JP5589374B2 - Microscope equipment - Google Patents
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Description
本発明は、試料に照射光を照射し、前記照射光に基づく前記試料からの光を検出する顕微鏡装置に関する。
The present invention relates to a microscope apparatus that irradiates a sample with irradiation light and detects light from the sample based on the irradiation light.
従来のレーザ顕微鏡よりも高い解像度を得るための方法として、一つの像を得る為に複数のレーザビームを用いた超解像レーザ走査型顕微鏡が知られている。非特許文献1には、超解像レーザ走査型顕微鏡の原理が開示されている。非特許文献1に示されたものは、STED励起蛍光顕微鏡と呼ばれるもので、蛍光発生を抑制するようなエネルギーを持ったビームを、励起レーザスポットの両側に近接させて照射することにより、実質的に蛍光の発生する領域を小さくし、所謂回折限界以下の小さな領域からのみ蛍光を発生させて、超解像を得るというものである。また、米国特許第5,731,588号明細書には、STED蛍光顕微鏡に関するものとして、蛍光を発生させる励起用のレーザとその集光位置の近傍に蛍光現象を抑制するための別のレーザビームを照射/集光させることより、実質的に蛍光を発する領域を小さくし超解像を行うものが開示されている。
As a method for obtaining a resolution higher than that of a conventional laser microscope, a super-resolution laser scanning microscope using a plurality of laser beams to obtain one image is known. Non-Patent
しかしながら上記の顕微鏡では、通常の励起用のレーザの他に蛍光発生を抑制するような別の波長のレーザが必要であるため、装置構成が大掛かりになる上に、これらの励起用レーザと蛍光発生を抑制するレーザの組み合わせは、その波長が限定されており、様々な蛍光色素に対応するものではなく、使い勝手が悪いという問題がある。 However, since the above-mentioned microscope requires a laser with a different wavelength that suppresses the generation of fluorescence in addition to the normal excitation laser, the apparatus configuration becomes large, and these excitation laser and fluorescence generation are also increased. The combination of lasers that suppresses the light has a limited wavelength, does not correspond to various fluorescent dyes, and has a problem that it is not easy to use.
本発明の目的は、簡易な構成により超解像観察を行うことができる顕微鏡装置を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a microscope apparatus that can perform super-resolution observation with a simple configuration.
本発明の顕微鏡装置は、試料に照射光を照射し、前記照射光に基づく前記試料からの光を検出する顕微鏡装置において、可干渉性を有する照射光を少なくとも2つ以上に分離し、分離された前記照射光の少なくとも一の照射光に変調を加える変調手段と、前記分離された照射光をそれぞれ対物レンズに導くとともに、その焦点付近における前記照射光により生ずる干渉光を生じさせる照射光学系と、前記焦点付近から反射する光または前記焦点付近から生じる光のうち、前記干渉光に対応する周波数成分の光を抽出するとともに、この抽出された光を検出する検出手段と、前記検出手段により検出された光に基づいて画像データを作成する画像作成手段と、を備え、分離された前記照射光の個々の前記焦点の位置が互いに異なっていることを特徴とする。
この顕微鏡装置によれば、可干渉性を有する照明光を分離し、分離された照明光の少なくとも一の照明光に変調を加え、焦点付近における照明光による干渉光を検出するので、簡易な構成により超解像観察を行うことができる。
Microscope apparatus of the present invention irradiates the illumination light to a sample, the microscope apparatus for detecting light from the sample based on the irradiation light, separates the illumination light having coherence in at least two, isolated and modulation means for applying at least one modulated irradiation light of the irradiation light, the separated illumination light guides to the objective lens, respectively, an irradiation optical system to generate a more generated interference light to the illumination light in the vicinity of the focal point And extracting light having a frequency component corresponding to the interference light from light reflected from the vicinity of the focus or light generated from the vicinity of the focus, and detecting means for detecting the extracted light , and the detection means comprising an image forming means for forming an image data based on the detected light, and that the position of each of the focus of separated the irradiation light are different from each other And butterflies.
According to this microscope apparatus, since coherent illumination light is separated, modulation is applied to at least one of the separated illumination lights, and interference light due to illumination light in the vicinity of the focal point is detected. Thus, super-resolution observation can be performed.
分離された前記照射光の焦点は、それぞれの前記照射光が互いに重なる領域を有しながら、光軸に対し直交する方向にずれていてもよい。
The focal point of the separated irradiation light may be shifted in a direction orthogonal to the optical axis while having a region where the irradiation light overlaps each other.
分離された前記照射光の焦点は、それぞれの前記照射光が互いに重なる領域を有しながら、光軸の方向にずれていてもよい。
The focal points of the separated irradiation lights may be shifted in the direction of the optical axis while having regions where the irradiation lights overlap each other.
可干渉性を有する前記照射光は2つに分離され、前記変調手段はその一方に一定の周波数で変化する位相変調または周波数変調を加えることで前記焦点付近において起こる干渉光に変調周波数で変化する強度変調を起こさせ、前記検出手段は前記変調周波数成分の光を抽出してもよい。
The irradiation light having coherence is separated into two, and the modulation means applies phase modulation or frequency modulation that changes at a constant frequency to one of them, and changes to interference light that occurs near the focal point at the modulation frequency. to cause intensity modulation, the detecting means may extract light before Symbol modulation frequency component.
