JP5570810B2 - Colorectal cancer marker polypeptide and diagnostic method for colorectal cancer - Google Patents
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Description
本発明は、大腸癌マーカポリペプチド、特に血清等に存在する大腸癌マーカポリペプチド、及び該大腸癌マーカポリペプチドを検出する大腸癌の診断方法に関するものである。 The present invention relates to a colorectal cancer marker polypeptide, particularly a colorectal cancer marker polypeptide present in serum or the like, and a method for diagnosing colorectal cancer by detecting the colorectal cancer marker polypeptide.
肺癌、胃癌、及び肝臓癌とともに、大腸癌は発生率が高く、近年の食生活欧米化に伴いその発生率は急速に上昇している。そして、従来、大腸癌は便潜血反応検査、X線造影検査、及び大腸内視鏡検査などを行い、次いでバイオプシーによる組織学的検査による診断が行われてきた。 Along with lung cancer, stomach cancer, and liver cancer, colorectal cancer has a high incidence, and the incidence is rapidly increasing with the recent westernization of dietary habits. Conventionally, colorectal cancer has been subjected to fecal occult blood test, X-ray contrast test, colonoscopy, etc., followed by diagnosis by biopsy histological examination.
しかし、便潜血反応検査は、大腸癌からの出血が間欠的であるため、偽陰性の判定となる割合が高く、また逆に、痔疾、歯肉炎、潰瘍、アスピリン使用などが陽性の判定を引き起こすため、不必要な侵襲的な再検査が行われるという欠点がある。また、X線造影検査、及び大腸内視鏡検査などは、費用も高く、患者に負担と苦痛を与えるという欠点があった。 However, the fecal occult blood test is intermittent because bleeding from colorectal cancer is intermittent, so the rate of false negative judgments is high. Conversely, hemorrhoids, gingivitis, ulcers, and aspirin use cause positive judgments. Therefore, there is a drawback that unnecessary invasive reexamination is performed. In addition, X-ray contrast examinations and colonoscopy are expensive, and have the disadvantage of burdening and distressing patients.
そこで、非侵襲的で、患者に苦痛を与えない大腸癌の検査方法の研究が行われた。例えば、血液試料から癌胎児性抗原(CEA)を検出することで進行した大腸癌の存在を検出する方法(特許文献5)があるが、初期の大腸腫瘍を検出するためには信頼できる試験ではない。また、大腸癌における免疫反応を示す抗原としてのある種の大腸癌関連ポリペプチドを同定する、大腸癌を含む癌の診断方法(特許文献1)、大腸癌マーカをコードするcDNAを利用する大腸癌及びポリープのような結腸疾患の診断方法(特許文献2)、特定の糖転移酵素活性を有する蛋白質をコードする大腸癌マーカ遺伝子を利用する大腸癌の検出方法(特許文献3)、並びにAPC遺伝子、K-ras遺伝子、β-カテニン遺伝子及びB-raf遺伝子中の選択された領域中の変異解析を行うことができるプライマーを用いて、大腸癌細胞及び/又は大腸癌前駆細胞の非侵襲的早期検出を行う方法(特許文献4)などがある。しかし、これらの大腸癌の検査方法も、精度、実施容易性、費用などの面から臨床的な診断方法を変えるに到るものではなかった。 Therefore, research was conducted on a method for examining colorectal cancer that is non-invasive and does not cause pain to the patient. For example, there is a method (Patent Document 5) for detecting the presence of advanced colorectal cancer by detecting carcinoembryonic antigen (CEA) from a blood sample. However, in a reliable test for detecting an early colorectal tumor, Absent. In addition, a method for diagnosing cancer including colorectal cancer (Patent Document 1) for identifying a certain colorectal cancer-related polypeptide as an antigen showing an immune response in colorectal cancer, colorectal cancer using cDNA encoding a colorectal cancer marker And a method for diagnosing colon diseases such as polyps (Patent Document 2), a method for detecting colorectal cancer using a colon cancer marker gene encoding a protein having a specific glycosyltransferase activity (Patent Document 3), and an APC gene, Non-invasive early detection of colorectal cancer cells and / or colorectal cancer progenitor cells using primers that can analyze mutations in selected regions of the K-ras gene, β-catenin gene and B-raf gene (Patent Document 4) and the like. However, these colorectal cancer test methods have not changed clinical diagnosis methods in terms of accuracy, ease of implementation, and cost.
本発明は、大腸癌マーカポリペプチド、特に血清等に存在する大腸癌マーカポリペプチド、該大腸癌マーカポリペプチドを検出する大腸癌の診断方法、該診断用の抗体、及び該診断方法に用いるキットを提供することを目的とする。 The present invention relates to a colorectal cancer marker polypeptide, particularly a colorectal cancer marker polypeptide present in serum or the like, a colorectal cancer diagnostic method for detecting the colorectal cancer marker polypeptide, an antibody for the diagnosis, and a kit used for the diagnostic method The purpose is to provide.
本発明者らは、診断に有用な大腸癌マーカを得るため検討した結果、細胞性検体、特に生検によって得られる細胞を対象に検査を行うのは効率が悪く、かつ被験者に負担を強いることになるので、体液試料、特に血清等に含まれる大腸癌マーカを早期の大腸癌診断に用いるのが好ましく、かつ容易に検査できると考え研究を行った。その結果、発明者らは、大腸癌患者の血清に大腸癌マーカとなる4種類のペプチドが含まれていることを見出した。 As a result of investigations to obtain a colorectal cancer marker useful for diagnosis, the present inventors have found that it is inefficient to perform a test on a cellular specimen, particularly a cell obtained by biopsy, and imposes a burden on the subject. Therefore, research was conducted on the assumption that a colon cancer marker contained in a body fluid sample, particularly serum or the like is preferably used for early colon cancer diagnosis and can be easily examined. As a result, the inventors have found that the serum of colorectal cancer patients contains four types of peptides serving as colorectal cancer markers.
したがって、本発明は、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを提供する。本明細書中において、配列番号1、2、3、又は5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを。それぞれ大腸癌マーカポリペプチドA、B、D及びC、又は大腸癌マーカA、B、D及びCと表記する。 Therefore, the present invention provides a colorectal cancer marker polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5. In the present specification, a colorectal cancer marker polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, or 5. They are referred to as colon cancer marker polypeptides A, B, D, and C, or colon cancer markers A, B, D, and C, respectively.
また、本発明は、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導する、下記(1)又は(2)のポリペプチドを含むポリペプチド断片を提供する。
(1) 配列番号1、2、3、及び5いずれか1のアミノ酸配列を含むポリペプチド;及び
(2)配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列から、アミノ酸残基1以上の置換、欠失、付加及び/又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドである。The present invention also includes the following polypeptide (1) or (2) that induces antibody production against a colorectal cancer marker polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5. Polypeptide fragments are provided.
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5; and
(2) A polypeptide comprising an amino acid sequence mutated from the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5 by substitution, deletion, addition and / or insertion of one or more amino acid residues.
さらに、本発明は、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも1種を、被験者から得た体液試料、特に血清又は血漿から検出することを特徴とする、大腸癌の診断方法を提供する。
さらに、本発明は、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも1種を、被験者から得た体液試料、特に血清又は血漿から検出することを特徴とする、大腸癌転移の診断方法を提供する。Furthermore, the present invention detects at least one colorectal cancer marker polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5 from a body fluid sample obtained from a subject, particularly serum or plasma. A diagnostic method for colorectal cancer is provided.
Furthermore, the present invention detects at least one colorectal cancer marker polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5 from a body fluid sample obtained from a subject, particularly serum or plasma. A diagnostic method for colorectal cancer metastasis is provided.
さらに、本発明は、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を提供する。
さらに、本発明は、前記ポリペプチド断片を非ヒト哺乳動物に投与することを含む、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を製造する方法を提供する。Furthermore, the present invention provides an antibody that recognizes a colon cancer marker polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5.
Furthermore, the present invention provides an antibody that recognizes a colon cancer marker polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5, comprising administering the polypeptide fragment to a non-human mammal. A method of manufacturing the same is provided.
さらに、本発明は、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を、少なくとも1種含有する、大腸癌診断用キットを提供する。
さらに、本発明は、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドに特異性を有する抗体を、少なくとも1種含有する、大腸癌転移の診断用キットを提供する。Furthermore, the present invention provides a kit for diagnosing colorectal cancer, comprising at least one antibody that recognizes a colorectal cancer marker polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5. .
Furthermore, the present invention is for diagnosing colorectal cancer metastasis, comprising at least one antibody having specificity for a colorectal cancer marker polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5. Provide kit.
(定義)
本明細書中において、「低分子量タンパク質」とは、分子量30,000以下、好ましくは分子量20,000以下のタンパク質をいう。また、特に断らない限り「低分子量タンパク質等」とは、低分子量タンパク質、及びペプチドの双方を意味する。例を挙げると、極微量存在するペプチドホルモン、インターロイキン、サイトカイン等の生理活性タンパク質、特に機能がない極微量のバイオマーカタンパク質、及びペプチドなどがある。これらは腎臓を通過して尿中に一部排泄されるため、血液のみならず尿を検体として測定することも可能な場合もある。(Definition)
In the present specification, “low molecular weight protein” refers to a protein having a molecular weight of 30,000 or less, preferably 20,000 or less. Further, unless otherwise specified, “low molecular weight protein and the like” means both low molecular weight proteins and peptides. Examples include physiologically active proteins such as peptide hormones, interleukins, and cytokines that are present in trace amounts, and trace amounts of biomarker proteins and peptides that have no particular function. Since they pass through the kidney and are partially excreted in the urine, it may be possible to measure not only blood but also urine as a sample.
