JP5544594B2 - Rice ZIM motif gene family that promotes growth and flowering of crops and enlarges seeds and uses thereof - Google Patents
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Description
本発明は、イネZIMモチーフ遺伝子ファミリーおよびその利用に関する。 The present invention relates to a rice ZIM motif gene family and use thereof.
植物のゲノム研究は、個々の遺伝子機能解析により、従来育種技術では困難な短期間の優良形質品種の作出を可能にし得る。そのため植物に有用形質を付与することができる遺伝子の探索が世界レベルで実施されている。 Plant genome research can enable short-term production of excellent trait varieties, which is difficult with conventional breeding techniques, by analyzing individual gene functions. Therefore, the search for genes that can impart useful traits to plants has been carried out at the world level.
主要穀物であるイネについては、2004年にイネゲノムの全塩基配列の決定が完了した。さらに、イネの完全長cDNAの単離が進められ、単離された完全長cDNAクローンの情報はデータベース化され公開されている。しかし、全ての遺伝子の機能解析が終了したわけではなく、新規有用形質遺伝子の発見が期待されている。 In 2004, the complete genome sequence of the rice genome was completed for rice, the main crop. Furthermore, the isolation of rice full-length cDNA has been promoted, and information on the isolated full-length cDNA clone has been made into a database and published. However, functional analysis of all genes has not been completed, and the discovery of new useful trait genes is expected.
ところで、シロイヌナズナ由来のZIMタンパク質は、GATA転写因子ファミリーに属するタンパク質として知られている(非特許文献1-3)。ZIM遺伝子をCaMV 35S プロモーターを用いてシロイヌナズナに過剰発現させたところ、胚軸および葉柄の伸長が認められたことが報告されている(非特許文献3)。ZIM遺伝子は、構造的特徴として、ZIMモチーフ、CCTモチーフ、およびGATA型のZinc Fingerドメインを有する(非特許文献1-3)。Zinc Fingerドメインは転写因子に多く見られる構造であるが、一方、ZIMモチーフとタンパク質機能との関係は全く知られていない。また、バレイショおよびタバコ(非特許文献4)、ポプラ(非特許文献5)においても、ZIMモチーフを持つ遺伝子が見つかったとの報告があるが、該遺伝子の機能は未知である。 By the way, the ZIM protein derived from Arabidopsis thaliana is known as a protein belonging to the GATA transcription factor family (Non-patent Documents 1-3). It has been reported that when the ZIM gene was overexpressed in Arabidopsis thaliana using the CaMV 35S promoter, hypocotyl and petiole elongation was observed (Non-patent Document 3). The ZIM gene has, as structural features, a ZIM motif, a CCT motif, and a GATA type Zinc Finger domain (Non-patent Documents 1-3). The Zinc Finger domain is a structure often found in transcription factors, but the relationship between the ZIM motif and protein function is not known at all. In addition, in potato, tobacco (Non-patent Document 4), and poplar (Non-patent Document 5), it has been reported that a gene having a ZIM motif has been found, but the function of the gene is unknown.
本発明は上記状況に鑑みて成されたものであり、本発明が解決しようとする課題は、植物に有用形質を付与しうる遺伝子およびその利用法の提供であり、より具体的には、作物の生育や花成の促進、種子肥大をもたらす遺伝子および生育が促進された植物を該遺伝子を用いて製造する方法を提供することである。 The present invention has been made in view of the above situation, and the problem to be solved by the present invention is to provide a gene capable of imparting a useful trait to a plant and a method for using the gene, and more specifically, a crop. It is intended to provide a method for producing a gene that promotes the growth and flowering of plants, a gene that causes seed enlargement, and a plant in which the growth is promoted.
