JP5568829B2 - Enzymatic synthesis of quinic acid diesters and quinic acid diester derivatives - Google Patents
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Description
本発明は、新規なキナ酸ジエステル及びキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法に関し、詳しくはイオン液体中でのエステル交換反応により、キナ酸ジエステル及びキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成を簡便に安全に収率よく行う方法に関するものである。 The present invention relates to a novel method for synthesizing quinic acid diesters and quinic acid diester derivatives. More specifically, the present invention relates to enzymatic synthesis of quinic acid diesters and quinic acid diester derivatives by a transesterification reaction in an ionic liquid. It's about how to do well.
既に、発明者らは、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステルと、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）を基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、４，５−ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ；４，５−Ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌ Ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を酵素合成し得ることの知見を得ている（特許文献１の段落００５５〜００６５を参照。）。 Already, the inventors have carried out a transesterification reaction with an immobilized lipase in an ionic liquid using a caffeic acid vinyl ester obtained by transesterifying a carboxy group of caffeic acid with a vinyl group and caffeoylquinic acid (CQA) as substrates. Thus, it has been found that 4,5-dicaffeoylquinic acid (diCQA; 4,5-Dicaffeoyl Quinic acid) can be enzymatically synthesized (see paragraphs 0055 to 0065 of Patent Document 1).
ここで、一方の基質であるカフェ酸ビニルエステルは有機溶媒に溶けやすいといった性質であり、他方の基質のカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）は水に溶けやすいといった性質である。すなわち、カフェ酸ビニルエステルは疎水性イオン液体に溶解させ易く、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）は疎水性イオン液体に溶解させ難い。また、特許文献１に記載しているように、発明者らは、疎水性イオン液体が親水性イオン液体と比較してリパーゼ酵素の触媒反応が優れていることの知見を得ている。 Here, one substrate, caffeic acid vinyl ester, has a property of being easily soluble in an organic solvent, and the other substrate has caffeoylquinic acid (CQA), a property that is easily soluble in water. That is, caffeic acid vinyl ester is easily dissolved in a hydrophobic ionic liquid, and caffeoylquinic acid (CQA) is difficult to dissolve in a hydrophobic ionic liquid. Moreover, as described in Patent Document 1, the inventors have obtained knowledge that the hydrophobic ionic liquid is superior in the catalytic reaction of the lipase enzyme as compared with the hydrophilic ionic liquid.
具体例として、クロロゲン酸（５−ＣＱＡ）で説明する。クロロゲン酸は、疎水性イオン液体に溶解しないが、親水性イオン液体には溶解する。しかしながら、親水性イオン液体中では固定化リパーゼの酵素が失活する。そこで、固定化リパーゼの触媒反応に適している疎水性イオン液体と、クロロゲン酸の溶解に優れた親水性イオン液体を混合して酵素合成することを試みた。
すなわち、図１に示すように、疎水性イオン液体と親水性イオン液体を混合して作製した混合イオン液体中で、クロロゲン酸とカフェ酸ビニルエステルとを基質として、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）の酵素合成を試みた。しかしながら、クロロゲン酸の溶解と酵素活性の発現を両立できる混合イオン液体を見出すことはできず、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）の酵素合成はできなかった。
As a specific example, chlorogenic acid (5-CQA) will be described. Chlorogenic acid does not dissolve in hydrophobic ionic liquids, but dissolves in hydrophilic ionic liquids. However, the immobilized lipase enzyme is inactivated in the hydrophilic ionic liquid. Therefore, an enzymatic synthesis was attempted by mixing a hydrophobic ionic liquid suitable for the catalytic reaction of immobilized lipase and a hydrophilic ionic liquid excellent in dissolution of chlorogenic acid.
That is, as shown in FIG. 1, dicaffeoylquinic acid (diCQA) is prepared using chlorogenic acid and caffeic acid vinyl ester as substrates in a mixed ionic liquid prepared by mixing a hydrophobic ionic liquid and a hydrophilic ionic liquid. I tried to synthesize the enzyme. However, it was not possible to find a mixed ionic liquid capable of achieving both dissolution of chlorogenic acid and expression of enzyme activity, and enzymatic synthesis of dicaffeoylquinic acid (diCQA) could not be performed.
上記状況下、本発明は、リパーゼ酵素の活性が優れている疎水性イオン溶液および微生物が生産する酵素を用いて、桂皮酸類、特に生理活性が高いカフェ酸から付加価値の高いジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）を少ない工程で工業生産レベルに酵素合成することを目的とする。
すなわち、本発明は、かかる目的を達成すべく、イオン液体中でのエステル交換反応により、キナ酸ジエステル及びキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成を簡便に効率よく行う方法を提供するものである。
Under the above circumstances, the present invention uses a hydrophobic ionic solution having excellent lipase enzyme activity and an enzyme produced by a microorganism to use cinnamic acids, particularly dicaffeoylquinic acid having a high added value from caffeic acid having a high physiological activity. The object is to enzymatically synthesize (diCQA) to industrial production levels with few steps.
That is, the present invention provides a method for simply and efficiently carrying out enzymatic synthesis of quinic acid diesters and quinic acid diester derivatives by transesterification in an ionic liquid in order to achieve this object.
上記状況下、本発明者らは、クロロゲン酸に修飾基をつけて疎水性にしておき、リパーゼの触媒反応として優れている疎水性イオン液体に溶解させ易くすれば、その後の酵素反応がスムーズに進むのではないかと仮説を立てた。
本発明者らは、このような事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、クロロゲン酸を疎水性にできる修飾基はメチル基以外にもあるが（例えば、エチル基，プロピル基，ブチル基など）、リパーゼ（ＬｉｐｏｚｙｍｅＴＬ−ＩＭ）がカフェオイル基をエステル交換する基質に最も適しているのがメチルエステルであることを見出した。そして、キナ酸のカルボキシ基をメチル化し疎水性を上げたものと、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したものとを基質として、両者を疎水性イオン液体中で酵素によるエステル交換反応を施すことにより、少ない工程でキナ酸ジエステル誘導体を高い収率で酵素合成できることの知見を得て、本発明に至った。
Under the above circumstances, the present inventors have made a hydrophobic group by adding a modifying group to chlorogenic acid and making it easily dissolved in a hydrophobic ionic liquid that is excellent as a catalytic reaction of lipase, so that the subsequent enzyme reaction is smooth. I hypothesized that it would go on.
As a result of intensive studies in view of such circumstances, the present inventors have other modifying groups that can make chlorogenic acid hydrophobic (for example, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, etc.) It has been found that lipase (Lipozyme TL-IM) is most suitable as a substrate for transesterifying the caffeoyl group. Then, the carboxy group of quinic acid was methylated to increase its hydrophobicity and the cinnamic acid carboxy group was transesterified with a vinyl group, and both were subjected to an enzyme transesterification reaction in a hydrophobic ionic liquid. As a result, the inventors have obtained the knowledge that the quinic acid diester derivative can be enzymatically synthesized with a high yield in a small number of steps, and the present invention has been achieved.