本明細書中において、「血漿」とは、EDTA又はヘパリンなどを加えて遠心分離した血液凝固系が作用し難い、又は作用しない上清をいう。
本明細書中において「血清」とは、血液から凝固成分をとり除いた部分である。新鮮な血液を放置すると血液凝固がおこり、ついで血球ならびにフィブリンは塊状に収縮し、透明な琥珀色の血清を遊離する。その成分はほぼ血漿からフィブリノゲンを除いたものにあたる。In the present specification, “plasma” refers to a supernatant in which EDTA or heparin is added and centrifuged to which a blood coagulation system hardly acts or does not act.
In the present specification, “serum” is a portion obtained by removing a coagulation component from blood. If fresh blood is allowed to stand, blood coagulation occurs, and then blood cells and fibrin contract in a lump and release a clear amber serum. Its component is almost equal to the plasma minus fibrinogen.
本明細書中において、血清等の「主要タンパク質」及び「キャリアタンパク質」とは、血清中の高含量のタンパク質をいう。例を挙げると、アルブミン(分子量66kDa)、免疫グロブリン(150〜190kDa)、トランスフェリン(80kDa)、ハプトグロビン(>85kDa)、リポタンパク質(数100kDa)などがある。
本明細書中において、「SDS」とは、ドデシル硫酸ナトリウム(sodium dodecyl sμlfate)を意味する。
本明細書中において、「PAGE」とは、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動(polyacrylamide gel electrophoresis)を意味する。In the present specification, “major protein” such as serum and “carrier protein” refer to a high content protein in serum. Examples include albumin (molecular weight 66 kDa), immunoglobulin (150-190 kDa), transferrin (80 kDa), haptoglobin (> 85 kDa), lipoprotein (several hundred kDa) and the like.
In this specification, “SDS” means sodium dodecyl sμlfate.
In the present specification, “PAGE” means polyacrylamide gel electrophoresis.
(大腸癌マーカポリペプチドの検索)
本発明者らは、大腸癌の早期発見に有用で、かつ生検等の細胞試料でなく、採取の容易な体液試料に存在する大腸癌マーカを発見するため、大腸癌患者から採取した血清を用いて大腸癌マーカの検索を行った。該大腸癌マーカの探索、同定、及び評価の方法は、後述する実施例に記載されているとおりである。
なお、本発明の大腸癌マーカポリペプチドA,B、D及びCの最終的な同定は、実施例4に示すようにタンデム型MS(MS/MS)質量分析により行った。該質量分析法の概念を次に説明する。(Search for colorectal cancer marker polypeptide)
In order to discover colorectal cancer markers that are useful for early detection of colorectal cancer and that are not collected in cell samples such as biopsy, but are present in easily collected body fluid samples, the present inventors have collected serum collected from colorectal cancer patients. The colorectal cancer marker was searched using it. The method for searching, identifying and evaluating the colorectal cancer marker is as described in the examples described later.
The final identification of the colon cancer marker polypeptides A, B, D and C of the present invention was performed by tandem MS (MS / MS) mass spectrometry as shown in Example 4. Next, the concept of the mass spectrometry will be described.
図1に4残基のペプチドの開裂パターンを示す。開裂したペプチドはその開裂部分に応じて呼び方が変わる。例えば、主鎖のペプチド結合部分で開裂したペプチド断片でペプチドのN端の1アミノ酸残基を含むペプチド断片をB1、N端を含む2アミノ酸残基を含むペプチド断片をB2、同様にN端から3アミノ酸残基を含む物をB3と呼ぶ。これに対してペプチドのC端の1アミノ酸残基をY1、C端を含む2アミノ酸残基を含むペプチド断片をY2、3アミノ酸残基を含む物をY3と呼ぶ。B1からB3のペプチド断片をB系列、Y1からY3のペプチド断片をY系列と呼ぶ。A,X、C,Zで切断されたペプチド断片に関しても同じようにA系列、X系列、C系列、Z系列と呼び、含まれるアミノ酸残基数に応じて番号をつける。 FIG. 1 shows the cleavage pattern of a 4-residue peptide. The name of the cleaved peptide varies depending on the cleavage site. For example, a peptide fragment cleaved at the peptide-binding portion of the main chain is B1 for a peptide fragment containing 1 amino acid residue at the N-terminus of the peptide, B2 for a peptide fragment containing 2 amino acid residues including the N-terminus, and similarly from the N-terminus A substance containing 3 amino acid residues is called B3. On the other hand, one amino acid residue at the C terminal of the peptide is called Y1, a peptide fragment containing two amino acid residues including the C terminal is called Y2, and a peptide fragment containing three amino acid residues is called Y3. The peptide fragments B1 to B3 are called B series, and the peptide fragments Y1 to Y3 are called Y series. Similarly, peptide fragments cleaved by A, X, C, and Z are also called A series, X series, C series, and Z series, and are numbered according to the number of amino acid residues contained.
今回使用したMALDI-TOF-MS分析計のMS/MSは低エネルギー解離であり、主にペプチド結合部分で開裂されるためB系列、Y系列が強く出る。図1のMS/MSスペクトルでは、前記B系列とY系列のペプチド断片のm/zに対応する信号(出力データ)が強く出る。より大きな開裂エネルギーによる開裂ではA,X, C,Z系列も増えてくるため、MS/MSスペクトルはより複雑となる。開裂のエネルギーは質量分析計のタイプによって異なる。UCSFが提供している質量スペクトラム解析用ホームページ(ProteinProspector: http://prospector.ucsf.edu/)ではアミノ酸配列を入力するとそのペプチドのmonoaisotopic
massやMS/MSパターン、タンパク質の酵素消化パターンを計算することが出来る。
本発明の大腸癌マーカポリペプチドは、ポリペプチドのm/zとB系列とY系列のペプチド断片のm/zに対応する出力データを解析することにより同定したものであり、実施例4に対応する図13、図14及び図15にその出力データ一覧表を示した。The MS / MS of the MALDI-TOF-MS analyzer used this time is a low energy dissociation, and the B series and Y series appear strongly because it is mainly cleaved at the peptide bond. In the MS / MS spectrum of FIG. 1, signals (output data) corresponding to m / z of the peptide fragments of the B series and the Y series are strong. Since the A, X, C, and Z sequences increase in the cleavage with a larger cleavage energy, the MS / MS spectrum becomes more complicated. The energy of cleavage depends on the type of mass spectrometer. UCSF provides a mass spectrum analysis homepage (ProteinProspector: http://prospector.ucsf.edu/).
Mass, MS / MS patterns, and protein enzyme digestion patterns can be calculated.
The colorectal cancer marker polypeptide of the present invention was identified by analyzing output data corresponding to m / z of the polypeptide and m / z of the B-series and Y-series peptide fragments, and corresponds to Example 4. FIG. 13, FIG. 14 and FIG. 15 show the output data list.
(大腸癌マーカポリペプチドの検出)
本発明の大腸癌マーカは、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドであり、これを検査対象者の体液試料、特に血清又は血漿から検出することにより大腸癌の診断、及び/又は転移を判断することができる。
本発明で用いる検出方法は、特に制限されないが、例えば、該大腸癌マーカポリペプチドに対する抗体を作成し、該抗体との抗原抗体反応により本発明の大腸癌マーカを検出する方法、又は近年進歩が著しいプロテオーム的手法としてよい。(Detection of colorectal cancer marker polypeptide)
The colorectal cancer marker of the present invention is a colorectal cancer marker polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5, and this is detected from a body fluid sample of a subject to be examined, particularly serum or plasma. By doing so, diagnosis of colorectal cancer and / or metastasis can be determined.
The detection method used in the present invention is not particularly limited. For example, an antibody against the colorectal cancer marker polypeptide is prepared, and a method for detecting the colorectal cancer marker of the present invention by an antigen-antibody reaction with the antibody, or recent progress has been made. Good proteomic approach.
(腸癌ポリペプチドマーカ検出用抗体)
本発明の抗体は、大腸癌マーカポリペプチドの検出に用いることが出来る、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。特にモノクローナル抗体では特異性に優れた抗体を選択することが可能となる。
免疫感作は常法により行うことができ、例えば抗原を、例えば7〜30日間隔で2〜3回投与するのが好ましい。抗原の投与量は1回当たり、例えばマウスでは約0.05〜2mg程度とする。投与経路も特に限定する必要はなく、皮下、皮内、腹膜腔内、静脈、筋肉内を適宜選択できる。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント又は水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができる。(Intestinal cancer polypeptide marker detection antibody)
The antibody of the present invention is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody that can be used for detection of a colon cancer marker polypeptide. In particular, monoclonal antibodies can be selected with excellent specificity.
Immunization can be performed by a conventional method. For example, it is preferable to administer an
免疫感作した哺乳動物を一定期間飼育した後、抗体価の上昇後、100μg〜1000μgの抗原で追加免疫することができる。最後の投与から通常1〜2ケ月後に免疫感作した哺乳動物から血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム又はポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の常法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明の大腸癌マーカポリペプチドを認識するポリクローナル抗体を得ることができる。 After the immunized mammal has been bred for a certain period of time, it can be boosted with 100 μg to 1000 μg of antigen after the antibody titer has risen. Blood is collected from a mammal immunized usually 1 to 2 months after the last administration, and the blood is subjected to, for example, centrifugation, precipitation using ammonium sulfate or polyethylene glycol, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, A polyclonal antibody that recognizes the colorectal cancer marker polypeptide of the present invention can be obtained as a polyclonal antiserum by separation and purification by a conventional method such as chromatography such as affinity chromatography.