前記変調手段は、分離された前記照射光の少なくとも2つ以上に互いに異なる周波数の位相変調、強度変調、周波数変調のいずれかを加えることで、前記焦点近傍において起こる干渉光に少なくとも2つ以上の変調周波数の和もしくは差の周波数で変化する強度変調を起こさせ、前記検出手段は前記少なくとも2つ以上の変調周波数の和もしくは差の周波数成分の光を抽出してもよい。
The modulating means is a phase modulation of at least two or more different frequencies separated the irradiation light intensity modulation, the addition of any of frequency modulation, two even without least interference light occurring at the focal point Intensity modulation that changes at the sum or difference frequency of the above modulation frequencies may be caused, and the detection means may extract light having a frequency component that is the sum or difference of the at least two modulation frequencies.
前記変調手段により分離、変調された前記照明光の光路が、前記対物レンズへの入射位置において互いに重ならないように構成されていてもよい。 The optical paths of the illumination light separated and modulated by the modulation means may be configured not to overlap each other at the incident position on the objective lens.
前記変調手段により分離、変調された前記照明光の前記光路が、前記対物レンズへの入射面において、互いに重ならない放射状に区画された領域に分離されていてもよい。 The optical path of the illumination light separated and modulated by the modulation means may be separated into radially partitioned areas that do not overlap each other on the entrance surface to the objective lens.
本発明の顕微鏡装置によれば、可干渉性を有する照明光を分離し、分離された照明光の少なくとも一の照明光に変調を加え、焦点付近における照明光による干渉光を検出するので、簡易な構成により超解像観察を行うことができる。 According to the microscope apparatus of the present invention, it is easy to separate coherent illumination light, modulate at least one of the separated illumination lights, and detect the interference light due to the illumination light near the focal point. With this configuration, super-resolution observation can be performed.
次に、本発明による顕微鏡装置の実施形態について説明する。 Next, an embodiment of a microscope apparatus according to the present invention will be described.
以下、図1〜図6を参照して実施例1の顕微鏡装置について説明する。 Hereinafter, the microscope apparatus according to the first embodiment will be described with reference to FIGS.
図1は、実施例1の顕微鏡装置の構成を示すブロック図、図2は光路分割装置の構成を示すブロック図である。 FIG. 1 is a block diagram illustrating the configuration of the microscope apparatus according to the first embodiment, and FIG. 2 is a block diagram illustrating the configuration of the optical path dividing apparatus.
図1に示すように、本実施例の顕微鏡装置1は、可視域の波長を有するコリメート光を発するレーザ光源装置2を有し、その光軸上には光路分割装置3が配置されている。
As shown in FIG. 1, the
図2に示すように、光分割装置3には、レーザ光源装置2からのレーザ光を受けるビームスプリッタ30が配置されており、そのビームスプリッタ30による反射方向にはミラー31が配置されている。図2においてビームスプリッタ30により反射された光の光路を破線で、その他の光路を実線で、それぞれ示している。
As shown in FIG. 2, a
ミラー31は微動傾きステージ32に取り付けられ、その設置角度が調整可能とされている。
The
図3は微動傾きステージ32の構成を示す断面図である。
FIG. 3 is a cross-sectional view showing the configuration of the fine
ミラー31は、図3に示すような微動傾きステージ32の可動部32aに固定されている。図3のように微動傾きステージ32は、固定部32bが可動部32aを弾性支持し、内部にある2本もしくは3本の圧電素子32cによって数mrad程度だけ可動部32aが2方向にその傾きを変えられるように構成されている。さらに、ビームスプリッタ30を通過する光の光路上にはAOM(音響光学素子)33が、ミラー31により折り返された光の光路上にはAOM34が、それぞれ配置されている。
The
ここで、AOM33は、周波数f1=10.1MHzで駆動され、AOM34は、周波数f2=10MHzで駆動されており、それぞれのAOMを通過する光に強度変調(振幅変調)を加えるようになっている。AOM33により変調されたビーム光、およびAOM34により変調されミラー35で折り返されたビーム光は、ビームスプリッタ36で合成され、進行方向を揃えられる。
Here, the AOM 33 is driven at a frequency f1 = 10.1 MHz, and the AOM 34 is driven at a frequency f2 = 10 MHz, and intensity modulation (amplitude modulation) is applied to light passing through each AOM. . The beam light modulated by the AOM 33 and the beam light modulated by the AOM 34 and turned back by the
図1に示すように、光路分割装置3の先には、レーザの向きを変えるためのダイクロイックミラー4とレーザ光を走査するための走査光学ユニット5とが配置されている。ダイクロイックミラー4はレーザ光の波長を反射し、レーザ光による蛍光を透過させる特性を有する。走査光学ユニット5は、一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー5aと可変ミラー5aの軸にほぼ直交する一本の軸の周りに回転可能な可変ミラー5bを備えている。
As shown in FIG. 1, a dichroic mirror 4 for changing the direction of the laser and a scanning optical unit 5 for scanning the laser light are arranged at the tip of the optical path dividing device 3. The dichroic mirror 4 has a characteristic of reflecting the wavelength of the laser beam and transmitting the fluorescence of the laser beam. The scanning optical unit 5 includes a
