JP5551620B2 - Cold shock protein composition and methods and kits for its use - Google Patents
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Description
優先権の主張
本願は２００８年２月２９日付けで出願された米国仮出願第６１／０６７，５９６号明細書、２００８年１０月９日付けで出願された米国仮出願第６１／１９５，７４７号明細書、及び２００８年５月１６日付けで出願された特願２００８−１２９７４５号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に対する優先権を主張するものである。
This application is based on US Provisional Application No. 61 / 067,596 filed on Feb. 29, 2008, and US Provisional Application No. 61 / 195,747 filed on Oct. 9, 2008. And the priority of Japanese Patent Application No. 2008-129745 filed on May 16, 2008 (the entire disclosure of which is incorporated herein by reference).
配列リスト
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ＤＮＡ合成は研究において様々な目的で使用される。そのうち、オリゴヌクレオチド等の短鎖ＤＮＡの化学合成を除く大抵のＤＮＡ合成は、ＤＮＡポリメラーゼを利用する酵素法によって行われる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の核酸断片を容易に増幅することが可能なＰＣＲは非常に有益であり、生物学、医学、農学、及び他の分野において必須のツールとなっている。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅においては、多くの場合、反応の高い特異性が必要とされる。非特異的増幅を低減するために新たなＤＮＡポリメラーゼの開発及び反応混合物の組成の最適化がされているが、それでも依然としてＰＣＲ増幅特異性の向上が必要とされている。 DNA synthesis is used for various purposes in research. Among them, most DNA synthesis except chemical synthesis of short-chain DNA such as oligonucleotides is performed by an enzymatic method using a DNA polymerase. PCR, which can easily amplify a desired nucleic acid fragment in vitro, is very useful and has become an essential tool in biology, medicine, agriculture, and other fields. In amplification of DNA by PCR, high specificity of the reaction is often required. Although new DNA polymerases have been developed and reaction mixture compositions have been optimized to reduce non-specific amplification, there is still a need for improved PCR amplification specificity.
ＤＮＡは、ＤＮＡを鋳型として用いる従来のＰＣＲによる以外にも、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、即ち逆転写酵素を用いることにより合成することができる。生命現象を解明するためには、様々な遺伝子のｍＲＮＡ分子の解析が非常に重要である。逆転写酵素によってＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを合成する逆転写反応が可能となり、ｍＲＮＡ分子の解析法は長足の進歩を遂げた。逆転写酵素を用いたｍＲＮＡ分子の解析法は現在、遺伝子に関する研究において必須の実験法となっている。更に該方法はクローニング技術やＰＣＲ技術にも応用され、遺伝子に関する研究のみならず、生物学、医学、農業等、幅広い分野において不可欠の技術となっている。 DNA can be synthesized by using RNA-dependent DNA polymerase, that is, reverse transcriptase, in addition to the conventional PCR using DNA as a template. In order to elucidate biological phenomena, it is very important to analyze mRNA molecules of various genes. Reverse transcriptase, which synthesizes cDNA using RNA as a template by reverse transcriptase, has become possible, and the method for analyzing mRNA molecules has made great strides. Analysis of mRNA molecules using reverse transcriptase is now an essential experimental method for gene research. Furthermore, the method is applied to cloning techniques and PCR techniques, and has become an indispensable technique in a wide range of fields such as biology, medicine, agriculture, as well as gene research.
逆転写反応の反応性を改善するための取組みも行われている。例えば、逆転写反応を高温で行う方法、逆転写酵素及び３´−５´エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いるｃＤＮＡの合成方法（特許文献１）、並びにＮｃｐ７、ｒｅｃＡ、ＳＳＢ、及びＴ４ｇｐ３２のような核酸結合タンパク質を利用する方法（特許文献２）等が検討されてきた。逆転写反応は、その反応性について改善がなされてきたが、現在においても、十分な鎖長を持ったｃＤＮＡを合成できない場合や十分な量のｃＤＮＡを合成することができない場合がある。従って、逆転写反応の更なる反応性の改善が望まれている。 Efforts have also been made to improve the reactivity of reverse transcription reactions. For example, a method of performing a reverse transcription reaction at a high temperature, a method of synthesizing a cDNA using a reverse transcriptase and an enzyme having 3′-5 ′ exonuclease activity (Patent Document 1), and Ncp7, recA, SSB, and T4gp32 A method using a nucleic acid binding protein (Patent Document 2) has been studied. Although the reverse transcription reaction has been improved in its reactivity, there are cases where a cDNA having a sufficient chain length cannot be synthesized or a sufficient amount of cDNA cannot be synthesized even at present. Therefore, further improvement in the reactivity of the reverse transcription reaction is desired.
上記の２つのＤＮＡ合成方法の改善に加えて、科学分野においてはエンドリボヌクレアーゼの切断部位特異性を決定する技法も必要とされている。例えば、ｍＲＮＡインターフェラーゼは、広範な細菌ゲノムに存在する毒素−抗毒素系によってコードされる配列特異的エンドリボヌクレアーゼである。これらのエンドリボヌクレアーゼは通常、一本鎖ＲＮＡ内に特異的切断部位を有する。大腸菌（E. coli）のＭａｚＦはＡＣＡ配列で、ＣｈｐＢＫはＡＣＹ配列（ＹはＵ、Ａ、又はＧである）で、プラスミドＲ１００に由来するＰｅｍＫはＵＡＨ配列（ＨはＣ、Ａ、又はＵである）で、ヒト型結核菌（M. tuberculosis）に由来するＭａｚＦ−ｍｔ１及びＭａｚＦ−ｍｔ６はそれぞれＵＡＣ及びＵリッチ領域で特異的に切断を行う。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来するＭａｚＦホモローグが、ＶＵＵＶ’（Ｖ及びＶ’はＡ、Ｃ、又はＧであり、同一であっても、又は同一でなくてもよい）で切断を行うことが近年見出されている。しかしながら、ヒト型結核菌の幾つかのＭａｚＦホモローグの切断特異性を決定する従来の試みは失敗に終わっている。特に３塩基より長い特異的配列が認識される場合の切断特異性の決定に関しては、考え得る標的配列の全てをカバーするほど十分に長いＲＮＡ基質を使用することが重要である。しかしながら、長いＲＮＡを基質として用いる上で主要な問題は、それが一本鎖ＲＮＡではあるが、広範な安定した二次構造を形成することである。この又は任意の他の長いＲＮＡをエンドリボヌクレアーゼに対する基質として使用するためには、その二次構造は折り畳まれていない必要がある。したがって、ｍＲＮＡインターフェラーゼ等のエンドリボヌクレアーゼに関する切断部位特異性を決定する新たな技法を開発することが依然として必要とされている。 In addition to the improvement of the two DNA synthesis methods described above, there is also a need in the scientific field for techniques for determining the cleavage site specificity of endoribonuclease. For example, mRNA interferases are sequence-specific endoribonucleases encoded by toxin-antitoxin systems that are present in a wide range of bacterial genomes. These endoribonucleases usually have specific cleavage sites within single stranded RNA. In E. coli, MazF is an ACA sequence, ChpBK is an ACY sequence (Y is U, A, or G), and PemK derived from plasmid R100 is a UAH sequence (H is C, A, or U). In other words, MazF-mt1 and MazF-mt6 derived from M. tuberculosis specifically cleave at UAC and U-rich regions, respectively. MazF homologue from Staphylococcus aureus is cleaved with VUUV ′ (V and V ′ are A, C, or G, which may or may not be the same) Has been found in recent years. However, previous attempts to determine the cleavage specificity of several MazF homologues of Mycobacterium tuberculosis have failed. With respect to determining cleavage specificity, particularly when specific sequences longer than 3 bases are recognized, it is important to use an RNA substrate that is long enough to cover all possible target sequences. However, a major problem in using long RNA as a substrate is that it forms a wide range of stable secondary structures, although it is a single-stranded RNA. In order to use this or any other long RNA as a substrate for endoribonuclease, its secondary structure needs to be unfolded. Accordingly, there remains a need to develop new techniques for determining cleavage site specificity for endoribonucleases such as mRNA interferases.
コールドショックタンパク質は、種々の微生物から見出されており、低温への生育温度シフトへの適応に関与するものと考えられている。このうち、Ｍａｊｏｒ Ｃｏｌｄ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎとして知られるＣｓｐＡは、その遺伝子が大腸菌（Escherichia coli）から単離され、組換え体が製造されている（特許文献３）。しかしながら、コールドショックタンパク質の用途として提案されているものは、農業分野において凍害や霜害を防ぐための抗凍結タンパク質としての利用に限られている。 Cold shock proteins have been found in various microorganisms and are thought to be involved in adaptation to the growth temperature shift to low temperatures. Among these, CspA known as Major Cold Shock Protein has its gene isolated from Escherichia coli and a recombinant is produced (Patent Document 3). However, what is proposed as a use of cold shock protein is limited to use as an antifreeze protein for preventing frost damage and frost damage in the agricultural field.
本発明は、反応性が向上した、改善されたＤＮＡ合成反応のためのコールドショックタンパク質含有組成物、かかる組成物を用いてＤＮＡを合成する方法、かかる方法に使用されるキット、及びかかる方法によって得られる合成ＤＮＡ産物を提供する。本発明は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位の同定用のコールドショックタンパク質含有組成物、かかる組成物を用いてエンドリボヌクレアーゼ切断部位を同定する方法、及びかかる方法に使用されるキットをさらに提供する。 The present invention relates to a cold shock protein-containing composition for improved DNA synthesis reaction with improved reactivity, a method of synthesizing DNA using such a composition, a kit used in such a method, and such a method. The resulting synthetic DNA product is provided. The present invention further provides cold shock protein-containing compositions for identification of endoribonuclease cleavage sites, methods for identifying endoribonuclease cleavage sites using such compositions, and kits used in such methods.
本発明によると、ＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ合成に有用な組成物、かかる組成物を用いてＤＮＡを合成する方法、かかる方法に使用されるＤＮＡ合成用のキット、及びかかる方法によって合成されるＤＮＡ組成物が提供される。反応の反応性が向上した、ＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡ合成を可能にすることが本発明の一目的である。 According to the present invention, compositions useful for DNA synthesis using DNA polymerase, methods for synthesizing DNA using such compositions, kits for DNA synthesis used in such methods, and DNA compositions synthesized by such methods Things are provided. It is an object of the present invention to enable DNA synthesis using DNA polymerase with improved reaction reactivity.
本発明の実施の形態は、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ合成用の組成物に関する。本発明の或る特定の実施の形態では、該組成物は、コールドショックタンパク質としての、ＣｓｐＡ又はそのホモローグ、好ましくは大腸菌由来のＣｓｐＡ又はそのホモローグにより例示される。組成物は、組成物２５μＬ当たり０．５μｇ超のＣｓｐＡを含み得る。かかる実施の形態による組成物は、２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含み得る。さらに、かかる実施の形態による組成物は、少なくとも１種のプライマー及び少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチドを含み得る。かかる組成物は反応緩衝液等の液体媒体をさらに含み得る。 Embodiments of the present invention relate to a composition for DNA synthesis comprising a cold shock protein and a DNA polymerase. In certain embodiments of the invention, the composition is exemplified by CspA or a homologue thereof, preferably CspA from E. coli or a homologue thereof, as a cold shock protein. The composition may comprise greater than 0.5 μg CspA per 25 μL composition. The composition according to such an embodiment may comprise two or more DNA polymerases. Furthermore, the composition according to such an embodiment may comprise at least one primer and at least one deoxyribonucleotide. Such a composition may further comprise a liquid medium such as a reaction buffer.
本発明のさらなる実施の形態は、Ａ）コールドショックタンパク質、Ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＤＮＡから成る群から選択される少なくとも１つのコンポーネント、並びにＣ）液体媒体を含む。 Further embodiments of the present invention include A) cold shock protein, B) at least one component selected from the group consisting of DNA polymerase, primer, deoxyribonucleotide, and DNA, and C) a liquid medium.
本発明のさらなる実施の形態は、ＤＮＡを合成する方法であって、Ａ）コールドショックタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びＤＮＡを含む混合物を調製する工程、並びにＢ）工程Ａ）で調製した混合物をインキュベートする工程を含む、方法に関する。 A further embodiment of the present invention is a method for synthesizing DNA comprising: A) preparing a mixture comprising cold shock protein, DNA polymerase, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide triphosphate, and DNA And B) incubating the mixture prepared in step A).
本発明の別の実施の形態は、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ合成用のキットに関する。かかる実施の形態によるキットは、液体媒体、又はキットの利用に関する紙若しくは電子形式の説明書をさらに含み得る。かかるキットのコンポーネントは、個別に又は単独で存在し得る。 Another embodiment of the present invention relates to a kit for DNA synthesis comprising a cold shock protein and a DNA polymerase. Kits according to such embodiments may further comprise liquid media or paper or electronic instructions for use of the kit. The components of such a kit can be present individually or alone.
本発明は、Ａ）コールドショックタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及びＤＮＡを含む混合物を調製する工程、並びにＢ）工程Ａ）で調製した混合物をインキュベートする工程を含むプロセスによって合成されるＤＮＡ組成物にも関する。 The present invention includes A) preparing a mixture comprising cold shock protein, DNA polymerase, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide, and DNA, and B) incubating the mixture prepared in step A). It also relates to a DNA composition synthesized by a process comprising:
本発明は、逆転写反応に有利に使用される組成物、該組成物を用いたｃＤＮＡ合成プロセス、逆転写反応に有利に使用されるキット、及びかかるプロセスによって合成されるｃＤＮＡ組成物にも関する。本発明によると、特異性、合成される鎖の長さ、合成量等の観点から反応性の優れた、有利な逆転写反応を実現することができる。 The present invention also relates to a composition advantageously used for reverse transcription reaction, a cDNA synthesis process using the composition, a kit advantageously used for reverse transcription reaction, and a cDNA composition synthesized by such a process. . According to the present invention, it is possible to realize an advantageous reverse transcription reaction having excellent reactivity in terms of specificity, the length of a synthesized chain, the amount of synthesis, and the like.
本発明の実施の形態は、コールドショックタンパク質又はそのホモローグ、及び逆転写酵素を含む逆転写反応用の組成物に関する。本発明によるかかる実施の形態では、コールドショックタンパク質の一例はＣｓｐＡ又はそのホモローグであり、ＣｓｐＡの一例は大腸菌由来ＣｓｐＡである。幾つかの実施の形態では、ＣｓｐＡは、組成物２０μＬ当たりＣｓｐＡ約０．５μｇ〜約２０μｇの量で存在し得る。逆転写酵素の例は、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素、及び／又はトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素、及び／又はそれらの組み合わせである。さらに、本発明によるこの実施の形態における組成物は、少なくとも１種のプライマー及び少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチドをさらに含み得る。組成物のさらなる実施の形態は、反応緩衝液等の液体媒体を含む。他の実施の形態はオリゴ（ｄＴ）プライマー、又はランダムな配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー、又はそれらの組み合わせを含む。 Embodiments of the present invention relate to a composition for a reverse transcription reaction comprising a cold shock protein or a homologue thereof, and a reverse transcriptase. In such an embodiment according to the invention, an example of a cold shock protein is CspA or a homologue thereof, and an example of CspA is E. coli-derived CspA. In some embodiments, CspA may be present in an amount from about 0.5 μg to about 20 μg CspA per 20 μL composition. Examples of reverse transcriptase are Moloney murine leukemia virus-derived reverse transcriptase and / or avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase, and / or combinations thereof. Furthermore, the composition in this embodiment according to the invention may further comprise at least one primer and at least one deoxyribonucleotide. Further embodiments of the composition include a liquid medium such as a reaction buffer. Other embodiments include oligo (dT) primers, or oligonucleotide primers with random sequences, or combinations thereof.