また、モノクローナル抗体は、抗体産生細胞をクローニングすることによって得ることができる。一般的には、免疫動物から回収した抗体産生細胞を適当な融合パートナーと細胞融合させることによってハイブリドーマを形成し、HAT培養液によって癌細胞のハイブリドーマを選択した後、産生される抗体の活性を指標としてスクリーニングを行う。続いて、得られたハイブリドーマを常法に基づき、適当な培地中で培養後、該培養液を精製することによりモノクローナル抗体を得ることができる。 Monoclonal antibodies can be obtained by cloning antibody-producing cells. In general, antibody-producing cells recovered from immunized animals are cell-fused with an appropriate fusion partner to form a hybridoma. After selecting a hybridoma of a cancer cell using a HAT culture solution, the activity of the antibody produced is used as an indicator. As a screening. Subsequently, the obtained hybridoma can be cultured in an appropriate medium according to a conventional method, and then the culture solution can be purified to obtain a monoclonal antibody.
本発明で、免疫動物として使用できるのは、非ヒト哺乳動物、例えば、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ラット、マウス、ウサギなどがあり、特にラット、マウス、ハムスターなどのげっ歯類が好ましい。マウスを免疫動物とするときには、融合パートナーとしては、マウス由来のミエローマ細胞が好しい。 Examples of immunized animals that can be used in the present invention include non-human mammals such as monkeys, sheep, goats, pigs, dogs, rats, mice, rabbits, and particularly rodents such as rats, mice, and hamsters. preferable. When mice are used as immunized animals, mouse-derived myeloma cells are preferred as fusion partners.
前記非ヒト哺乳動物を感作するのに用いる抗原として、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドに対する抗体産生を誘導し、かつ下記(1)又は(2)のポリペプチドを含むポリペプチド断片を用いることができる。
(1) 配列番号1、2、3、及び5いずれか1のアミノ酸配列を含むポリペプチド;及び
(2) 配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列から、アミノ酸残基1以上の置換、欠失、付加及び/又は挿入によって変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドである。As an antigen used to sensitize the non-human mammal, it induces antibody production against a colon cancer marker polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5, and the following (1 ) Or a polypeptide fragment containing the polypeptide of (2) can be used.
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5; and
(2) A polypeptide comprising an amino acid sequence mutated from the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5 by substitution, deletion, addition and / or insertion of one or more amino acid residues.
また、該抗原は、少なくとも15アミノ酸残基を含む、好ましくは少なくとも20アミノ酸残基を含む、さらに好ましくは少なくとも25アミノ酸残基を含む、前記ポリペプチド断片とすることができる。
これらのポリペプチド断片は、該断片をコードするcDNAを組み込んだベクターを宿主に導入して作成するか、又は化学合成で作成することができる。In addition, the antigen may be the polypeptide fragment containing at least 15 amino acid residues, preferably at least 20 amino acid residues, and more preferably at least 25 amino acid residues.
These polypeptide fragments can be prepared by introducing a vector incorporating a cDNA encoding the fragment into a host, or by chemical synthesis.
(組み換え法による作成)
組み換え法では、例えば、本明細書記載の配列番号7〜14のcDNAを組み込んだベクターを作成し、適当な宿主細胞に導入、形質転換した後、該形質転換細胞を培養し、培養液等を精製することにより、該抗体誘導に用いるポリペプチド断片を作成することができる。(Making by recombination method)
In the recombination method, for example, a vector incorporating the cDNAs of SEQ ID NOS: 7 to 14 described in the present specification is prepared, introduced into a suitable host cell, transformed, the transformed cell is cultured, and a culture solution or the like is obtained. By purifying, a polypeptide fragment used for inducing the antibody can be prepared.
該宿主細胞は、哺乳動物の遺伝子を発現し得る細胞であれば特に限定されず、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞等を用いることができる。例えば、脊椎動物細胞であれば、サルの細胞であるCOS細胞(Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182、ATCC CRL-1650)、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)やそのジヒドロ葉酸還元酵素欠損株(Urlaub,
G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220)、間葉系幹細胞や骨軟骨系の培養細胞株を用いることができる。また、昆虫細胞であれば、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞(Sf-9またはSf-21)やTrichoplusia niの卵細胞由来High Five細胞(Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog.i: 391-396)等を用いることができる。The host cell is not particularly limited as long as it can express a mammalian gene, and cells such as vertebrates, insects and yeasts can be used. For example, in the case of vertebrate cells, COS cells that are monkey cells (Gluzman, Y. (1981)
G. and Chasin, LA (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220), mesenchymal stem cells and osteochondral cultured cell lines can be used. For insect cells, Spodoptera frugiperda ovarian cell-derived cell lines (Sf-9 or Sf-21) and Trichoplusia ni egg cell high five cells (Wickham, TJ et al, (1992) Biotechnol Prog.i: 391-396) can be used.
また、脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現させようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用できる。該発現ベクターの例としては、サイトメガロウイルス初期プロモーターを有するPCR3.1(Invitrogen社製)、SV40の初期プロモーターを有するpSV2dhfr(Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864)等のほか、レトロウィルスベクターpLCNX(Clontech, K1060-1)等を用いることができる。 As an expression vector for vertebrate cells, a vector having a promoter located upstream of a gene to be normally expressed, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, and the like can be used. Examples of the expression vector include PCR3.1 having a cytomegalovirus early promoter (Invitrogen), pSV2dhfr having an SV40 early promoter (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) and the like, retroviral vector pLCNX (Clontech, K1060-1) and the like can be used.
該宿主細胞として、COS細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、SV40複製起点を有し、COS細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロモーター、転写終結シグナル、およびRNAスプライス部位を備えたものが好ましい。該発現ベクターは、ジエチルアミノエチル(DEAE)−デキストラン法(Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308)、リン酸カルシウム−DNA共沈殿法(Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457)、及び電気パルス穿孔法(Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845)等によりCOS細胞に取り込ませることができる。
As an example of the case where a COS cell is used as the host cell, the expression vector has an SV40 origin of replication, can be independently propagated in the COS cell, and further comprises a transcription promoter, a transcription termination signal, and an RNA splice. The thing provided with the site | part is preferable. The expression vector includes diethylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308), calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, FL and van der Eb, AJ (1973)
また、宿主細胞としてCHO細胞や293細胞を用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質G418耐性マーカーとして機能するneo遺伝子を発現し得るベクター、例えば、pRSVneo(Sambrook, J. et al. (1989) : “Molecular Cloning A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor Laboratory, NY)やpSV2neo(Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341)等をコ・トランスフェクトし、G418耐性のコロニーを選択することにより、目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。 When CHO cells or 293 cells are used as host cells, a vector capable of expressing a neo gene that functions as an antibiotic G418 resistance marker together with an expression vector, such as pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989) : "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and pSV2neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341) By selecting G418-resistant colonies, transformed cells that stably produce the polypeptide of interest can be obtained.
また、昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ヤガ科のSpodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞(Sf-9またはSf-21)やTrichoplusia niの卵細胞由来High Five細胞(Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog.i: 391-396)等が宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウイルストランスファーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウイルス(AcNPV)のポリヘドリン蛋白質のプロモーターを利用したpVL1392/1393を用いることができる(Kidd,i. M. and V.C. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 420, 137-159)。さらに、バキュロウイルスのP10や同塩基性蛋白質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、AcNPVのエンベロープ表面蛋白質GP67の分泌シグナル配列を目的蛋白質のN末端側に繋げることにより、組換え蛋白質を分泌蛋白質として発現させることも可能である(Zhe-mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem., 379, 167-174)。
前記組換え細胞は、常法にしたがい培養することにより、その細胞膜上に目的の蛋白質を産生する。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択できる。In addition, when insect cells are used as host cells, cell lines derived from ovarian cells of Spodoptera frugiperda (Sf-9 or Sf-21) of Lepidoptera gourdaceae and high five cells derived from egg cells of Trichoplusia ni (Wickham, TJ et al , (1992) Biotechnol. Prog.i: 391-396) is often used as a host cell, and the baculovirus transfer vector is pVL1392 / 1393 which uses the promoter of the polyhedrin protein of autographer nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). (Kidd, i. M. and VC Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 420, 137-159). Furthermore, vectors using baculovirus P10 and promoters of the same basic protein can also be used. Furthermore, it is also possible to express a recombinant protein as a secreted protein by linking the secretory signal sequence of AcNPV envelope surface protein GP67 to the N-terminal side of the target protein (Zhe-mei Wang, et al. (1998)). Biol. Chem., 379, 167-174).
The recombinant cells produce the desired protein on their cell membranes by culturing according to a conventional method. As a medium used for the culture, various media commonly used according to the employed host cells can be appropriately selected.
