の数字は、トリガー鎖１のｔ１−２部位に結合するｍＲＮＡの部位に一塩基置換が存在することを、負の数字は、トリガー鎖１のｔ１−１部位に結合するｍＲＮＡの部位に一塩基置換が存在することを意味する。また、正負は、トリガー鎖１のｔ１−１部位とｔ１−２部位との境から起算する。 FIG. 6 is a photograph showing the results of evaluating the influence of mRNA-corresponding sequences having different lengths on the ability to recognize single nucleotide substitutions. First, as shown in FIG. 6, the mRNA equivalent sequence and the TWJ structure differ in the length n of the mRNA equivalent sequence (n is the site of the mRNA binding to the t1-2 site of the trigger chain 1) and the position of the single base substitution. And 1 μM each, and analyzed by Native-PAGE after 30 minutes. The results are shown in FIG. FIG. 6 is a photograph showing the result of Native-PAGE. In the figure, M lane indicates the standard substance, TWJ lane indicates the TWJ structure itself, in each lane, the upper number indicates the length of n, and the lower number indicates the position of the single base substitution. Further, “-” indicates that no single base substitution is included. A number indicating the position of the single base substitution, where the positive number indicates that there is a single base substitution at the site of the mRNA that binds to the t1-2 site of the trigger strand 1, and the negative number indicates the t1- It means that there is a single base substitution at the site of mRNA that binds to one site. Positive / negative is calculated from the boundary between the trigger chain 1 t1-1 site and the t1-2 site.
図６から、ｎ＝８のときは、一塩基置換の位置（１の位置）によってＴＷＪ構造体が崩壊することがわかる。一塩基置換の位置が３の位置にあるときは、ＴＷＪ構造体は崩壊していない。一方、ｎ＝１６のときは、一塩基置換の位置に関わらず、ＴＷＪ構造体が崩壊することがわかる。すなわち、ｍＲＮＡ相当鎖のトリガー鎖と相補的に結合する部位の長さがｎ＝８程度であれば、一塩基置換認識能があることがわかった。 FIG. 6 shows that when n = 8, the TWJ structure collapses depending on the position of single base substitution (position 1). When the position of single base substitution is at position 3, the TWJ structure is not collapsed. On the other hand, when n = 16, the TWJ structure collapses regardless of the position of the single base substitution. That is, when the length of the site that complementarily binds to the trigger chain of the mRNA-corresponding chain is about n = 8, it was found that single-base substitution recognition ability was possible.
（実施例５）
［一塩基置換認識能の位置特異性の評価］
図１に示す三方向ジョイント構造を有するＴＷＪ構造体を作製し、ｍＲＮＡ相当配列に含まれる一塩基置換の位置が、一塩基置換認識能に対する、影響を検討した。具体的には、エフェクター鎖として、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡの一部に対応するＤＮＡを用い、トリガー鎖として、ＶＥＧＦの受容体の一つであるＫＤＲ（２型受容体）のＤＮＡを用いた。作製したオリゴヌクレオチドの配列を表５に示す。各配列中のアンダーラインは、ＴＷＪ構造体の１本鎖の部分または１本鎖の部分の相補鎖を意味する。
[Evaluation of position specificity of single base substitution recognition ability]
A TWJ structure having a three-way joint structure shown in FIG. 1 was prepared, and the influence of the position of single base substitution contained in the mRNA-corresponding sequence on the single base substitution recognition ability was examined. Specifically, a DNA corresponding to a part of mRNA of vascular endothelial growth factor (VEGF) is used as an effector chain, and KDR (2), which is one of VEGF receptors, is used as a trigger chain. Type receptor) DNA was used. Table 5 shows the sequences of the prepared oligonucleotides. The underline in each sequence means a single strand part of the TWJ structure or a complementary strand of the single strand part.