上記課題を解決すべく、本発明者等は鋭意研究を行った。本発明者等は、機能未知の遺伝子の中から有用形質をもたらす遺伝子を見出すため、Full-length cDNA Over-eXpressor gene hunting system(FOX hunting system)を利用した(Ichikawa, T., Nakazawa, M., Kawashima, M., Iizumi, H., Kuroda, H., Kondou, Y., Tsuhara, Y., Suzuki, K., Ishikawa, A., Seki, M., Fujita, M., Motohashi, R., Nagata, N., Takagi, T., Shinozaki, K. and Matsui, M. (2006) The FOX hunting system: an alternative gain-of-function gene hunting technique. Plant J. 48: 974-85.、WO2003/018808)。FOX hunting systemは、完全長cDNAを利用した高速かつゲノムワイドな遺伝子機能探索技術である。本発明者等はFOX hunting systemを利用してイネ完全長cDNAを形質転換したイネの中から、稈や根の伸長促進、花芽形成の促進、種子胚乳の肥大といった、有意な生育促進が観察される系統(AB323およびAG163)を見出した。このAB323およびAG163系統に導入されたcDNAを解析したところ、AB323およびAG163の双方に同一の完全長cDNA(アクセッション番号:AK067971)が導入されていたことが明らかになった。AK067971 cDNAは187アミノ酸からなるZIMモチーフタンパク質をコードする。ZIMモチーフは、シロイヌナズナZIM (Zinc-finger protein expressed in Inflorescence Meristem) タンパク質に最初に見出された機能未知のモチーフである。309アミノ酸からなるシロイヌナズナZIMタンパク質はZIMモチーフの他にGATA型Zinc FingerドメインおよびCCTモチーフを含むが、一方、AK067971遺伝子産物はGATA型Zinc Fingerドメインが存在せず、典型的なCCTモチーフ配列を含まない。そこで本発明者らはAK067971と同様の特徴を有する遺伝子を探索し、さらに該遺伝子でイネの形質転換を行い、その表現型を評価した。すると、AK067971と同様の特徴を有する遺伝子群は、AK067971と同様に、植物の生育促進効果を有することが明らかになった。したがって、AK067971およびその類縁遺伝子は植物の生育促進に利用することができる。すなわち本発明は、ZIMモチーフを含み、GATA型Zinc Fingerドメイン及び典型的CCTモチーフ配列を含まない遺伝子およびその利用に関し、具体的には、下記の発明を提供するものである。 In order to solve the above problems, the present inventors have conducted extensive research. The present inventors have, to find a gene that provides a useful trait from the function unknown genes, using F ull-length cDNA O ver- e X pressor gene hunting system (FOX hunting system) (Ichikawa, T., Nakazawa, M., Kawashima, M., Iizumi, H., Kuroda, H., Kondou, Y., Tsuhara, Y., Suzuki, K., Ishikawa, A., Seki, M., Fujita, M., Motohashi, R., Nagata, N., Takagi, T., Shinozaki, K. and Matsui, M. (2006) The FOX hunting system: an alternative gain-of-function gene hunting technique.Plant J. 48: 974- 85., WO2003 / 018808). The FOX hunting system is a high-speed, genome-wide gene function search technique using full-length cDNA. From the rice transformed with rice full-length cDNA using the FOX hunting system, the present inventors observed significant growth promotion such as promotion of elongation of cocoons and roots, promotion of flower bud formation, and enlargement of seed endosperm. (AB323 and AG163) were found. Analysis of cDNA introduced into the AB323 and AG163 lines revealed that the same full-length cDNA (accession number: AK067971) was introduced into both AB323 and AG163. AK067971 cDNA encodes a ZIM motif protein consisting of 187 amino acids. ZIM motifs are Arabidopsis ZIM (Z inc-finger protein expressed in I nflorescence M eristem) first discovered the unknown function motif protein. The 309 amino acid Arabidopsis ZIM protein contains a GATA-type zinc finger domain and a CCT motif in addition to the ZIM motif, whereas the AK067971 gene product does not contain a GATA-type zinc finger domain and does not contain a typical CCT motif sequence. . Therefore, the present inventors searched for a gene having the same characteristics as AK067971, further transformed rice with the gene, and evaluated its phenotype. Then, it became clear that the gene group which has the characteristic similar to AK067971 has the growth promotion effect of a plant like AK067971. Therefore, AK067971 and its related genes can be used to promote plant growth. That is, the present invention relates to a gene containing a ZIM motif and not including a GATA-type Zinc Finger domain and a typical CCT motif sequence, and uses thereof, and specifically provides the following inventions.