本発明のさらなる実施の形態は、逆転写反応用の組成物であって、Ａ）コールドショックタンパク質、Ｂ）逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＲＮＡから成る群から選択される少なくとも１つのコンポーネント、並びにＣ）液体媒体を含む、組成物を含む。 A further embodiment of the present invention is a composition for reverse transcription reaction, at least one component selected from the group consisting of A) cold shock protein, B) reverse transcriptase, primer, deoxyribonucleotide, and RNA. And C) a composition comprising a liquid medium.
本発明のさらなる実施の形態は、（Ａ）コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となるＲＮＡを含有する溶液を調製する工程、及び（Ｂ）（Ａ）工程で調製した溶液をインキュベーションする工程を含む、ｃＤＮＡの合成方法に関する。 A further embodiment of the invention comprises (A) preparing a solution containing cold shock protein, reverse transcriptase, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide, and template RNA, and (B ) A method for synthesizing cDNA comprising the step of incubating the solution prepared in step (A).
本発明のさらなる実施の形態は、逆転写反応用のキットであって、Ａ）コールドショックタンパク質、Ｂ）逆転写酵素、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、及びＲＮＡから成る群から選択される少なくとも１つのコンポーネント、並びにＣ）液体媒体を含む、キットに関する。かかる実施の形態によるキットは、液体媒体、又はキットの利用に関する紙若しくは電子形式の説明書をさらに含み得る。かかるキットのコンポーネントは、個別に又は単独で存在し得る。かかる実施の形態のキットは、遺伝子増幅反応を行うための試薬をさらに含み得る。 A further embodiment of the present invention is a kit for reverse transcription reaction, wherein at least one component selected from the group consisting of A) cold shock protein, B) reverse transcriptase, primer, deoxyribonucleotide, and RNA, And C) relates to a kit comprising a liquid medium. Kits according to such embodiments may further comprise liquid media or paper or electronic instructions for use of the kit. The components of such a kit can be present individually or alone. The kit of such an embodiment may further include a reagent for performing a gene amplification reaction.
本発明は、Ａ）コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及びＲＮＡを含む溶液を調製する工程、並びにＢ）工程Ａ）で調製した溶液をインキュベートする工程を含むプロセスによって合成されるｃＤＮＡ組成物にさらに関する。 The present invention includes A) a step of preparing a solution containing cold shock protein, reverse transcriptase, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide, and RNA, and B) incubating the solution prepared in step A). It further relates to a cDNA composition synthesized by a process comprising steps.
本発明は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位の同定用の組成物、かかる組成物を用いてエンドリボヌクレアーゼ切断部位を同定する方法、及びかかる方法に使用されるキットにさらに関する。 The invention further relates to compositions for identifying endoribonuclease cleavage sites, methods for identifying endoribonuclease cleavage sites using such compositions, and kits used in such methods.
本発明の実施の形態は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位の同定用の組成物であって、Ａ）コールドショックタンパク質、並びにＢ）ＲＮＡ基質及びエンドリボヌクレアーゼから成る群から選択される少なくとも１つのコンポーネントを含む、組成物に関する。本発明によるかかる実施の形態では、コールドショックタンパク質の一例はＣｓｐＡ又はそのホモローグであり、ＣｓｐＡの一例は大腸菌由来ＣｓｐＡである。好ましい実施の形態では、ＲＮＡ基質は１０２４塩基より長く、ほぼ等しい数の各々の塩基を含有する。かかるＲＮＡ基質の一例は、バクテリオファージＭＳ２のＲＮＡである。かかる実施の形態の組成物は、液体媒体をさらに含み得る。 An embodiment of the present invention is a composition for identification of an endoribonuclease cleavage site, comprising at least one component selected from the group consisting of A) a cold shock protein, and B) an RNA substrate and an endoribonuclease, Relates to the composition. In such an embodiment according to the invention, an example of a cold shock protein is CspA or a homologue thereof, and an example of CspA is E. coli-derived CspA. In a preferred embodiment, the RNA substrate is longer than 1024 bases and contains an approximately equal number of each base. One example of such an RNA substrate is bacteriophage MS2 RNA. The composition of such embodiments may further comprise a liquid medium.
本発明の別の実施の形態は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位を決定する方法であって、Ａ）コールドショックタンパク質、ＲＮＡ基質、及びエンドリボヌクレアーゼを含む混合物を調製する工程、並びにＢ）工程Ａ）の混合物をインキュベートする工程を含む、方法に関する。かかる方法は混合物を電気泳動によって解析することをさらに含み得る。 Another embodiment of the present invention is a method for determining an endoribonuclease cleavage site, comprising A) preparing a mixture comprising a cold shock protein, an RNA substrate, and an endoribonuclease, and B) a mixture of step A). And incubating the method. Such a method may further comprise analyzing the mixture by electrophoresis.
本発明のさらなる実施の形態は、エンドリボヌクレアーゼ切断部位の決定用のキットであって、コールドショックタンパク質及びＲＮＡ基質を含む、キットに関する。かかる実施の形態のキットは、反応緩衝液等の液体媒体をさらに含み得る。かかる実施の形態は、かかるキットの利用に関する紙若しくは電子形式の説明書をさらに含み得る。かかる実施の形態では、コールドショックタンパク質及びＲＮＡ基質は、個別に又は組み合わせて存在し得る。 A further embodiment of the invention relates to a kit for the determination of an endoribonuclease cleavage site, comprising a cold shock protein and an RNA substrate. The kit of such an embodiment may further include a liquid medium such as a reaction buffer. Such embodiments may further include paper or electronic instructions regarding the use of such kits. In such embodiments, the cold shock protein and RNA substrate may be present individually or in combination.
本明細書中で使用される場合、コールドショックタンパク質とは、生物、特に微生物においてその生育温度が正常の温度から低下した際、コールドショックにさらされた際に発現誘導されるタンパク質の総称である。大腸菌の培養温度を３７℃から１５℃に低下させると、ＣｓｐＡというコールドショックタンパク質が一過性に高レベルで発現される。大腸菌にはＣｓｐＡとアミノ酸配列上の同一性があるＣｓｐＢ〜ＣｓｐＩの８種のタンパク質が知られているが、このうちのＣｓｐＢ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＩがコールドショックタンパク質である。さらに、これらのコールドショックタンパク質のホモローグがＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＣｓｐＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＣｓｐＢ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（ＣｓｐＢ、ＣｓｐＬ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＣｓｐＬ）等の微生物にも存在していることが知られている。なお、本発明においてＣｓｐＡのホモローグとは、大腸菌由来ＣｓｐＡのアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有するコールドショックタンパク質のことを言う。本発明には、これらのコールドショックタンパク質を使用することができる。本発明に使用されるコールドショックタンパク質としては、好ましくはＣｓｐＡが、より好ましくはグラム陰性菌由来のＣｓｐＡが、さらにより好ましくは大腸菌由来のＣｓｐＡが使用される。また、本発明に用いるＣｓｐＡは、ＤＮＡ組換技術によって生成されたものであっても微生物から単離されたものであっても良い。 As used herein, a cold shock protein is a generic term for proteins that are induced to be expressed when exposed to a cold shock when their growth temperature drops from a normal temperature in an organism, particularly a microorganism. . When the culture temperature of E. coli is lowered from 37 ° C. to 15 ° C., a cold shock protein called CspA is transiently expressed at a high level. E. coli has 8 types of proteins, CspB to CspI, which are identical in amino acid sequence to CspA. Among them, CspB, CspG and CspI are cold shock proteins. Furthermore, homologues of these cold shock proteins are also known to be present in microorganisms such as Bacillus subtilis (CspB), Bacillus caldoliticus (CspB), Thermotoga maritima (CspB, CspL), Lactobacillus plantarum (CspL), etc. . In the present invention, the CspA homolog refers to a cold shock protein having an amino acid sequence showing 50% or more homology to the amino acid sequence of CspA derived from E. coli. These cold shock proteins can be used in the present invention. The cold shock protein used in the present invention is preferably CspA, more preferably CspA derived from gram-negative bacteria, and even more preferably CspA derived from E. coli. In addition, CspA used in the present invention may be one produced by DNA recombination technology or one isolated from a microorganism.
ホモローグとは、対象のタンパク質と配列相同性を有し、好ましくは別のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を示し、構造特性又は生物学的機能において類似点を有する実体を意味する。 Homolog means an entity having sequence homology with the protein of interest, preferably showing at least 50% sequence identity with the amino acid sequence of another polypeptide and having similarities in structural properties or biological function To do.
本明細書中で使用される場合、デオキシリボヌクレオチドとは、有機塩基に結合されているデオキシリボースにホスホエステル結合によって結合されたリン酸基からなる。天然型ＤＮＡは、４つの異なるヌクレオチドを含有する。アデニン、グアニン、シトシン及びチミン塩基を有するヌクレオチドが天然型ＤＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略される。デオキシリボヌクレオチドは、遊離の一リン酸型、二リン酸型及び三リン酸型（すなわち、リン酸基が、それぞれ、１つ、２つ又は３つのリン酸部分を有する）を含む。従って、デオキシリボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）並びにそれらの誘導体を含む。デオキシリボヌクレオチド誘導体は、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ及び核酸分解に抵抗性を示すデオキシヌクレオチド誘導体を含む。ヌクレオチド誘導体は、例えば、３２Ｐ若しくは３５Ｓなどの放射性同位体、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分又は酵素で検出できるように標識されているデオキシリボヌクレオチドを含む。 As used herein, deoxyribonucleotides consist of a phosphate group bound by a phosphoester bond to deoxyribose bound to an organic base. Natural DNA contains four different nucleotides. Nucleotides with adenine, guanine, cytosine and thymine bases are found in natural DNA. The bases adenine, guanine, cytosine, and thymine are abbreviated as A, G, C, and T, respectively. Deoxyribonucleotides include free monophosphate, diphosphate, and triphosphate types (ie, the phosphate group has one, two, or three phosphate moieties, respectively). Thus, deoxyribonucleotides include deoxyribonucleoside triphosphates (eg, dATP, dCTP, dITP, dGTP, and dTTP) and derivatives thereof. Deoxyribonucleotide derivatives include [αS] dATP, 7-deaza-dGTP, 7-deaza-dATP and deoxynucleotide derivatives that are resistant to nucleolytic degradation. Nucleotide derivatives include, for example, deoxyribonucleotides that are labeled for detection with a radioisotope, such as 32P or 35S, a fluorescent moiety, a chemiluminescent moiety, a bioluminescent moiety, or an enzyme.
本明細書中で使用される場合、デオキシリボヌクレオチド三リン酸とは、その糖部分がデオキシリボースから成り、且つ三リン酸基を有するヌクレオチドのことを言う。天然型ＤＮＡは、各々が塩基部分としてアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンを有する４つの異なるヌクレオチドを含む。本発明の組成物中に含有されるデオキシリボヌクレオチド三リン酸は、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（deoxyribonucleotides triphosphate）、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの混合物である。本発明では、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の誘導体も同様に使用することができる。デオキシリボヌクレオチド三リン酸誘導体は、［・Ｓ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ、及び核酸の消化に対して抵抗性を示すデオキシヌクレオチド誘導体を含む。ヌクレオチド誘導体はまた、例えば３２Ｐ若しくは３５Ｓ等の放射性同位体、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子、又は酵素によって検出することができるように標識されているデオキシリボヌクレオチド三リン酸を含む。 As used herein, deoxyribonucleotide triphosphate refers to a nucleotide whose sugar moiety consists of deoxyribose and has a triphosphate group. Native DNA contains four different nucleotides, each with adenine, guanine, cytosine, and thymine as base moieties. The deoxyribonucleotide triphosphate contained in the composition of the present invention is a mixture of four deoxyribonucleotides triphosphates, dATP, dCTP, dGTP, and dTTP. In the present invention, derivatives of deoxyribonucleotide triphosphate can be used as well. Deoxyribonucleotide triphosphate derivatives include [.S] dATP, 7-deaza-dGTP, 7-deaza-dATP, and deoxynucleotide derivatives that are resistant to nucleic acid digestion. Nucleotide derivatives also include deoxyribonucleotide triphosphates that are labeled such that they can be detected by radioisotopes, such as 32 P or 35 S, fluorescent molecules, chemiluminescent molecules, bioluminescent molecules, or enzymes.
本明細書中で使用される場合、反応緩衝液とは、緩衝剤又は緩衝剤混合物を含む溶液を意味し、二価陽イオン及び一価陽イオンをさらに含む場合もある。 As used herein, a reaction buffer means a solution containing a buffer or a buffer mixture, and may further contain a divalent cation and a monovalent cation.
「又は」という用語が本明細書中で使用される場合（例えばＡ又はＢ）、「Ａ又はＢ又はその両方」を意味することが意図される。本明細書中で使用される場合、「a」又は「an」又は「the」という用語の使用は、量について限定することを意図しない。例えば、発明を実施するための形態における「コールドショックタンパク質」への言及は、「単一のコールドショックタンパク質」を意味することを意図せず、かかる言及は単一のコールドショックタンパク質又は複数のコールドショックタンパク質を包含し得る。 When the term “or” is used herein (eg A or B), it is intended to mean “A or B or both”. As used herein, the use of the term “a” or “an” or “the” is not intended to limit the amount. For example, reference to “cold shock protein” in the detailed description is not intended to mean “single cold shock protein”, and such reference includes a single cold shock protein or multiple cold shock proteins. Shock proteins can be included.
（１）本発明によるＤＮＡポリメラーゼを用いる改善されたＤＮＡ合成のための組成物
本発明の組成物は、コールドショックタンパク質又はそのホモローグ、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。驚くべきことに、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物を使用した場合に、コールドショックタンパク質の非存在下でのＤＮＡ合成反応と比較して、ＤＮＡ合成反応の反応性は向上していた。
(1) Composition for improved DNA synthesis using the DNA polymerase according to the present invention The composition of the present invention comprises a cold shock protein or a homologue thereof, and a DNA polymerase. Surprisingly, when a reaction mixture containing cold shock protein and DNA polymerase was used, the reactivity of the DNA synthesis reaction was improved compared to the DNA synthesis reaction in the absence of cold shock protein.
本発明では、上記のＤＮＡ合成の反応性の向上とは、特に限定されるものではないが、非特異的増幅の減少、標的配列に由来する増幅産物の量の増大等を意味する。かかる向上は、反応混合物において合成される産物を従来の方法、例えばアガロースゲル上での電気泳動によって解析することにより定量化することができる。 In the present invention, the improvement in the reactivity of the above-mentioned DNA synthesis is not particularly limited, but means a decrease in non-specific amplification, an increase in the amount of amplification product derived from the target sequence, and the like. Such improvement can be quantified by analyzing the product synthesized in the reaction mixture by conventional methods, eg, electrophoresis on an agarose gel.
本発明のＤＮＡ合成方法によると、ＤＮＡの非特異的合成が抑制される。従来、ＤＮＡ合成用の反応混合物は、非特異的反応の発生を防止するために反応開始まで低温下に維持しなければならないことが知られていた。本発明による組成物を使用することによって、室温に置いてある混合物を直接用いたＤＮＡ合成反応が可能となる。 According to the DNA synthesis method of the present invention, non-specific synthesis of DNA is suppressed. Conventionally, it has been known that a reaction mixture for DNA synthesis must be kept at a low temperature until the start of the reaction in order to prevent the occurrence of a nonspecific reaction. By using the composition according to the present invention, a DNA synthesis reaction using a mixture at room temperature directly becomes possible.