図７は、一塩基置換の位置が異なるｍＲＮＡ相当配列が、一塩基置換認識能に及ぼす影響を評価した結果を示す写真である。まず、表５に示すようにｍＲＮＡ相当配列の長さｎ＝８（ｎは、トリガー鎖１のｔ１部位に結合するｍＲＮＡの部位）であり、塩基置換の位置が異なるｍＲＮＡ相当配列とＴＷＪとを１μＭずつ混合し、３０分後Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥによって分析した。結果を、図７に示す。図７中、ｍａｔｃｈは、トリガー鎖１のｔ１部位と相補的に結合するｍＲＮＡ相当配列を、１〜８は、表５に示す一塩基置換体を、２'、４'は、２、４の一塩基置換体と同一の位置で異なるリボ核酸を導入した一塩基置換体を示す。 FIG. 7 is a photograph showing the results of evaluating the influence of mRNA-corresponding sequences having different positions for single base substitution on the ability to recognize single base substitution. First, as shown in Table 5, the length of the mRNA equivalent sequence is n = 8 (where n is the portion of the mRNA that binds to the t1 portion of the trigger chain 1), and the mRNA equivalent sequence and TWJ with different base substitution positions are 1 μM each was mixed and analyzed by Native-PAGE after 30 minutes. The results are shown in FIG. In FIG. 7, “match” is a sequence corresponding to mRNA that complementarily binds to the t1 site of the trigger strand 1, 1 to 8 are single-base substitutes shown in Table 5, 2 ′, 4 ′ are 2, 4 A single base substitution product in which a different ribonucleic acid is introduced at the same position as the single base substitution product is shown.
図７から、ｎ＝８のときは、一塩基置換が３の位置の置換体は、ＴＷＪ構造体が崩壊していないことがわかる。一塩基置換が１、２の位置の置換体は、ＴＷＪ構造体が残存しているが、ＴＷＪ構造体がほぼ崩壊していることがわかる。このことから、一塩基置換の位置にもよるが、ＴＷＪ構造体を用いれば、一塩基置換認識能があることがわかった。 From FIG. 7, it can be seen that when n = 8, the TWJ structure is not collapsed in the substitution product at the position where the single base substitution is 3. It can be seen that the TWJ structure remains in the substitution products at positions 1 and 2 of the single base substitution, but the TWJ structure is almost collapsed. From this, it was found that, although it depends on the position of the single base substitution, the single base substitution recognition ability can be obtained by using the TWJ structure.
表５に示すＴＷＪ構造体のトリガー鎖において、表６に示すようにｍＲＮＡ相当配列の位置３に相補的なトリガー鎖を作製して、上記と同様の実験を行った。配列中のアンダーラインは、ＴＷＪ構造体の１本鎖の部分を意味する。
図８は、一塩基置換の位置が３であるｍＲＮＡ相当配列とこれに相補的な配列を有するトリガー鎖が、ＴＥＪ構造体崩壊に及ぼす影響を評価した結果を示す写真である。図８中、Ｍレーンは標準物質を、レーン１は、ＴＷＪ構造体を、レーン２は、ＴＷＪ構造体とｍＲＮＡ相当配列とを混合して反応させたものを示す。図８から、ＴＷＪ構造体が崩壊していることがわかる。すなわち、ＴＷＪ構造体を用いれば、一塩基置換認識能があることがわかった。 FIG. 8 is a photograph showing the results of evaluating the influence of a trigger strand having an mRNA-corresponding sequence having a single base substitution position of 3 and a sequence complementary thereto on TEJ structure collapse. In FIG. 8, M lane indicates a standard substance, lane 1 indicates a TWJ structure, and lane 2 indicates a mixture of a TWJ structure and an mRNA-corresponding sequence that are reacted. It can be seen from FIG. 8 that the TWJ structure has collapsed. That is, it was found that the use of the TWJ structure has a single base substitution recognition ability.