すなわち、上記課題を達成すべく、本発明の第１の観点によれば、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸の桂皮酸エステルとを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、手順１−１〜１−２を備えたキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法が提供される。
（手順１−１）キナ酸の桂皮酸エステルのキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順１−２）メチルエステル化したものと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
That is, in order to achieve the above object, according to a first aspect of the present invention, a cinnamic acid vinyl ester obtained by transesterifying a cinnamate acid with a vinyl group and a cinnamic acid ester of quinic acid as substrates, There is provided an enzymatic synthesis method of a quinic acid diester derivative, which is a transesterification reaction with an immobilized enzyme in a liquid, and comprises steps 1-1 to 1-2.
(Procedure 1-1) Step of methyl esterifying the carboxy group at the quinic acid moiety of the cinnamate ester of quinic acid (Procedure 1-2) Establishing the esterified methyl ester and cinnamic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid Exchange reaction step
かかるキナ酸ジエステルの酵素合成法によれば、桂皮酸類のビニルエステルから目的とするキナ酸ジエステル誘導体を簡便かつ安全に、また高い収率で得ることができる。一段階の反応で目的生成物が得られ効率がよく、また本発明のエステル交換反応は一相系で行われるため多様な基質と酵素を使用でき、また有機溶媒類を用いないので環境に優しく、イオン液体および酵素がリサイクル利用できるといった利点を有する。 According to such an enzymatic synthesis method of quinic acid diester, the desired quinic acid diester derivative can be obtained easily and safely at a high yield from the cinnamic acid vinyl ester. The target product is obtained in a single step and is efficient, and the transesterification reaction of the present invention is carried out in a one-phase system, so that various substrates and enzymes can be used, and no organic solvents are used. , Ionic liquids and enzymes can be recycled.
ここで、上記のイオン液体は、疎水性のものであることが好適である。親水性のイオン液体よりも、疎水性のイオン液体の方が、エステル交換反応の変換率が極めて高いからである。
また、上記の固定化酵素は、リパーゼ類であることが好適である。更にかかるリパーゼ類は、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標） ＴＬ−ＩＭであることが好ましい。後述する酵素スクリーニング結果から、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標） ＴＬ−ＩＭが、キナ酸ジエステル誘導体のエステル交換反応を示すという知見を得たものである。
Here, the ionic liquid is preferably hydrophobic. This is because the conversion rate of the transesterification reaction is much higher in the hydrophobic ionic liquid than in the hydrophilic ionic liquid.
The immobilized enzyme is preferably a lipase. Further, the lipase is preferably Lipozyme (registered trademark) TL-IM. From the enzyme screening results described below, we have obtained the knowledge that Lipozyme (registered trademark) TL-IM exhibits a transesterification reaction of a quinic acid diester derivative.
また、桂皮酸類は、特に制限はないが、コーヒーなどの植物等の天然物中の成分として存在するものが好ましく、例えば、桂皮酸、カフェ酸、ヒドロキシ桂皮酸、フェルラ酸、ヘスペリチン酸、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、およびシナピン酸の群から選択されたものである。
また、酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
また、疎水性イオン液体は、[Ｂｄｍｉｍ][ＮＴｆ２]，[Ｂｍｉｎ] [ＮＴｆ２]，[Ｂｍｐｒｏ] [ＮＴｆ２]のいずれかであることが好ましい。すなわち、疎水性イオン液体は、アニオンに[ＮＴｆ２]をもつことが好ましい。
Cinnamic acids are not particularly limited, but are preferably present as components in natural products such as coffee plants, such as cinnamic acid, caffeic acid, hydroxycinnamic acid, ferulic acid, hesperic acid, 3, One selected from the group of 4-dihydroxyphenylpropionic acid, 3-phenylpropionic acid, and sinapinic acid.
Moreover, the substances necessary for the enzyme reaction are only the substrate and the immobilized enzyme and ionic liquid, and no organic solvent such as acetone or polyethylene glycol (PEG) is added.
The hydrophobic ionic liquid is preferably any one of [Bdmim] [NTf 2 ], [Bmin] [NTf 2 ], and [Bmpro] [NTf 2 ]. That is, the hydrophobic ionic liquid preferably has [NTf 2 ] in the anion.
次に、本発明の第２の観点によれば、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸の桂皮酸エステルとを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、手順１−１〜１−３を備えたキナ酸ジエステルの酵素合成法が提供される。
（手順１−２）キナ酸の桂皮酸エステルのキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順１−２）メチルエステル化したものと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（手順１−３）エステル交換反応のステップにより得られたキナ酸ジエステル誘導体のメチルエステル結合を加水分解するステップ
Next, according to a second aspect of the present invention, an immobilized enzyme in an ionic liquid using a cinnamic acid vinyl ester obtained by transesterifying a carboxy group of cinnamic acid with a vinyl group and a cinnamic acid ester of quinic acid as substrates. A method for the enzymatic synthesis of quinic acid diesters comprising steps 1-1 to 1-3.
(Procedure 1-2) Step of methyl esterifying the carboxy group at the quinic acid site of the cinnamate ester of quinic acid (Procedure 1-2) Establishing the esterified methyl ester and cinnamic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid Step of exchange reaction (Procedure 1-3) Step of hydrolyzing the methyl ester bond of the quinic acid diester derivative obtained by the step of transesterification
次に、本発明の第３の観点によれば、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）と、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、手順２−１〜２−２を備えたキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法が提供される。
（手順２−１）カフェオイルキナ酸のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順２−２）メチルエステル化したカフェオイルキナ酸メチル（ＣＱＡ−Ｍｅ）とカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
Next, according to the third aspect of the present invention, an ionic liquid containing caffeic acid vinyl ester obtained by transesterifying the carboxy group of caffeic acid with a vinyl group and caffeoylquinic acid (CQA) as substrates is used. There is provided an enzymatic synthesis method of a quinic acid diester derivative, which is a transesterification reaction with an immobilized lipase, comprising steps 2-1 to 2-2.
(Procedure 2-1) Step of methyl esterifying the carboxy group of the quinic acid moiety of caffeoylquinic acid (Procedure 2-2) Methyl esterified methyl caffeoylquinate (CQA-Me) and caffeic acid vinyl ester Transesterification step in hydrophobic ionic liquid
次に、本発明の第４の観点によれば、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）と、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、手順２−１〜２−３を備えたキナ酸ジエステルの酵素合成法が提供される。
（手順２−１）カフェオイルキナ酸のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順２−２）メチルエステル化したカフェオイルキナ酸メチル（ＣＱＡ−Ｍｅ）とカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（手順２−３）エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップ
Next, according to a fourth aspect of the present invention, an ionic liquid containing caffeic acid vinyl ester obtained by transesterifying a carboxy group of caffeic acid with a vinyl group and caffeoylquinic acid (CQA) as substrates. There is provided an enzymatic synthesis method of a quinic acid diester comprising transesterification with an immobilized lipase and comprising steps 2-1 to 2-3.