また光を収束させる瞳リレーレンズ6、レーザビームを偏向するミラー7、結像レンズ8および対物レンズ9が光路に沿って順次、配置されている。
A pupil relay lens 6 for converging light, a mirror 7 for deflecting a laser beam, an
また、対物レンズ9の先には、試料10を載せるステージ11が設けられる。
A stage 11 on which the
一方、試料10から発生し、ダイクロイックミラー4を透過した蛍光の光路には、蛍光を選択的に透過する蛍光フィルタ13と、蛍光ビームを収束させるレンズ14と、ピンホール15と、ピンホール15を通過した光を検出する検出器16とが設けられる。検出器16からの信号はバンドパスフィルタ19を介してコントローラ17に与えられる。
On the other hand, in the fluorescence optical path generated from the
さらにコントローラ17には表示モニタ18が接続される。コントローラ17は光学走査ユニット4の走査制御や、光路分割装置3の制御を実行する。また、表示モニタ18には検出器16を介して取得される観察像、その他各種の情報が表示される。
Further, a
次に、顕微鏡装置1の動作について説明する。
Next, the operation of the
試料10は、レーザ光源2からの光によって励起される蛍光指示薬が導入されて、ステージ11上に配置されている。
The
レーザ光源2からのコリメートされたレーザ光は光路分割装置3に導かれる。光路分割装置3内部で、レーザ光はビームスプリッタ30を直進する光はAOM33を通過することによって、周波数f1=10.1MHzで変調される。ビームスプリッタ30で反射されたレーザ光は、ミラー31で反射されて、AOM34によって、周波数f2=10MHzで変調される。AOM34を通った光はミラー35によって反射される。これら2つのレーザ光の一部はビームスプリッタ36によってその進行方向がほぼ同じになるように構成されている。
The collimated laser beam from the
これらのレーザ光はダイクロイックミラー4によって光走査ユニット5へと導かれ、光走査ユニット5によって任意の方向に走査される。レーザ光はさらに瞳リレーレンズ6、反射ミラー7、結像レンズ8を通過し、対物レンズ9に入射される。対物レンズ9によってこのレーザ光は試料10の近傍に収束される。
These laser beams are guided to the optical scanning unit 5 by the dichroic mirror 4 and scanned by the optical scanning unit 5 in an arbitrary direction. The laser light further passes through the pupil relay lens 6, the reflection mirror 7, and the
対物レンズ9の瞳は瞳リレーレンズ6によって、光走査ユニット5の位置にリレーされるので、光走査ユニット5で走査される光は、対物レンズ9の瞳位置で光を走査していることと同様になり、これによって、対物レンズ9による焦点は焦点面上を走査される。また、微動傾きステージ32を駆動することによって光分割装置3で分けられた光の一方の向きを微小移動させることによって、これらの2つの光の焦点位置が微小にずれるように構成されている。
Since the pupil of the objective lens 9 is relayed to the position of the optical scanning unit 5 by the pupil relay lens 6, the light scanned by the optical scanning unit 5 scans the light at the pupil position of the objective lens 9. Thus, the focal point by the objective lens 9 is scanned on the focal plane. Further, by driving the fine
例えば、レーザ光の波長を40nm、対物レンズとして倍率100倍で焦点距離2mm、NA1.4のものを用いるとすると焦点のサイズは約0.17μmとなる。 For example, if the wavelength of the laser beam is 40 nm, the objective lens is 100 times magnification, the focal length is 2 mm, and the NA is 1.4, the focal spot size is about 0.17 μm.
ここで微動傾きステージ32によって2つの光の向きが50μrad異なるように調節すると、それぞれの焦点位置は約0.1μmずれる。図4は、この時の焦点位置近傍の光ビームの状態を示す断面図である。図4に示すように、2つの光ビーム41,42は焦点面43に向かって収束しているが、両者の焦点位置がずれているため、光ビーム41,42は図4において互いに左右方向(光軸と直交する方向)にシフトした位置に描かれる。なお、図4においてZ方向は対物レンズ9の光軸方向を、X方向は当該光軸方向と直交する方向を示す。
Here, if the fine
図5は光ビーム41,42の強度分布を示す図である。図5において横軸は焦点面43におけるX方向(図4)に対応し、縦軸は各ビームの光ビーム41,42の強度を示す。
FIG. 5 is a diagram showing the intensity distribution of the light beams 41 and 42. In FIG. 5, the horizontal axis corresponds to the X direction (FIG. 4) on the
図6は2つの光の主たる交差領域の位相を合わせた場合の光の強度分布を示す図である。図6の横軸は図5と同様、焦点面43におけるX方向(図4)に対応する。
FIG. 6 is a diagram showing the light intensity distribution when the phases of the main intersecting regions of the two lights are matched. The horizontal axis in FIG. 6 corresponds to the X direction (FIG. 4) on the
2つの光の光路長を調節することにより、2つの光の主たる交差領域の位相を合わせると、2つの光を合わせた強度分布は図6の曲線44として示される。また、このとき2つの光の干渉成分は曲線45のようになる。この2つの光の干渉成分は、2つの光の変調周波数の差周波数であるf1−f2での変調成分を含んでいる。
When the phase of the main intersection region of the two lights is matched by adjusting the optical path length of the two lights, the intensity distribution of the two lights is shown as a
このようなレーザ光によって試料10の蛍光指示薬が励起されて、蛍光が発する。この蛍光は対物レンズ9で捕らえられてレーザ光とは逆向きに進み、結像レンズ8、反射ミラー7、瞳リレーレンズ6、光走査ユニット5を介してダイクロイックミラー4へ導かれる。この蛍光はダイクロイックミラー4を透過して、蛍光フィルタ13によって特定の波長成分が選択的に透過されて、レンズ14で集光され、ピンホール15を通過した光が検出器16で検出される。
The fluorescence indicator of the
蛍光信号の中の、干渉光によって励起された成分はレーザ光と同様にf1−f2=100kHzの変調成分を有し、この100kHzの成分を抽出することによって、干渉光による蛍光を取り出すことができる。 The component excited by the interference light in the fluorescence signal has a modulation component of f1-f2 = 100 kHz as in the case of the laser light. By extracting this 100 kHz component, the fluorescence due to the interference light can be extracted. .