(1)植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、植物中で過剰発現させることを特徴とする、植物の生育を促進する方法、
(2)下記工程(a)および(b)を含む、上記(1)記載の方法
(a)植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
(b)該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を再生する工程、
(3)下記工程(a)から(c)を含む、生育が促進された植物の製造方法
(a)植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
(b)該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を再生する工程
(c)該植物体由来の繁殖材料(種子以外)から植物体を再生する工程、
(4)下記工程(a)から(c)を含む、生育が促進された植物の製造方法
(a)植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
(b)該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を作出する工程
(c)該植物体から得られた該ポリヌクレオチドを有する種子から、ZIMモチーフを有する遺伝子を過剰発現する植物を作出する工程、
(5)植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、下記(a)から(d)のいずれかである、上記(1)から(4)のいずれかに記載の方法
(a)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
(c)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(d)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に1または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(6)植物の生育の促進が、草丈、根、または稈の伸長、種子胚乳肥大、花成・出穂の促進のいずれか1以上の促進である、上記(1)から(5)に記載の方法、
(7)植物がイネ科、アブラナ科、ナス科、ウリ科、ヒルガオ科、ヤナギ科である、上記(1)から(6)のいずれかに記載の方法、
(8)植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードする、下記(a)から(d)の単離されたポリヌクレオチド
(a)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
(c)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(d)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に1または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(9)上記(8)記載のポリヌクレオチドを過剰発現する形質転換植物細胞、
(10)上記(9)に記載の形質転換細胞を含む、生育が促進された形質転換植物体、
(11)上記(10)に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、生育が促進された形質転換植物体、
(12)上記(10)または(11)記載の形質転換植物体の繁殖材料、
(13)下記(a)から(d)のいずれかのポリヌクレオチドを含有する、植物の生育促進剤
(a)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
(c)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(d)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に1または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(14)下記(a)から(d)のいずれかのポリヌクレオチドを含む、植物の生育促進用キット
(a)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
(c)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド
(d)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に1または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(1) Overexpressing a polynucleotide encoding a protein having an activity of promoting plant growth and containing a ZIM motif in the amino acid sequence and a typical CCT motif and no GATA-type zinc finger domain in the plant. A method for promoting plant growth, characterized by
(2) The method according to (1) above, comprising the following steps (a) and (b): (a) a typical CCT motif and GATA type having an activity of promoting plant growth and including a ZIM motif in the amino acid sequence A step of introducing a polynucleotide encoding a protein not containing a Zinc Finger domain or a vector carrying the polynucleotide into a plant seed, fertilized egg, plant cell or callus (b) the seed, fertilized egg, plant cell, Or a process of regenerating a plant from callus,
(3) A method for producing a plant whose growth is promoted, comprising the following steps (a) to (c): (a) a typical CCT motif having an activity of promoting the growth of a plant and containing a ZIM motif in the amino acid sequence; A step of introducing a polynucleotide encoding a protein not containing a GATA-type zinc finger domain, or a vector carrying the polynucleotide into a plant seed, fertilized egg, plant cell or callus (b) the seed, fertilized egg, plant A step of regenerating the plant from cells or callus (c) a step of regenerating the plant from propagation material (other than seeds) derived from the plant,
(4) A method for producing a plant whose growth is promoted, comprising the following steps (a) to (c): (a) a typical CCT motif having an activity of promoting the growth of a plant and containing a ZIM motif in the amino acid sequence; A step of introducing a polynucleotide encoding a protein not containing a GATA-type zinc finger domain, or a vector carrying the polynucleotide into a plant seed, fertilized egg, plant cell or callus (b) the seed, fertilized egg, plant A step of producing a plant from cells or callus (c) a step of producing a plant overexpressing a gene having a ZIM motif from a seed having the polynucleotide obtained from the plant;