（実施例６）
［細胞選択性の評価］
（カスパーゼ８またはカスパーゼ３のｓｉＲＮＡによるノックダウンの確認）
Ｆａｓリガンドは受容体Ｆａｓに結合すると細胞にアポトーシスを誘導するサイトカイン=デス因子である。具体的には、Ｆａｓリガンドは細胞表層の受容体Ｆａｓに結合して、カスパーゼ８を活性化する。次にカスパーゼ８はカスパーゼ３を活性化し、アポトーシスを引き起こす。このとき、カスパーゼ８または３が細胞内になければ、この細胞はＦａｓリガンドによるアポトーシスに耐性となる。(Example 6)
[Evaluation of cell selectivity]
(Confirmation of knockdown of caspase 8 or caspase 3 by siRNA)
Fas ligand is a cytokine = death factor that induces apoptosis in cells upon binding to the receptor Fas. Specifically, Fas ligand binds to cell surface receptor Fas and activates caspase-8. Caspase 8 then activates caspase 3 and causes apoptosis. At this time, if caspase 8 or 3 is not present in the cell, this cell becomes resistant to apoptosis by Fas ligand.
ヒト培養細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ））非発現株）およびそれにＧＦＰを恒常発現させた株（ＧＦＰ発現株）を用い、表７に示すカスパーゼ8および３に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣａｓｐ８およびｓｉＣａｓｐ３、各３３ ｍｉｃｒｏＭ）、コントロールとしてＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ、３３ ｍｉｃｒｏＭ）、トランスフェクション剤だけ（Ｌｉｐｏ）、無添加（ｎｏｎｅ）をそれぞれの細胞株にトランスフェクションした。２日後、Ｆａｓリガンドを（２５ ｎｇ／ｍｌ）を添加した。１日後、細胞の生死をＷＳＴで常法によりアッセイした。
図９は、ＧＦＰ発現株とＧＦＰ非発現株において、カスパーゼに対するｓｉＲＮＡの効果を評価したグラフである。図中、横軸において、ＦａｓＬ＋はＦａｓリガンドを添加したもの、ＦａｓＬ−はＦａｓリガンドを添加しなかったものを示し、縦軸は細胞のＷＳＴ活性を示す。図９から、ＧＦＰ発現、非発現株にかかわらず、Ｆａｓリガンドを入れた細胞のＷＳＴ活性は入れない場合の半分以下であった。一方、カスパーゼに対するｓｉＲＮＡを入れた場合もＧＦＰ発現、非発現株にかかわらず、Ｆａｓリガンドを入れない場合とほぼ同等であった。すなわち、カスパーゼに対するｓｉＲＮＡは細胞内でカスパーゼのｍＲＮＡをノックダウンしていることが示唆された。 FIG. 9 is a graph evaluating the effect of siRNA on caspase in a GFP-expressing strain and a GFP non-expressing strain. In the figure, on the horizontal axis, FasL + represents that to which Fas ligand was added, FasL− represents that to which Fas ligand was not added, and the vertical axis represents WST activity of the cells. From FIG. 9, the WST activity of the cells containing Fas ligand was less than half that of the cells not containing GFP expression and non-expressing strains. On the other hand, the case where siRNA against caspase was added was almost the same as the case where Fas ligand was not added regardless of the GFP expression or non-expression strain. That is, it was suggested that siRNA for caspase knocks down caspase mRNA in cells.
（ＴＷＪ構造体の設計）
ＧＦＰのｍＲＮＡを認識する部位を有するトリガー鎖と、カスパーゼ８または３に対するｓｉＲＮＡを放出するエフェクター鎖（下記表８に示す「ガイド鎖」）を有するＴＷＪ構造体を設計した。このＴＷＪ構造体を用いると、細胞がＧＦＰを発現していると、ＧＦＰ ｍＲＮＡによって、ＴＷＪ構造体が崩壊し、カスパーゼ８または３に対するｓｉＲＮＡを放出し、カスパーゼ８または３をノックダウンする。これにより、Ｆａｓリガンドによるアポトーシス誘導に耐性となる。一方、ＧＦＰ非発現細胞ではＧＦＰ ｍＲＮＡが存在しないので、ＴＷＪ構造体は崩壊しない。すなわち、ｓｉＲＮＡは放出せず、アポトーシスに感受性である。このため、Ｆａｓリガンドによって細胞死が起こる。(Design of TWJ structure)
A TWJ structure having a trigger chain having a site recognizing GFP mRNA and an effector chain that releases siRNA for caspase 8 or 3 (“guide chain” shown in Table 8 below) was designed. When this TWJ structure is used and the cell expresses GFP, the TWJ structure is disrupted by GFP mRNA, siRNA against caspase 8 or 3 is released, and caspase 8 or 3 is knocked down. This makes it resistant to apoptosis induction by Fas ligand. On the other hand, since GFP mRNA does not exist in GFP non-expressing cells, the TWJ structure does not collapse. That is, siRNA is not released and is sensitive to apoptosis. For this reason, cell death occurs by Fas ligand.