本発明に使用することのできるＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。本発明に利用可能なＤＮＡポリメラーゼとしては、真正細菌、例えばサーマス属又はバシラス属に属する細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼ（サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）、バシラス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）等に由来するＤＮＡポリメラーゼ）、古細菌、例えばパイロコッカス属又はサーモコッカス属に属するものに由来するＤＮＡポリメラーゼ（パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litralis）、サーモコッカス・コダカラエンシス（Thermococcus kodakaraensis）等に由来するＤＮＡポリメラーゼ）により例示される。本発明のＤＮＡ合成方法では、ＰＣＲにおいて使用することのできる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。 The DNA polymerase that can be used in the present invention is not particularly limited, but a thermostable DNA polymerase is preferable. Examples of the DNA polymerase usable in the present invention include DNA polymerases derived from eubacteria such as those belonging to the genus Thermus or Bacillus (Thermus aquaticus, Bacillus caldotenax, etc.) ), DNA polymerases derived from archaea such as those belonging to the genus Pyrococcus or Thermococcus (Pyrococcus furiosus), Thermococcus litralis, Thermococcus kodakaraensis Etc.). In the DNA synthesis method of the present invention, a thermostable DNA polymerase that can be used in PCR is preferred.
２種以上のＤＮＡポリメラーゼが本発明の組成物に含まれる場合もある。例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない別のＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせを本発明において使用することができる。かかるＤＮＡポリメラーゼの組み合わせを用いる技術は、ＬＡ−ＰＣＲ（長く正確な（Long and accurate）ＰＣＲ）として知られている。 Two or more DNA polymerases may be included in the composition of the present invention. For example, a combination of a DNA polymerase having 3 '→ 5' exonuclease activity and another DNA polymerase having substantially no 3 '→ 5' exonuclease activity can be used in the present invention. A technique using such a combination of DNA polymerases is known as LA-PCR (Long and accurate PCR).
本発明による組成物は、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼに加えて、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び／又は反応緩衝液をさらに含み得る。 The composition according to the invention may further comprise at least one primer, at least one deoxyribonucleotide triphosphate, and / or a reaction buffer in addition to the cold shock protein and the DNA polymerase.
プライマーは、鋳型ＤＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである。プライマーに関しては、本発明において使用される反応条件下で鋳型ＤＮＡに対してアニーリング可能であれば特に限定されない。 A primer is an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to a template DNA. The primer is not particularly limited as long as it can be annealed to the template DNA under the reaction conditions used in the present invention.
プライマーの長さは、特異的なアニーリングプロセスを行うため、少なくとも６ヌクレオチドであるのが好ましく、より好ましくは少なくとも１０ヌクレオチドである。プライマーの長さは、オリゴヌクレオチド合成の観点から、好ましくは最大で１００ヌクレオチドであり、より好ましくは最大で３０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは既知の方法によって化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドは天然源に由来するオリゴヌクレオチドであってもよく、例えば天然源から調製されたＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼによる消化によって調製され得る。 The length of the primer is preferably at least 6 nucleotides, more preferably at least 10 nucleotides in order to perform a specific annealing process. From the viewpoint of oligonucleotide synthesis, the length of the primer is preferably at most 100 nucleotides, more preferably at most 30 nucleotides. Oligonucleotides can be chemically synthesized by known methods. Oligonucleotides can be oligonucleotides derived from natural sources and can be prepared, for example, by restriction endonuclease digestion of DNA prepared from natural sources.
本発明の組成物は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成のための混合物の調製に有用である。コールドショックタンパク質を含むＤＮＡ合成反応用の組成物、又はコールドショックタンパク質を含むＤＮＡ合成反応の促進剤も本発明の実施形態である。 The composition of the present invention is useful for preparing a mixture for DNA synthesis by a DNA polymerase. A composition for a DNA synthesis reaction containing a cold shock protein or an accelerator for a DNA synthesis reaction containing a cold shock protein is also an embodiment of the present invention.
（２）本発明によるＤＮＡポリメラーゼを用いる改善されたＤＮＡ合成のための方法
本発明のＤＮＡを合成する方法は、
Ａ）コールドショックタンパク質又はそのホモローグ、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び鋳型としてのＤＮＡを含む混合物を調製する工程、並びに
Ｂ）工程Ａ）で調製した混合物をインキュベートする工程を含む。
(2) Method for improved DNA synthesis using the DNA polymerase according to the present invention The method for synthesizing the DNA of the present invention comprises:
A) preparing a mixture comprising cold shock protein or homolog thereof, DNA polymerase, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide triphosphate, and DNA as a template, and B) prepared in step A) Incubating the mixture.
本発明の方法によって、ＤＮＡ合成反応の反応性が、コールドショックタンパク質の非存在下でのＤＮＡ合成反応と比較して向上した。 By the method of the present invention, the reactivity of the DNA synthesis reaction is improved as compared with the DNA synthesis reaction in the absence of cold shock protein.
鋳型としてのＤＮＡとは、プライマーがかかるＤＮＡにアニールする場合にＤＮＡ伸長のための鋳型として働くことのできるＤＮＡを意味する。本発明の方法のための混合物は単一の鋳型、又は異なる配列を有する複数の鋳型を含み得る。それぞれが特異的な鋳型に対するプライマー対を用いることで、各々の鋳型に対応する産物を同時に得ることができる。かかる複数の鋳型は、同じＤＮＡ分子に存在しても、又は異なるＤＮＡ分子中に存在してもよい。鋳型としてのＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。 DNA as a template means DNA that can serve as a template for DNA extension when a primer anneals to such DNA. The mixture for the method of the invention can comprise a single template or multiple templates having different sequences. By using a primer pair for each specific template, a product corresponding to each template can be obtained simultaneously. Such multiple templates may be present in the same DNA molecule or in different DNA molecules. The DNA as a template can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, or a DNA-RNA hybrid.
本発明において使用されるコールドショックタンパク質の量は特に限定されず、反応混合物２５μｌ当たり０．５μｇ超、好ましくは２μｇ〜１５μｇ、より好ましくは５μｇ〜１２μｇであり得る。 The amount of cold shock protein used in the present invention is not particularly limited, and may be more than 0.5 μg, preferably 2 μg to 15 μg, more preferably 5 μg to 12 μg per 25 μl of the reaction mixture.
本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼの量は特に限定されない。例えば、従来のＤＮＡ合成において使用されるのと同じ量であり得る。ＰＣＲに好ましいＤＮＡポリメラーゼの量は当業者に知られている。サーマス・アクアチクスに由来するＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲの場合、通常は反応混合物２５μｌ当たり０．１２５Ｕ〜５ＵのＤＮＡポリメラーゼが使用される。 The amount of DNA polymerase used in the present invention is not particularly limited. For example, it can be the same amount as used in conventional DNA synthesis. Preferred amounts of DNA polymerase for PCR are known to those skilled in the art. In the case of PCR using DNA polymerase derived from Thermus Aquatics, 0.125 U to 5 U of DNA polymerase is usually used per 25 μl of reaction mixture.
本願において、市販のＤＮＡポリメラーゼの活性は、各々のＤＮＡポリメラーゼ製品に対する取扱説明書に示される単位に基づいて表される。例えば、ＤＮＡポリメラーゼの活性は、２５ｍＭ ＴＡＰＳ（２５℃でのｐＨ９．３）、５０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、並びに１００μＭ ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを含む５０μｌの最終容量を有する混合物を用いて決定される。１単位（以下「１Ｕ」と記載する）のＤＮＡポリメラーゼ活性は、「７４℃で３０分間に酸不溶性物質中に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを取り込むことの可能な酵素の量」として規定される。 In this application, the activity of commercially available DNA polymerases is expressed based on the units indicated in the instructions for each DNA polymerase product. For example, the activity of DNA polymerase is 25 mM TAPS (pH 9.3 at 25 ° C.), 50 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride, 1 mM β-mercaptoethanol, 200 μM dATP, dGTP and dTTP, respectively, and 100 μM [α-32P]. Determined using a mixture with a final volume of 50 μl containing dCTP. One unit (hereinafter referred to as “1U”) of DNA polymerase activity is defined as “the amount of enzyme capable of incorporating 10 nmol of dNTP into an acid-insoluble substance in 30 minutes at 74 ° C.”.
本発明の方法において使用される各々のプライマーの量は特に限定されず、０．０５μＭ〜２μＭであり得る。 The amount of each primer used in the method of the present invention is not particularly limited, and may be 0.05 μM to 2 μM.
本発明の好ましい実施形態では、ＤＮＡ合成はＰＣＲ等のＤＮＡ増幅方法によって行われる。 In a preferred embodiment of the present invention, DNA synthesis is performed by a DNA amplification method such as PCR.
（３）本発明によるＤＮＡポリメラーゼを用いる改善されたＤＮＡ合成のためのキット
本発明によるキットは、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼを含む。本発明のキットに関しては、上記のＤＮＡ合成方法において使用可能であれば特に限定されない。本発明のキットは、核酸を標識化するためのキット、ＰＣＲのためのキット、核酸の評価のためのキット、部位特異的突然変異誘発のためのキット等であり得る。
(3) Kit for improved DNA synthesis using the DNA polymerase according to the invention The kit according to the invention comprises a cold shock protein and a DNA polymerase. The kit of the present invention is not particularly limited as long as it can be used in the above DNA synthesis method. The kit of the present invention can be a kit for labeling a nucleic acid, a kit for PCR, a kit for nucleic acid evaluation, a kit for site-directed mutagenesis, and the like.
本発明のキットは、コールドショックタンパク質及びＤＮＡポリメラーゼに加えて、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び／又は反応緩衝液をさらに含み得る。キットのコンポーネント（コールドショックタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、及び／又は反応緩衝液）としては、上記項目（１）に記載されるものを使用することができる。 The kit of the present invention may further comprise at least one primer, at least one deoxyribonucleotide triphosphate, and / or a reaction buffer in addition to the cold shock protein and the DNA polymerase. As the components of the kit (cold shock protein, DNA polymerase, primer, deoxyribonucleotide triphosphate, and / or reaction buffer), those described in the above item (1) can be used.
キットは上記のコンポーネントを、各々のコンポーネントが独立したコンポーネントとして存在する状態、又は一部のコンポーネントが組み合わせられた状態で含み得る。一実施形態では、本発明のキットは上記（１）で記載される本発明の組成物を含む。 The kit may include the above components in a state where each component exists as an independent component, or in a state where some components are combined. In one embodiment, the kit of the present invention comprises the composition of the present invention described in (1) above.
４）本発明による逆転写酵素を用いる改善されたｃＤＮＡ合成のための組成物
本発明の組成物は、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む。驚くべきことに、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む反応組成物を利用することにより、逆転写酵素のみを用いた場合に比べて逆転写反応の反応性が向上した。
4) Composition for improved cDNA synthesis using reverse transcriptase according to the present invention The composition of the present invention comprises cold shock protein and reverse transcriptase. Surprisingly, by using a reaction composition containing a cold shock protein and reverse transcriptase, the reactivity of the reverse transcription reaction was improved as compared to the case of using only reverse transcriptase.
逆転写反応の反応性の向上とは、特に限定するものではないが、例えば反応特異性の向上、核酸合成量の増大、及び合成鎖長の増大から選択される効果のことを言う。 The improvement in the reactivity of the reverse transcription reaction is not particularly limited, but refers to an effect selected from, for example, an improvement in reaction specificity, an increase in the amount of nucleic acid synthesis, and an increase in the synthetic chain length.
特に本発明は、長鎖のｃＤＮＡの合成を目的とした逆転写反応の際に有用であり、目的とするｃＤＮＡの合成量が増加する。また、非特異的なｃＤＮＡの合成を抑えることもできる。従来、長鎖のｃＤＮＡ合成には、耐熱性の逆転写酵素を用いる高温での逆転写反応が効果的であると提唱されていた（例えば、国際公開第０１／９２５００号パンフレット）が、本発明によれば、逆転写反応を高温で行うことなく、長鎖のｃＤＮＡの合成を効率よく行うことができる。さらに、本発明は、高温での逆転写反応にも適用可能であり、種々の酵素を用いた逆転写反応を改善することが可能である。 In particular, the present invention is useful in reverse transcription reactions for the purpose of synthesizing long-chain cDNAs, and increases the amount of cDNA synthesized. In addition, synthesis of non-specific cDNA can be suppressed. Conventionally, it has been proposed that reverse transcription reaction at high temperature using a thermostable reverse transcriptase is effective for the synthesis of long-chain cDNA (for example, WO 01/92500 pamphlet). According to the method, it is possible to efficiently synthesize a long-chain cDNA without performing a reverse transcription reaction at a high temperature. Furthermore, the present invention is applicable to reverse transcription reactions at high temperatures, and can improve reverse transcription reactions using various enzymes.
本発明の組成物におけるＣｓｐＡの作用としては、低温時のミスプライミングの抑制による反応特異性の向上及び増幅量の増大や、ＲＮＡの２次構造の解消効果による伸長性の改善及び増幅量の増大が考えられる。 As the action of CspA in the composition of the present invention, the reaction specificity is improved by suppressing mispriming at low temperatures and the amount of amplification is increased, the elongation is improved by the effect of eliminating the secondary structure of RNA, and the amount of amplification is increased. Can be considered.
逆転写酵素は、逆転写活性、すなわちＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば本発明に使用でき、このような逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ由来逆転写酵素）やトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ由来逆転写酵素）等のウイルス由来の逆転写酵素、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性の逆転写酵素が例示される。 Any reverse transcriptase can be used in the present invention as long as it has reverse transcription activity, that is, an activity of synthesizing complementary DNA using RNA as a template. Such reverse transcriptase is derived from Moloney murine leukemia virus. Reverse transcriptase derived from viruses such as reverse transcriptase (MMLV-derived reverse transcriptase) and avian myeloblastosis virus-derived reverse transcriptase (AMV-derived reverse transcriptase), DNA polymerase derived from Thermus genus (Tth DNA polymerase) Etc.) and thermostable reverse transcriptases derived from eubacteria such as thermophilic Bacillus bacteria-derived DNA polymerases (Bca DNA polymerase, etc.).
本発明には、ウイルス由来の逆転写酵素が好適に使用され、ＭＭＬＶ由来逆転写酵素がより好適に使用される。また、逆転写活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施された逆転写酵素も本発明に使用できる。 In the present invention, virus-derived reverse transcriptase is preferably used, and MMLV-derived reverse transcriptase is more preferably used. Moreover, reverse transcriptase in which a naturally occurring amino acid sequence is modified within a range having reverse transcription activity can also be used in the present invention.
本発明の組成物には、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素に加えて、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド及び／又は反応緩衝液が含まれていても良い。 The composition of the present invention may contain at least one primer, at least one deoxyribonucleotide and / or a reaction buffer in addition to cold shock protein and reverse transcriptase.
プライマーは、鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、使用される反応条件において鋳型となるＲＮＡに対してアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーはオリゴ（ｄＴ）等のオリゴヌクレオチドやランダムな配列を有するオリゴヌクレオチド（ランダムプライマー）であっても良い。 The primer is an oligonucleotide having a base sequence complementary to the template RNA, and is not particularly limited as long as it anneals to the template RNA under the reaction conditions used. The primer may be an oligonucleotide such as oligo (dT) or an oligonucleotide having a random sequence (random primer).
プライマーの鎖長は、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成出来る。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等いかなる方法で合成されたものであっても良い。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。 The primer chain length is preferably 6 nucleotides or more, more preferably 10 nucleotides or more from the viewpoint of specific annealing, and preferably 100 nucleotides or less, more preferably from the viewpoint of oligonucleotide synthesis. Is 30 nucleotides or less. The oligonucleotide can be synthesized by the phosphoramidite method using, for example, a DNA synthesizer type 394 manufactured by ABI (Applied Biosystem Inc.). In addition, those synthesized by any method such as a phosphoric acid triester method, an H-phosphonate method, and a thiophosphonate method may be used. Moreover, it may be an oligonucleotide derived from a biological sample, for example, isolated from a restriction endonuclease digest of DNA prepared from a natural sample.
なお、コールドショックタンパク質を含む逆転写反応用の組成物又はコールドショックタンパク質を含む逆転写反応の反応性促進剤も、本発明の態様の一つである。 Note that a reverse transcription reaction composition containing a cold shock protein or a reverse transcription reaction reactivity promoter containing a cold shock protein is also one aspect of the present invention.