(Procedure 2-1) Step of methyl esterifying the carboxy group of the quinic acid moiety of caffeoylquinic acid (Procedure 2-2) Methyl esterified methyl caffeoylquinate (CQA-Me) and caffeic acid vinyl ester Step of transesterification in hydrophobic ionic liquid (Procedure 2-3) Step of hydrolyzing methyl ester bond of methyl dicaffeoylquinate (diCQA-Me) obtained by transesterification
次に、本発明の第５の観点によれば、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、手順３−１〜３−２を備えたキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法が提供される。
（手順３−１）キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順３−２）メチルエステル化したキナ酸メチルと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
Next, according to the fifth aspect of the present invention, transesterification by an immobilized enzyme in an ionic liquid using cinnamic acid vinyl ester obtained by transesterifying the carboxy group of cinnamic acid with a vinyl group and quinic acid as a substrate. A method for synthesizing a quinic acid diester derivative comprising procedures 3-1 to 3-2 is provided.
(Procedure 3-1) Step of methyl esterifying the carboxy group of quinic acid (Procedure 3-2) Step of transesterifying methyl esterified methyl quinate and cinnamic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid
次に、本発明の第６の観点によれば、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、手順３−１〜３−３を備えたキナ酸ジエステルの酵素合成法が提供される。
（手順３−１）キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順３−２）メチルエステル化したキナ酸メチルと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（手順３−３）エステル交換反応のステップにより得られたキナ酸ジエステル誘導体のメチルエステル結合を加水分解するステップ
Next, according to the sixth aspect of the present invention, transesterification reaction is carried out by an immobilized enzyme in an ionic liquid using cinnamic acid vinyl ester obtained by transesterifying the carboxy group of cinnamic acid with vinyl group and quinic acid as a substrate. A method for synthesizing a quinic acid diester comprising steps 3-1 to 3-3 is provided.
(Procedure 3-1) Step of methyl esterifying the carboxy group of quinic acid (Procedure 3-2) Transesterification reaction of methyl esterified methyl quinate and cinnamic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid (Procedure 3-2) 3-3) Hydrolyzing the methyl ester bond of the quinic acid diester derivative obtained by the transesterification step
次に、本発明の第７の観点によれば、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）と、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、手順４−１〜４−２を備えたキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法が提供される。
（手順４−１）キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順４−２）メチルエステル化したキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
Next, according to the seventh aspect of the present invention, an immobilized lipase in an ionic liquid using a vinyl caffeate obtained by transesterifying a carboxy group of caffeic acid with a vinyl group and quinic acid as substrates. A method of enzymatic synthesis of a quinic acid diester derivative comprising steps 4-1 to 4-2 is provided.
(Procedure 4-1) Step of methyl esterifying the carboxy group of quinic acid (Procedure 4-2) Step of transesterifying methyl esterified methyl quinate and vinyl caffeate in a hydrophobic ionic liquid
次に、本発明の第８の観点によれば、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ ｃａｆｆｅａｔｅ）と、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、手順４−１〜４−３を備えたキナ酸ジエステルの酵素合成法が提供される。
（手順４−１）キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順４−２）メチルエステル化したキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（手順４−３）エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップ
Next, according to an eighth aspect of the present invention, an immobilized lipase in an ionic liquid using a vinyl caffeic acid ester obtained by transesterifying a carboxy group of caffeic acid with a vinyl group and quinic acid as substrates. A method for enzymatic synthesis of quinic acid diesters comprising steps 4-1 to 4-3.
(Procedure 4-1) Step of methyl esterifying carboxy group of quinic acid (Procedure 4-2) Step of transesterifying methyl esterified methyl quinate and caffeic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid (Procedure 4-1) 4-3) Hydrolyzing methyl ester bond of methyl dicaffeoylquinate (diCQA-Me) obtained by transesterification
本発明により、イオン液体中でのエステル交換反応により、キナ酸ジエステル及びキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成を簡便に効率よく行う方法が提供できる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a method for simply and efficiently performing enzymatic synthesis of a quinic acid diester and a quinic acid diester derivative by an ester exchange reaction in an ionic liquid.
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following examples and illustrated examples.
実施例１は、以下の（１）〜（３）の処理を行って、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）を酵素合成する方法について、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）としてクロロゲン酸（５−ＣＱＡ）を用いた処理を詳細に説明する。
（１）カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（２）メチルエステル化したカフェオイルキナ酸メチル（ＣＱＡ−Ｍｅ）とカフェ酸ビニルエステルとを基質として、疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（３）エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップ
Example 1 is a method for enzymatically synthesizing dicaffeoylquinic acid (diCQA) by performing the following treatments (1) to (3). Chlorogenic acid (5-CQA) as caffeoylquinic acid (CQA) The process using is described in detail.
(1) Step of methyl esterifying the carboxy group of the quinic acid site of caffeoylquinic acid (CQA) (2) Using methyl esterified methyl caffeoylquinate (CQA-Me) and caffeic acid vinyl ester as substrates, Step of transesterification in hydrophobic ionic liquid (3) Step of hydrolyzing methyl ester bond of methyl dicaffeoylquinate (diCQA-Me) obtained by transesterification
（５−ＣＱＡ−Ｍｅの合成）
先ず、クロロゲン酸（５−ＣＱＡ）のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップについて説明する。図２に、クロロゲン酸からクロロゲン酸メチル（５−ＣＱＡ−Ｍｅ；５−カフェオイルキナ酸メチル）への酵素変換のイメージを示す。
図５に示すように、クロロゲン酸からクロロゲン酸メチルへの酵素変換は、具体的には、１０.０ｍｌ用スクリューキャップ付きバイアル瓶に５−ＣＱＡ １７.７ｍｇと、もう１種類の基質であるメタノール
９８ μｌ、[Ｂｍｉｍ][ＮＴＦ２] ０．９０２ ｍｌ、３オングストローム モレキュラーシーブ １５ｍｇを加え、オイルバス中で４０℃、１０分間予備加温した。ここに、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５を１．５×１０４
Ｕを加え、４０℃、２００ｒｐｍ （Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ ＳＷ−ＲＳ７７７Ｄ、ＮＩＳＳＩＮ) で撹拌した。経時的にサンプリングし、ＨＰＬＣ分析に供した。クロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）からクロロゲン酸メチル（５−カフェオイルキナ酸メチル）への酵素変換の変換率は、９３％であった。
(Synthesis of 5-CQA-Me)
First, the step of methyl esterifying the carboxy group of the quinic acid moiety of chlorogenic acid (5-CQA) will be described. FIG. 2 shows an image of enzyme conversion from chlorogenic acid to methyl chlorogenic acid (5-CQA-Me; methyl 5-caffeoylquinate).