(5) A polynucleotide encoding a protein having an activity of promoting plant growth and containing a ZIM motif in the amino acid sequence and not a typical CCT motif and a GATA type Zinc Finger domain is described below (a) to (d). The method according to any one of (1) to (4) above, wherein (a) any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 A polynucleotide comprising the coding region of the base sequence described in (b) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 (C) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence coding for SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 that is stringent to the complementary strand of the nucleotide sequence described in any one of Polynucleotide that hybridizes under conditions (d) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 , 12, 14, 16, 18, or 20 comprising a nucleotide sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, inserted, deleted, or added to the amino acid sequence of any one of ,
(6) The growth of the plant is any one or more of plant height, root or cocoon elongation, seed endosperm hypertrophy, flowering / heading promotion, according to (1) to (5) above Method,
(7) The method according to any one of (1) to (6) above, wherein the plant is Gramineae, Brassicaceae, Eggplant, Cucurbitaceae, Convolvulaceae, Willowaceae,
(8) Isolation of the following (a) to (d), which encodes a protein having an activity of promoting plant growth and containing a ZIM motif in the amino acid sequence and not a typical CCT motif and a GATA type Zinc Finger domain Polynucleotide (a) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 comprising the coding region of the nucleotide sequence described in (b) sequence No .: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or a polynucleotide containing a base sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence of (20) (c) SEQ ID NO: 1, A polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to a complementary strand of the base sequence according to any one of 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 (d) SEQ ID NO: 2, 4, Amino acid according to any of 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 Column one or more amino acid substitutions, insertions, deletions, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein consisting added in the amino acid sequence,
(9) A transformed plant cell that overexpresses the polynucleotide according to (8) above,
(10) A transformed plant body with enhanced growth, comprising the transformed cell according to (9) above,
(11) A transformed plant body whose growth is promoted, which is a descendant or clone of the transformed plant body according to (10),
(12) A propagation material of the transformed plant according to (10) or (11) above,
(13) Plant growth promoter containing the polynucleotide of any one of (a) to (d) below: (a) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, Or a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence described in any one of (19) (b) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 A polynucleotide comprising a base sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence (c) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 complementary to the base sequence A polynucleotide that hybridizes to the strand under stringent conditions (d) one or more of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 A base sequence encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which the amino acid is substituted, inserted, deleted, or added. Polynucleotide comprising,
(14) A plant growth promotion kit comprising any of the polynucleotides (a) to (d) below: (a) SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, Or a polynucleotide comprising the coding region of the base sequence described in any one of (19) (b) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 A polynucleotide comprising a base sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence (c) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 complementary to the base sequence A polynucleotide that hybridizes to the strand under stringent conditions (d) one or more of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 A base that encodes a protein consisting of an amino acid sequence in which amino acids are substituted, inserted, deleted, or added Polynucleotide comprising a column,