５）本発明による逆転写酵素を用いる改善されたｃＤＮＡ合成の方法
本発明のｃＤＮＡの合成方法は、本発明の組成物を用いて、
Ａ）コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、及び鋳型となるＲＮＡを含有する溶液を調製する工程、及び
Ｂ）Ａ）工程で調製した溶液をインキュベートする工程を含む。
5) Improved cDNA synthesis method using reverse transcriptase according to the present invention The method for synthesizing cDNA of the present invention uses the composition of the present invention.
A) preparing a solution containing cold shock protein, reverse transcriptase, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide, and template RNA; and B) incubating the solution prepared in step A). Process.
本発明のｃＤＮＡの合成方法により、コールドショックタンパク質を含まない組成物を用いた場合と比較して、逆転写反応の反応性が向上する。 According to the method for synthesizing cDNA of the present invention, the reactivity of the reverse transcription reaction is improved as compared with the case where a composition containing no cold shock protein is used.
逆転写反応の反応性向上は、例えばｃＤＮＡの合成量や合成鎖長を確認することにより、評価することができる。 The improvement in the reactivity of the reverse transcription reaction can be evaluated, for example, by confirming the amount of cDNA synthesis or the synthetic chain length.
逆転写反応によって得られたｃＤＮＡの合成量は、例えば、逆転写反応後の反応液の一定量をリアルタイムＰＣＲに供し、目的とする核酸配列の合成量を定量することにより確認することができる。本発明の組成物を用いて逆転写反応を行なった場合、コールドショックタンパク質を含まない組成物を用いて逆転写反応を行なった場合と比較してｃＤＮＡの合成量が増大する。 The synthesis amount of cDNA obtained by the reverse transcription reaction can be confirmed, for example, by subjecting a certain amount of the reaction solution after the reverse transcription reaction to real-time PCR and quantifying the synthesis amount of the target nucleic acid sequence. When the reverse transcription reaction is performed using the composition of the present invention, the amount of cDNA synthesis increases as compared with the case where the reverse transcription reaction is performed using a composition not containing a cold shock protein.
逆転写反応によって得られたｃＤＮＡの合成鎖長は、例えば、逆転写反応で用いたプライマーのプライミング領域下流近傍から増幅鎖長が異なる複数種類のプライマー対を設定し、各プライマー対を用いたＰＣＲに逆転写反応後の反応液の一定量をそれぞれ供し、その増幅産物量より確認することができる。本発明の組成物を用いて逆転写反応を行なった場合、コールドショックタンパク質を含まない組成物を用いて逆転写反応を行なった場合と比較して長鎖のｃＤＮＡの合成量が増大する。 The synthetic strand length of the cDNA obtained by the reverse transcription reaction is set, for example, by setting a plurality of types of primer pairs having different amplification chain lengths from the downstream of the primer priming region used in the reverse transcription reaction, and PCR using each primer pair A fixed amount of the reaction solution after the reverse transcription reaction can be provided for each and confirmed from the amount of the amplified product. When the reverse transcription reaction is performed using the composition of the present invention, the amount of long-chain cDNA synthesized is increased as compared with the case where the reverse transcription reaction is performed using a composition not containing a cold shock protein.
鋳型となるＲＮＡは、プライマーがハイブリダイズした場合に、プライマーからの逆転写反応の鋳型として働くことができるＲＮＡである。本発明の組成物には、１種類の鋳型を含んでも、又は異なるヌクレオチド配列を有する複数種の鋳型が含まれていてもよい。特定の鋳型に特異的なプライマーを使用することによって、核酸混合物中の複数種の鋳型についてプライマー伸長産物を作製することができる。複数の鋳型は、異なる核酸内に存在しても、同一の核酸内に存在してもよい。 The template RNA is RNA that can serve as a template for reverse transcription reaction from the primer when the primer is hybridized. The composition of the present invention may contain one type of template or a plurality of types of templates having different nucleotide sequences. By using primers specific for a particular template, primer extension products can be made for multiple types of templates in a nucleic acid mixture. Multiple templates may be present in different nucleic acids or in the same nucleic acid.
本発明に適用することができる鋳型となるＲＮＡとしては特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、又は特定のＲＮＡ分子群（例えば、共通の塩基配列モチーフを有するＲＮＡ分子群、ＲＮＡポリメラーゼによる転写物、サブトラクション法によって濃縮されたＲＮＡ分子群）が挙げられ、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能な任意のＲＮＡが挙げられる。 The template RNA that can be applied to the present invention is not particularly limited, and is a RNA molecule group such as total RNA, mRNA, tRNA, or rRNA in a sample, or a specific RNA molecule group (for example, a common base sequence motif). RNA molecules having RNA, transcripts by RNA polymerase, RNA molecules concentrated by subtraction method), and any RNA capable of producing a primer used for reverse transcription reaction.
本発明において、鋳型となるＲＮＡは、例えば細胞、組織、血液のような生体由来試料、食品、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料に含有されたものであっても良く、該試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物に含有されたものであっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の全ＲＮＡ、あるいは特定のＲＮＡ分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が挙げられる。 In the present invention, RNA used as a template may be contained in a sample that may contain a living organism such as a cell, tissue, or blood, or a living organism such as food, soil, or waste water. The nucleic acid-containing preparation obtained by treating the sample or the like by a known method may be used. Examples of the preparation include cell debris and a sample obtained by fractionating the same, total RNA in the sample, or a specific RNA molecule group, for example, a sample enriched with mRNA.
本発明の方法におけるコールドショックタンパク質の使用量は、特に限定はないが、反応液量２０μＬで逆転写反応を行う場合、好適には０．５〜２０μｇであり、より好適には１〜１０μｇであり、さらにより好適には２〜５μｇである。 The amount of cold shock protein used in the method of the present invention is not particularly limited. However, when the reverse transcription reaction is performed with a reaction solution amount of 20 μL, it is preferably 0.5 to 20 μg, more preferably 1 to 10 μg. Yes, even more preferably 2-5 μg.
本発明の方法における逆転写酵素の使用量は、特に限定はないが、例えば従来の逆転写反応において使用されていた量を使用すれば良い。例えばＭＭＬＶ由来逆転写酵素を用いて反応液量２０μＬで逆転写反応を行う場合、反応液中の該酵素量は１０Ｕ以上であり、ｃＤＮＡ合成効率の観点から、好ましくは１００Ｕ以上であり、更に好ましくは２００Ｕ以上である。従来の方法では、過剰量の逆転写酵素による反応阻害を避けるために鋳型ＲＮＡ量やｃＤＮＡ合成鎖長に応じて酵素量を調節する必要があったが、本発明の方法においてはその必要はない。 The amount of reverse transcriptase used in the method of the present invention is not particularly limited. For example, the amount used in the conventional reverse transcription reaction may be used. For example, when a reverse transcription reaction is carried out using an MMLV-derived reverse transcriptase with a reaction volume of 20 μL, the amount of the enzyme in the reaction liquid is 10 U or more, and preferably 100 U or more, more preferably from the viewpoint of cDNA synthesis efficiency. Is over 200U. In the conventional method, in order to avoid reaction inhibition by an excessive amount of reverse transcriptase, it was necessary to adjust the amount of enzyme according to the amount of template RNA or the cDNA synthesis chain length, but this is not necessary in the method of the present invention. .
なお、本明細書に記載の逆転写酵素の活性は市販の酵素の表示に基づくものであり、例えば、Ｐｏｌｙ（ｒＡ）・ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８を鋳型／プライマーとし、３７℃で１０分間に１ｎｍｏｌの［３Ｈ］ｄＴＴＰ を取り込む酵素活性を１Ｕとする。 In addition, the activity of the reverse transcriptase described in the present specification is based on the indication of a commercially available enzyme. For example, Poly (rA) · oligo (dT) 12-18 is used as a template / primer for 10 minutes at 37 ° C. The enzyme activity for incorporating 1 nmol of [ 3 H] dTTP is defined as 1 U.
本発明の方法におけるプライマーの濃度は、特に制限はないが、鋳型ＲＮＡからの最大限のｃＤＮＡ合成の観点から、特異的プライマーで逆転写反応を行う場合、好ましくは０．１μＭ以上、Ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマーで逆転写反応を行う場合、好ましくは２．５μＭ以上、ランダムプライマーで逆転写反応を行う場合、好ましくは５μＭ以上の十分量のプライマー濃度で行えばよい。従来の方法では、過剰量のプライマーによる反応阻害を避けるために鋳型ＲＮＡ量やｃＤＮＡ合成鎖長に応じてプライマー量を調節する必要があったが、本発明の方法においてはその必要はない。 The concentration of the primer in the method of the present invention is not particularly limited, but from the viewpoint of maximum cDNA synthesis from the template RNA, when performing reverse transcription reaction with a specific primer, preferably 0.1 μM or more, Oligo dT primer When the reverse transcription reaction is carried out with a random primer, the primer concentration is preferably 2.5 μM or more. When the reverse transcription reaction is carried out with a random primer, the primer concentration is preferably 5 μM or more. In the conventional method, it was necessary to adjust the amount of primer according to the amount of template RNA or the cDNA synthesis chain length in order to avoid reaction inhibition by an excessive amount of primer, but this is not necessary in the method of the present invention.
本発明のｃＤＮＡの合成方法は、好適には
Ａ）ＣｓｐＡ、逆転写酵素、少なくとも一種のリボヌクレオチド、少なくとも１種のプライマー、及び鋳型となるＲＮＡを混合し、反応組成物を調製する工程、及び
Ｂ）鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件でＡ）工程で調製した反応組成物をインキュベートする工程を含む。
The cDNA synthesis method of the present invention preferably comprises A) a step of preparing a reaction composition by mixing CspA, reverse transcriptase, at least one ribonucleotide, at least one primer, and RNA as a template, and B) Incubating the reaction composition prepared in step A) under conditions sufficient to synthesize a primer extension strand complementary to the template RNA.
鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー伸長鎖を合成するために十分な条件とは、特に限定するものではないが、温度条件としては３０℃〜６５℃が例示され、好適には３７℃〜５０℃であり、４２℃〜４５℃がより好適である。また、反応時間としては、５分〜１２０分が例示され、１５分〜６０分がより好適である。なお、本発明のｃＤＮＡの合成方法によれば、上記の温度条件に満たない温度に反応液を放置することに起因する、非特異的なプライマー伸長鎖の合成を抑制又は低減することができる。従って、本発明のｃＤＮＡの合成方法は、例えば、反応液の調製に長時間を要するような多検体を取り扱うｃＤＮＡの合成の際に、特に有用である。 The conditions sufficient for synthesizing the primer extension strand complementary to the template RNA are not particularly limited, but the temperature conditions include 30 ° C to 65 ° C, preferably 37 ° C to 50 ° C. Yes, 42 ° C to 45 ° C is more suitable. Moreover, as reaction time, 5 minutes-120 minutes are illustrated, and 15 minutes-60 minutes are more suitable. According to the method for synthesizing cDNA of the present invention, it is possible to suppress or reduce the synthesis of a nonspecific primer extension chain caused by leaving the reaction solution at a temperature that does not satisfy the above temperature conditions. Therefore, the cDNA synthesis method of the present invention is particularly useful, for example, when synthesizing cDNA that handles multiple specimens that require a long time to prepare a reaction solution.
なお、本発明の方法により得られたｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅反応を実施することにより、ｃＤＮＡを増幅することが出来る。核酸増幅反応としては、特に限定するものではないが、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が例示される。 The cDNA can be amplified by carrying out a nucleic acid amplification reaction using the cDNA obtained by the method of the present invention as a template. Although it does not specifically limit as a nucleic acid amplification reaction, For example, a polymerase chain reaction (PCR) method is illustrated.
６）本発明による逆転写酵素を用いる改善されたｃＤＮＡ合成のためのキット
本発明のキットは、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素を含む。本発明のキットにより、反応性が高い逆転写反応を行うことができる。本発明のキットとしては、逆転写反応に用いられるためのキットであれば特に限定されるものではなく、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での逆転写反応を行なうためのキットが挙げられる。具体的には、例えば、核酸標識用キット、ＲＴ−ＰＣＲ用キット、ｃＤＮＡ合成用キット、部位特異的変異導入用キット等が挙げられる。
6) Kit for improved cDNA synthesis using reverse transcriptase according to the present invention The kit of the present invention comprises a cold shock protein and a reverse transcriptase. With the kit of the present invention, a highly reactive reverse transcription reaction can be performed. The kit of the present invention is not particularly limited as long as it is a kit for use in a reverse transcription reaction, and includes a kit for performing a reverse transcription reaction in a test tube (in vitro). Specific examples include nucleic acid labeling kits, RT-PCR kits, cDNA synthesis kits, site-specific mutagenesis kits, and the like.
本発明のキットには、コールドショックタンパク質及び逆転写酵素に加えて、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、鋳型となる核酸及び／又は反応緩衝液が含まれていても良い。 In addition to the cold shock protein and reverse transcriptase, the kit of the present invention may contain at least one primer, at least one deoxyribonucleotide, a nucleic acid serving as a template, and / or a reaction buffer.
コールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、鋳型となる核酸及び／又は反応緩衝液は、これらのうち一部又は全部が混合された状態でキットに包含されていても、それぞれが単独のコンポーネントの状態でキットに包含されていてもよい。 A cold shock protein, reverse transcriptase, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide, a template nucleic acid and / or a reaction buffer are included in the kit in a state in which some or all of them are mixed. Or each may be included in the kit in the form of a single component.
また、本発明のキットには、逆転写反応によって得られるｃＤＮＡを鋳型とした遺伝子増幅反応、例えばＰＣＲを行うための試薬がさらに含有されていても良い。このような試薬としては、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝液、少なくとも一種のデオキシリボヌクレオチド、及び少なくとも一対のプライマー対が挙げられる。 The kit of the present invention may further contain a reagent for performing a gene amplification reaction, for example, PCR, using cDNA obtained by reverse transcription as a template. Such reagents include heat-resistant DNA polymerases, reaction buffers, at least one deoxyribonucleotide, and at least one primer pair.
本発明のキットに含まれるコールドショックタンパク質、逆転写酵素、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド、鋳型となる核酸及び反応緩衝液としては、前記のものが例示される。 Examples of the cold shock protein, reverse transcriptase, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide, the nucleic acid used as a template, and the reaction buffer contained in the kit of the present invention include those described above.
（７）本発明によるエンドリボヌクレアーゼ切断部位の同定用の組成物
本発明による組成物は、コールドショックタンパク質、ＲＮＡ基質、及びエンドリボヌクレアーゼを含む。３塩基より長い特異的配列を認識するエンドリボヌクレアーゼの切断特異性を決定する際には、考え得る標的配列の全てをカバーするほど十分に長いＲＮＡ基質を使用することが重要である。例えば、ＲＮＡが等しい数の各々の塩基を含有すると仮定すれば、ＲＮＡ基質は、考え得る５塩基切断部位の全てを含有するためには１０２４塩基（＝４５）より長くなくてはならない。好ましくは、３５６９塩基から成り、極めて均等な塩基含量（２６％のＧ、２３％のＡ、２６％のＣ、及び２５％のＵ）を有するバクテリオファージＭＳ２ ＲＮＡが切断特異性を決定するための基質として使用され得る。
(7) Composition for identification of endoribonuclease cleavage site according to the present invention The composition according to the present invention comprises a cold shock protein, an RNA substrate, and an endoribonuclease. In determining the cleavage specificity of an endoribonuclease that recognizes a specific sequence longer than 3 bases, it is important to use an RNA substrate that is long enough to cover all possible target sequences. For example, assuming that the RNA contains an equal number of each base, the RNA substrate must be longer than 1024 bases (= 4 5 ) in order to contain all possible five base cleavage sites. Preferably, bacteriophage MS2 RNA consisting of 3569 bases and having a very even base content (26% G, 23% A, 26% C, and 25% U) is used to determine cleavage specificity. Can be used as a substrate.