As shown in FIG. 5, the enzyme conversion from chlorogenic acid to methyl chlorogenic acid is specifically performed by 17.7 mg of 5-CQA in a 10.0 ml screw cap vial and methanol which is another type of substrate. 98 μl, [Bmim] [NTF 2 ] 0.902 ml, 3 angstrom molecular sieves 15 mg were added and pre-warmed in an oil bath at 40 ° C. for 10 minutes. Here, Novozyme 435 is 1.5 × 10 4
U was added, and the mixture was stirred at 40 ° C. and 200 rpm (Magnetic stirrer SW-RS777D, NISSIN). Samples were taken over time and subjected to HPLC analysis. The conversion rate of enzyme conversion from chlorogenic acid (5-caffeoylquinic acid) to methyl chlorogenic acid (methyl 5-caffeoylquinic acid) was 93%.
反応液からサンプルを採取し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；High
Performance Liquid Chromatography)にて分析を行なった。ＨＰＬＣ分析は、ＨＩＴＡＣＨＩ Ｄ−２０００ Ｅｌｉｔｅ（日立ハイテクノロジー）とＣｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ１８−ＡＲIIカラム(４．６ ｍｍ Ｉ．Ｄ．× ２５０ ｍｍ、Ｎａｃａｒａｉ
ｔｅｓｑｕｅ Ｉｎｃ.) を用い、移動相に０．２％（ｖ／ｖ）酢酸とメタノールを用いた。１０分間でメタノールが３０％から６０％（ｖ／ｖ）になるようにグラジエントをかけ、その後１５分間１００％メタノールを流した。カラム温度４０℃、流速１．０
ｍｌ／ｍｉｎで分析し、３３０ ｎｍにおける吸光度を検出した。
ＨＰＬＣの分析結果を図３に示す。分析結果から、５−カフェオイルキナ酸のリテンションタイムとは全く異なる場所に新規ピークが生じていることが確認できた。
A sample is taken from the reaction solution and subjected to high performance liquid chromatography (HPLC; High
Performance Liquid Chromatography). HPLC analysis was performed using HITACHI D-2000 Elite (Hitachi High Technology) and Cosmosil.
5C18-ARII column (4.6 mm ID x 250 mm, Nacarai
tesque Inc.) and 0.2% (v / v) acetic acid and methanol in the mobile phase. Gradient was applied so that methanol would be 30% to 60% (v / v) in 10 minutes, and then 100% methanol was allowed to flow for 15 minutes. Column temperature 40 ° C, flow rate 1.0
Analysis was performed at ml / min, and absorbance at 330 nm was detected.
The analysis result of HPLC is shown in FIG. From the analysis results, it was confirmed that a new peak was generated at a place completely different from the retention time of 5-caffeoylquinic acid.
５−ＣＱＡとメタノールをイオン液体[Ｂｍｉｍ][ＮＴｆ２]の存在下で、酵素反応によって生じた物質を単離し、ＮＭＲ(Nuclear
Magnetic Resonance Spectroscopy)分析を行なった。ＮＭＲ分析の結果、この酵素反応によって生じた物質は、図４に示す構造の５−ＣＱＡ−Ｍｅ（５−カフェオイルキナ酸メチル）であることが確認できた。なお、ＮＭＲ分析に用いた分析機器は、BRUKER ULTRASHIELD 400 PLUSである。
ＮＭＲ分析の結果について、下表１に示す。なお、対応する符号数字（１〜６，１´〜９´）は、図４の構造図に表記しているものに対応している。
The substance produced by the enzymatic reaction was isolated from 5-CQA and methanol in the presence of the ionic liquid [Bmim] [NTf 2 ], and NMR (Nuclear
Magnetic Resonance Spectroscopy) analysis was performed. As a result of NMR analysis, it was confirmed that the substance produced by this enzymatic reaction was 5-CQA-Me (methyl 5-caffeoylquinate) having the structure shown in FIG. The analytical instrument used for the NMR analysis is BRUKER ULTRASHIELD 400 PLUS.
The results of NMR analysis are shown in Table 1 below. Corresponding reference numerals (1-6, 1′-9 ′) correspond to those shown in the structural diagram of FIG.
（ｄｉＣＱＡの合成：酵素スクリーニング）
５−カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルからジカフェオイルキナ酸メチルへの変換が可能かどうかについて、市販の酵素製剤１２種類を用いて酵素のスクリーニングを行なった。スクリーニングに用いたのは、５−カフェオイルキナ酸メチル（１５ｍＭ；５．５０ｍｇ）とカフェ酸ビニルエステル（８５ｍＭ；１７．５ｍｇ）である。これらを１０．０ ｍｌ容スクリューキャップ付きバイアル瓶にイオン液体[Ｂｍｉｍ] [ＮＴｆ２] ０．５ｍｌ、３オングストローム モレキュラーシーブ １５ ｍｇとともに添加し、オイルバス中で４０℃、１０分間予備加温した。さらに、リパーゼ酵素製剤５ｍｇと共に、６０℃，１７０
ｒｐｍで撹拌し反応開始した。１４４時間インキュベートしたところ（図６を参照）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ−ＩＭを使用したときのみ新規ピークの出現が確認できた。
(DiCQA synthesis: enzyme screening)
Enzyme screening was performed using 12 types of commercially available enzyme preparations to determine whether conversion from methyl 5-caffeoylquinate and vinyl caffeate to methyl dicaffeoylquinate is possible. It was methyl 5-caffeoylquinate (15 mM; 5.50 mg) and caffeic acid vinyl ester (85 mM; 17.5 mg) used for the screening. These were added to a vial with a 10.0 ml screw cap together with 0.5 ml of ionic liquid [Bmim] [NTf 2 ] together with 15 mg of 3 angstrom molecular sieve and pre-warmed in an oil bath at 40 ° C. for 10 minutes. Furthermore, together with 5 mg of lipase enzyme preparation,
The reaction was started by stirring at rpm. When incubated for 144 hours (see FIG. 6), the appearance of a new peak could be confirmed only when Lipozyme TL-IM was used.
反応液からサンプルを採取し、ＨＰＬＣ分析を行なった。ＨＰＬＣクロマトグラムを図７に示す。分析の結果、５−カフェオイルキナ酸およびカフェ酸ビニルのリテンションタイムとは全く異なる場所に新規ピークが生じていた（図８のＨＰＬＣクロマトグラムの拡大図を参照）。 A sample was taken from the reaction solution and subjected to HPLC analysis. The HPLC chromatogram is shown in FIG. As a result of the analysis, a new peak was generated at a place completely different from the retention time of 5-caffeoylquinic acid and vinyl caffeate (see the enlarged view of the HPLC chromatogram in FIG. 8).