(化学合成法による作成)
該ポリペプチド断片の化学合成は、当分野で周知の化学的方法によって行うことができる。例えば、固相技術を用いるペプチド合成は、バッチ式或いは連続的なフロープロセスによって行うことができる。連続的なフロープロセスでは、αアミノ保護及び側鎖保護アミノ酸残基をリンカーを介して不溶性の高分子支持物に連続的に追加する。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールなどのリンカーを、ポリ(スチレン-co-ジビニルベンゼン)に結合させて支持レジンを形成する。このアミノ酸残基は、酸不安定Boc(t-butyloxycarbonyl)法、若しくは塩基不安定Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)法によって保護されたN-α-である。保護されたアミノ酸のカルボキシル基をリンカーのアミンに結合して、この残基を固相支持レジンに結合させる。Boc若しくはFmocを用いた場合、トリフルオロ酢酸若しくはピペリジンを用いて保護基を除去する。カップリング試薬若しくは予め活性化されたアミノ酸誘導体を用いて、追加する各アミノ酸を結合された残基に付加してから、レジンを洗浄する。完全長のペプチドは、連続的な保護の停止、即ち誘導体化アミノ酸を結合させて合成し、ジクロロメタン及び/またはN、N-ジメチルホルムアミドで洗浄する。このペプチドは、ペプチドカルボキシル末端とリンカーとの間で切断され、ペプチド酸またはペプチドアミドが作られる(Novabiochem 1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook, San Diego CA pp. S1-S20)。ABI 431 A ペプチドシンセサイザー(Applied Biosystems)などの装置を用いて、ペプチドを自動合成することができる。合成したポリペプチド断片を高性能液体クロマトグラフィーによって精製し、その組成をアミノ酸解析またはシークエンシングによって確認することができる(Creighton (1984) Proteins. Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY)。(Created by chemical synthesis method)
Chemical synthesis of the polypeptide fragment can be performed by chemical methods well known in the art. For example, peptide synthesis using solid phase technology can be performed by a batch or continuous flow process. In a continuous flow process, alpha amino protected and side chain protected amino acid residues are continuously added to an insoluble polymer support via a linker. A linker, such as methylamine derivatized polyethylene glycol, is attached to poly (styrene-co-divinylbenzene) to form a support resin. This amino acid residue is N-α- protected by the acid labile Boc (t-butyloxycarbonyl) method or the base labile Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) method. The carboxyl group of the protected amino acid is attached to the linker amine, and this residue is attached to the solid support resin. When Boc or Fmoc is used, the protecting group is removed using trifluoroacetic acid or piperidine. Each additional amino acid is added to the bound residue using a coupling reagent or a pre-activated amino acid derivative, and then the resin is washed. The full-length peptide is synthesized by stopping successive protections, ie derivatized amino acids, and washed with dichloromethane and / or N, N-dimethylformamide. This peptide is cleaved between the peptide carboxyl terminus and the linker to produce a peptide acid or peptide amide (Novabiochem 1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook, San Diego CA pp. S1-S20). Peptides can be synthesized automatically using equipment such as the ABI 431 A peptide synthesizer (Applied Biosystems). The synthesized polypeptide fragment can be purified by high performance liquid chromatography and its composition can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (Creighton (1984) Proteins. Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY).
得られた抗体の検定は、ELISAやリポソーム溶解検定法を利用するのが好ましい。ELISAでは、反応性を観察すべき抗原を感作したマイクロプレートを用意し、これにハイブリドーマの培養上清を適当に希釈した試料を加えて反応させる。十分に反応させた後にウエルを洗浄し、イムノグロブリンに対する2次抗体を更に反応させる。最終的にウエルに結合した2次抗体を測定すれば、培養上清中に存在する抗体の抗原に対する結合活性を定量的に知ることができる。 The obtained antibody is preferably assayed using ELISA or liposome lysis assay. In ELISA, a microplate sensitized with an antigen whose reactivity is to be observed is prepared, and a sample obtained by appropriately diluting the culture supernatant of the hybridoma is added thereto and reacted. After sufficiently reacting, the well is washed and further reacted with a secondary antibody against immunoglobulin. When the secondary antibody finally bound to the well is measured, the binding activity of the antibody present in the culture supernatant to the antigen can be quantitatively known.
リポソーム溶解検定法とは、抗原を感作したリポソームに抗体が反応すると、補体の作用によってリポソームが溶解する現象を利用した方法である。該リポソームは、たとえばジセチルホスフェート(dicetyl-phosphate;以下DCPと省略する)、ジミリストイルホスファチジルコリン(以下DMPCと省略する)、コレステロールに加えて試験すべきリン脂質抗原から構成されたものである。これらの脂質成分を適当な有機溶媒で溶解後に乾燥させてリピッドフィルムとし、水系溶媒に加えて強く撹拌すると、多層ラメラ構造のリポソームを生じる。こうして調製されたリポソームでは、膜の構成成分としてリン脂質抗原が取りこまれる。そのため現実の細胞膜に存在する形に近い状態で抗原構造が提示されることが期待できるので、モノクローナル抗体のスクリーニングには好適である。該リポソームの内部には、その溶解の標識となる蛍光色素を封入しておくのが好ましい。該蛍光色素には、4-メチルウンベリフェロンやカルセイン等が用いられる。補体の存在下でこのリポソームを構成するリン脂質抗原に抗体が結合すると、リポソームが破壊され内部の蛍光色素が流出されるので、抗体の存在は液相の蛍光増大として観察される。 The liposome lysis assay is a method that utilizes the phenomenon that when an antibody reacts with an antigen-sensitized liposome, the liposome is dissolved by the action of complement. The liposome is composed of, for example, dicetyl phosphate (hereinafter abbreviated as DCP), dimyristoyl phosphatidylcholine (hereinafter abbreviated as DMPC), cholesterol, and a phospholipid antigen to be tested. When these lipid components are dissolved in a suitable organic solvent and then dried to form a lipid film, and added to the aqueous solvent and stirred vigorously, multilayered lamellar liposomes are formed. In the liposome thus prepared, a phospholipid antigen is incorporated as a component of the membrane. Therefore, it can be expected that the antigen structure is presented in a state close to the shape present in the actual cell membrane, and thus it is suitable for screening for monoclonal antibodies. It is preferable to encapsulate the inside of the liposome with a fluorescent dye that serves as a label for dissolution. As the fluorescent dye, 4-methylumbelliferone, calcein, or the like is used. When an antibody binds to the phospholipid antigen constituting the liposome in the presence of complement, the liposome is destroyed and the fluorescent dye inside flows out, so that the presence of the antibody is observed as an increase in fluorescence in the liquid phase.
(大腸癌マーカポリペプチドの検出)
本発明では、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも1種を、被験者から得た体液試料、好ましくは血清又は血漿から検出することにより、大腸癌の診断方法を提供する。本発明のマーカが1種以上陽性を示す量で存在する場合、大腸癌に罹患、又はその前段階に到っていると考えることができる。(Detection of colorectal cancer marker polypeptide)
In the present invention, at least one colorectal cancer marker polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5 is detected from a body fluid sample obtained from a subject, preferably serum or plasma. Provides a method for diagnosing colorectal cancer. When the marker of this invention exists in the quantity which shows 1 or more types positive, it can be considered that it is suffering from colon cancer or it has reached the previous stage.
また、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドの少なくとも1種を、大腸癌を外科的又はその他の手段で除去した被験者から得た体液試料から検出することにより、大腸癌の転移を診断することができる。すなわち、大腸癌が除去されていれば被験者の血清などには通常、該大腸癌マーカは存在しない、又は存在量は低いが、転移により除去部位以外に大腸癌が転移していれば、該大腸癌マーカが陽性を示す量で存在する。 Also, a body fluid sample obtained from a subject from which at least one colorectal cancer marker polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5 has been removed surgically or by other means is removed. By detecting from this, metastasis of colorectal cancer can be diagnosed. That is, if the colon cancer is removed, the serum of the subject usually does not have the colon cancer marker, or the abundance is low, but if the colon cancer has metastasized to other than the removed site by metastasis, the colon cancer The amount of cancer marker is positive.
(特異的抗体を使った検出方法)
先に記載した方法で得た、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を、被験者から得た体液試料と接触させることにより、本発明の大腸癌マーカポリペプチドを検出することができる。当該抗原抗体反応は、周知の常法で行うことができる。該常法の例を挙げると、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、及び蛍光活性化セルソーター法(FACS)がある。該大腸癌マーカポリペプチドの検出には、2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる(Coligan 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Wiley-Interscience, New
York NY)。(Detection method using specific antibody)
The colon cancer marker polypeptide of the present invention can be detected by contacting a polyclonal antibody or a monoclonal antibody obtained by the method described above with a body fluid sample obtained from a subject. The antigen-antibody reaction can be performed by a known ordinary method. Examples of such conventional methods include ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), radioimmunoassay (RIA), and fluorescence activated cell sorter method (FACS). The detection of the colon cancer marker polypeptide is preferably a two-site monoclonal immunoassay using monoclonal antibodies that react with two non-interfering epitopes, but a competitive binding assay can also be used (Coligan et al. (1997) Current Protocols in Immunology, Wiley-Interscience, New
York NY).
当該抗体を使った検出方法を実施するため、本発明では、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む大腸癌マーカポリペプチドを認識する抗体を少なくとも1種含有する、大腸癌診断用キット、及び大腸癌転移の診断用キットを提供する。 In order to carry out the detection method using the antibody, the present invention contains at least one antibody that recognizes a colorectal cancer marker polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5. A colorectal cancer diagnostic kit and a colorectal cancer metastasis diagnostic kit are provided.