しかしながら、かかる長いＲＮＡを基質として用いる上で主要な問題は、それが一本鎖ＲＮＡではあるが、切断を妨げる可能性のある広範な安定した二次構造を形成することである（図１４Ａを参照されたい）。したがって、かかる長いＲＮＡを基質としてエンドリボヌクレアーゼに対して使用するためには、その二次構造は折り畳まれていない必要がある。 However, a major problem in using such long RNAs as substrates is that although it is a single-stranded RNA, it forms a wide range of stable secondary structures that can prevent cleavage (see FIG. 14A). See). Therefore, in order to use such long RNA as a substrate for endoribonuclease, its secondary structure needs to be unfolded.
本発明は、これらの長いＲＮＡ基質の二次構造をほどくためにコールドショックタンパク質を利用する。コールドショックタンパク質は、これらの二次構造をほどくことによって切断が可能なＲＮＡの量を増大させ、したがってエンドリボヌクレアーゼ切断部位の決定に役立つ。好ましくは、コールドショックタンパク質の濃度は少なくとも０．４３ｍＭ、又はそうでなくともＲＮＡ基質を完全に飽和させるのに十分な濃度である。 The present invention utilizes cold shock proteins to unravel the secondary structure of these long RNA substrates. Cold shock proteins increase the amount of RNA that can be cleaved by unwinding these secondary structures, thus helping to determine the endoribonuclease cleavage site. Preferably, the concentration of cold shock protein is at least 0.43 mM, or otherwise sufficient to fully saturate the RNA substrate.
ｍＲＮＡインターフェラーゼは、本発明において利用することのできるエンドリボヌクレアーゼの一例であるが、かかるエンドリボヌクレアーゼは一本鎖ＲＮＡを切断することが可能であれば特に限定されない。 mRNA interferase is an example of an endoribonuclease that can be used in the present invention, but such endoribonuclease is not particularly limited as long as it can cleave single-stranded RNA.
（８）本発明によるエンドリボヌクレアーゼ切断部位を同定する方法
本発明によるエンドリボヌクレアーゼ切断部位を同定する別の方法は、
Ａ）コールドショックタンパク質、ＲＮＡ基質、及びエンドリボヌクレアーゼを含む混合物を調製する工程、並びに
Ｂ）工程Ａ）で調製した混合物をインキュベートする工程を含む。
(8) Method for identifying an endoribonuclease cleavage site according to the present invention Another method for identifying an endoribonuclease cleavage site according to the present invention comprises:
A) preparing a mixture comprising cold shock protein, RNA substrate, and endoribonuclease; and B) incubating the mixture prepared in step A).
この本発明の方法によって、エンドリボヌクレアーゼの切断特異性を決定することができる。コールドショックタンパク質は、ＲＮＡにおける二次構造の形成を防止することによって、エンドリボヌクレアーゼによるＲＮＡ基質の切断を増強する。 By this method of the present invention, the cleavage specificity of endoribonuclease can be determined. Cold shock proteins enhance the cleavage of RNA substrates by endoribonucleases by preventing the formation of secondary structures in RNA.
好ましくは、混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。切断部位は、実施例１７に記載されるようにプライマー伸長解析によってｉｎ ｖｉｔｒｏで解析してもよい。 Preferably, the mixture is incubated at 37 ° C. for 15 minutes. The cleavage site may be analyzed in vitro by primer extension analysis as described in Example 17.
（９）本発明によるエンドリボヌクレアーゼ切断部位の同定用のキット
本発明によるキットは、コールドショックタンパク質及びＲＮＡ基質を含む。本発明のキットによると、エンドリボヌクレアーゼの切断部位は、対象のエンドリボヌクレアーゼをキットのコンポーネントと共にインキュベートすることによって決定され得る。本発明によるキットは、エンドリボヌクレアーゼ切断部位を同定するために使用されるように設計されていれば特に限定されない。
(9) Kit for identification of endoribonuclease cleavage site according to the present invention The kit according to the present invention comprises a cold shock protein and an RNA substrate. According to the kit of the invention, the endoribonuclease cleavage site can be determined by incubating the subject endoribonuclease with the components of the kit. The kit according to the present invention is not particularly limited as long as it is designed to be used for identifying an endoribonuclease cleavage site.
以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。なお、下記実施例において各逆転写酵素の活性は、各逆転写酵素に添付の説明書の表示に基づいて示した。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the scope of the examples. In the following examples, the activity of each reverse transcriptase was shown based on the instructions in the instructions attached to each reverse transcriptase.
調製例
ＣｓｐＡ溶液及び酵素保存バッファーの調製
ＣｓｐＡをＳ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．）， １９９３， １１４， ６６３−６６９］に記載の方法に従って発現、精製した後、２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液（２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液（５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、及び１４．８μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液（１４．８μｇ／μＬ ＣｓｐＡ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を調製した。
Preparation Example Preparation of CspA solution and enzyme storage buffer After expression and purification according to the method described in Chatterje et al. [J. Biochem., 1993, 114, 663-669], 2 μg / μL CspA solution (2 μg / μL CspA, 20 mM Tris-HCl (PH 7.8 (4 ° C.)), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol), 5 μg / μL CspA solution (5 μg / μL CspA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.8 (4 ° C.)), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol), and 14.8 μg / μL CspA solution (14.8 μg / μL CspA, 20 mM Tris-HCl (pH 7.8 (4 ° C.)), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM D T, 50% Glycerol) was prepared.
また、ＣｓｐＡを含まない酵素保存バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）についても調製した。 An enzyme storage buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.8 (4 ° C.)), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol) not containing CspA was also prepared.
以下の実施例における酵素保存バッファーとしては、本調製例で調製したものを使用した。また、ＣｓｐＡ溶液としては、実施例６〜１１では本調製例において調製した２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を使用し、実施例１２〜１３では本調製例において調製した５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を使用し、実施例１〜５では本調製例において調製した１４．８μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を使用した。 As the enzyme storage buffer in the following examples, those prepared in this Preparation Example were used. In addition, as the CspA solution, in Examples 6 to 11, the 2 μg / μL CspA solution prepared in this Preparation Example was used, and in Examples 12 to 13, the 5 μg / μL CspA solution prepared in this Preparation Example was used. In Examples 1 to 5, the 14.8 μg / μL CspA solution prepared in this Preparation Example was used.
菌株及びプラスミド
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を組み換えタンパク質発現に使用した。プラスミドｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＦ−ｍｔ３及びｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＦ−ｍｔ７を、ｐＥＴ−２８ａ（Novagen）からそれぞれ（Ｈｉｓ）６ＭａｚＦ−ｍｔ３及び（Ｈｉｓ）６ＭａｚＦ−ｍｔ７を発現するように構築した。
Strains and plasmids E. coli BL21 (DE3) strain was used for recombinant protein expression. Plasmids pET-28a-MazF-mt3 and pET-28a-MazF-mt7 were constructed from pET-28a (Novagen) to express (His) 6 MazF-mt3 and (His) 6 MazF-mt7, respectively.
大腸菌における（Ｈｉｓ）６タグ付きＭａｚＦ−ｍｔ３及びＭａｚＦ−ｍｔ７の精製
Ｎ末端に（Ｈｉｓ）６タグを付けたＭａｚＦ−ｍｔ３及びＭａｚＦ−ｍｔ７を、ｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＦ−ｍｔ３及びｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＦ−ｍｔ７を担持するＢＬ２１（ＤＥ３）株からＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Qiagen）を用いて精製した。
Purification of (His) 6- tagged MazF-mt3 and MazF-mt7 in E. coli MazF-mt3 and MazF-mt7 with (His) 6 tag at the N-terminus were transformed into pET-28a-MazF-mt3 and pET-28a-MazF. -Purified from strain BL21 (DE3) carrying mt7 using Ni-NTA resin (Qiagen).
実施例１
５ｎｇ又は５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Clontech Laboratories, Inc.製）、ｐ５３遺伝子の２ｋｂＤＮＡ断片の増幅用のフォワードプライマー（配列番号１）及びリバースプライマー（配列番号２）各々１０ｐｍｏｌ、０．６２５ＵのＴａＫａＲａ Ｔａｑ（Ｔａｇ ＤＮＡポリメラーゼ、タカラバイオ社製）を含む、２５μｌの最終容量を有するＰＣＲ混合物を、ＴａＫａＲａ Ｔａｑに付属の反応バッファーを用いて、ＴａＫａＲａ Ｔａｑの取扱説明書に従って氷上調製した。上記の混合物に２μｇ、４μｇ、６μｇ、８μｇ、１０μｇ、１２μｇ、又は１４μｇのＣｓｐＡをそれぞれ添加した。また、ＣｓｐＡを含有しない混合物を対照として調製した。
Example 1
5 ng or 50 ng human genomic DNA (Clontech Laboratories, Inc.), forward primer (SEQ ID NO: 1) and reverse primer (SEQ ID NO: 2) for amplification of 2 kb DNA fragment of p53 gene, 10 pmol, 0.625 U TaKaRa Taq (Tag) A PCR mixture having a final volume of 25 μl containing DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was prepared on ice using a reaction buffer attached to TaKaRa Taq according to the instruction manual of TaKaRa Taq. 2 μg, 4 μg, 6 μg, 8 μg, 10 μg, 12 μg, or 14 μg of CspA was added to the above mixture, respectively. A mixture containing no CspA was also prepared as a control.
このように調製した各々の混合物を２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＣＲを３０サイクル（１サイクルは９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間から成るプロセスを含む）で行った。反応終了後、各々３μｌの試料を１％アガロースゲル上で電気泳動し、各々の混合物中の増幅産物の長さ及び量を決定した。 Each mixture thus prepared was incubated at 25 ° C. for 30 minutes. PCR was then performed in 30 cycles (one cycle comprising a process consisting of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 2 minutes). At the end of the reaction, 3 μl of each sample was electrophoresed on a 1% agarose gel to determine the length and amount of amplification product in each mixture.
図１に示すように、ＣｓｐＡを含有しない混合物においては長さ２ｋｂの産物は見られず、非特異的増幅による様々な長さの産物が観察された。これに対し、それぞれ４μｇ〜１４μｇのＣｓｐＡを含有する各々の混合物において、２ｋｂの産物がはっきりと観察された。６μｇ〜１０μｇのＣｓｐＡを含有する混合物中の産物の量は、他の混合物より多かった。この結果により、ＣｓｐＡが、混合物をＰＣＲ前に室温に放置することによって起こる非特異的増幅を低減することが明らかとなった。 As shown in FIG. 1, in the mixture containing no CspA, a product having a length of 2 kb was not observed, and products of various lengths due to non-specific amplification were observed. In contrast, a 2 kb product was clearly observed in each mixture containing 4 μg to 14 μg CspA each. The amount of product in the mixture containing 6 μg to 10 μg CspA was higher than the other mixtures. This result revealed that CspA reduced non-specific amplification caused by leaving the mixture at room temperature prior to PCR.
実施例２
さらに、ＤＮＡポリメラーゼをＴａＫａＲａ ＴａｑからＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＬＡ−ＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ混合物、タカラバイオ社製）に変更した以外は、実施例１に記載されるものと同じ実験を行った。ＬＡ−ＰＣＲ用のＤＮＡポリメラーゼ混合物を用いても、本質的に同じ結果が得られた。６μｇ以上のＣｓｐＡを含有する混合物において、産物量の増加が観察された（図２を参照されたい）。
Example 2
Furthermore, the same experiment as described in Example 1 was performed except that the DNA polymerase was changed from TaKaRa Taq to TaKaRa Ex Taq (DNA polymerase mixture for LA-PCR, manufactured by Takara Bio Inc.). Essentially the same results were obtained using a DNA polymerase mixture for LA-PCR. In mixtures containing 6 μg or more of CspA, an increase in product amount was observed (see FIG. 2).
実施例３
５ｎｇ又は５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Clontech Laboratories, Inc.製）、ｐ５３遺伝子の２ｋｂＤＮＡ断片の増幅用のフォワードプライマー（配列番号１）及びリバースプライマー（配列番号２）各々１０ｐｍｏｌ、０．６２５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（α型ＤＮＡポリメラーゼ、タカラバイオ社製）を含む、２５μｌの最終容量を有するＰＣＲ混合物を、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼに付属の反応バッファーを用いて、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの取扱説明書に従って氷上調製した。上記の混合物に０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、４μｇ、６μｇ、８μｇ、１０μｇ、１２μｇ、又は１４μｇのＣｓｐＡをそれぞれ添加した。また、ＣｓｐＡを含有しない混合物を対照として調製した。
Example 3
5 ng or 50 ng of human genomic DNA (manufactured by Clontech Laboratories, Inc.), forward primer (SEQ ID NO: 1) and reverse primer (SEQ ID NO: 2) for amplification of 2 kb DNA fragment of p53 gene, 10 pmol, 0.625 U Pyrobest DNA polymerase ( A PCR mixture having a final volume of 25 μl containing α-type DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was prepared on ice according to the Pyrobest DNA polymerase instruction manual using the reaction buffer attached to the Pyrobest DNA polymerase. 0.5 μg, 1 μg, 2 μg, 4 μg, 6 μg, 8 μg, 10 μg, 12 μg, or 14 μg of CspA was added to the above mixture, respectively. A mixture containing no CspA was also prepared as a control.
このように調製した各々の混合物を２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＰＣＲを３０サイクル（１サイクルは９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間から成るプロセスを含む）で行った。反応終了後、各々３μｇの試料を１％アガロースゲル上で電気泳動し、各々の混合物中の増幅産物の長さ及び量を決定した。結果を図３に示す。 Each mixture thus prepared was incubated at 25 ° C. for 30 minutes. PCR was then performed in 30 cycles (one cycle comprising a process consisting of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 2 minutes). At the end of the reaction, each 3 μg sample was electrophoresed on a 1% agarose gel to determine the length and amount of amplification product in each mixture. The results are shown in FIG.
ＣｓｐＡを含有しない混合物において、長さ２ｋｂの産物に加えて、顕著な量の様々な長さの産物が観察された。ＣｓｐＡの非存在下で観察された非特異的増幅は減少し、２μｇ以上のＣｓｐＡを含有する混合物における２ｋｂ産物の量は増加した。 In the mixture containing no CspA, significant amounts of various length products were observed in addition to the 2 kb product. The non-specific amplification observed in the absence of CspA decreased and the amount of 2 kb product in the mixture containing 2 μg or more CspA increased.
この結果により、ＣｓｐＡが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにおいても非特異的増幅を低減することが示された。 This result showed that CspA reduced non-specific amplification even in PCR using α-type DNA polymerase.
実施例４
５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、０．６２５ＵのＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ、１０μｇのＣｓｐＡ、及びＴＰ５３遺伝子の５７５ｂｐ断片（配列番号３及び配列番号４）、Ｂｃ １２遺伝子の５９１ｂｐ断片（配列番号５及び配列番号６）、ＥＧＦＲ遺伝子の５２１ｂｐ断片（配列番号７及び配列番号８）、ＣＤＫ９遺伝子の３８０ｂｐ断片（配列番号９及び配列番号１０）、ＦＦＡＲ２遺伝子の１０１０ｂｐ断片（配列番号１１及び配列番号１２）、ＩＲＳ１遺伝子の５２０ｂｐ断片（配列番号１３及び配列番号１４）、又はＧＡＰ遺伝子の４６０ｂｐ断片（配列番号１５及び配列番号１６）の増幅用のプライマー対を含む、２５μｇの最終容量を有するＰＣＲ混合物をそれぞれ、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑに付属の反応バッファーを用いて、ＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑの取扱説明書に従って氷上調製した。ＣｓｐＡを含有しない混合物を同様に対照として調製した。
Example 4
50 ng human genomic DNA, 0.625 U TaKaRa ExTaq, 10 μg CspA, and 575 bp fragment of TP53 gene (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), 591 bp fragment of Bc 12 gene (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), EGFR gene 521 bp fragment (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8), CDK9 gene 380 bp fragment (SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10), FFAR2 gene 1010 bp fragment (SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12), IRS1 gene 520 bp fragment (sequence) No. 13 and SEQ ID NO: 14), or a PCR buffer with a final volume of 25 μg, each containing a primer pair for amplification of a 460 bp fragment of the GAP gene (SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16), each with a reaction buffer attached to TaKaRa ExTaq Using Ta Prepared on ice according to KaRa ExTaq instructions. A mixture containing no CspA was similarly prepared as a control.