ここで、ピンホール15は干渉光による蛍光が最大になるように図6の46に対応する信号のみが通過するように調節されている。検出器16で検出された光は、バンドパスフィルタ19に送られ、ここで差の周波数100kHz近傍の周波数のみが抽出されることによって、図6の曲線45で示す強度分布を有する干渉光で励起された蛍光に相当する信号が得られる。
Here, the
バンドパスフィルタ19で抽出された信号はコントローラ17へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応させて画像データを作成し、表示モニタ18上に表示される。また、画像データはコントローラ17の内部のメモリ(不図示)に記憶される。
The signal extracted by the
ここで、曲線45で示される干渉光の焦点面におけるX方向の半値全幅は、それぞれの励起光(光ビーム41、42)の半値全幅よりも40%程度小さくなる。照明する範囲が小さくなるので、この干渉光による蛍光をピンホールを用いた検出光学系で検出した場合、通常の光学顕微鏡よりもX方向の分解能が50%程度改善される。
Here, the full width at half maximum in the X direction on the focal plane of the interference light indicated by the
また、図示しないアクチュエータによって、対物レンズ9もしくは試料10を対物レンズ9の光軸方向に移動させて、別の深さの画像を観察することもできる。さらに、光走査ユニット5とアクチュエータを連動させて、任意の断面画像を観察したり、3次元情報を観察したりすることが可能である。さらに、干渉光のPSF(点像分布関数)を求めて、逆演算を行い、より高分解能な画像を得ることもできる。
In addition, the objective lens 9 or the
このように、本実施形態の顕微鏡装置によれば、単一のレーザ光源装置によって超解像観察を行うことができるので、装置の複雑化を回避できる。また、励起用レーザとの波長を自由に選択できるので、様々な蛍光色素に対応が可能である。 As described above, according to the microscope apparatus of the present embodiment, super-resolution observation can be performed with a single laser light source apparatus, and thus the complexity of the apparatus can be avoided. In addition, since the wavelength of the excitation laser can be freely selected, various fluorescent dyes can be supported.
上記実施例では、干渉光が含む周波数の差であるf1−f2成分を抽出するようにしたが、これに限らず、周波数の和であるf1+f2の成分を抽出しても同様の効果が得られる。 In the above embodiment, the f1-f2 component that is the difference in frequency included in the interference light is extracted. However, the present invention is not limited to this, and the same effect can be obtained by extracting the component of f1 + f2 that is the sum of the frequencies. .
また、光路分割装置3内部の2つのAOM33、34による変調に代えて、2つのEOM(電気光学変調素子)によって位相変調もしくは強度変調を加えても、同様の効果が得られる。また、他の方式で強度変調を加えても良い。 Further, the same effect can be obtained by applying phase modulation or intensity modulation by two EOMs (electro-optic modulation elements) instead of the modulation by the two AOMs 33 and 34 in the optical path dividing device 3. Further, intensity modulation may be added by other methods.
さらに、AOM33、34を周波数シフタとして使用しても構わない。この場合、互いに異なる一定周波数で駆動されるAOMに光を入射し、周波数変調の加わった回折光を用いても同様の効果が得られる。
Further, the
また、分割された光路のいずれか一方のみに、AOMもしくはEOMを挿入して、この光路の光に周波数変調もしくは位相変調を加えてもよい。この場合、干渉成分は変調周波数による成分を有するので、この変調周波数成分を抽出しても同様の効果が得られる。 Further, AOM or EOM may be inserted into only one of the divided optical paths, and frequency modulation or phase modulation may be added to the light in this optical path. In this case, since the interference component has a component due to the modulation frequency, the same effect can be obtained even if this modulation frequency component is extracted.
その他、変調手段として任意の構成を採用することができる。 In addition, any configuration can be employed as the modulation means.
また、光源としてはレーザに限らず干渉光を生じさせる光であれば任意の光源を使用できる。光源として、極短パルスのレーザ光を用いても同様の効果が得られる。 Further, the light source is not limited to the laser, and any light source can be used as long as it is light that generates interference light. The same effect can be obtained even when an extremely short pulse laser beam is used as the light source.
さらに、2つの光の交差領域で変調される励起光によって生じる多光子蛍光を検出しても良く、また、波長が半分になる2次高調波やさらに高次の高調波を検出しても良い。 Furthermore, multiphoton fluorescence generated by excitation light modulated in the intersection region of two lights may be detected, and second harmonics and higher harmonics whose wavelengths are halved may be detected. .
また、上記実施例では、光を走査する方法として可変ミラーを示したが、走査方法はこれに限らず焦点と試料が相対運動するものであれば良く、試料をステージで移動させるなどの方法でも良い。 In the above embodiment, the variable mirror is shown as a method for scanning light. However, the scanning method is not limited to this, as long as the focal point and the sample move relative to each other, and the sample can be moved on the stage. good.
またピンホールの開口は任意の大きさや形状のものを選択できる。図6の47に対応するアパーチャと48に対応するアパーチャを切り替えて、それぞれの信号を用いて高分解能信号を算出してもよい。 Further, the pinhole opening can be selected to have an arbitrary size and shape. The aperture corresponding to 47 in FIG. 6 and the aperture corresponding to 48 may be switched, and a high resolution signal may be calculated using each signal.
また、本実施例では蛍光を検出する構成としたが、これに限らず照明光の反射光を検出する構成としても良い。 In the present embodiment, the fluorescence is detected. However, the present invention is not limited to this, and a configuration for detecting reflected light of illumination light may be used.
上記実施例によれば、2光束の光の焦点を微小にずらして干渉させ、この干渉光による蛍光を検出しているので、干渉光の半値全幅が小さくなり、従来の共焦点顕微鏡よりも高い分解能を得ることできる。また、変調手段により干渉光を発生させるので、装置の複雑化を避けつつ、光の波長を自由に設定できる。 According to the above embodiment, since the focal points of the two light beams are slightly shifted and interfered, and the fluorescence due to the interference light is detected, the full width at half maximum of the interference light is reduced, which is higher than that of the conventional confocal microscope. Resolution can be obtained. In addition, since the interference light is generated by the modulation means, the wavelength of the light can be set freely while avoiding the complexity of the apparatus.