（反応生成物の精製）
反応液に対して、ｎ−ヘキサン：２−プロパノール
／ ２：１（ｖ／ｖ） ３．０ ｍｌを加えて激しく攪拌し、生成物と残存する基質を抽出した。得られた抽出液を減圧濃縮してシリカゲルカラム（径２６ｍｍ×４００ｍｍ、
ワコーゲル Ｃ−２００）に供して、クロロホルム : 酢酸エチル／１ : １（ｖ／ｖ）でカフェ酸ビニルエステルと反応副産物を溶出した。その後、メタノールで５−カフェオイルキナ酸メチルと新規ピーク物質を溶出させた。
次に、この工程で得たメタノール溶出画分を減圧乾固させ、ＨＣｌ酸性水（ｐＨ３）に再溶解した。その後、ＨＣｌ酸性水で活性化させたＳＰ２０７カラム（径２６ｍｍ×４００ｍｍ）にサンプルをアプライした。ＨＣｌ酸性水でＳＰ２０７樹脂にサンプルを吸着させた後、まず３０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液（ｐＨ３）で５−カフェオイルキナ酸メチルを溶出させ、その後、１００％エタノールで新規ピーク物質を溶出させた。溶出画分を一つにまとめ、濃縮、凍結乾燥を行なった。
(Purification of reaction product)
To the reaction solution, 3.0 ml of n-hexane: 2-propanol / 2: 1 (v / v) was added and stirred vigorously to extract the product and the remaining substrate. The obtained extract was concentrated under reduced pressure to obtain a silica gel column (diameter 26 mm × 400 mm,
Wako Gel C-200) was used to elute the caffeic acid vinyl ester and the reaction by-product with chloroform: ethyl acetate / 1: 1 (v / v). Thereafter, methyl 5-caffeoylquinate and a new peak substance were eluted with methanol.
Next, the methanol elution fraction obtained in this step was dried under reduced pressure and redissolved in HCl acidic water (pH 3). Thereafter, the sample was applied to an SP207 column (diameter 26 mm × 400 mm) activated with HCl acidic water. After adsorbing the sample to SP207 resin with HCl acidic water, first elute methyl 5-caffeoylquinate with 30% (v / v) ethanol aqueous solution (pH 3), then elute new peak substance with 100% ethanol I let you. The eluted fractions were combined, concentrated and freeze-dried.
（ＬＣ−ＭＳによる分析）
５−カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルをイオン液体[Ｂｍｉｍ] [ＮＴｆ２]の存在下で、リパーゼ（ＬｉｐｏｚｙｍｅＴＬ−ＩＭ）によって新たに生成した物質について、ＬＣ−ＭＳ分析（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｏｎ ｍｏｄｅ）を行なった。ＬＣ−ＭＳは以下のものを使用した。
・ＨＰＬＣ：Ａｌｌｉａｎｃｅ
ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏ．ＵＳＡ）
・ＭＳ：Ｑ−ＴＯＦ
Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏ．ＵＳＡ）
ここで、ＬＣ−ＭＳ分析条件は、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸:メタノール／ ７０:３０（ｖ／ｖ）で平衡化したカラムに、２５．０分間でメタノールが３０％から６０％（ｖ／ｖ）になるようにグラジエントをかけ、その後３７分間１００％メタノールを流した後、１３分間、最初の溶媒比率でカラムを再平衡化した。
(Analysis by LC-MS)
LC-MS analysis (Negative ion mode) of a substance newly generated by lipase (Lipozyme TL-IM) in the presence of ionic liquid [Bmim] [NTf 2 ] with methyl 5-caffeoylquinate and vinyl caffeate I did it. The following were used for LC-MS.
・ HPLC: Alliance
HPLC system (Waters Co. USA)
・ MS: Q-TOF
Premier (Waters Co. USA)
Here, LC-MS analysis conditions were as follows: a column equilibrated with 0.2% (v / v) acetic acid: methanol / 70: 30 (v / v), and methanol was 30% to 60% in 25.0 minutes. The gradient was set to (v / v), then flushed with 100% methanol for 37 minutes, and then the column was re-equilibrated with the initial solvent ratio for 13 minutes.
ＬＣ−ＭＳ分析結果を図９に示す。図９に示すように、ＬＣ−ＭＳ分析の結果、衝突エネルギーが５Ｖのときで５２９（ｍ／ｚ）が得られた。この新規反応生成物質の分子イオンピーク５２９（ｍ／ｚ）は、ジカフェオイルキナ酸メチルの分子量５３０と一致した。さらに衝突エネルギーが２０Ｖのとき３６７（ｍ／ｚ）と１７９（ｍ／ｚ）が観察された。これらはそれぞれ、新規反応生成物質が開裂しカフェオイル基が脱離したもの、および脱離したカフェオイル基のフラグメントピークの（ｍ／ｚ）と一致した。これらの結果から、新規ピーク物質はジカフェオイルキナ酸メチルと同定した。 The LC-MS analysis results are shown in FIG. As shown in FIG. 9, 529 (m / z) was obtained when the collision energy was 5 V as a result of LC-MS analysis. The molecular ion peak 529 (m / z) of this new reaction product coincided with the molecular weight 530 of methyl dicaffeoylquinate. Further, 367 (m / z) and 179 (m / z) were observed when the collision energy was 20V. These coincided with the case where the novel reaction product was cleaved and the caffeoyl group was eliminated, and the fragment peak (m / z) of the eliminated caffeoyl group, respectively. From these results, the new peak substance was identified as methyl dicaffeoylquinate.
（４,５−ｄｉＣＱＡ−Ｍｅの同定）
５−カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルをイオン液体[Ｂｍｉｍ]
[ＮＴｆ２]の存在下で、酵素反応によって生じた物質を単離し、ＮＭＲ分析を行なった。ＮＭＲ分析の結果、この酵素反応によって生じた物質は、図１０に示す構造の４，５−ｄｉＣＱＡメチル（４、５−ジカフェオイルキナ酸メチル）であることが確認できた。
ＮＭＲ分析の結果について、下表３に示す。なお、対応する符号数字（１〜６，１´〜８´等）は、図１１の構造図に表記しているものに対応している。
(Identification of 4,5-diCQA-Me)
5-Caffeoyl methyl quinate and vinyl caffeate ionic liquid [Bmim]
In the presence of [NTf 2 ], the substance produced by the enzyme reaction was isolated and subjected to NMR analysis. As a result of NMR analysis, it was confirmed that the substance produced by this enzymatic reaction was 4,5-diCQA methyl (methyl 4,5-dicaffeoylquinate) having the structure shown in FIG.
The results of NMR analysis are shown in Table 3 below. Corresponding reference numerals (1 to 6, 1 'to 8', etc.) correspond to those shown in the structural diagram of FIG.