このように調製した各々の混合物を、２つの異なる条件下で３０サイクルのＰＣＲに供した。条件１では、１サイクルは９８℃で１０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で３０秒間から成るプロセスを含む。条件２では、１サイクルは９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間から成るプロセスを含む。反応終了後、各々３μｇの１０個の混合物を１％アガロースゲル上で電気泳動し、混合物中の増幅産物を解析した。 Each mixture thus prepared was subjected to 30 cycles of PCR under two different conditions. In condition 1, one cycle includes a process consisting of 98 ° C. for 10 seconds, 53 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 30 seconds. In condition 2, one cycle includes a process consisting of 98 ° C. for 10 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 30 seconds. After completion of the reaction, 10 mixtures of 3 μg each were electrophoresed on a 1% agarose gel, and the amplification products in the mixture were analyzed.
上記の反応において使用した全てのプライマーは、７０℃を超えるＴｍ値を有する。したがって、非特異的増幅を引き起こす傾向がある。実際に、条件１下での増幅特異性は、ＣｓｐＡの非存在下で顕著に低かった。しかしながら、ＣｓｐＡの存在下では、条件１及び条件２下で増幅した各々の混合物において、予想される産物のみが観察された（図４を参照されたい）。 All primers used in the above reactions have Tm values above 70 ° C. Therefore, it tends to cause non-specific amplification. In fact, the amplification specificity under condition 1 was significantly lower in the absence of CspA. However, in the presence of CspA, only the expected product was observed in each mixture amplified under conditions 1 and 2 (see FIG. 4).
この結果により、ＣｓｐＡがＰＣＲ増幅の特異性を増大させる能力を有し、核酸の特異的増幅に対するアニーリング温度の範囲を広げることができることが示される。 This result indicates that CspA has the ability to increase the specificity of PCR amplification and can extend the range of annealing temperatures for specific amplification of nucleic acids.
実施例５
１０μｇ／ｍｌのＣｓｐＡを含む溶液を２アリコート調製し、一方を９８℃で５分間処理した。実施例４に示すものと同じ組成を有するが、このように調製した熱処理ＣｓｐＡ又は非熱処理ＣｓｐＡを１０μｇ含むＰＣＲ混合物を調製した。このように調製した各々の混合物を、条件１下で３０サイクルのＰＣＲに供した。反応終了後、各々の混合物中の増幅産物を検査したところ、熱処理ＣｓｐＡと非熱処理ＣｓｐＡとで違いは観察されなかった。結果は図５に示す。この結果により、ＣｓｐＡの高い熱安定性が示唆される。
Example 5
Two aliquots of a solution containing 10 μg / ml CspA were prepared and one was treated at 98 ° C. for 5 minutes. A PCR mixture having the same composition as that shown in Example 4 but containing 10 μg of heat-treated or non-heat-treated CspA prepared in this way was prepared. Each mixture thus prepared was subjected to 30 cycles of PCR under Condition 1. After completion of the reaction, amplification products in each mixture were examined, and no difference was observed between heat-treated CspA and non-heat-treated CspA. The results are shown in FIG. This result suggests high thermal stability of CspA.
実施例６
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応におけるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物量（バックグランド）の確認
Ｈｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇ（クロンテック社）を鋳型とし、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ（終濃度２．５μＭ）によりｃＤＮＡを合成するための逆転写反応液２０μＬをＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて氷上調製した。その際、逆転写反応液の組成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに添付の説明書に記載の逆転写反応液の組成に加えて２μｇ ＣｓｐＡを含むものとした。また、対照として、ＣｓｐＡの代わりに酵素保存バッファー１μＬを加えたＣｓｐＡを含まない逆転写反応液についても調製した。次に、氷上調製したこれらの逆転写反応液について、０〜２０分間氷上放置した後、９５℃まで加熱して逆転写酵素を失活させた。続いて、０〜２０分間の氷上放置によりそれぞれの溶液に生成したｃＤＮＡ量を確認するため、これらの反応液のうちそれぞれ２μＬを、ディストロフィン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００４００６）のＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９塩基（６５２９−６６６７）、及びＰｏｌｙＡの近傍から６９３０塩基の鎖長（６５２９−１３４５８）をターゲットとしたリアルタイムＰＣＲに供した。
Example 6
Confirmation of non-specific extension product amount (background) from other than PolyA in reverse transcription reaction using Oligo dT as a primer Using Human heart total RNA 1 μg (Clontech) as a template, Oligo dT (final concentration 2.5 μM) 20 μL of a reverse transcription reaction solution for synthesizing cDNA was prepared on ice using PrimeScript (registered trademark) RTase (Takara Bio Inc.). At that time, the composition of the reverse transcription reaction solution contained 2 μg CspA in addition to the composition of the reverse transcription reaction solution described in the instructions attached to PrimeScript (registered trademark) RTase. In addition, as a control, a reverse transcription reaction solution containing no CspA supplemented with 1 μL of enzyme storage buffer instead of CspA was also prepared. Next, these reverse transcription reaction solutions prepared on ice were left on ice for 0 to 20 minutes, and then heated to 95 ° C. to inactivate the reverse transcriptase. Subsequently, in order to confirm the amount of cDNA generated in each solution by standing on ice for 0 to 20 minutes, 2 μL of each of these reaction solutions was separated from PolyA of the dystrophin gene (GenBank Accession Number NM_004006) by about 7 kb. The region was subjected to real-time PCR targeting 139 bases (6529-6667) in the region and a chain length of 6930 bases (6529-13458) from the vicinity of PolyA.
上記１３９塩基をターゲットとしたリアルタイムＰＣＲは、プライマーとして配列番号１７の塩基配列からなるプライマー及び配列番号１８の塩基配列からなるプライマーを用い、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社）を用いて添付の説明書の推奨条件に従って行った。一方、上記６９３０塩基をターゲットとした長鎖のリアルタイムＰＣＲは、プライマーとして配列番号１７の塩基配列からなるプライマー及び配列番号１９の塩基配列からなるプライマーを用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＧＸＬ（タカラバイオ社）及びＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ（タカラバイオ社）を用いて行った。リアルタイムＰＣＲの反応液は、最終濃度が×０．３３となるようにＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉを加えた点以外はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＧＸＬに添付の説明書に記載の高速ＰＣＲプロトコールの反応液組成に従って調製した。また、リアルタイムＰＣＲは、９８℃で１０秒間のインキュベートの後、９８℃で５秒〜６８℃で２分を１サイクルとした４０サイクルの条件で実施した。なお、本明細書に記載のいずれの逆転写の実施例においても、リアルタイムＰＣＲにはＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｃｙｓｔｅｍ ＴＰ８００（タカラバイオ社）を使用した。また、検量線は、上記領域を含む１３５４２塩基（１７３−１３７１４）のｃＤＮＡをｐＵＣ１１８のＨｉｎｃ ＩＩサイトにクローン化したプラスミドの希釈系列を用いて作成した。 The above-mentioned real-time PCR targeting 139 bases uses a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 17 and a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 18 as primers, and SYBR (registered trademark) Premix Ex Taq (Takara Bio Inc.). In accordance with the recommended conditions in the attached manual. On the other hand, the long-chain real-time PCR targeting the 6930 bases described above uses PrimeSTAR (registered trademark) GXL (Takara Bio Inc.) using a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 17 and a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 19 as primers. ) And SYBR (registered trademark) Green I (Takara Bio Inc.). The reaction solution of the real-time PCR was the reaction of the high-speed PCR protocol described in the instructions attached to PrimeSTAR (registered trademark) GXL except that SYBR (registered trademark) Green I was added so that the final concentration was × 0.33. Prepared according to the liquid composition. Moreover, real-time PCR was performed on the conditions of 40 cycles which made 1 cycle from 98 degreeC 5 second-68 degreeC 2 minutes after incubation for 10 second. In any of the reverse transcription examples described in the present specification, Thermal Cycler Dice (registered trademark) Real Time System TP800 (Takara Bio Inc.) was used for real-time PCR. A calibration curve was prepared using a dilution series of a plasmid obtained by cloning 13542 base (173-13714) cDNA including the above region into the Hinc II site of pUC118.
その結果、ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は、逆転写反応液中のＣｓｐＡの有無にかかわらず検出されなかった。一方、ＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ量は、逆転写反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合には氷上放置時間が長くなるに従い増加した。これに対し、逆転写反応液中にＣｓｐＡが存在する場合は、同領域のｃＤＮＡ量がほとんど増加せず、氷上放置２０分のｃＤＮＡ合成量は反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合の４０分の１であった（図６）。ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は検出されないことから、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ合成産物は、ＰｏｌｙＡから伸長した産物ではなくＰｏｌｙＡ以外からの非特異的な伸長産物であることが分かる。このような非特異的な伸長産物は、完全長のｃＤＮＡを得る目的においてはバックグランドとなる。また、この非特異的な伸長産物は、ＰｏｌｙＡからＲＮＡの５′端までの伸長反応を阻害し、不完全長のｃＤＮＡ合成産物の増加をもたらす。 As a result, a long-chain cDNA product of 6930 bases from the vicinity of PolyA was not detected regardless of the presence or absence of CspA in the reverse transcription reaction solution. On the other hand, the amount of 139 bp cDNA in a region about 7 kb away from PolyA increased as the standing time on ice increased in the absence of CspA in the reverse transcription reaction solution. On the other hand, when CspA is present in the reverse transcription reaction solution, the amount of cDNA in the same region hardly increases, and the amount of cDNA synthesized on ice for 20 minutes is 40 minutes when CspA is not present in the reaction solution. 1 (FIG. 6). Since a long-chain cDNA product of 6930 bases from the vicinity of PolyA is not detected, the 139 bp cDNA synthesis product in the region about 7 kb away from PolyA generated when preparing the reverse transcription reaction solution and standing on ice is not a product extended from PolyA. It can be seen that it is a non-specific extension product from other than PolyA. Such a non-specific extension product is a background for the purpose of obtaining a full-length cDNA. In addition, this non-specific extension product inhibits the extension reaction from PolyA to the 5 'end of RNA, resulting in an increase in incomplete length cDNA synthesis product.
本実施例において、逆転写反応液中のＣｓｐＡにより、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるｐｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物（バックグランド）の生成がほぼ完全に抑制されることが示された。 In this example, it is shown that CspA in the reverse transcription reaction solution almost completely suppresses the generation of a non-specific extension product (background) other than polyA that occurs when the reverse transcription reaction solution is prepared and left on ice. It was done.
実施例７
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応におけるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物量（バックグランド）の確認
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅ（インビトロジェン）を用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅに添付の説明書に沿って２μｇ ＣｓｐＡを含む逆転写反応液２０μＬ及び対照のＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点以外は、実施例６と同様の方法で、ＣｓｐＡの効果を検討した。なお、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅはＭＭＬＶ由来逆転写酵素の変異体である。
Example 7
Confirmation of non-specific extension product amount (background) other than PolyA in reverse transcription reaction using Oligo dT as a primer SuperScript III RTase (Invitrogen) is used instead of PrimeScript (registered trademark) RTase, and attached to SuperScript III RTase The effect of CspA was examined in the same manner as in Example 6 except that 20 μL of the reverse transcription reaction solution containing 2 μg CspA and 20 μL of the reverse transcription reaction solution not containing CspA as a control were prepared according to SuperScript III RTase is a mutant of MMLV-derived reverse transcriptase.
その結果、逆転写酵素にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅを用いた場合も、ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は反応液中のＣｓｐＡの有無にかかわらず検出されなかった。また、ＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ産物量は、反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合は氷上放置時間が長くなるに従い増加するのに対し、反応液中にＣｓｐＡが存在する場合はほとんど増加せず、氷上放置２０分のｃＤＮＡ合成量が反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合の８７分の１であった（図２）。以上のことより、逆転写酵素にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅを用いても、逆転写反応液中のＣｓｐＡにより、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物（バックグランド）の生成がほぼ完全に抑制されることが示された。 As a result, even when SuperScript III RTase was used as the reverse transcriptase, a long-chain cDNA product of 6930 bases from the vicinity of PolyA was not detected regardless of the presence or absence of CspA in the reaction solution. In addition, the amount of 139 bp cDNA product in a region about 7 kb away from PolyA increases as the standing time on ice increases in the absence of CspA in the reaction solution, whereas in the case where CspA exists in the reaction solution There was almost no increase, and the amount of cDNA synthesized on ice for 20 minutes was 1/87 of the case where CspA was not present in the reaction solution (FIG. 2). As described above, even when SuperScript III RTase is used as the reverse transcriptase, nonspecific extension products other than PolyA (background) generated by CspA in the reverse transcription reaction solution when the reverse transcription reaction solution is prepared and left on ice. It was shown that the production of is almost completely suppressed.
実施例８
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応におけるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物量（バックグランド）の確認
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（タカラバイオ社）を用い、１μｇ／μＬのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社）１μＬ、５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ １μＬ、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １．６μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ、４０Ｕ／μＬのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μＬ、２５Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） ０．８μＬ、及び２μｇ／μＬのＣｓｐＡ １μＬを含む逆転写反応液２０μＬを調製する点、並びにこの反応液の対照としてＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点以外は、実施例６と同様の方法で、ＣｓｐＡの効果を検討した。なお、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）は、ＡＭＶ由来逆転写酵素である。
Example 8
Confirmation of non-specific extension product amount (background) other than PolyA in reverse transcription reaction using Oligo dT as a primer Instead of PrimeScript (registered trademark) RTase, Reverse Transscriptase XL (AMV) (Takara Bio Inc.) was used. 1 μg / μL Human heart total RNA (Clontech) 1 μL, 50 μM Oligo dT 1 μL, 2.5 mM each dNTP mix 1.6 μL, Reverse Transscriptase XL (AMV) Buffer 2 μL 25 U / μL Reverse Transscriptase XL (AMV) 0.8 μL, and 2 μg / μL CspA 1 μL Point to prepare a reverse transcription reaction solution 20μL containing, and except for preparing a reverse transcription reaction solution 20μL containing no CspA as a control for the reaction, in the same manner as in Example 6, was examined the effect of CspA. Note that reverse transcriptase XL (AMV) is an AMV-derived reverse transcriptase.
その結果、逆転写酵素にＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）を用いた場合も、ＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖のｃＤＮＡ産物は、反応液中のＣｓｐＡの有無にかかわらず検出されなかった。また、ＰｏｌｙＡから約７ｋｂ離れた領域の１３９ｂｐのｃＤＮＡ産物量は、反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合は氷上放置時間が長くなるに従い増加するのに対し、反応液中にＣｓｐＡが存在する場合はほとんど増加せず、氷上放置２０分のｃＤＮＡ合成量は反応液中にＣｓｐＡが存在しない場合の８４分の１であった（図８）。以上のことから、ＡＭＶ由来逆転写酵素を用いても、逆転写反応液中のＣｓｐＡにより、逆転写反応液調製時及び氷上放置で生じるＰｏｌｙＡ以外からの非特異的伸長産物（バックグランド）の生成がほぼ完全に抑制されることが示された。 As a result, even when Reverse Transcriptase XL (AMV) was used as the reverse transcriptase, a long-chain cDNA product of 6930 bases from around PolyA was not detected regardless of the presence or absence of CspA in the reaction solution. In addition, the amount of 139 bp cDNA product in the region about 7 kb away from PolyA increases as the standing time on ice increases when CspA does not exist in the reaction solution, whereas when the amount of CspA exists in the reaction solution Almost no increase was observed, and the amount of cDNA synthesized on ice for 20 minutes was 1/84 of that in the absence of CspA in the reaction solution (FIG. 8). From the above, even when AMV-derived reverse transcriptase is used, nonspecific elongation products (background) other than PolyA generated during preparation of the reverse transcription reaction solution and standing on ice are generated by CspA in the reverse transcription reaction solution. Was shown to be almost completely suppressed.