本発明によって、植物の生育促進効果を有する新規遺伝子および該遺伝子によって生育が促進された形質転換植物の製造方法が提供された。本発明の遺伝子を農業分野において利用した場合は、例えば、イネであれば、胚乳の肥大による多収性が見込まれる。また、根や稈の伸長促進、すなわちバイオマスの増大が見込まれる。また、花成誘導の促進効果が確認されており、わせ作物の作出も可能になると考えられる。さらに本発明の遺伝子は、イネのみならず他のイネ科植物(コムギ、オオムギ、トウモロコシ、サトウキビ、ソルガム等)に利用可能と考えられ、食糧問題の解決につながるものと期待される。農業分野以外の分野であれば、本発明の遺伝子を利用して植物工場による有用物質生産量の増大を図ることができる。重金属や有害ガスによる環境汚染の吸収・除去(環境修復)効果を向上させることができると考えられる。このように本発明は、農業分野への高い貢献が期待できるのみならず、その他の産業にも広く利用可能である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a novel gene having a plant growth promoting effect and a method for producing a transformed plant whose growth is promoted by the gene are provided. When the gene of the present invention is used in the agricultural field, for example, in the case of rice, high yield is expected due to the enlargement of endosperm. In addition, the growth of roots and cocoons, that is, an increase in biomass is expected. In addition, the effect of promoting flowering induction has been confirmed, and it is considered possible to produce fertilized crops. Furthermore, the gene of the present invention is considered to be usable not only for rice but also for other grasses (wheat, barley, corn, sugarcane, sorghum, etc.), and is expected to lead to the solution of food problems. If it is a field other than the field of agriculture, the gene production of the present invention can be used to increase the amount of useful substances produced by the plant factory. It is thought that the effect of absorption / removal (environmental restoration) of environmental pollution by heavy metals and harmful gases can be improved. Thus, the present invention is not only expected to make a high contribution to the agricultural field, but can also be widely used in other industries.
[発明の詳細な説明]
本発明は、植物の生育を促進する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物中で過剰発現させることにより、植物の生育を促進する方法を提供する。本発明者らは、イネの機能未知の遺伝子の全長cDNAを解析し、植物の生育を促進する活性を有するタンパク質の遺伝子を見出した。
Detailed Description of the Invention
The present invention provides a method of promoting plant growth by overexpressing a polynucleotide encoding a protein having an activity of promoting plant growth in the plant. The present inventors have analyzed the full-length cDNA of a gene whose function is unknown in rice and found a gene for a protein having an activity of promoting plant growth.
本発明の方法で使用するポリヌクレオチド(以下、「本発明のポリヌクレオチド」と称す)は、「植物の生育を促進する活性を有するタンパク質」をコードし、該タンパク質はアミノ酸配列中にZIMモチーフを含むが、GATA型Zinc Fingerドメイン及び典型的CCTモチーフ配列を含まない。 The polynucleotide used in the method of the present invention (hereinafter referred to as “the polynucleotide of the present invention”) encodes “a protein having an activity of promoting plant growth”, and the protein has a ZIM motif in the amino acid sequence. Contains, but does not contain a GATA-type Zinc Finger domain and a typical CCT motif sequence.
ZIMモチーフは、シロイヌナズナ由来のZIM遺伝子産物(あるいはZIMタンパク質)に見出された、機能未知のモチーフである。ZIMモチーフは、GATA型Zinc Fingerドメインや他のモチーフを含む転写因子に見られることが多い。シロイヌナズナのZIM遺伝子産物は、ZIMモチーフよりもC末端側にCCTモチーフおよびGATA型Zinc Fingerドメインを有する。ZIMモチーフにおいて最も高度に保存されたアミノ酸配列はTIFFXG(配列番号:31)またはTIFYXG(配列番号:32)で表される。ZIMモチーフに関する情報は、ドメインのデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)からアクセッション番号:pfam06200によって得ることができる。 The ZIM motif is a motif of unknown function found in the ZIM gene product (or ZIM protein) derived from Arabidopsis thaliana. The ZIM motif is often found in transcription factors containing GATA-type Zinc Finger domains and other motifs. The Arabidopsis ZIM gene product has a CCT motif and a GATA type Zinc Finger domain on the C-terminal side of the ZIM motif. The most highly conserved amino acid sequence in the ZIM motif is represented by TIFFXG (SEQ ID NO: 31) or TIFYXG (SEQ ID NO: 32). Information on the ZIM motif can be obtained from the domain database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml) by accession number: pfam06200.