（ｄｉＣＡＱ−Ｍｅを合成できるイオン液体の探索）
５−カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルからジカフェオイルキナ酸メチルへの変換において、どのようなイオン液体を用いれば最も収率が適切かについて、下表４に示すイオン液体および有機溶媒（合計９種類）を用いて反応溶媒のスクリーニングを行なった。
(Search for ionic liquid capable of synthesizing diCAQ-Me)
In the conversion of methyl 5-caffeoylquinate and vinyl caffeate to methyl dicaffeoylquinate, the ionic liquids and organic solvents (see Table 4 below) The reaction solvent was screened using a total of nine types.
反応溶媒のスクリーニングは、カフェオイルキナ酸メチル（１０．８ｍＭ；３．９６ｍｇ）とカフェ酸ビニルエステル（４３．２ｍＭ；８．９０ｍｇ）、３オングストローム
モレキュラーシーブ ５ｍｇとを上記表４に示すイオン液体および有機溶媒（合計９種類）０．２５ｍｌ中に添加し、オイルバス中で６０℃、１０分間予備加温した。その後、ＬｉｐｏｚｙｍｅＴＬ−ＩＭ
５ｍｇと共に６０℃、１７０ｒｐｍで１４４時間インキュベートした。
反応液からサンプルを採取し、ＨＰＬＣ分析を行なった。ＨＰＬＣ分析は、ＨＩＴＡＣＨＩ
Ｄ−２０００ ＥｌｉｔｅとＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲIIカラム(４．６
ｍｍ Ｉ.Ｄ.×２５０ｍｍ)
を用い、移動相に０．２％（ｖ／ｖ）酢酸とメタノールを用いた。２０分間でメタノールが２０％(ｖ／ｖ)から１００％になるようにグラジエントをかけ、その後１５分間１００％メタノールを流した。カラム温度４０℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで分析し、３３０ｎｍにおける吸光度を検出した。その結果、[Ｂｄｍｉｍ][ＮＴｆ２]が最も効率よくジカフェオイルキナ酸メチルを生成することが確認できた。
ここで、図１２は、上記表４に示すイオン液体の構造を示している。
Screening of the reaction solvent was carried out using methyl caffeoylquinate (10.8 mM; 3.96 mg), vinyl ester of caffeic acid (43.2 mM; 8.90 mg), 5 mg of 3 angstrom molecular sieves as shown in Table 4 above and They were added to 0.25 ml of organic solvents (9 types in total) and pre-warmed in an oil bath at 60 ° C. for 10 minutes. Then, Lipozyme TL-IM
Incubated with 5 mg at 60 ° C. and 170 rpm for 144 hours.
A sample was taken from the reaction solution and subjected to HPLC analysis. HPLC analysis is HITACHI
D-2000 Elite and Cosmosil 5C18-ARII column (4.6
mm ID x 250mm)
And 0.2% (v / v) acetic acid and methanol were used for the mobile phase. Gradient was applied so that the methanol was 20% (v / v) to 100% in 20 minutes, and then 100% methanol was allowed to flow for 15 minutes. Analysis was performed at a column temperature of 40 ° C. and a flow rate of 1.0 ml / min, and the absorbance at 330 nm was detected. As a result, it was confirmed that [Bdmim] [NTf 2 ] produced methyl dicaffeoylquinate most efficiently.
Here, FIG. 12 shows the structure of the ionic liquid shown in Table 4 above.
図１３は、ｄｉＣＱＡの酵素合成における最適なイオン液体のスクリーニング結果を示したものである。図１３から、カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応させるのに適したイオン液体としては、[Ｂｄｍｉｍ] [ＮＴｆ２]（１−Ｂｕｔｙｌ−２，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｂｉｓ(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ) ｉｍｉｄｅ）が最も相対活性が高く、次いで、[Ｂｍｉｍ] [ＮＴｆ２]（１−Ｂｕｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｂｉｓ(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ) ｉｍｉｄｅ）、[Ｂｍｐｒｏ] [ＮＴｆ２]（Ｎ−Ｂｕｔｈｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｉｕｍ ｂｉｓ(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ) ｉｍｉｄｅ）であった。アニオンに[ＮＴｆ２]をもつ疎水性イオン液体は、[ＣＦ３ＳＯ３]をもつ親水性イオン液体や有機溶媒よりも新規ピーク物質の酵素合成に適していた。 FIG. 13 shows the screening results of the optimal ionic liquid in the enzymatic synthesis of diCQA. From FIG. 13, as an ionic liquid suitable for transesterification with an immobilized enzyme in an ionic liquid using methyl caffeoylquinate and vinyl caffeate as substrates, [Bdmim] [NTf 2 ] (1- Butyl-2,3-dimethylimidazolium bis (trifluoromethanesulfonyl ) imide) is the most relative activity is high, then, [Bmim] [NTf 2] (1-buthyl-3-methylimidazolium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide), [Bmpro] [NTf 2 ] (N-Butyl-N-methylpyrrolidinium bis (trifluoromethylsulfide) imide). The hydrophobic ionic liquid having [NTf 2 ] as an anion was more suitable for enzymatic synthesis of a new peak substance than the hydrophilic ionic liquid having [CF 3 SO 3 ] or an organic solvent.
次に、実施例２は、以下の（１）〜（３）の処理を行って、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）を酵素合成する方法について、キナ酸とカフェ酸ビニルエステルとを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を行わせる処理を詳細に説明する。
（１）キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（２）メチルエステル化したキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（３）エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップ
Next, Example 2 is a method for enzymatically synthesizing dicaffeoylquinic acid (diCQA) by performing the following treatments (1) to (3), using quinic acid and caffeic acid vinyl ester as substrates: A process for carrying out a transesterification reaction with an immobilized lipase in an ionic liquid will be described in detail.
(1) Step of methyl esterifying carboxy group of quinic acid (2) Step of transesterifying methyl esterified methyl quinate and vinyl caffeate in a hydrophobic ionic liquid (3) Obtained by transesterification Hydrolyzing the methyl ester bond of the obtained methyl dicaffeoylquinate (diCQA-Me)
実施例１に示したように、イオン液体にクロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）とメタノールを溶解し、リパーゼを反応させるとクロロゲン酸メチル（５−カフェオイルキナ酸メチル）を得ることができた。
そこで、他のカフェオイルキナ酸、具体的には、３−ＣＱＡ（３−カフェオイルキナ酸）、４−ＣＱＡ（４−カフェオイルキナ酸）でも同様の反応生成物が得られるか否か実験を行なった。しかしながら、３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡではメチル化反応を行うことは困難であった。
なお、３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡの構造は、図１４のクロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）の構造式において、キナ酸の３位の位置、４位の位置がカフェ酸に置換されているものがそれぞれ３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡである。
As shown in Example 1, by dissolving chlorogenic acid (5-caffeoylquinic acid) and methanol in an ionic liquid and reacting with lipase, methyl chlorogenate (methyl 5-caffeoylquinate) can be obtained. It was.