以下、図7〜図9を参照して実施例2の顕微鏡装置について説明する。本実施例は、実施例1に対し、ビーム光の個数を増やした構成を示すものである。 Hereinafter, the microscope apparatus according to the second embodiment will be described with reference to FIGS. The present embodiment shows a configuration in which the number of light beams is increased compared to the first embodiment.
図7は実施例1における焦点面での2つの光束の位置関係を示す図である。図7に示すように、対物レンズの光軸をZ軸とすると、実施例1における焦点面では、2つの光の焦点をX方向にずらすことで、X方向に高分解能な画像を得ている。 FIG. 7 is a diagram illustrating a positional relationship between two light beams on the focal plane in the first embodiment. As shown in FIG. 7, when the optical axis of the objective lens is the Z-axis, the high-resolution image is obtained in the X direction by shifting the focal points of the two lights in the X direction on the focal plane in the first embodiment. .
これに対し、図8は焦点面に3つの光の焦点を配置する例を示している。互いにY方向に焦点位置のずれた光を照射することで、X方向のみならずY方向の分解能も向上させることができる。 On the other hand, FIG. 8 shows an example in which three light focal points are arranged on the focal plane. By irradiating light whose focal positions are shifted in the Y direction, the resolution in the Y direction as well as the X direction can be improved.
この場合、光路分割装置によって光路を3分岐し、それぞれの光を異なる周波数で変調を加える。これらの光の焦点が焦点面において図8に示すような位置関係になるように構成し、光検出装置では光ビーム51と光ビーム52の干渉光でX方向の分解能が向上する構成とし、さらに光ビーム51と光ビーム53の干渉光によってY方向の分解能が向上する構成とする。このときX方向とY方向の干渉光の変調周波数が異なる構成にする。
In this case, the optical path is split into three by the optical path splitting device, and each light is modulated with a different frequency. The focal point of these lights is configured to have a positional relationship as shown in FIG. 8 on the focal plane, and the photodetection device is configured to improve the resolution in the X direction by the interference light of the
このような構成で、光を走査して得られた信号から演算を行うことによって、X方向およびY方向共に高い分解能の画像を算出できる。 With such a configuration, an image with high resolution can be calculated in both the X direction and the Y direction by performing an operation from a signal obtained by scanning light.
また、図9に示すように3つの焦点の位置関係を設定してもよい。この場合には、光ビーム51と光ビーム52の干渉成分、光ビーム51と光ビーム53の干渉成分、および光ビーム52と光ビーム53の干渉成分を用いることで、各光ビームのずれ方向の分解能を向上させることができる。この場合もそれぞれの干渉成分が別の変調周波数になる構成とすると、互いの信号を分離することができる。
Further, as shown in FIG. 9, the positional relationship between the three focal points may be set. In this case, the interference component between the
以下、図10〜図12を参照して実施例3の顕微鏡装置について説明する。 Hereinafter, the microscope apparatus according to the third embodiment will be described with reference to FIGS.
本実施例は実施例1の変形例で、Z方向(対物レンズの光軸方向)の分解能を向上させるものである。 The present embodiment is a modification of the first embodiment and improves the resolution in the Z direction (the optical axis direction of the objective lens).
図10は、本実施例の顕微鏡装置で使用される光路分割装置3Aの構成を示すブロック図である。他の構成要素は実施例1と同様とされる。図10において、図2と同一構成要素には同一符合を付し、その説明を省略する。 FIG. 10 is a block diagram showing a configuration of an optical path dividing device 3A used in the microscope apparatus of the present embodiment. Other components are the same as those in the first embodiment. 10, the same components as those in FIG. 2 are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
図10に示すように、光路分割装置3Aでは、ビームスプリッタ30で折り曲げられた光を、微弱な曲率を有する凹面ミラー37で反射させる。本実施例では光の片側にのみ、EOM38を挿入して位相変調を加える。
As shown in FIG. 10, in the optical path splitting device 3A, the light bent by the
実施例1と同じ対物レンズを用いると、Z方向の半値全幅は約0.6μmとなる。凹面ミラーの局率は焦点位置が光軸方向に0.4μm程度ずれるものを用いる。 When the same objective lens as in Example 1 is used, the full width at half maximum in the Z direction is about 0.6 μm. A concave mirror having a focal point whose focal position is shifted by about 0.4 μm in the optical axis direction is used.
図11は2つの光ビームの強度分布を示す図、図12は2つの光を合わせた光および干渉成分の強度分布を示す図である。 FIG. 11 is a diagram showing the intensity distribution of two light beams, and FIG. 12 is a diagram showing the intensity distribution of the light and interference components combined with the two lights.
図11に示すように、このとき2つの光ビーム61,62の強度分布は、そのピークがZ方向(光軸方向)に互いにずれた位置関係となる。
As shown in FIG. 11, at this time, the intensity distributions of the two
また、図12において、曲線63は2つの光を合わせた強度分布を、曲線64は干渉成分の強度分布を、それぞれ示している。干渉成分はEOM38の変調成分を含むので、曲線64で示す干渉光による蛍光も同様の変調成分を含む。実施例1と同様に、この干渉光の半値全幅はそれぞれの光ビーム61,62よりも小さくなるので、この干渉光による蛍光信号を画像化することによってZ方向の分解能が向上した画像を得ることができる。
In FIG. 12, a
以下、図13を参照して実施例4の顕微鏡装置について説明する。実施例4の顕微鏡装置は、蛍光ではなく反射、散乱光を検出するものである。 Hereinafter, the microscope apparatus of Example 4 will be described with reference to FIG. The microscope apparatus according to the fourth embodiment detects reflected and scattered light instead of fluorescence.