CCTモチーフは植物タンパク質中によくみられる構造で、塩基性アミノ酸に富む。約45アミノ酸からなり、CCTモチーフの後半部分に仮想核局在シグナルが存在するとみられている。シロイヌナズナのCONSTANS(CO)タンパク質のCCTモチーフは、核局在に関与することが知られているが、さらなる機能を有することが見出されつつある。COタンパク質のCCTモチーフは、真核生物の種々のプロモーターに存在するCCAAT boxに結合する酵母HEME ACTIVATOR PROTEIN2(HAP2: HAP3およびHAP5と結合して機能)と相同性があり、シロイヌナズナの由来HAP3およびHAP5と相互作用する。CCTモチーフの後半には、DNAすなわちCCAAT boxと結合するHAP2のNF-YA2領域と相同性があることも知られている(Wenkel et al. (2006) Plant Cell 18: 2971-2984.)。CCTモチーフの情報は、上述のドメインのデータベースにおいてアクセッション番号:pfam06203で得ることができる。 The CCT motif is a common structure in plant proteins and is rich in basic amino acids. It consists of about 45 amino acids, and a hypothetical nuclear localization signal is thought to exist in the latter half of the CCT motif. The CCT motif of the Arabidopsis CONSTANS (CO) protein is known to be involved in nuclear localization but is being found to have additional functions. The CCT motif of the CO protein is homologous to the yeast HEME ACTIVATOR PROTEIN2 (HAP2: functions in combination with HAP3 and HAP5) that binds to the CCAAT box present in various eukaryotic promoters. HAP3 and HAP5 from Arabidopsis thaliana Interact with. It is also known that the second half of the CCT motif is homologous to the NF-YA2 region of HAP2 that binds to DNA, that is, the CCAAT box (Wenkel et al. (2006) Plant Cell 18: 2971-2984.). Information on the CCT motif can be obtained by the accession number: pfam06203 in the above-mentioned domain database.
本発明における「典型的CCTモチーフ」は、下記のアミノ酸配列で表すことができる。
RearvlRYreKrk-RkfeK-iRYasRKa-Ae-RpRvkGRFvkr (配列番号:33)
上記配列において、大文字で示したアミノ酸はCCT motifを有するタンパク質間で高度に保存されていることを示し、小文字は比較的保存性が高い領域を示す。また「-(ハイフン)」で示したか所は保存性が低いことを示す。すなわち、配列番号:33に記載されたアミノ酸配列において、第1、7-8、11、15、19、22-23、26-27、30、33、35、38-40位のアミノ酸は高度に保存され、第2-6、9-10、12-13、16-18、21、24-25、28、31、34、36-37、41-43位のアミノ酸は比較的保存性が高く、第14、20、29、32位のアミノ酸は保存性が低い。
The “typical CCT motif” in the present invention can be represented by the following amino acid sequence.
RearvlRYreKrk-RkfeK-iRYasRKa-Ae-RpRvkGRFvkr (SEQ ID NO: 33)
In the above sequence, the amino acids shown in capital letters indicate that the protein having the CCT motif is highly conserved, and the lower case letters indicate a relatively highly conserved region. A place indicated by “-(hyphen)” indicates that the storage stability is low. That is, in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 33, amino acids at positions 1, 7-8, 11, 15, 19, 22-23, 26-27, 30, 33, 35, 38-40 are highly Amino acids at positions 2-6, 9-10, 12-13, 16-18, 21, 24-25, 28, 31, 34, 36-37, 41-43 are relatively highly conserved, The amino acids at positions 14, 20, 29 and 32 are poorly conserved.