(プロテオーム的手法を使った検出方法)
本発明の大腸癌マーカポリペプチドA、B、D及びCは、それぞれアミノ酸配列、及び分子量が明らかになっているので、被験者から得た血清等の体液試料から質量分析により検出することができる。当該質量分析は、液体クロマト質量分析法(LC-MS分析法)、又はマトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF-MS分析法)により行うことができる。(Detection method using proteomic method)
Since the colorectal cancer marker polypeptides A, B, D, and C of the present invention are known for their amino acid sequences and molecular weights, they can be detected from a body fluid sample such as serum obtained from a subject by mass spectrometry. The mass spectrometry can be performed by liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS analysis) or matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS analysis).
MALDI-TOF-MS分析により検出を行う場、液体試料中に含まれるタンパク質及びポリペプチドの質量分析データを得て、該データ中に本発明の大腸癌マーカに対応する質量に対応する出力(ピーク)があるか否かを調べることにより、大腸癌マーカの有無を調べることができる。 When detection is performed by MALDI-TOF-MS analysis, mass spectrometry data of proteins and polypeptides contained in a liquid sample is obtained, and the output corresponding to the mass corresponding to the colorectal cancer marker of the present invention (peak) ), The presence or absence of a colorectal cancer marker can be examined.
該MALDI-TOF-MS分析により大腸癌マーカの有無を調べる手順は次のとおりである。まず、体液試料を前処理して、該試料に含まれるタンパク質及びポリペプチド成分を濃縮、又は凍結乾燥し、その後、適当なマトリックスと混合し、試料プレート上で乾燥させる。該試料を質量分析計の高真空内に導入する。該試料スポットをレーザで照射し、イオンを気相中に脱離させるとともに、飛行時間を測定する計時装置を始動させる。イオンは電場によって同じ運動エネルギーで加速され、電場内の自由飛行管を飛翔する間に質量電荷比に対応して分離される。該イオンはイオンの質量電荷比に依存した異なる時間に検出器に到達する。データシステムにより検出器のすべてのパラメーターを制御して時間毎の検出シグナルを獲得することにより、質量電荷比に依存したイオンの到達順位を示すデータ処理が可能となる。所定のスペクトル計によって試料に含まれるタンパク質及びポリペプチドのプロファイルを得た後、該プロファイル中に本発明の大腸癌マーカポリペプチドに対応する出力データの有無を調べることで、該大腸癌マーカを検出することができる。 The procedure for examining the presence or absence of colorectal cancer markers by the MALDI-TOF-MS analysis is as follows. First, a body fluid sample is pretreated, and the protein and polypeptide components contained in the sample are concentrated or lyophilized, and then mixed with an appropriate matrix and dried on a sample plate. The sample is introduced into the high vacuum of the mass spectrometer. The sample spot is irradiated with a laser to desorb ions into the gas phase, and a time measuring device for measuring the time of flight is started. Ions are accelerated by the electric field with the same kinetic energy and are separated corresponding to the mass-to-charge ratio while flying through the free flight tube in the electric field. The ions reach the detector at different times depending on the mass to charge ratio of the ions. By controlling all the parameters of the detector by the data system and acquiring the detection signal for each time, it is possible to process data indicating the arrival order of ions depending on the mass-to-charge ratio. After obtaining a profile of the protein and polypeptide contained in the sample with a predetermined spectrometer, the colon cancer marker is detected by examining the presence of output data corresponding to the colorectal cancer marker polypeptide of the present invention in the profile. can do.
なお、酸素原子、炭素原子、水素原子及び窒素原子などの同位体元素でラベルした、配列番号1、2、3、及び5のいずれか1のアミノ酸配列を含む比較用大腸癌マーカポリペプチドを用いることにより、検出(定性)の精度を向上させ、かつ定量的な分析が可能となる。
例えば、図17に示すように、本発明の大腸癌マーカポリペプチドAのアラニン及びグリシンの炭素原子を同位体である13C炭素原子に置換することで、比較用の標準マーカポリペプチドAを得ることができる。そして該標準ポリペプチドマーカAを試料に一定量加えて質量分析することにより、図18に示すように強度1の基準出力データを得ることができる。該基準出力データは常に一定の位置に現れるものであるから、大腸癌マーカポリペプチドA検出(定性)の基準になる。また、図18に示すように該基準出力データと比較することにより、大腸癌摘出手術の後では、明らかに大腸癌マーカポリペプチドAの減少が確認できる。また、大腸癌摘出手術の後で、大腸癌マーカポリペプチドAの減少が確認されなければ、該大腸癌の転移が疑われることになる。A comparative colorectal cancer marker polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, and 5 labeled with an isotope element such as an oxygen atom, a carbon atom, a hydrogen atom and a nitrogen atom is used. This improves the accuracy of detection (qualitative) and enables quantitative analysis.
For example, as shown in FIG. 17, the standard marker polypeptide A for comparison is obtained by substituting the carbon atoms of alanine and glycine of the colon cancer marker polypeptide A of the present invention with 13 C carbon atoms, which are isotopes. be able to. Then, by adding a certain amount of the standard polypeptide marker A to the sample and performing mass spectrometry, reference output data of
(体液試料、特に血清及び血漿の前処理)
なお、前記大腸癌マーカポリペプチドを検出する前に、該体液試料、特に血清及び血漿から主要タンパク質を除去し、該大腸癌マーカポリペプチドを濃縮するのが好ましい。被験者から得た血清等には、比較的分子量の大きい主要タンパク質が含まれており、本発明の大腸癌マーカポリペプチドの検出を妨害、又は検出感度を著しく低下させることがある。特に、該検出にプロテオーム的手法を用いる場合、キャリアタンパク質を含む主要タンパク質の影響は大きい。該主要タンパク質の除去には、本発明者らが平成19年8月8日に出願した特願2007-206602記載の方法が好ましい。すなわち、
(a) 被験者から得た体液試料、特に血清等に、尿素及びチオ尿素を含む試薬1、及びジチオスレイトール(DTT)を含む試薬2を加えて混合し、ついで有機溶媒90%以上含む試薬3に滴下して、混合する工程;
(b) 工程(a)で得られた混合溶液を低温下で攪拌する工程;
(c) 工程(b)で得られた攪拌溶液を低温下で遠心分離し、上清を除去する工程;
(d) (c)で得られた沈降物に有機溶媒及び酸を含む試薬4を加えて混和する工程;
(e) 工程(d)で得られた混合溶液を低温下で攪拌する工程;及び
(f) 工程(e)で得られた攪拌溶液を低温下で遠心分離し、上清を回収する工程により処理することでキャリアタンパク質を含む主要タンパク質を除去する方法である。また該方法は、さらに、(g)工程(f)で回収した上清を凍結乾燥する工程を含んでいてもよい。(Pretreatment of body fluid samples, especially serum and plasma)
Prior to detecting the colorectal cancer marker polypeptide, it is preferable to remove the major protein from the body fluid sample, particularly serum and plasma, and concentrate the colorectal cancer marker polypeptide. Serum obtained from a subject contains a major protein having a relatively high molecular weight, which may interfere with detection of the colorectal cancer marker polypeptide of the present invention or significantly reduce detection sensitivity. In particular, when a proteomic method is used for the detection, the influence of main proteins including a carrier protein is great. For the removal of the main protein, the method described in Japanese Patent Application No. 2007-206602 filed on August 8, 2007 by the present inventors is preferable. That is,
(a)
(b) a step of stirring the mixed solution obtained in the step (a) at a low temperature;
(c) centrifuging the stirred solution obtained in step (b) at low temperature and removing the supernatant;
(d) adding the
(e) stirring the mixed solution obtained in step (d) at a low temperature; and
(f) The stirring solution obtained in the step (e) is centrifuged at a low temperature, and the main protein including the carrier protein is removed by processing in a step of collecting the supernatant. The method may further include a step (g) of lyophilizing the supernatant collected in step (f).
なお、試薬1における濃度は尿素1〜8M、かつチオ尿素0.5〜3M、好ましくは尿素3〜8M、かつチオ尿素1〜3Mであり、かつ試薬2におけるDTTの濃度は5mM〜10M、好ましくは20mM〜1Mである。また、試薬3の有機溶媒は、アセトン、エタノール、メタノール、2プロパノール、アセトニトリル、及びこれらの混合物からなる群から選ばれたもの、好ましくはアセトンである。
The concentration in
また、試薬4の有機溶媒は、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール及びこれらの混合物からなる群から選ばれたもの、好ましくはアセトニトリルであり、かつ前記酸は、塩酸、トリフルオロ酢酸(TFA)、ギ酸、酢酸、及びトリクロロ酢酸(TCA)からなる群から選ばれたものであり、かつ該有機溶媒の濃度が50〜99%である。好ましい試薬4の酸は、塩酸であり、その濃度は5mM〜500mMとするのが好ましい。
The organic solvent of
また、前記工程(g)で得られた上清の凍結乾燥物に、TFA、塩酸、ギ酸、酢酸、及びTCAからなる群から選ばれた成分、好ましくはTFAを0.1〜20%を含有する試薬5を加え、本発明の大腸癌マーカポリペプチドの分析用試料を作成することができる。
Further, the lyophilized product of the supernatant obtained in the step (g) contains a component selected from the group consisting of TFA, hydrochloric acid, formic acid, acetic acid, and TCA, preferably 0.1 to 20% of TFA. The
健常者血清8検体、及び大腸癌罹患者血清8検体を用意し、図2に示すフローチャートに従い大腸癌マーカポリペプチドを探索した。続いて、得られた大腸癌マーカポリペプチドの評価を行った。 Eight healthy subject sera and eight colorectal cancer-affected sera were prepared, and colon cancer marker polypeptides were searched according to the flowchart shown in FIG. Subsequently, the obtained colorectal cancer marker polypeptide was evaluated.