図13は、実施例4の顕微鏡装置の構成を示すブロック図である。実施例1と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。 FIG. 13 is a block diagram illustrating a configuration of the microscope apparatus according to the fourth embodiment. The same components as those in the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
本実施例の顕微鏡装置1Aでは、光源としてコリメート光を発する近赤外光のSLD2Aを使用する。また、光路分割装置3は実施例1と同様である。また、実施例1におけるダイクロイックミラー4の代わりに偏光ビームスプリッタ60が用いられ、蛍光フィルタ13の代わりに偏光フィルタ62が用いられる。さらに対物レンズ9の前には、1/4波長板61が挿入されている。
In the
SLD2Aからの光は、直線偏光を有する。この光は光路分割装置3で2つのビームに分けられて、それぞれ変調を加えられた後に、偏光ビームスプリッタ60で反射された後、実施例1と同様の光路を通り、1/4波長板61でそれぞれ円偏光へと変換され、対物レンズ9によって焦点を結ぶ。
The light from
実施例1と同様、集光点付近ではX方向にずれた2つの焦点を形成し、2つの光の干渉領域はそれぞれの光よりも半値全幅が小さくなる。干渉光は差周波数(100kHz)での強度変調を含んでいる。焦点からの反射、散乱光は対物レンズ9で集められて、もう一度1/4波長板61を通過することにより、入射光とは90度偏光方向の異なる偏光となり、照明光の光路を逆方向に戻る。さらに偏光ビームスプリッタ60を透過した後に、偏光フィルタ62でその偏光成分を選択され、さらに、ピンホール15を通過して検出器16で検出される。
Similar to the first embodiment, two focal points shifted in the X direction are formed in the vicinity of the condensing point, and the full width at half maximum of the interference area of the two lights is smaller than that of the respective lights. The interference light includes intensity modulation at the difference frequency (100 kHz). Reflected and scattered light from the focal point is collected by the objective lens 9, and once again passes through the quarter-
光検出器16からの出力信号は、バンドパスフィルタ19に送られ、ここで差の周波数100kHz近傍の周波数のみが抽出される。抽出された信号はコントローラ17へ導かれ、走査制御に同期してデジタル信号に変換され、走査位置と対応させて画像データを作成し、表示モニタ18上に表示される。また、画像データはコントローラ17の内部のメモリ(不図示)に記憶される。
The output signal from the
本実施例の顕微鏡装置1Aによれば、試料を照明する可干渉光を、それぞれ違う周波数で変調を加えて投光し、焦点付近においてそれぞれの光ビームよりも半値全幅の狭い微小な干渉領域を作るように構成し、この干渉領域からの反射、散乱光を検出するようにしたので、通常よりも分解能の高い観察が可能である。本構成は生物用途だけでなく、金属や半導体表面を観察する工業用途でも効果を発揮する。
According to the
以下、図14〜図15を参照して実施例5の顕微鏡装置について説明する。本実施例は、実施例1の顕微鏡装置の光路分割装置内に、一対の遮光フィルタを追加した構成を示すものである。本実施例の構成は、光路分割装置以外の他の構成要素については実施例1と同一である。 Hereinafter, the microscope apparatus according to the fifth embodiment will be described with reference to FIGS. The present embodiment shows a configuration in which a pair of light shielding filters are added to the optical path dividing device of the microscope apparatus of the first embodiment. The configuration of the present embodiment is the same as that of the first embodiment with respect to other components other than the optical path splitting device.
図14は、実施例5の顕微鏡装置に用いられる光路分割装置3Bの構成を示すブロック図、図15は遮光フィルタの遮光パターンを例示する図である。図14において、実施例1の顕微鏡装置と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。 FIG. 14 is a block diagram illustrating a configuration of an optical path splitting device 3B used in the microscope apparatus according to the fifth embodiment, and FIG. 15 illustrates a light shielding pattern of a light shielding filter. In FIG. 14, the same components as those of the microscope apparatus of the first embodiment are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
図14に示すように、光路分割装置3Bには、遮光フィルタ301および遮光フィルタ302が設けられる。図15(a)に示すように、遮光フィルタ301は8つの領域に放射状に分割され、各領域に光を遮断する遮光部301aと、光を通過させる透過部301bとが交互に割当てられている。同様に、遮光フィルタ302は8つの領域に放射状に分割され、各領域に光を遮断する遮光部302aと、光を通過させる透過部302bとが交互に割当てられている。 As shown in FIG. 14, the light path dividing device 3B is provided with a light shielding filter 301 and a light shielding filter 302. As shown in FIG. 15A, the light shielding filter 301 is radially divided into eight regions, and a light shielding portion 301a that blocks light and a transmission portion 301b that transmits light are alternately assigned to each region. . Similarly, the light shielding filter 302 is radially divided into eight regions, and a light shielding unit 302a that blocks light and a transmission unit 302b that transmits light are alternately assigned to each region.