Thus, an experiment is conducted to determine whether similar reaction products can be obtained with other caffeoylquinic acids, specifically, 3-CQA (3-caffeoylquinic acid) and 4-CQA (4-caffeoylquinic acid). Was done. However, it was difficult to carry out the methylation reaction with 3-CQA and 4-CQA.
The structures of 3-CQA and 4-CQA are the same as those in the structural formula of chlorogenic acid (5-caffeoylquinic acid) in FIG. 14 except that caffeic acid is substituted at positions 3 and 4 of quinic acid. These are 3-CQA and 4-CQA, respectively.
実施例２においては、３−ＣＱＡ（３−カフェオイルキナ酸）、４−ＣＱＡ（４−カフェオイルキナ酸）では、クロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）とは異なり、メチル化物が生成され難いことに鑑みて、先ず、キナ酸をメチル化してから、メチル化されたキナ酸メチルとカフェ酸ビニルとを作用させて、エステル交換によりクロロゲン酸メチルを合成する方法を説明する。 In Example 2, 3-CQA (3-caffeoylquinic acid) and 4-CQA (4-caffeoylquinic acid), unlike chlorogenic acid (5-caffeoylquinic acid), produced methylated products. In view of the difficulty, first, a method of synthesizing methyl chlorogenate by transesterification by methylating quinic acid and then allowing methylated methyl quinate and vinyl caffeate to act will be described.
（キナ酸メチルの合成）
キナ酸メチルの合成は、キナ酸とメタノールの存在下において、塩酸を添加し６０℃で１日反応させることにより合成した。そして、反応液を減圧乾固させ、クロロホルムに懸濁し、クロロホルム：メタノール＝９０：１０（v/v）で抽出を行った。この抽出液をサンプルとして薄層クロマトグラフィー（展開溶媒＝クロロホルム：メタノール＝７０：３０（v／v））を行い、リンモリブデン酸試薬によってキナ酸メチルと同じＲｆ値にあるスポットを確認した。
そして、この薄層上にあるスポット部分を回収して、ＮＭＲ分析に供した。
図１５は、キナ酸からキナ酸メチルへの変換イメージを示している。
(Synthesis of methyl quinate)
Methyl quinate was synthesized by adding hydrochloric acid in the presence of quinic acid and methanol and reacting at 60 ° C. for 1 day. The reaction solution was dried under reduced pressure, suspended in chloroform, and extracted with chloroform: methanol = 90: 10 (v / v). Using this extract as a sample, thin layer chromatography (developing solvent = chloroform: methanol = 70: 30 (v / v)) was performed, and a spot having the same Rf value as methyl quinate was confirmed by a phosphomolybdic acid reagent.
And the spot part on this thin layer was collect | recovered, and it used for the NMR analysis.
FIG. 15 shows an image of conversion from quinic acid to methyl quinate.
（キナ酸メチルの同定）
キナ酸とメタノールの存在下において、塩酸を添加し６０℃で１日反応させた。生じた物質を単離し、ＮＭＲ分析を行なった。その結果、キナ酸メチルであることを確認できた。また、収率は６０．２％であった。
ＮＭＲ分析の結果について、下表５に示す。なお、対応する符号数字（１〜６）は、図１６の構造図に表記しているものに対応している。
(Identification of methyl quinate)
In the presence of quinic acid and methanol, hydrochloric acid was added and reacted at 60 ° C. for 1 day. The resulting material was isolated and subjected to NMR analysis. As a result, it was confirmed that it was methyl quinate. The yield was 60.2%.
The results of NMR analysis are shown in Table 5 below. Corresponding reference numerals (1 to 6) correspond to those shown in the structural diagram of FIG.
（カフェオイルキナ酸メチルの合成における酵素スクリーニング）
キナ酸メチルとカフェ酸ビニルからカフェオイルキナ酸メチルへの変換が可能かどうかについて、市販の酵素製剤７種類（下記表６を参照）を用いて酵素のスクリーニングを行なった。
カフェ酸ビニル、キナ酸メチルをイオン液体[Ｂｍｉｍ] [ＮＴｆ２]に添加し、さらにリパーゼ酵素製剤と共に６０℃でインキュベートした。この反応液からサンプルを採取し、ヘキサンと２−プロパノール＝２：１の混合液で抽出を行い、ＨＰＬＣにて分析を行なった。その結果、リパーゼＰＬを用いたときは図にみられるように４−カフェオイルキナ酸メチルおよび５−カフェオイルキナ酸メチルと思われるピークが多く生じていた。
図１７に、キナ酸メチルとカフェ酸ビニルからカフェオイルキナ酸メチル（４−ＣＱＡメチル）への変換イメージを示す。
また、図１８は、カフェオイルキナ酸メチル合成における最適な酵素のスクリーニング結果を示すグラフである。
(Enzyme screening in synthesis of methyl caffeoylquinate)
Enzyme screening was performed using 7 types of commercially available enzyme preparations (see Table 6 below) as to whether conversion from methyl quinate and vinyl caffeate to methyl caffeoylquinate was possible.
Vinyl caffeate and methyl quinate were added to the ionic liquid [Bmim] [NTf 2 ] and further incubated at 60 ° C. with the lipase enzyme preparation. A sample was taken from this reaction solution, extracted with a mixed solution of hexane and 2-propanol = 2: 1, and analyzed by HPLC. As a result, when lipase PL was used, as shown in the figure, many peaks considered to be methyl 4-caffeoylquinate and methyl 5-caffeoylquinate were generated.
FIG. 17 shows a conversion image from methyl quinate and vinyl caffeate to methyl caffeoylquinate (4-CQA methyl).
FIG. 18 is a graph showing the screening results for the optimum enzyme in the synthesis of methyl caffeoylquinate.
（カフェオイルキナ酸メチルを合成できるイオン液体のスクリーニング）
キナ酸メチルとカフェ酸ビニルからカフェオイルキナ酸メチルへの変換において、どのようなイオン液体を用いれば最も収率が良いかについて、下記表７に示すイオン液体および有機溶媒（合計７種類）を用いて反応溶媒のスクリーニングを行なった。カフェ酸ビニルおよびキナ酸メチルを表に示すイオン液体に添加し、リパーゼＰＬと共に４０℃、２００ｒｐｍで１４４時間インキュベートした。反応液からサンプルを採取し、ヘキサンと２−プロパノール＝２：１の混合液で抽出を行い、ＨＰＬＣにて分析を行なった。ＨＰＬＣ分析の結果、[Ｂｄｍｉｍ] [ＮＴｆ２]をはじめ、疎水性イオン液体が効率よくカフェオイルキナ酸メチルを生成することが確認できた。
図１９は、カフェオイルキナ酸メチル合成における最適なイオン液体のスクリーニング結果を示すグラフである。
(Screening of ionic liquids that can synthesize methyl caffeoylquinate)
In the conversion from methyl quinate and vinyl caffeate to methyl caffeoylquinate, the ionic liquids and organic solvents (total 7 types) shown in Table 7 below are used to determine the best yield when using ionic liquids. The reaction solvent was used for screening. Vinyl caffeate and methyl quinate were added to the ionic liquids shown in the table, and incubated with lipase PL at 40 ° C. and 200 rpm for 144 hours. A sample was taken from the reaction solution, extracted with a mixed solution of hexane and 2-propanol = 2: 1, and analyzed by HPLC. As a result of HPLC analysis, it was confirmed that hydrophobic ionic liquids including [Bdmim] [NTf 2 ] efficiently produce methyl caffeoylquinate.