(実施例1) 大腸癌マーカポリペプチド成分の濃縮
本実施例では、図3に示すフローチャートに従い、大腸癌マーカポリペプチド成分の濃縮を行った(以下、この濃縮方法をK法という。)。
まず、用意した血清検体10μlを分取し、試薬1(7M尿素, 2Mチオ尿素)18μlと試薬2(200mM DTT) 2 μlを加え、Vortexで混和した。その際、該血清、試薬1、及び試薬2は全て4℃に冷やして使用した。ついで該混合溶液を、4℃に冷却した高純度アセトンからなる1.2 mlの試薬3に滴下し、該滴下後すぐにvortexを用いて混和し、ついで4℃の環境で1時間撹拌した。該攪拌後、該混合溶液を冷却遠心機により4℃で15分間遠心分離し(19,000g)、得られた上清を完全に除去した。次いで、残留沈殿物に4℃の試薬4 (アセトニトリル70%, 塩酸12 mM、残部水) 200μlを加え、4℃で1時間撹拌したのち、該混合溶液を冷却遠心機により4℃で15分間遠心分離し(19,000g)、得られた上清を血清のポリペプチド濃縮溶液として回収した。
次いで、該濃縮溶液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物に試薬5 (99.9% H2O, 0.1% TFA) 80μlを加えて溶解した。Example 1 Concentration of Colorectal Cancer Marker Polypeptide Component In this example, the colorectal cancer marker polypeptide component was concentrated according to the flowchart shown in FIG. 3 (hereinafter, this concentration method is referred to as “K method”).
First, 10 μl of the prepared serum sample was collected, 18 μl of reagent 1 (7M urea, 2M thiourea) and 2 μl of reagent 2 (200 mM DTT) were added, and mixed with Vortex. At that time, the serum,
Subsequently, the concentrated solution was freeze-dried, and 80 μl of reagent 5 (99.9% H 2 O, 0.1% TFA) was added to the resulting freeze-dried product to dissolve it.
(実施例2) 血清ポリペプチドの逆相HPLCによる分画
実施例1で得られた健常者血清(N1〜N8)及び大腸癌患者血清(P1〜P8)のポリペプチド濃縮溶液を、それぞれ逆相HPLCにより分画した。該分画は逆相HPLCの溶出時間25〜85分部分を1分間隔で60分画に分取した。その分析条件を図4に、分析結果を図5に示す。(Example 2) Fractionation of serum polypeptide by reversed-phase HPLC Polypeptide-concentrated solutions of healthy subject serum (N1-N8) and colorectal cancer patient serum (P1-P8) obtained in Example 1 were each reversed-phase. Fractionated by HPLC. The fraction was fractionated into 60 fractions at intervals of 1 minute, with an elution time of 25 to 85 minutes of reverse phase HPLC. The analysis conditions are shown in FIG. 4, and the analysis results are shown in FIG.
(実施例3) 逆相HPLCで得た画分のポリペプチドの検索
実施例2で得た各画分を、MALDI-TOF-MS(Matrix - Assisted Laser Desorption Ionization Time - Of - Fright Mass Spectrometer:
マトリックス支援レーザー脱離イオン化―飛行時間型質量分析計, 型番:Voyager-DE PRO, メーカー:Applied Biosystems社,USA )により分析し、大腸癌患者血清P1〜P8に特異的に存在するポリペプチドを探索した。まず、MALDI-TOF-MS用サンプルプレート上で各画分のサンプル1μlと マトリックス 0.5μlを混ぜて風乾した後、MALDI-TOF-MS分析を行った。該マトリックスとして、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸(CHCA; Nacalai Tesque社製) を
50%CH3CN - 0.1%TFAで溶解した飽和溶液を用いた。Example 3 Search for Polypeptides of Fractions Obtained by Reversed Phase HPLC Each fraction obtained in Example 2 was subjected to MALDI-TOF-MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Fright Mass Spectrometer:
Matrix-assisted laser desorption / ionization-time-of-flight mass spectrometer, model number: Voyager-DE PRO, manufacturer: Applied Biosystems, USA) and search for polypeptides that are specifically present in sera P1 to P8 of colorectal cancer patients did. First, 1 μl of each fraction sample and 0.5 μl of matrix were mixed and air-dried on a MALDI-TOF-MS sample plate, and then MALDI-TOF-MS analysis was performed. As the matrix, α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA; manufactured by Nacalai Tesque) was used.
A saturated solution dissolved in 50% CH 3 CN-0.1% TFA was used.
当該MALDI-TOF-MS分析で示された、各画分における健常者血清N1〜N8及び大腸癌患者血清P1〜P8のポリペプチドの存在を、図6〜図9に示す。各図における白丸は、健常者血清N1〜N8中に存在するポリペプチドを示し、灰色の丸は、大腸癌患者血清P1〜P8中に存在するポリペプチドを示す。各丸はその存在を明確にするため、少しずつスライドさせて表示されており、各丸の大きさはMALDI-TOF-MS分析のピークの強度を示す。また、図6〜図9の縦軸は質量/価数を横軸はHPLCの画分の番号を示す。 The presence of polypeptides of healthy subject serum N1 to N8 and colon cancer patient sera P1 to P8 in each fraction, as shown by the MALDI-TOF-MS analysis, are shown in FIGS. White circles in each figure indicate polypeptides present in healthy subject sera N1 to N8, and gray circles indicate polypeptides present in colon cancer patient sera P1 to P8. Each circle is displayed by sliding it little by little to clarify its existence, and the size of each circle indicates the intensity of the peak of MALDI-TOF-MS analysis. Moreover, the vertical axis | shaft of FIGS. 6-9 shows a mass / valence, and a horizontal axis shows the number of the fraction of HPLC.
図6〜図9に示された各画分のポリペプチドの分布を調べた結果、第6画分、第15画分、及び第18画分に健常者にはなく、大腸癌患者特異的なポリペプチドの分布が見られた。すなわち、図10に大腸癌患者血清特異的に増加しているペプチド4種類のMSスペクトルを示す。図中のスペクトルは以下の通りである。 As a result of examining the polypeptide distribution of each fraction shown in FIG. 6 to FIG. 9, it was not found in healthy subjects in the sixth fraction, the fifteenth fraction, and the eighteenth fraction, and was specific to colon cancer patients. Polypeptide distribution was seen. That is, FIG. 10 shows MS spectra of four types of peptides increasing specifically in colorectal cancer patient serum. The spectrum in the figure is as follows.
図10に示されているように、MALDI-TOF-MS法のスペクトルにより、各サンプルの画分No.6のスペクトルの一部(m/z=2092, 及び2163)、画分No.15のスペクトルの一部(m/z=2188)、及び画分No.18のスペクトルの一部(m/z=3505)に大腸癌患者血清特異的なペプチドが検出されている。 As shown in FIG. 10, according to the spectrum of the MALDI-TOF-MS method, a part of the spectrum of fraction No. 6 (m / z = 2092, and 2163) of each sample, fraction No. 15 Serospecific peptides of colorectal cancer patients are detected in part of the spectrum (m / z = 2188) and part of the spectrum of fraction No. 18 (m / z = 3505).
前記特異的ペプチドの解析結果を図11及び12に示す。図11は、図10の各大腸癌マーカポリペプチドのMSスペクトル(健常者血清N1〜N8、大腸癌患者血清P1〜P8)の平均スペクトルである。また図12は、これらのMSピークの強度の平均と標準偏差を表すグラフ(左)と各大腸癌マーカポリペプチドのMSピークの強度から求めたP値(右)を示し、そのP値はm/z=2092(A), m/z=2163(B), m/z=2188(C), m/z=3505(D) に対して、それぞれ0.0013, 0.0021, 0.0006, 0.0047であった。これらの結果に対応するポリペプチドを大腸癌マーカポリペプチドと判断した。 The analysis results of the specific peptide are shown in FIGS. FIG. 11 is an average spectrum of the MS spectra (serious human serum N1 to N8, colon cancer patient sera P1 to P8) of each colon cancer marker polypeptide of FIG. FIG. 12 shows a graph (left) representing the mean and standard deviation of the intensity of these MS peaks and the P value (right) obtained from the intensity of the MS peak of each colorectal cancer marker polypeptide. For / z = 2092 (A), m / z = 2163 (B), m / z = 2188 (C), and m / z = 3505 (D), they were 0.0013, 0.0021, 0.0006, and 0.0047, respectively. The polypeptide corresponding to these results was determined to be a colon cancer marker polypeptide.
(実施例4) 大腸癌マーカポリペプチドの同定
実施例3で得られた大腸癌マーカポリペプチドA、B、D及びCの同定を行った。
(大腸癌患者血清の濃縮と分画)
同定においてはMSスペクトルの強度を大きくするために、大腸癌患者血清20μlを使用した点を除き、実施例1と同じ方法でポリペプチド等の濃縮を行った。(Example 4) Identification of colorectal cancer marker polypeptide The colorectal cancer marker polypeptides A, B, D and C obtained in Example 3 were identified.
(Concentration and fractionation of colorectal cancer patient serum)
In the identification, in order to increase the intensity of the MS spectrum, the polypeptide and the like were concentrated by the same method as in Example 1 except that 20 μl of colorectal cancer patient serum was used.