実施例９
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応における長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、２μｇ ＣｓｐＡを含む逆転写反応液２０μＬ、及びＣｓｐＡを含まない対照の逆転写反応液２０μＬを、実施例１と同様の方法で調製した。氷上調製した反応液は、０〜２０分間氷上放置した後、４２℃で３０分の条件で逆転写反応を行ない、９５℃で５分間加熱し反応を中止した。この反応液のうち２μＬについて、ディストロフィン遺伝子のＰｏｌｙＡ近傍から６９３０塩基の長鎖をターゲットとしたリアルタイムＰＣＲを実施例６と同様の方法で行い、逆転写反応により生成したｃＤＮＡ量を定量した。
Example 9
Inhibition of long-chain cDNA synthesis reaction in reverse transcription reaction using Oligo dT as a primer Using PrimeScript (registered trademark) RTase (Takara Bio Inc.), 20 μL of a reverse transcription reaction solution containing 2 μg CspA, and a control without CspA 20 μL of the reverse transcription reaction solution was prepared in the same manner as in Example 1. The reaction solution prepared on ice was allowed to stand on ice for 0 to 20 minutes, and then reverse transcription was performed at 42 ° C. for 30 minutes, and the reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 5 minutes. 2 μL of this reaction solution was subjected to real-time PCR targeting a long chain of 6930 bases from the vicinity of PolyA of the dystrophin gene in the same manner as in Example 6 to quantify the amount of cDNA produced by the reverse transcription reaction.
その結果、ＣｓｐＡを含まない反応液では、２０分の氷上放置によりＰｏｌｙＡ近傍からの６９３０塩基の長鎖の伸長産物量が氷上放置しない場合の５２％に減少した。これに対し、ＣｓｐＡを含む反応液では２０分氷上放置してもｃＤＮＡ合成量は全く減少しなかった（図９）。このＣｓｐＡの効果は、反応液中のＣｓｐＡによりＰｏｌｙＡ以外からの非特異的な伸長反応がほぼ完全に抑制され、ＰｏｌｙＡからの伸長反応阻害が起こらなかったことに起因すると考えられる。 As a result, in the reaction solution not containing CspA, the amount of 6930-base long-chain extension products from the vicinity of PolyA was reduced to 52% when not left on ice by being left on ice for 20 minutes. On the other hand, in the reaction solution containing CspA, the amount of cDNA synthesis did not decrease at all even when left on ice for 20 minutes (FIG. 9). This effect of CspA is considered to be due to the fact that nonspecific extension reaction from other than PolyA was almost completely suppressed by CspA in the reaction solution, and extension reaction inhibition from PolyA did not occur.
以上の結果から、反応液中のＣｓｐＡにより、反応液調製後、逆転写反応するまでに要する時間を気にする必要がなく、ＰｏｌｙＡからのｃＤＮＡ合成において極めてバックグランドが少なく、完全長の割合が高い高品質なｃＤＮＡ合成反応が可能であることが分かった。 From the above results, it is not necessary to worry about the time required for the reverse transcription reaction after preparation of the reaction solution due to CspA in the reaction solution, and there is very little background in cDNA synthesis from PolyA, and the ratio of the full length is It was found that a high-quality cDNA synthesis reaction was possible.
実施例１０
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応における長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害２
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅ（インビトロジェン社）を用い、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅに添付の説明書に沿って２μｇ ＣｓｐＡを含む逆転写反応液２０μＬ及び対照のＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点、並びに５０℃で３０分の条件で逆転写反応を行い、７０℃で１５分間加熱し反応を中止する点以外は実施例９と同様の方法で試験を行い、逆転写反応により生成したｃＤＮＡ量を定量し、ＣｓｐＡの効果を確認した。
Example 10
Inhibition of long-chain cDNA synthesis reaction in reverse transcription reaction using Oligo dT as a primer 2
SuperScript III RTase (Invitrogen) was used instead of PrimeScript (registered trademark) RTase, and 20 μL of a reverse transcription reaction solution containing 2 μg CspA and a control CspA-free reverse transcription reaction solution according to the instructions attached to SuperScript III RTase The reverse transcription reaction was carried out in the same manner as in Example 9, except that 20 μL was prepared and the reverse transcription reaction was performed at 50 ° C. for 30 minutes and the reaction was stopped by heating at 70 ° C. for 15 minutes. The amount of cDNA produced by the above was quantified to confirm the effect of CspA.
その結果、ＣｓｐＡを含まない反応液では、２０分の氷上放置によりＰｏｌｙＡ近傍からの長鎖の伸長産物量が氷上放置しない場合の１１％に減少した。これに対し、ＣｓｐＡを含む反応液では、２０分氷上放置しても氷上放置しない場合と比較して８０％のｃＤＮＡ合成量を保った（図１０）。本実施例により、逆転写酵素にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅを用いた場合であっても、ＣｓｐＡが逆転写反応液調製や氷上放置によるＰｏｌｙＡからの長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害を抑制することが確認できた。 As a result, in the reaction solution not containing CspA, the amount of long-chain extension products from the vicinity of PolyA was reduced to 11% when not left on ice by being left on ice for 20 minutes. In contrast, the reaction solution containing CspA maintained a cDNA synthesis amount of 80% even when left on ice for 20 minutes compared to the case where it was not left on ice (FIG. 10). According to this example, even when SuperScript III RTase was used as the reverse transcriptase, it was confirmed that CspA suppresses the inhibition of the long-chain cDNA synthesis reaction from PolyA due to the preparation of the reverse transcription reaction solution and standing on ice. .
実施例１１
Ｏｌｉｇｏ ｄＴをプライマーとして用いた逆転写反応における長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴａｓｅに代えてＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（タカラバイオ社）を用い、１μｇ／μＬのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社） １μＬ、５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ １μＬ、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １．６μＬ、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） Ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ、４０Ｕ／μＬのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μＬ、２５Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ） ０．８μＬ、及び２μｇ／μＬのＣｓｐＡ １μＬを含む逆転写反応液２０μＬ、並びにこの反応液の対照としてＣｓｐＡを含まない逆転写反応液２０μＬを調製する点以外は実施例９と同様の方法で試験を行い、逆転写反応により生成したｃＤＮＡ合成量を定量し、ＣｓｐＡの効果を確認した。
Example 11
Inhibition of long-chain cDNA synthesis reaction in reverse transcription reaction using Oligo dT as a primer Reverse Transscriptase XL (AMV) (Takara Bio Inc.) was used instead of PrimeScript (registered trademark) RTase, and 1 μg / μL Human heart total RNA ( Clontech) 1 μL, 50 μM Oligo dT 1 μL, 2.5 mM dNTP mixture 1.6 μL, Reverse Transscriptase XL (AMV) Buffer 2 μL, 40 U / μL Ribonuclease InLiverL ) 20 μL of a reverse transcription reaction solution containing 0.8 μL and 1 μL of 2 μg / μL CspA, and this The test was performed in the same manner as in Example 9 except that 20 μL of a reverse transcription reaction solution not containing CspA was prepared as a control for the reaction solution, and the amount of cDNA synthesized by the reverse transcription reaction was quantified to confirm the effect of CspA. did.
その結果、ＣｓｐＡを含まない反応液では、２０分の氷上放置によりＰｏｌｙＡ近傍からの長鎖の伸長産物量が氷上放置しない場合の３３％に減少した。これに対し、ＣｓｐＡを含む反応液では、２０分氷上放置しても氷上放置しない場合と比較して７５％のｃＤＮＡ合成量を保った（図１１）。本実施例により、ＡＭＶ由来逆転写酵素を用いた場合であっても、ＣｓｐＡが逆転写反応液調製や氷上放置によるＰｏｌｙＡからの長鎖ｃＤＮＡ合成反応の阻害を抑制することが確認できた。 As a result, in the reaction solution not containing CspA, the amount of long-chain extension products from the vicinity of PolyA was reduced to 33% when left on ice for 20 minutes when left on ice. In contrast, the reaction mixture containing CspA maintained a cDNA synthesis amount of 75% even when left on ice for 20 minutes as compared to when not left on ice (FIG. 11). According to this example, it was confirmed that even when AMV-derived reverse transcriptase was used, CspA suppressed inhibition of the long-chain cDNA synthesis reaction from PolyA caused by preparation of the reverse transcription reaction solution or standing on ice.
実施例１２
未変性ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応に及ぼすＣｓｐＡの効果
調製例で調製した５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を酵素保存バッファーで希釈し、０．２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、１μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、及び２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を調製した。次に、１μｇ／μＬのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社） １μＬ、５０μＭのＯｌｉｇｏ ｄＴ １μＬ、各１０ｍＭのｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １μＬ、及び滅菌蒸留水６μＬに、酵素保存バッファーを１μＬ、及び０．２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、１μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、２μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液、又は５μｇ／μＬ ＣｓｐＡ溶液を１μＬ加えた計１０μＬの混合液をそれぞれ調製した。酵素保存バッファーを用いて調製したＣｓｐＡを含まない混合液については、６５℃で５分のＲＮＡ変性処理を行った場合と行わない場合の２種類の試料を調製し、ＣｓｐＡを含む各混合液についてはＲＮＡの変性処理を行わなかった。
Example 12
Effect of CspA on Reverse Transcription Reaction Using Native RNA as Template The 5 μg / μL CspA solution prepared in the Preparation Example was diluted with an enzyme storage buffer, 0.2 μg / μL CspA solution, 1 μg / μL CspA solution, and 2 μg / A μL CspA solution was prepared. Next, 1 μg / μL Human heart total RNA (Clontech) 1 μL, 50 μM Oligo dT 1 μL, each 10 mM dNTP mix 1 μL, and sterile distilled water 6 μL, enzyme storage buffer 1 μL, and 0.2 μg / μL CspA A total solution of 10 μL was prepared by adding 1 μL of the solution, 1 μg / μL CspA solution, 2 μg / μL CspA solution, or 5 μg / μL CspA solution. For a mixture containing no CspA prepared using an enzyme storage buffer, prepare two types of samples with and without RNA denaturation treatment at 65 ° C. for 5 minutes. For each mixture containing CspA Did not denature RNA.
これらの混合液各１０μＬに対し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）に含まれる５×ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｂｕｆｆｅｒ ４μＬ、４０Ｕ／μＬのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５μＬ、２００Ｕ／μＬのＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ ０．５μＬ、及び滅菌蒸留水５μＬを添加して計２０μＬの反応液を調製した後、４２℃で３０分の逆転写反応を行い、９５℃で５分の加熱により反応を中止した。次に、これらの反応液各２．５μＬを、ディストロフィン遺伝子の約８ｋｂの領域をターゲットとするＰＣＲに供した。ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（登録商標） Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（タカラバイオ社）を用いて添付の説明書記載の反応組成により行った。プライマーとしては、配列番号２０の塩基配列からなるプライマーと配列番号２１の塩基配列からなるプライマーを用い、ＰＣＲ反応液中の各プライマーの濃度は、２００ｎＭとした。また、ＰＣＲは、９８℃で１０秒〜６８℃で８分を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲ条件で、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）（タカラバイオ社）を用いて実施した。ＰＣＲ反応終了後、反応液のうち３μＬをアガロースゲル電気泳動に供して増幅鎖長と増幅量を確認し、各逆転写反応におけるｃＤＮＡ合成量と反応特異性を評価した（図１２）。 For each 10 μL of these mixed solutions, 5 × PrimeScript Buffer 4 μL included in PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara Bio Inc.), 40 U / μL Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL 200 μL After adding 5 μL of sterilized distilled water to prepare a total reaction solution of 20 μL, a reverse transcription reaction was performed at 42 ° C. for 30 minutes, and the reaction was stopped by heating at 95 ° C. for 5 minutes. Next, 2.5 μL of each of these reaction solutions was subjected to PCR targeting an approximately 8 kb region of the dystrophin gene. PCR was performed using TaKaRa LA Taq (registered trademark) Hot Start Version (Takara Bio Inc.) according to the reaction composition described in the attached instructions. As a primer, a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 20 and a primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 21 were used, and the concentration of each primer in the PCR reaction solution was 200 nM. PCR was carried out using TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice (registered trademark) (Takara Bio Inc.) under PCR conditions of 30 cycles of 98 ° C. for 10 seconds to 68 ° C. for 8 minutes. After completion of the PCR reaction, 3 μL of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis to confirm the amplified chain length and the amplification amount, and the cDNA synthesis amount and reaction specificity in each reverse transcription reaction were evaluated (FIG. 12).
その結果、未変性のＲＮＡを鋳型とした逆転写反応において、反応液中にＣｓｐＡを添加することで、その後のＰＣＲにより確認できる約８ｋｂの長鎖のｃＤＮＡの増幅量が大きく増加するとともにターゲット以外のＤＮＡの増幅量が減少した（図１２）。以上のことより、ＲＮＡの変性操作を行わなくても反応液中にＣｓｐＡを加えることで効率よく、かつ高い特異性でｃＤＮＡ合成されることが示された。 As a result, in the reverse transcription reaction using native RNA as a template, the addition of CspA to the reaction solution greatly increases the amount of amplification of a long-chain cDNA of about 8 kb that can be confirmed by subsequent PCR. The amount of amplified DNA decreased (FIG. 12). From the above, it was shown that cDNA synthesis can be performed efficiently and with high specificity by adding CspA to the reaction solution without performing RNA denaturation operation.
実施例１３
１ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲに及ぼすＣｓｐＡの効果
５ｎｇ又は５０ｎｇのＨｕｍａｎ ｈｅａｒｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（クロンテック社）を鋳型として用い、ディストロフィン遺伝子の約２ｋｂの領域をターゲットとする１ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲについて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて行った。プライマーとしては、配列番号２１の塩基配列を有するプライマー及び配列番号２２の塩基配列を有するプライマーを用いた。１ ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲの反応液の組成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔに添付の説明書に記載の組成に加えて、５μｇのＣｓｐＡを２５μＬの反応液に加えた。また、対照として、５μｇ ＣｓｐＡの代わりに酵素保存バッファー１μＬを加えたＣｓｐＡを含まない反応液と、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＳＢ）溶液（ＵＳＢ社）（５μｇ／μＬ ＳＳＢ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０％ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を１μＬ加えた反応液についても調製した。それぞれの反応液について、４２℃で３０分の逆転写反応、９４℃で２分の熱処理を行った後、９４℃で３０秒〜５５℃で３０秒〜７２℃で２分を１サイクルとする３０サイクルのＰＣＲ反応をＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標）で行った。反応終了後、反応液のうち３μＬを１％アガロースゲル電気泳動に供して、反応産物を解析した（図１３）。
Example 13
Effect of CspA on 1-step RT-PCR PrimeScript (registered trademark) for 1-step RT-PCR targeting about 2 kb region of dystrophin gene using 5 ng or 50 ng of human heart total RNA (Clontech) as a template ) One Step RT-PCR Kit (Takara Bio Inc.) was used. As the primer, a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 21 and a primer having the base sequence of SEQ ID NO: 22 were used. The composition of the reaction solution for 1 step RT-PCR was 5 μg of CspA added to 25 μL of the reaction solution in addition to the composition described in the instructions attached to PrimeScript (registered trademark) One Step RT-PCR Kit. In addition, as a control, a reaction solution containing 1 μL of enzyme storage buffer instead of 5 μg CspA and not containing CspA, and a Single-Stranded DNA Binding Protein (SSB) solution (USB) (5 μg / μL SSB, 50 mM Tris-HCl ( A reaction solution containing 1 μL of pH 7.5), 200 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol) was also prepared. Each reaction solution was subjected to a reverse transcription reaction at 42 ° C. for 30 minutes and a heat treatment at 94 ° C. for 2 minutes, and then one cycle from 94 ° C. for 30 seconds to 55 ° C. for 30 seconds to 72 ° C. for 2 minutes. Thirty cycles of PCR reactions were performed with TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice®. After completion of the reaction, 3 μL of the reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and the reaction product was analyzed (FIG. 13).