図15(a)に示す遮光フィルタ301および遮光フィルタ302を対比すると判るように、それぞれの遮光フィルタにおける遮光部および透過部は、互いに相補的な位置関係にあり、ビームスプリッタ36を経た2つの光の光路が対物レンズ9に至るまで互いに重ならないという条件を満たしており、これらの光路は、対物レンズ9への入射面について、互いに重なり合わない放射状の領域に分離される。この条件は微動傾きステージ32により駆動されるミラー31の角度に依らず満たされる(図1参照)。
As can be seen by comparing the light shielding filter 301 and the light shielding filter 302 shown in FIG. 15A, the light shielding portion and the transmission portion in each of the light shielding filters have a complementary positional relationship with each other, and the two light beams that have passed through the
このように、本実施例の顕微鏡装置では光路分割装置3B内に一対の遮光フィルタ301,302を設けているため、光路分割装置3Bにおいて分割された光路の重なりが排除され、対物レンズ9での集光により形成される焦点近傍においてのみ2つの光路が重なり合う。したがって、2つの光の干渉が焦点近傍でしか起こらなくなるため、実施例1の顕微鏡装置と比べて、焦点近傍からの信号をより選択的に抽出することが可能となる。さらに、この効果により、例えば生物組織の表面から離れた深い部位を観察する場合にも、焦点近傍の信号を効率的に抽出できるため、より深部まで観察が可能となる。 As described above, since the pair of light shielding filters 301 and 302 are provided in the optical path splitting device 3B in the microscope apparatus of the present embodiment, the overlap of the optical paths split in the optical path splitting device 3B is eliminated, and the objective lens 9 The two optical paths overlap only in the vicinity of the focal point formed by condensing. Accordingly, interference between the two lights occurs only in the vicinity of the focal point, so that it is possible to extract a signal from the vicinity of the focal point more selectively than in the microscope apparatus of the first embodiment. Furthermore, due to this effect, for example, even when observing a deep part away from the surface of a biological tissue, a signal near the focal point can be efficiently extracted, so that a deeper part can be observed.
また、光フィルタ301および遮光フィルタ302における遮光部および透過部の領域を放射状に区分しているため、それぞれの光の焦点の大きさは実施例1の顕微鏡装置とほとんど変わらず、2つの光の交差領域の大きさも、ほぼ同等に維持することができる。 Further, since the regions of the light shielding portion and the transmission portion in the optical filter 301 and the light shielding filter 302 are radially divided, the size of the focal point of each light is almost the same as that of the microscope apparatus of the first embodiment, and the two light beams The size of the intersecting region can be maintained substantially the same.
図15(b)は一対の遮光フィルタの別の遮光パターンを例示する図である。 FIG. 15B is a diagram illustrating another light shielding pattern of the pair of light shielding filters.
図15(b)の例では、遮光フィルタ303は4つの領域に放射状に分割され、各領域に光を遮断する遮光部303aと、光を通過させる透過部303bとが交互に割当てられている。同様に、遮光フィルタ304は4つの領域に放射状に分割され、各領域に光を遮断する遮光部304aと、光を通過させる透過部304bとが交互に割当てられている。また、図15(a)に示す一対の遮光フィルタ301,302と同様、それぞれの遮光フィルタにおける遮光部および透過部は、互いに相補的な位置関係にあり、ビームスプリッタ36を経た2つの光の光路が対物レンズ9に至るまで互いに重ならない。したがって、図15(a)に示す一対の遮光フィルタと同様の機能を発揮する。
In the example of FIG. 15B, the light shielding filter 303 is radially divided into four regions, and a light shielding portion 303a that blocks light and a transmission portion 303b that transmits light are alternately assigned to each region. Similarly, the light blocking filter 304 is radially divided into four regions, and a light blocking portion 304a that blocks light and a light transmitting portion 304b that allows light to pass through are alternately assigned to each region. Further, similarly to the pair of light shielding filters 301 and 302 shown in FIG. 15A, the light shielding portions and the transmission portions in the respective light shielding filters are in a complementary positional relationship, and the optical paths of the two lights that have passed through the
以下、図16を参照して実施例6の顕微鏡装置について説明する。本実施例は、実施例3の顕微鏡装置の光路分割装置(図10)内に、一対の遮光フィルタを追加した構成を示すものである。本実施例の構成は、光路分割装置以外の他の構成要素については実施例3と同一である。 Hereinafter, the microscope apparatus of Example 6 will be described with reference to FIG. The present embodiment shows a configuration in which a pair of light shielding filters are added to the optical path splitting device (FIG. 10) of the microscope apparatus of the third embodiment. The configuration of the present embodiment is the same as that of the third embodiment with respect to other components other than the optical path splitting device.
図16は、実施例6の顕微鏡装置に用いられる光路分割装置3Cの構成を示すブロック図である。図16において、実施例3の顕微鏡装置と同一構成要素には同一符合を付し、その説明は省略する。 FIG. 16 is a block diagram illustrating a configuration of an optical path dividing device 3C used in the microscope apparatus according to the sixth embodiment. In FIG. 16, the same components as those in the microscope apparatus of the third embodiment are denoted by the same reference numerals, and the description thereof is omitted.
図16に示すように、光路分割装置3Cには、図15(b)に示した遮光パターンを有する遮光フィルタ303および遮光フィルタ304が設けられる。実施例5の顕微鏡装置と同様、それぞれの遮光フィルタにおける遮光部および透過部は、互いに相補的な位置関係にあり、ビームスプリッタ36を経た2つの光の光路が対物レンズ9に至るまで互いに重ならないという条件を満たしており、これらの光路は、対物レンズ9への入射面について、互いに重なり合わない放射状の領域に分離される。この条件は、凹面ミラー37(図10参照)の効果によって2つの光の焦点が深さ方向に異なるような集光状態である場合にも満たされる。
As shown in FIG. 16, the light path dividing device 3C is provided with a light shielding filter 303 and a light shielding filter 304 having the light shielding pattern shown in FIG. Similar to the microscope apparatus of the fifth embodiment, the light shielding portions and the transmission portions in the respective light shielding filters have a complementary positional relationship, and the optical paths of the two lights passing through the
このように、本実施例の顕微鏡装置では光路分割装置3C内に一対の遮光フィルタ303,304を設けているため、光路分割装置3Cにおいて分割された光路の重なりが排除され、対物レンズ9での集光により形成される焦点近傍においてのみ2つの光路が重なり合う。したがって、2つの光の干渉が焦点近傍でしか起こらなくなるため、実施例3の顕微鏡装置と比べて、焦点近傍からの信号をより選択的に抽出することが可能となる。さらに、この効果により、例えば生物組織の表面から離れた深い部位を観察する場合にも、焦点近傍の信号を効率的に抽出できるため、より深部まで観察が可能となる。 Thus, in the microscope apparatus of the present embodiment, since the pair of light shielding filters 303 and 304 are provided in the optical path splitting device 3C, the overlap of the optical paths split in the optical path splitting device 3C is eliminated, and the objective lens 9 The two optical paths overlap only in the vicinity of the focal point formed by condensing. Therefore, interference between the two lights occurs only in the vicinity of the focal point, so that a signal from the vicinity of the focal point can be extracted more selectively than in the microscope apparatus of the third embodiment. Furthermore, due to this effect, for example, even when observing a deep part away from the surface of a biological tissue, a signal near the focal point can be efficiently extracted, so that a deeper part can be observed.