すなわち、図3に示すK法のフローチャートに従い、大腸癌血清検体20μlを分取し、試薬1(7M尿素, 2Mチオ尿素) 36μlと試薬2(200mM DTT) 4μlを加え、Vortexで混和した。その際、該血清、試薬1、及び試薬2は全て4℃に冷やして使用した。ついで該混合溶液を、4℃に冷却した高純度アセトンからなる1.8 mlの試薬3に滴下し、該滴下後すぐにvortexを用いて混和し、ついで4℃の環境で1時間撹拌した。該攪拌後、該混合溶液を冷却遠心機により4℃で15分間遠心分離し(19,000g)、得られた上清を完全に除去した。次いで、残留沈殿物に4℃の試薬4 (アセトニトリル70%, 塩酸12 mM、残部水) 800μlを加え、4℃で1時間撹拌したのち、該混合溶液を冷却遠心機により4℃で15分間遠心分離し(19,000g)、得られた上清を血清のポリペプチド濃縮溶液として回収した。
That is, according to the flow chart of the K method shown in FIG. 3, 20 μl of colorectal cancer serum sample was collected, 36 μl of reagent 1 (7M urea, 2M thiourea) and 4 μl of reagent 2 (200 mM DTT) were added and mixed with Vortex. At that time, the serum,
次いで、該濃縮溶液を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物に試薬5 (99.9% H2O, 0.1% TFA) 80μlを加えて溶解した。
次いで、得られた血清ポリペプチド濃縮溶液を逆相HPLCにより分画した。該分画は逆相HPLCの溶出時間25〜85分部分を1分間隔で60分画に分取した。その分析条件は図4に示したとおりである。Subsequently, the concentrated solution was freeze-dried, and 80 μl of reagent 5 (99.9% H 2 O, 0.1% TFA) was added to the resulting freeze-dried product to dissolve it.
Subsequently, the obtained serum polypeptide concentrated solution was fractionated by reverse phase HPLC. The fraction was fractionated into 60 fractions at intervals of 1 minute, with an elution time of 25 to 85 minutes of reverse phase HPLC. The analysis conditions are as shown in FIG.
(ポリペプチドマーカのMS及びMS/MSスペクトル測定)
前記ポリペプチドマーカA, B, C及び Dの存在する凍結乾燥した分画物(A,B: 画分No.6, C:画分No.15, 及びD:画分No.18)を10μlの溶媒(50% アセトニトリル/ 0.1% TFA)に溶かした。該溶液1μlを取り、MALDI-TOF-MS分析し、MS スペクトル及び前記ペプチドマーカA, B, C及び DのMS/MSスペクトルを測定した。該測定は、タンデムMSスペクトル(MS/MSスペクトル)が測定できるMALDI-TOF-MS(Autoflex II TOF/TOF: Bruker Daltonics社、米国)を使用して行った。(MS and MS / MS spectrum measurement of polypeptide markers)
10 μl of lyophilized fractions (A, B: fraction No. 6, C: fraction No. 15, and D: fraction No. 18) in which the polypeptide markers A, B, C and D are present In a solvent (50% acetonitrile / 0.1% TFA). 1 μl of the solution was taken and subjected to MALDI-TOF-MS analysis, and MS spectra and MS / MS spectra of the peptide markers A, B, C and D were measured. The measurement was performed using MALDI-TOF-MS (Autoflex II TOF / TOF: Bruker Daltonics, USA) capable of measuring a tandem MS spectrum (MS / MS spectrum).
(MS及びMS/MSスペクトルの解析)
該測定によって得た、前記ペプチドマーカA, B, C及び DのMSスペクトル(正確な分子量)とMS/MSスペクトルから、MSスペクトル解析ソフトウエア Mascot (Matrix Science社, 米国) を利用し、NCBIデータベースで検索することにより各ペプチドマーカの同定を行った。ペプチドマーカA, B, D及びCのMascot Score はそれぞれ126, 106, 92, 162 であり、この結果から、各ペプチドの同定の信頼性はきわめて高いと考えられる。(MS and MS / MS spectrum analysis)
From the MS spectra (exact molecular weight) and MS / MS spectra of the peptide markers A, B, C and D obtained by the measurement, using MS spectrum analysis software Mascot (Matrix Science, USA), NCBI database Each peptide marker was identified by searching with. The Mascot Scores of peptide markers A, B, D, and C are 126, 106, 92, and 162, respectively. From this result, it is considered that the reliability of identification of each peptide is extremely high.
なお、本実施例のMSスペクトル解析ソフトウエア Mascotを利用した各ペプチドマーカの同定作業は下記の手順で行った。
まず、NCBIデータベース中の全タンパク質のアミノ酸配列の中から、対象ペプチドマーカのMSスペクトルから得られた分子量に、ある誤差範囲内で一致するペプチド断片を全てリストアップする。ここで該誤差範囲はMSスペクトル測定の質量精度に依存する。本実施例では観測されたm/z±100ppmを誤差範囲とした(m/zは質量とイオン価数の比、MSスペクトルの横軸はの値に対応)。In addition, the identification procedure of each peptide marker using the MS spectrum analysis software Mascot of this example was performed according to the following procedure.
First, from the amino acid sequences of all proteins in the NCBI database, all peptide fragments that match the molecular weight obtained from the MS spectrum of the target peptide marker within a certain error range are listed. Here, the error range depends on the mass accuracy of the MS spectrum measurement. In this example, the observed error range was m / z ± 100 ppm (m / z corresponds to the ratio of mass to ion valence, and the horizontal axis of the MS spectrum corresponds to the value of).
次にリストアップされたポリペプチド全てのMS/MSスペクトルをシミュレートした。ここでシミュレートされたMS/MSスペクトルと、測定された対象ポリペプチドのMS/MSスペクトルを比較して、その一致程度をスコアとして評価した。該リストしたポリペプチドをスコアの高いものからそのペプチドの含まれるタンパク質とそのアミノ酸配列をスコアとともに表示した。 The MS / MS spectra of all the listed polypeptides were then simulated. Here, the simulated MS / MS spectrum and the measured MS / MS spectrum of the target polypeptide were compared, and the degree of coincidence was evaluated as a score. The listed polypeptides are displayed with a score from the highest score to the protein containing the peptide and its amino acid sequence.
各ポリペプチドの同定結果をそれぞれ図13, 図14及び図15に示す。これらの結果から、大腸癌ペプチドマーカA、C及びDが配列番号1、5及び3に対応するポリペプチドであることが明らかになった。なお、図13,14及び15には大腸癌マーカポリペプチドA、C及びDに対応するペプチド断片のB系列とY系列のm/zに対応する出力データ一覧を示した。本発明の大腸癌マーカは、該出力データを解析することにより同定したものである。なお、大腸癌マーカポリペプチドBのデータはないが、該ポリペプチドBはポリペプチドAのN末端側にAla残基が付いたものであり、「Mascot Search による同定とポリペプチドAのMS/MSスペクトルのB系列フラグメントの一致から、アミノ酸配列の確認を行うことができた。 The identification results of each polypeptide are shown in FIGS. 13, 14 and 15, respectively. From these results, it was revealed that the colon cancer peptide markers A, C, and D are polypeptides corresponding to SEQ ID NOs: 1, 5, and 3. 13, 14 and 15 show output data lists corresponding to B / Y series m / z of peptide fragments corresponding to colon cancer marker polypeptides A, C and D. The colorectal cancer marker of the present invention is identified by analyzing the output data. Although there is no data on colorectal cancer marker polypeptide B, polypeptide B has an Ala residue on the N-terminal side of polypeptide A, and is identified by “Mascot Search and polypeptide A MS / MS. The amino acid sequence could be confirmed from the coincidence of the B-series fragments in the spectrum.
さらに、大腸癌ポリペプチドマーカA、C及びDの化学合成品を調製し、MS並びにMS/MS分析した結果、前記血清から得られた大腸癌ポリペプチドマーカA、C及びDと同様のMS/MSスペクトルを観測した。このことから、大腸癌マーカポリペプチドA、C及びDの同定結果が正しいことが確認できた。これらのMS/MSスペクトルデータを図21に示した。 Furthermore, as a result of preparing chemically synthesized products of colorectal cancer polypeptide markers A, C and D and performing MS and MS / MS analysis, the same MS / as the colorectal cancer polypeptide markers A, C and D obtained from the serum. MS spectrum was observed. From this, it was confirmed that the identification results of the colon cancer marker polypeptides A, C and D were correct. These MS / MS spectral data are shown in FIG.
(実施例5) 大腸癌ペプチドマーカの評価
大腸癌摘出手術前と手術後の大腸癌患者血清中のペプチドマーカAの存在量の定量解析により、本発明の大腸癌ペプチドマーカを評価した。
一人の大腸癌患者の大腸癌摘出手術前と手術後の血清中のペプチドマーカAの存在量を安定同位体(13C)標識ペプチドマーカAを使用して定量解析を行った。その実験フローチャートを図16に示す。この方法ではポリペプチド中の一部のアミノ酸の主鎖のカルボニル炭素を安定同位体炭素(13C)に置換した。このため質量以外の性質、つまりK法での濃縮効率、逆相HPLCの溶出時間、質量分析時のイオン化効率は同じである。したがって図16に示すとおり、K法処理前の血清に一定量の13C標識ペプチドAを一定量導入し、MSスペクトル上でペプチドマーカAと13C標識ペプチドマーカAの強度を比較することにより、本来の血清中に存在するペプチドマーカAの存在量を定量することが出来る。(Example 5) Evaluation of colorectal cancer peptide marker
The colorectal cancer peptide marker of the present invention was evaluated by quantitative analysis of the abundance of peptide marker A in the serum of colorectal cancer patients before and after colorectal cancer excision surgery.