またZinc Fingerドメインは、亜鉛原子の周りにポリペプチド鎖が折りたたまれることによって形成される構造ドメインで、転写因子等のDNA結合タンパク質中に頻繁にみられる。Zinc Fingerドメインは数種の型が知られており、TFIIIA型、GAL4型、GATA型のほか、植物に特有な型としてDof型およびWRKY型の存在が報告されている。GATA型はさらにサブタイプに分類され、C-X2-C-X17-C-X2-C(配列番号:34)モチーフを含むタイプ、C-X2-C-X18-C-X2-C(配列番号:35)モチーフを含むタイプ、C-X2-C-X19-C-X2-C(配列番号:36)モチーフを含むタイプ、C-X2-C-X20-C-X2-C(配列番号:37)モチーフを含むタイプが知られている。本発明におけるGATA型Zinc Fingerドメインは、上記のいずれであってもよいが、好ましくはC-X2-C-X20-C-X2-Cで表されるモチーフを含むタイプである。 The Zinc Finger domain is a structural domain formed by folding a polypeptide chain around a zinc atom, and is frequently found in DNA-binding proteins such as transcription factors. Several types of Zinc Finger domains are known. In addition to TFIIIA, GAL4, and GATA types, the existence of Dof and WRKY types as plant-specific types has been reported. The GATA type is further classified into subtypes, including the CX 2 -CX 17 -CX 2 -C (SEQ ID NO: 34) motif and the CX 2 -CX 18 -CX 2 -C (SEQ ID NO: 35) motif A type including a CX 2 -CX 19 -CX 2 -C (SEQ ID NO: 36) motif and a type including a CX 2 -CX 20 -CX 2 -C (SEQ ID NO: 37) motif are known. The GATA type Zinc Finger domain in the present invention may be any of the above, but is preferably a type containing a motif represented by CX 2 -CX 20 -CX 2 -C.
ZIMモチーフを含むタンパク質として、シロイヌナズナ由来のZIMタンパク質が知られているが、ZIMタンパク質は、ZIMモチーフのほかにCCTモチーフおよびGATA型Zinc Fingerドメインを有し(図6A)、本発明のポリヌクレオチドがコードするタンパク質とは明確に相違する。 As a protein containing a ZIM motif, a ZIM protein derived from Arabidopsis thaliana is known. The ZIM protein has a CCT motif and a GATA type Zinc Finger domain in addition to the ZIM motif (FIG. 6A). It is clearly different from the encoded protein.
上記「アミノ酸配列中にZIMモチーフを含むが、GATA型Zinc Fingerドメイン及び典型的CCTモチーフ配列を含まない」配列の例は、データベースに登録されている(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi?cmd=cdd&uid=46091)。2007年4月5日現在において、79配列が登録されている。 Examples of the above-described sequences “including the ZIM motif in the amino acid sequence but not including the GATA-type Zinc Finger domain and the typical CCT motif sequence” are registered in a database (http: //www.ncbi.nlm.nih .gov / Structure / lexington / lexington.cgi? cmd = cdd & uid = 46091). As of April 5, 2007, 79 sequences have been registered.
本発明のポリヌクレオチドは上記特徴を有する限り、由来は特に問わないが、好ましくは植物由来である。実施例に記載したように、本発明のポリヌクレオチドはイネ(イネ科)のほか、シロイヌナズナ(アブラナ科)、バレイショ(ナス科)、ベンサミアナタバコ(ナス科)、キュウリ(ウリ科)、アサガオ(ヒルガオ科)、トマト(ナス科)にも存在し、植物界に広く分布すると考えられる。したがって本発明のポリヌクレオチドの由来となる植物は特に種類は問わないが、好ましくは単子葉植物由来であり、より好ましくはイネ科由来である。 As long as the polynucleotide of this invention has the said characteristic, origin is not ask | required in particular, Preferably it is plant origin. As described in the Examples, the polynucleotide of the present invention is not only rice (Gramineae), but also Arabidopsis (Brassicaceae), potato (Solanum), Bensamiana tobacco (Solanum), cucumber (Cucurbitaceae), morning glory (Convolvulaceae) and tomatoes (Solanumaceae) are also present and are thought to be widely distributed in the plant kingdom. Accordingly, the plant from which the polynucleotide of the present invention is derived is not particularly limited, but is preferably derived from a monocotyledonous plant, more preferably from a grass family.