具体的には、表８に示す配列を有するＴＷＪ構造体を作製した。トリガー鎖は、ＧＦＰ ｍＲＮＡの２１９−２４０または５４３−５６５の位置と相補的になるようにしてあり、これらの部位に反応して崩壊する。これらの組み合わせで、計４種類のＴＷＪ構造体を設計した。表中、ＴＷＪｃａｓｐ８ ２１９とは、図１０に示すように、ＧＦＰ ｍＲＮＡ２１９−に反応し、カスパーゼ８のｓｉＲＮＡを放出するＴＷＪ構造体を意味する。
（ＴＷＪ構造体による細胞選択的生存）
ヒト培養細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（ＧＦＰ非発現株）およびそれにＧＦＰを恒常発現させた株（ＧＦＰ発現株）を用い、４種類のＴＷＪ構造体＋パッセンジャー鎖（各３３ ｍｉｃｒｏＭ）、コントロールとしてトランスフェクション剤だけ（Ｌｉｐｏ）、無添加（ｎｏｎｅ）をそれぞれの細胞株にトランスフェクションした。２日後、ＦａｓＬｉｇａｎｄを（２５ ｎｇ／ｍｌ）を添加した。１日後、細胞の生死をＷＳＴで常法によりアッセイした。結果を図１１に示す。(Cell selective survival by TWJ structure)
Using human cultured cell line HEK293T (GFP non-expressing strain) and a strain in which GFP is constitutively expressed (GFP expressing strain), four types of TWJ structures + passenger chains (each 33 microM), and only a transfection agent as a control ( (Lipo) and no (none) were transfected into each cell line. Two days later, FasLigand (25 ng / ml) was added. One day later, cell viability was assayed by WST in a conventional manner. The results are shown in FIG.
図１１は、ＧＦＰ発現株とＧＦＰ非発現株において、カスパーゼに対するｓｉＲＮＡを放出するＴＷＪ構造体の効果を評価したグラフである。図中、横軸において、ＦａｓＬ＋はＦａｓリガンドを添加したもの、ＦａｓＬ−はＦａｓリガンドを添加しなかったものを示し、縦軸は細胞のＷＳＴ活性を示す。図１１から、ＧＦＰ非発現株では、ＴＷＪ構造体の有無にかかわらず、Ｆａｓリガンドを添加するとアポトーシスが誘導し、ＷＳＴ活性は半分程度になった。一方、ＧＦＰ発現株ではＴＷＪ構造体を入れないコントロールでは同様にアポトーシスが誘導された。しかし、ＴＷＪ構造体添加後、Ｆａｓリガンドを入れたものは（ＴＷＪ ｃａｓｐ３ ２１９を除き）細胞が死んでおらず、アポトーシスしていない、すなわち選択的に生存していることがわかった。 FIG. 11 is a graph showing an evaluation of the effect of a TWJ structure that releases siRNA against caspase in a GFP-expressing strain and a GFP non-expressing strain. In the figure, on the horizontal axis, FasL + represents that to which Fas ligand was added, FasL− represents that to which Fas ligand was not added, and the vertical axis represents WST activity of the cells. From FIG. 11, in the GFP non-expressing strain, apoptosis was induced by adding Fas ligand regardless of the presence or absence of the TWJ structure, and WST activity was reduced to about half. On the other hand, in the GFP-expressing strain, apoptosis was similarly induced in the control without the TWJ structure. However, after addition of the TWJ structure, it was found that the cells containing Fas ligand (except for TWJ casp3 219) were not dead and not apoptotic, that is, selectively survived.