その結果、ＣｓｐＡを添加することにより約２ｋｂの目的サイズ以外の非特異的な増幅産物が著しく減少した。一方、ＳＳＢを添加した場合、目的サイズの増幅産物は得られなかった。 As a result, the addition of CspA significantly reduced nonspecific amplification products other than the target size of about 2 kb. On the other hand, when SSB was added, an amplification product of the desired size was not obtained.
実施例１４
ＲＴ−ＰＣＲ反応における、反応の収率及び特異性を向上するＣｓｐＡの効果
ヒト心臓ＲＮＡを反応の鋳型として使用し、ＲＴ−ＰＣＲの標的はジストロフィン２とした。反応はＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ、リボヌクレアーゼ阻害剤、ＥｘＴａｑ ＨＳ又はＰｒｉｍｅＳｔａｒ Ｍａｘ、オリゴヌクレオチドの存在下で行った。ＣｓｐＡを用いて又は用いずに複製反応を行った。４２℃又は５０℃といった異なる温度でも試験した。ＣｓｐＡの存在下で非特異的産物が減少すると共に、ＣｓｐＡ量の増加（１０μｌの反応物当たり最大で２．５μｇのＣｓｐＡ）に伴って産物の収率が向上することが観察された。ＣｓｐＡは４２℃及び５０℃といったより高い温度でも活性であった。ＣｓｐＡを用いた結果は、ＲＮＡ中の二次構造を熱処理によって不安定化した反応と同等であることが見出された。
Example 14
Effect of CspA to improve reaction yield and specificity in RT-PCR reaction Human heart RNA was used as a reaction template, and RT-PCR was targeted at dystrophin-2. The reaction was carried out in the presence of PrimeScript RTase, ribonuclease inhibitor, ExTaq HS or PrimeStar Max, oligonucleotide. Replication reactions were performed with or without CspA. Different temperatures such as 42 ° C or 50 ° C were also tested. It was observed that non-specific products decreased in the presence of CspA and that product yields increased with increasing amounts of CspA (up to 2.5 μg CspA per 10 μl reaction). CspA was also active at higher temperatures such as 42 ° C and 50 ° C. The result using CspA was found to be equivalent to a reaction in which the secondary structure in RNA was destabilized by heat treatment.
実施例１５
ｐＥＴ−２８ａ−ＭａｚＦ−ｍｔ３によって発現された（Ｈｉｓ）６ＭａｚＦ−ｍｔ３タンパク質を、Ｎｉ−ニトリロ三酢酸樹脂を用いて精製した。精製ＭａｚＦ−ｍｔ３をＣｓｐＡの非存在下でＭＳ２ ＲＮＡと共にインキュベートしたところ、ＲＮＡの部分的な切断が観察された（レーン３）（図１４Ｂ）。反応混合物に添加したＣｓｐＡタンパク質の量の増加に伴い、ＭＳ２ ＲＮＡ基質の切断が増強した（レーン４〜レーン６）。最高濃度のＣｓｐＡでは、完全長ＭＳ２ ＲＮＡは検出されなかった（レーン６）。この濃度（０．８６ｍＭ）は、ＲＮＡ結合に対するＣｓｐＡのＫｄ値よりも（that）３２倍高く、６塩基毎にＲＮＡに結合するＣｓｐＡによってＭＳ２ ＲＮＡがほぼ完全に飽和したことを示している。これらの結果により、ＭａｚＦ−ｍｔ３が、ＣｓｐＡがＭＳ２の二次構造をほどく際に生成する一本鎖ＲＮＡを切断可能なｍＲＮＡインターフェラーゼであることも実証される。
Example 15
The (His) 6 MazF-mt3 protein expressed by pET-28a-MazF-mt3 was purified using Ni-nitrilotriacetic acid resin. When purified MazF-mt3 was incubated with MS2 RNA in the absence of CspA, partial cleavage of RNA was observed (lane 3) (FIG. 14B). As the amount of CspA protein added to the reaction mixture increased, the cleavage of the MS2 RNA substrate increased (lanes 4-6). At the highest concentration of CspA, full-length MS2 RNA was not detected (lane 6). This concentration (0.86 mM) is 32 times higher than the Kd value of CspA for RNA binding, indicating that MS2 RNA was almost completely saturated by CspA binding to RNA every 6 bases. These results also demonstrate that MazF-mt3 is an mRNA interferase capable of cleaving single-stranded RNA generated when CspA unwinds the secondary structure of MS2.
実施例１５
ＭａｚＦ−−ｍｔ３はＲＮＡをＣＵＣＣＵ及びＵＵＣＣＵで特異的に切断する
ＭＳ２ ＲＮＡにおけるＭａｚＦ−ｍｔ３の切断部位を決定するために、０．４３ｍＭ ＣｓｐＡの存在下で反応混合物を用いてプライマー伸長実験を行った。全ＭＳ２ ＲＮＡ配列をカバーするために、合計で２２種のプライマーをプライマー伸長実験のために合成した。図１５Ａ〜図１５Ｈに示すように、ＣｓｐＡの添加はほとんどの場合、ＲＮＡ切断を有意に増強した。特に、図１５Ｆに示す切断部位に関しては、ＲＮＡ切断はＣｓｐＡの存在下でしか検出可能でなかった。塩基１０２８（図１５Ｂ）でのＲＮＡ切断はＣｓｐＡの存在下で減少するようであるが、これはプライマー結合部位と上流の切断部位との間に位置する、塩基１０２８にある切断部位のすぐ下流の塩基１０７８にある部位の切断が増強したためである。このＣｓｐＡの存在下で高度に増強された塩基１０７８にある切断部位を、図１５Ｃに示す。これらの実験によって、表２に挙げるように８つの切断部位が同定された。これらの切断部位によるコンセンサス配列はＣＵＣＣＵであり、ここでＭａｚＦ−ｍｔ３は２番目のＵ残基と３番目のＣ残基との間で切断を行う。８つのＭａｚＦ−ｍｔ３切断部位を同定したが、公開されたＭＳ２配列（ＮＣＢＩのウェブサイト）によると、ＭＳ２ ＲＮＡには９つのＣＵＣＣＵ配列がある。したがって９番目のＣＵＣＣＵ配列を含有する領域のリシークエンシングを行い、該領域中にＣＵＣＣＵ配列がないことを見出した。これらの実験において使用したＭＳ２ ＲＮＡ（Roche）は、ＣＵＣＣＵの代わりにＣＣＵＣＵ（塩基２１５８〜塩基２１６２）を含有していた。したがって、ＭＳ２ ＲＮＡ中の全てのＣＵＣＣＵ配列はＭａｚＦ−ｍｔ３によって切断されていた。
Example 15
MazF--mt3 specifically cleaves RNA with CUCCU and UUCCU To determine the cleavage site of MazF-mt3 in MS2 RNA, primer extension experiments were performed using the reaction mixture in the presence of 0.43 mM CspA. . A total of 22 primers were synthesized for primer extension experiments to cover the entire MS2 RNA sequence. As shown in FIGS. 15A-15H, the addition of CspA in most cases significantly enhanced RNA cleavage. In particular, for the cleavage site shown in FIG. 15F, RNA cleavage was only detectable in the presence of CspA. RNA cleavage at base 1028 (FIG. 15B) appears to decrease in the presence of CspA, which is located immediately downstream of the cleavage site at base 1028, located between the primer binding site and the upstream cleavage site. This is because cleavage at the site at base 1078 was enhanced. The cleavage site at base 1078 highly enhanced in the presence of this CspA is shown in FIG. 15C. These experiments identified eight cleavage sites as listed in Table 2. The consensus sequence by these cleavage sites is CUCCU, where MazF-mt3 cleaves between the second U residue and the third C residue. Eight MazF-mt3 cleavage sites were identified, but according to the published MS2 sequence (NCBI website), there are nine CUCCU sequences in the MS2 RNA. Therefore, resequencing of the region containing the 9th CUCCU sequence was performed, and it was found that there was no CUCCU sequence in the region. The MS2 RNA (Roche) used in these experiments contained CCUCU (base 2158 to base 2162) instead of CUCCU. Therefore, all CUCCU sequences in MS2 RNA were cleaved by MazF-mt3.
図１６Ａ〜図１６Ｄに示されるように、図１５に見られるものとは異なる他の４つの切断部位が検出された。これらのプライマー伸長実験によるコンセンサス配列はＵＵＣＣＵであり、ここでＭａｚＦ−ｍｔ３は２番目のＵ残基と３番目のＣ残基との間で切断を行う。ＭＳ２ ＲＮＡには５つのＵＵＣＣＵ配列があり、その全てがＲＮＡシークエンシングによって確認された。ＭａｚＦ−ｍｔ３に関する全ての切断部位を図１Ａに矢印で示す。 As shown in FIGS. 16A to 16D, four other cleavage sites different from those seen in FIG. 15 were detected. The consensus sequence from these primer extension experiments is UUCCU, where MazF-mt3 cleaves between the second U residue and the third C residue. There are 5 UUCCU sequences in MS2 RNA, all of which were confirmed by RNA sequencing. All cleavage sites for MazF-mt3 are indicated by arrows in FIG. 1A.
実施例１６
ＭａｚＦ−ｍｔ７も配列特異的ｍＲＮＡインターフェラーゼである
本明細書中に記載されるＭＳ２ ＲＮＡ−ＣｓｐＡ系を使用して、ＭａｚＦ−ｍｔ７の特異的切断部位を同定した。精製Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きＭａｚＦ−ｍｔ７を用いて、プライマー伸長実験を行ったが、その結果を図１７Ａ〜図１７Ｒに示し、表３に要約する。大半の切断部位がＵＣＧＣＵ配列を含有しており（図１７Ａ〜図１７Ｋ）、ここでＭａｚＦ−ｍｔ７は１番目のＵと２番目のＣとの間で切断を行う。一部の切断部位はコンセンサスＵＣＧＣＵとの１塩基ミスマッチを有し（図１７Ｃ、図１７Ｄ、図１７Ｈ、及び図１７Ｌ〜図１７Ｐ）、幾つかの切断部位は２塩基ミスマッチを有する（図１７Ｇ、図１７Ｎ、図１７Ｑ、図１７Ｒ）。しかしながら、これらの切断部位は全て、中央のＧ残基を共通して有し、その大半が中央のＧ残基に続くＣ残基も有している。したがって、ＭａｚＦ−ｍｔ７は、５塩基Ｕ・ＣＧＣＵ配列を認識するｍＲＮＡインターフェラーゼであることが判明したが、ＭａｚＦ−ｍｔ３よりも厳密ではないようである。
Example 16
MazF-mt7 is also a sequence-specific mRNA interferase The MS2 RNA-CspA system described herein was used to identify specific cleavage sites for MazF-mt7. Primer extension experiments were performed using purified N-terminal His-tagged MazF-mt7 and the results are shown in FIGS. 17A-17R and summarized in Table 3. Most cleavage sites contain the UCGCU sequence (FIGS. 17A-17K), where MazF-mt7 cuts between the first U and the second C. Some cleavage sites have a single base mismatch with the consensus UCGCU (FIGS. 17C, 17D, 17H, and 17L-17P), and some cleavage sites have a two base mismatch (FIG. 17G, FIG. 17N, FIG. 17Q, FIG. 17R). However, all of these cleavage sites have a common central G residue, most of which also have a C residue following the central G residue. Thus, MazF-mt7 was found to be an mRNA interferase that recognizes a 5 base U · CGCU sequence, but appears to be less strict than MazF-mt3.
実施例１７
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのプライマー伸長解析
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｍＲＮＡ切断部位のプライマー伸長解析のために、完全長ＭＳ２ ｍＲＮＡを精製毒素タンパク質（ＭａｚＦ−ｍｔ３又はＭａｚＦ−ｍｔ７）を用いて又は用いずに、また、精製ＣｓｐＡタンパク質を用いて又は用いずに、３７℃で１５分部分的に消化した。消化反応混合物（１０μｌ）は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）中、０．８μｇのＭＳ２ ＲＮＡ基質、０．０６２５μｇのＭａｚＦ−ｍｔ３（Ｈｉｓ）６又はＭａｚＦ−ｍｔ７（Ｈｉｓ）６、３２１μｇのＣｓｐＡ、及び０．５μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤（Roche）から成るものであった。プライマー伸長を２０μｌの反応混合物中、４７℃で１時間行った。１２μｌのシークエンシングローディングバッファー（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、及び０．０５％キシレンシアノールＥＦ）を添加することによって反応を停止した。試料を９０℃で５分間インキュベートした後、６％ポリアクリルアミド及び３６％尿素ゲル上で電気泳動を行った。ＭＳ２ ｍＲＮＡのプライマー伸長解析に使用したプライマーを表１に挙げる。プライマーは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［・−３２Ｐ］ＡＴＰで５’標識した。
Example 17
In vitro primer extension analysis For in vitro primer extension analysis of mRNA cleavage sites, full length MS2 mRNA was purified with or without purified toxin protein (MazF-mt3 or MazF-mt7). Partial digestion at 37 ° C. for 15 minutes with or without CspA protein. Digestion reaction mixture (10 μl) was prepared by adding 0.8 μg MS2 RNA substrate, 0.0625 μg MazF-mt3 (His) 6 or MazF-mt7 (His) 6 , 321 μg CspA in 10 mM Tris-HCl (pH 7.8). And 0.5 μl ribonuclease inhibitor (Roche). Primer extension was performed in 20 μl of reaction mixture at 47 ° C. for 1 hour. The reaction was stopped by adding 12 μl of sequencing loading buffer (95% formamide, 20 mM EDTA, 0.05% bromophenol blue, and 0.05% xylene cyanol EF). Samples were incubated at 90 ° C. for 5 minutes before electrophoresis on 6% polyacrylamide and 36% urea gels. The primers used for the primer extension analysis of MS2 mRNA are listed in Table 1. Primers were 5 ′ labeled with [• − 32 P] ATP using T4 polynucleotide kinase.
Claims (11)
Ａ）大腸菌由来のＣｓｐＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種のプライマー、少なくとも１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、及びＤＮＡを含む混合物を調製する工程、並びに
Ｂ）工程Ａ）で調製した混合物をインキュベートする工程を含む、方法
ただし室温に置いた混合物を直接、工程Ｂ）に供することを特徴とする。 A method for synthesizing DNA comprising the steps of:
A) preparing a mixture comprising CspA derived from E. coli , DNA polymerase, at least one primer, at least one deoxyribonucleotide triphosphate, and DNA, and B) incubating the mixture prepared in step A) Including, methods
However, it is characterized in that the mixture placed at room temperature is directly subjected to step B) .
Ａ）大腸菌由来のＣｓｐＡ、
Ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸から成る群から選択される少なくとも１つのコンポーネント、並びに
Ｃ）反応緩衝液を含む、キット。 A DNA synthesis kit used in the method of synthesizing DNA according to claim 1 ,
A) CspA derived from E. coli ,
B) DNA polymerase, including primers, and at least one component selected from the group consisting of deoxyribonucleotide triphosphates, and C) reaction buffer, kit.
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