FIG. 19 is a graph showing the screening results of the optimum ionic liquid in the synthesis of methyl caffeoylquinate.
本発明は、キナ酸ジエステル及びキナ酸ジエステル誘導体を簡便かつ安全に高い収率で酵素合成できる方法として有用である。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful as a method capable of enzymatically synthesizing quinic acid diesters and quinic acid diester derivatives easily and safely at a high yield.
Claims (10)
キナ酸の桂皮酸エステルのキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したものと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
を備えたことを特徴とするキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法。 Cinnamic acid vinyl ester obtained by transesterifying the carboxy group of cinnamic acid with vinyl group, and cinnamate ester of quinic acid as substrate,
Methyl esterifying the carboxy group of the quinic acid moiety of the cinnamic acid ester of quinic acid;
Transesterifying the methyl esterified and cinnamic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid;
A method for synthesizing a quinic acid diester derivative characterized by comprising:
キナ酸の桂皮酸エステルのキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したものと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
前記エステル交換反応のステップにより得られたキナ酸ジエステル誘導体のメチルエステル結合を加水分解するステップと、
を備えたことを特徴とするキナ酸ジエステルの酵素合成法。 Cinnamic acid vinyl ester obtained by transesterifying the carboxy group of cinnamic acid with vinyl group, and cinnamate ester of quinic acid as substrate,
Methyl esterifying the carboxy group of the quinic acid moiety of the cinnamic acid ester of quinic acid;
Transesterifying the methyl esterified and cinnamic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid;
Hydrolyzing the methyl ester bond of the quinic acid diester derivative obtained by the transesterification step;
A method for synthesizing quinic acid diester, comprising:
カフェオイルキナ酸のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したカフェオイルキナ酸メチル（ＣＱＡ−Ｍｅ）とカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
を備え、ジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）を合成することを特徴とするキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法。 A transesterification reaction with an immobilized lipase in an ionic liquid using a caffeic acid vinyl ester obtained by transesterifying a carboxy group of caffeic acid with a vinyl group and caffeoylquinic acid (CQA) as substrates,
Methyl esterifying the carboxy group of the quinic acid site of caffeoylquinic acid;
Transesterifying methyl esterified methyl caffeoylquinate (CQA-Me) with vinyl caffeate in a hydrophobic ionic liquid;
A method for synthesizing a quinic acid diester derivative characterized by comprising synthesizing methyl dicaffeoylquinate (diCQA-Me).
カフェオイルキナ酸のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したカフェオイルキナ酸メチル（ＣＱＡ−Ｍｅ）とカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップと、
を備え、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）を合成することを特徴とするキナ酸ジエステルの酵素合成法。 A transesterification reaction with an immobilized lipase in an ionic liquid using a caffeic acid vinyl ester obtained by transesterifying a carboxy group of caffeic acid with a vinyl group and caffeoylquinic acid (CQA) as substrates,
Methyl esterifying the carboxy group of the quinic acid site of caffeoylquinic acid;
Transesterifying methyl esterified methyl caffeoylquinate (CQA-Me) with vinyl caffeate in a hydrophobic ionic liquid;
Hydrolyzing the methyl ester bond of methyl dicaffeoylquinate (diCQA-Me) obtained by the transesterification reaction;
A method for synthesizing quinic acid diester, which comprises synthesizing dicaffeoylquinic acid (diCQA).
キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したキナ酸メチルと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
を備えたことを特徴とするキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法。 Cinnamic acid vinyl ester obtained by transesterifying the carboxy group of cinnamic acid with vinyl group, and quinic acid as a substrate, an ester exchange reaction by an immobilized enzyme in an ionic liquid,
Methyl esterifying the carboxy group of quinic acid;
Transesterifying methyl esterified methyl quinate and cinnamic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid;
A method for synthesizing a quinic acid diester derivative characterized by comprising:
キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したキナ酸メチルと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
前記エステル交換反応のステップにより得られたキナ酸ジエステル誘導体のメチルエステル結合を加水分解するステップと、
を備えたことを特徴とするキナ酸ジエステルの酵素合成法。 Cinnamic acid vinyl ester obtained by transesterifying the carboxy group of cinnamic acid with vinyl group, and quinic acid as a substrate, an ester exchange reaction by an immobilized enzyme in an ionic liquid,
Methyl esterifying the carboxy group of quinic acid;
Transesterifying methyl esterified methyl quinate and cinnamic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid;
Hydrolyzing the methyl ester bond of the quinic acid diester derivative obtained by the transesterification step;
A method for synthesizing quinic acid diester, comprising:
キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
を備え、ジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）を合成することを特徴とするキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法。 A transesterification reaction with an immobilized lipase in an ionic liquid using a vinyl caffeate obtained by transesterifying a carboxy group of caffeic acid with a vinyl group and quinic acid as a substrate,
Methyl esterifying the carboxy group of quinic acid;
Transesterifying methyl esterified methyl quinate and caffeic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid;
A method for synthesizing a quinic acid diester derivative characterized by comprising synthesizing methyl dicaffeoylquinate (diCQA-Me).
キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップと、
を備え、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）を合成することを特徴とするキナ酸ジエステルの酵素合成法。 A transesterification reaction with an immobilized lipase in an ionic liquid using a vinyl caffeate obtained by transesterifying a carboxy group of caffeic acid with a vinyl group and quinic acid as a substrate,
Methyl esterifying the carboxy group of quinic acid;
Transesterifying methyl esterified methyl quinate and caffeic acid vinyl ester in a hydrophobic ionic liquid;
Hydrolyzing the methyl ester bond of methyl dicaffeoylquinate (diCQA-Me) obtained by the transesterification reaction;
A method for synthesizing quinic acid diester, which comprises synthesizing dicaffeoylquinic acid (diCQA).
The method for synthesizing a quinic acid diester according to any one of claims 2, 4, 6, and 8, wherein the hydrophobic ionic liquid has [NTf 2 ] as an anion.
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