以上より、本発明のＴＷＪ構造体を用いると、ＧＦＰ ｍＲＮＡがあると生存し、ないとアポトーシスが誘導され死に至るという細胞選択性を有することが示された。 From the above, it was shown that the use of the TWJ structure of the present invention has cell selectivity such that it survives when GFP mRNA is present, and otherwise induces apoptosis and leads to death.
１ トリガー鎖
２ エフェクター鎖
２’ エフェクター鎖に相補的なオリゴヌクレオチド
３ サポート鎖
４ トリガー鎖に相補的に結合する部位を有するポリヌクレオチドDESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Trigger chain | strand 2 Effector chain | strand 2 'Oligonucleotide complementary to an effector chain | strand 3 Support chain | strand 4 Polynucleotide which has a site | part couple | bonded complementarily with a trigger chain | strand
Claims (11)
前記３本のオリゴヌクレオチドは、それぞれの鎖が、他の２本の鎖と結合して三方向ジョイント構造を形成し、
前記トリガー鎖は、前記サポート鎖の結合している部位の外側に他のポリヌクレオチドの配列を認識する部位を有する、オリゴヌクレオチド構造体。 Consists of three oligonucleotides, a trigger strand, an effector strand, and a support strand,
In the three oligonucleotides, each strand is combined with the other two strands to form a three-way joint structure,
The oligonucleotide structure, wherein the trigger strand has a site for recognizing the sequence of another polynucleotide outside the site to which the support strand is bonded.
他のポリヌクレオチドが存在する細胞、あるいは組織においてのみ、前記三方向ジョイント構造の崩壊を生じさせ、１本鎖エフェクター鎖を得る、
遺伝子発現抑制方法。 Consists of three oligonucleotides, a trigger strand, an effector strand, and a support strand. Each of the three oligonucleotides binds to the other two strands to form a three-way joint structure. The trigger strand has a site for recognizing the sequence of another polynucleotide outside the site to which the support strand is bound, and introduces an oligonucleotide structure into a cell or tissue other than an individual ,
Only in cells or tissues where other polynucleotides are present, the three-way joint structure is disrupted to obtain a single-stranded effector chain.
Gene expression suppression method.
前記三方向ジョイント構造の崩壊を生じた細胞、あるいは組織内で、生じた１本鎖エフェクター鎖とオリゴヌクレオチドとが二本鎖を形成する、請求項７または８に記載の遺伝子発現抑制方法。 Introducing an oligonucleotide that binds complementarily to the effector strand of the oligonucleotide structure together with the oligonucleotide structure,
The gene expression suppression method according to claim 7 or 8, wherein the generated single-stranded effector chain and the oligonucleotide form a double strand in a cell or tissue in which the three-way joint structure has collapsed.
前記トリガー鎖が認識する他のポリヌクレオチドが二種類存在する細胞、あるいは組織においてのみ、前記二種類のオリゴヌクレオチド構造体の三方向ジョイント構造を崩壊させ、
生じたエフェクター鎖同士が二本鎖を形成する、請求項９に記載の遺伝子発現抑制方法。 Two kinds of oligonucleotide structures having the same base sequence of the effector chain and different polynucleotides recognized by the trigger chain are introduced into cells or tissues other than individuals ,
Disrupting the three-way joint structure of the two types of oligonucleotide structures only in cells or tissues in which there are two types of other polynucleotides recognized by the trigger strand,
The gene expression suppression method according to claim 9, wherein the effector chains formed form a double strand.
前記オリゴヌクレオチド構造体の崩壊の有無により、他のポリヌクレオチドの一塩基置換体を検出する、一塩基置換体の検出方法。 Consists of three oligonucleotides, a trigger strand, an effector strand, and a support strand. Each of the three oligonucleotides binds to the other two strands to form a three-way joint structure. And the trigger strand has an oligonucleotide structure having a site for recognizing the sequence of another polynucleotide outside the site to which the support strand is bound, and a single nucleotide of another polynucleotide or another polynucleotide. Mixed with the substitute,
A method for detecting a single base substitution product, wherein a single base substitution product of another polynucleotide is detected based on whether or not the oligonucleotide structure is collapsed.
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