また、光フィルタ303および遮光フィルタ304における遮光部および透過部の領域を放射状に区分しているため、それぞれの光の焦点の大きさは実施例3と比べて遮光部分の方向に大きくなるが、2つの光の交差領域の大きさについてはほぼ同等に維持することができる。 In addition, since the regions of the light shielding portion and the transmission portion in the optical filter 303 and the light shielding filter 304 are radially divided, the size of the focal point of each light is larger in the direction of the light shielding portion than in the third embodiment. About the magnitude | size of the intersection area | region of two light, it can maintain substantially equal.
本実施例の顕微鏡装置においても、図15(b)に示す一対の遮光フィルタに替えて、図15(a)に示す遮光パターンを有する一対の遮光フィルタを用いることにより、同等の効果を得ることができる。 In the microscope apparatus of the present embodiment, the same effect can be obtained by using a pair of light shielding filters having the light shielding pattern shown in FIG. 15A instead of the pair of light shielding filters shown in FIG. Can do.
以上説明したように、本発明の顕微鏡装置によれば、可干渉性を有する照明光を分離し、分離された照明光の少なくとも一の照明光に変調を加え、焦点付近における照明光による干渉光を検出するので、簡易な構成により超解像観察を行うことができる。 As described above, according to the microscope apparatus of the present invention, the coherent illumination light is separated, the at least one illumination light of the separated illumination light is modulated, and the interference light due to the illumination light in the vicinity of the focal point. Therefore, super-resolution observation can be performed with a simple configuration.
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、試料に照射光を照射し、前記照射光に基づく前記試料からの光を検出する顕微鏡装置に対し、広く適用することができる。
The scope of application of the present invention is not limited to the above embodiment. The present invention can be widely applied to a microscope apparatus that irradiates a sample with irradiation light and detects light from the sample based on the irradiation light.
3 光路分割装置(変調手段)
3A 光路分割装置(変調手段)
9 対物レンズ
16 検出器(検出手段)
3 Optical path splitting device (modulation means)
3A Optical path splitting device (modulation means)
9
Claims (7)
可干渉性を有する照射光を少なくとも2つ以上に分離し、分離された前記照射光の少なくとも一の照射光に変調を加える変調手段と、
前記分離された照射光をそれぞれ対物レンズに導くとともに、その焦点付近における前記照射光により生ずる干渉光を生じさせる照射光学系と、
前記焦点付近から反射する光または前記焦点付近から生じる光のうち、前記干渉光に対応する周波数成分の光を抽出するとともに、この抽出された光を検出する検出手段と、
前記検出手段により検出された光に基づいて画像データを作成する画像作成手段と、
を備え、
分離された前記照射光の個々の前記焦点の位置が互いに異なっていることを特徴とする顕微鏡装置。 In a microscope apparatus for irradiating a sample with irradiation light and detecting light from the sample based on the irradiation light,
Modulation means for separating the irradiation light having coherence into at least two or more and modulating the at least one irradiation light of the separated irradiation light;
An irradiation optical system for guiding the separated irradiation light to the objective lens and generating interference light generated by the irradiation light in the vicinity of the focal point;
A detection means for extracting light of a frequency component corresponding to the interference light from light reflected from the vicinity of the focus or light generated from the vicinity of the focus, and detecting the extracted light,
Image creating means for creating image data based on the light detected by the detecting means;
With
The microscope apparatus characterized in that the positions of the individual focal points of the separated irradiation light are different from each other.
前記変調手段はその一方に一定の周波数で変化する位相変調または周波数変調を加えることで前記焦点付近において起こる干渉光に変調周波数で変化する強度変調を起こさせ、
前記検出手段は前記変調周波数成分の光を抽出することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の顕微鏡装置。 The irradiation light having coherence is separated into two,
The modulation means applies phase modulation or frequency modulation that changes at a constant frequency to one of them, and causes interference light that occurs near the focal point to undergo intensity modulation that changes at the modulation frequency,
The microscope apparatus according to claim 1, wherein the detection unit extracts light of the modulation frequency component.
前記検出手段は前記少なくとも2つ以上の変調周波数の和もしくは差の周波数成分の光を抽出することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の顕微鏡装置。 The modulating means is a phase modulation of at least two or more different frequencies separated the irradiation light intensity modulation, the addition of any of frequency modulation, two even without least interference light occurring at the focal point Cause intensity modulation that changes at the sum or difference frequency of the above modulation frequencies,
The microscope apparatus according to claim 1, wherein the detection unit extracts light having a frequency component that is a sum or difference of the at least two modulation frequencies.
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