Using a stable isotope ( 13 C) -labeled peptide marker A, quantitative analysis was performed on the abundance of peptide marker A in the serum before and after surgery to remove colorectal cancer in one colorectal cancer patient. The experimental flowchart is shown in FIG. In this method, the carbonyl carbon in the main chain of some amino acids in the polypeptide was substituted with a stable isotope carbon ( 13 C). For this reason, properties other than mass, that is, concentration efficiency by the K method, elution time of reverse phase HPLC, and ionization efficiency during mass analysis are the same. Therefore, as shown in FIG. 16, by introducing a certain amount of 13 C-labeled peptide A into the serum before the K method treatment and comparing the intensities of peptide marker A and 13 C-labeled peptide marker A on the MS spectrum, The amount of peptide marker A present in the original serum can be quantified.
図18に13C標識ペプチドマーカAを使って大腸癌摘出手術前及び手術後の同一患者血清中に含まれているペプチドマーカAの濃度を定量解析した結果を示す。13C標識ペプチドマーカAと本来血清中に存在するペプチドマーカAのMSスペクトルの強度比は手術前に0.63:1であったが、手術後は0.15:1に減少していた。このことから血清中に存在するペプチドマーカAの濃度は手術前に15.8 fmol/mlであったものが、手術後に3.8 fmol/mlに減少していることがわかる。この実験を4回繰り返した結果、再現性は非常に高くCV値は5%以下であった。
この結果から、血清中のペプチドマーカAの存在量は体内の大腸癌の有無(または存在量)に相関しており、大腸癌診断マーカとしての十分な有効性があると評価できる。FIG. 18 shows the result of quantitative analysis of the concentration of peptide marker A contained in the serum of the same patient before and after colorectal cancer excision surgery using 13 C-labeled peptide marker A. The intensity ratio of the MS spectrum of 13 C-labeled peptide marker A and peptide marker A originally present in serum was 0.63: 1 before surgery, but decreased to 0.15: 1 after surgery. This shows that the concentration of peptide marker A present in the serum was 15.8 fmol / ml before the operation, but decreased to 3.8 fmol / ml after the operation. As a result of repeating this experiment four times, the reproducibility was very high and the CV value was 5% or less.
From this result, the abundance of peptide marker A in serum correlates with the presence or absence (or abundance) of colorectal cancer in the body, and can be evaluated as having sufficient effectiveness as a colorectal cancer diagnostic marker.
(実施例6) 1人の大腸癌患者血清における3種類のポリペプチドマーカA,C及びDの定量とその結果
まず、本発明のペプチドA、C及びDと、その安定同位体標識ペプチドを用意した。該標識ペプチドと標識に用いた同位体は次のとおりである。
(安定同位体標識ペプチド)
*下線のアミノ酸を下表の安定同位体標識アミノ酸(FMOC体)を使って化学合成
安定同位体標識ペプチドA
DEAGSEADHEGTHSTKRGHA (配列番号:1)(分子量の増加分:17)
安定同位体標識ペプチドC
VNPFRPGDSEPPPAPGAQRAQ(配列番号:5)(分子量の増加分: 22)
安定同位体標識ペプチドD
SETESRGSESGIFTNTKESSSHHPGIAEFPSRG (配列番号:3)(分子量の増加分: 16)
First, peptides A, C and D of the present invention and their stable isotope labeled peptides were prepared. The labeled peptide and isotopes used for labeling are as follows.
(Stable isotope labeled peptide)
* Chemically synthesized stable isotope-labeled peptide A using the amino acid underlined as the stable isotope-labeled amino acid (FMOC form) in the table below
DE AG SE A DHE G THSTKR G HA (SEQ ID NO: 1) (Molecular weight increase: 17)
Stable isotope labeled peptide C
VNP F R P GDSEPPPA P GAQRAQ (SEQ ID NO: 5) (molecular weight increment: 22)
Stable isotope labeled peptide D
SETESR G SES G IFTNTKESSSHHP G I A EFPSR G (SEQ ID NO: 3) (Molecular weight increase: 16)
(実施例7) 大腸癌患者血清における3種類のポリペプチドマーカA,C及びDの診断応用可能性の評価
大腸癌摘出手術前と手術後の大腸癌患者5人の血清中のペプチドマーカA,C及びDの存在量の定量解析により、本発明の大腸癌ペプチドマーカを再評価した。該評価には、実施例6と同じ安定同位体標識ペプチド、及び解析手順を用いた。なお、該血清1ml当り、安定同位体標識ペプチドA2、C2及びD2をそれぞれ25fmol、5fmol及び50fmolを加えた点だけが相違している。(Example 7) Evaluation of diagnostic applicability of three types of polypeptide markers A, C and D in colorectal cancer patient serum Peptide marker A in the serum of 5 colorectal cancer patients before and after colorectal cancer extraction surgery, The colorectal cancer peptide marker of the present invention was re-evaluated by quantitative analysis of the abundance of C and D. For the evaluation, the same stable isotope-labeled peptide and analysis procedure as in Example 6 were used. The only difference is that 25 fmol, 5 fmol and 50 fmol of stable isotope labeled peptides A2, C2 and D2 are added per 1 ml of the serum.
下記表2に大腸癌摘出手術前及び手術後の5人の患者血清中に含まれているポリペプチドマーカA,C及びDの濃度を定量解析した結果を示した。表2に示されているように患者1〜5では、手術前はポリペプチドマーカA,C及びDの濃度は高く、手術後はその濃度は明らかに下がっている。この結果から、血清中における、本発明のポリペプチドマーカの存在量は体内の大腸癌の有無(または存在量)に相関しており、大腸癌診断マーカとしての十分な有効性があると考えられる。
(配列番号:1) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドAのアミノ酸配列を示す。該ポリペプチドはフィブリノーゲンα鎖の第605残基〜第624残基の部分ペプチドである。
(配列番号:2) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドBのアミノ酸配列を示す。該ポリペプチドはフィブリノーゲンα鎖の第604残基〜第624残基の部分ペプチドである。
(配列番号:3) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドDのアミノ酸配列を示す。該ポリペプチドはフィブリノーゲンα鎖の第542残基〜第574残基の部分ペプチドである。
(配列番号:4) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドA、B及びDのアミノ酸配列を含む、フィブリノーゲンα鎖のアミノ酸配列である。対応遺伝子の名称はFGAである。
(配列番号:5) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドCのアミノ酸配列を示す。該ポリペプチドはジキシン(Zyxin)の第36残基〜第56残基の部分ペプチドである。
(配列番号:6) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドCのアミノ酸配列を含む、ジキシンのアミノ酸配列である。対応遺伝子の名称はZYXである。(SEQ ID NO: 1) This shows the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide A of the present invention. The polypeptide is a partial peptide of residues 605 to 624 of the fibrinogen α chain.
(SEQ ID NO: 2) This shows the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide B of the present invention. The polypeptide is a partial peptide of residues 604 to 624 of the fibrinogen α chain.
(SEQ ID NO: 3) This shows the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide D of the present invention. The polypeptide is a partial peptide of residues 542 to 574 of the fibrinogen α chain.
(SEQ ID NO: 4) This is an amino acid sequence of a fibrinogen α chain including the amino acid sequences of the colon cancer marker polypeptides A, B and D of the present invention. The name of the corresponding gene is FGA.
(SEQ ID NO: 5) This shows the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide C of the present invention. The polypeptide is a partial peptide of
(SEQ ID NO: 6) This is an amino acid sequence of dixin, including the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide C of the present invention. The name of the corresponding gene is ZYX.
(配列番号:7) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドAのアミノ酸配列をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示す。
(配列番号:8) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドBのアミノ酸配列をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示す。
(配列番号:9) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドDのアミノ酸配列をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示す。
(配列番号:10) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドCのアミノ酸配列をコードするcDNAのヌクレオチド配列を示す。(SEQ ID NO: 7) This shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide A of the present invention.
(SEQ ID NO: 8) This shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide B of the present invention.
(SEQ ID NO: 9) This shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide D of the present invention.
(SEQ ID NO: 10) This shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide C of the present invention.
(配列番号:11) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドAのアミノ酸配列をコードするcDNAの混合塩基ヌクレオチド配列を示す。
(配列番号:12) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドBのアミノ酸配列をコードするcDNAの混合塩基ヌクレオチド配列を示す。
(配列番号:13) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドDのアミノ酸配列をコードするcDNAの混合塩基ヌクレオチド配列を示す。
(配列番号:14) 本発明の大腸癌マーカポリペプチドCのアミノ酸配列をコードするcDNAの混合塩基ヌクレオチド配列を示す。(SEQ ID NO: 11) This shows the mixed base nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide A of the present invention.
(SEQ ID NO: 12) This shows the mixed base nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide B of the present invention.
(SEQ ID NO: 13) This shows the mixed base nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide D of the present invention.
(SEQ ID NO: 14) This shows the mixed base nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence of colorectal cancer marker polypeptide C of the present invention.
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