本発明のポリヌクレオチドの具体例として、配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19に記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。実施例に示すとおり、上記ポリヌクレオチドの過剰発現によって植物の生育が促進されることが、本発明者らによって確認された。
配列番号:1は、アクセッション番号:AK067971としてデータベース上で公開されている。配列番号:1がコードする推定アミノ酸配列を配列番号:2に示す。また配列番号:2記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号:21に示す。
配列番号:3は、アクセッション番号:AK061602としてデータベース上で公開されている。配列番号:3がコードする推定アミノ酸配列を配列番号:4に示す。また配列番号:4記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号:22に示す。
配列番号:5は、アクセッション番号:AK107854としてデータベース上で公開されている。配列番号:5がコードする推定アミノ酸配列を配列番号:6に示す。また配列番号:6記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号:23に示す。
配列番号:7は、アクセッション番号:AK070649としてデータベース上で公開されている。配列番号:7がコードする推定アミノ酸配列を配列番号:8に示す。また配列番号:4記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号:24に示す。
配列番号:9は、アクセッション番号:AK073589としてデータベース上で公開されている。配列番号:9がコードする推定アミノ酸配列を配列番号:10に示す。また配列番号:10記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号:25に示す。
配列番号:11は、アクセッション番号:AK108738としてデータベース上で公開されている。配列番号:11がコードする推定アミノ酸配列を配列番号:12に示す。また配列番号:12記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号:26に示す。
配列番号:13は、アクセッション番号:AK068566としてデータベース上で公開されている。配列番号:13がコードする推定アミノ酸配列を配列番号:14に示す。また配列番号:14記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号:27に示す。
配列番号:15は、アクセッション番号:AK099557としてデータベース上で公開されている。配列番号:15がコードする推定アミノ酸配列を配列番号:16に示す。また配列番号:16記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号:28に示す。
配列番号:17は、アクセッション番号:AK107750としてデータベース上で公開されている。配列番号:17がコードする推定アミノ酸配列を配列番号:18に示す。また配列番号:18記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号:29に示す。
配列番号:19は、アクセッション番号:AK069326としてデータベース上で公開されている。配列番号:19がコードする推定アミノ酸配列を配列番号:20に示す。また配列番号:20記載のアミノ酸配列におけるZIMモチーフの配列を配列番号:30に示す。
Specific examples of the polynucleotide of the present invention include a polynucleotide containing the coding region of the base sequence described in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19. it can. As shown in the Examples, the present inventors confirmed that plant growth is promoted by overexpression of the polynucleotide.
SEQ ID NO: 1 is published on the database as Accession Number: AK067971. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2. The sequence of the ZIM motif in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 21.
SEQ ID NO: 3 is disclosed on the database as Accession Number: AK061602. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 3 is shown in SEQ ID NO: 4. The sequence of the ZIM motif in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is shown in SEQ ID NO: 22.
SEQ ID NO: 5 is disclosed on the database as Accession Number: AK107854. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 5 is shown in SEQ ID NO: 6. The sequence of the ZIM motif in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 6 is shown in SEQ ID NO: 23.
SEQ ID NO: 7 is published on the database as Accession Number: AK070649. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 7 is shown in SEQ ID NO: 8. The sequence of the ZIM motif in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is shown in SEQ ID NO: 24.
SEQ ID NO: 9 is published on the database as Accession Number: AK073589. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 9 is shown in SEQ ID NO: 10. The sequence of the ZIM motif in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 is shown in SEQ ID NO: 25.
SEQ ID NO: 11 is published on the database as Accession Number: AK108738. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 11 is shown in SEQ ID NO: 12. The sequence of the ZIM motif in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 12 is shown in SEQ ID NO: 26.
SEQ ID NO: 13 is published on the database as Accession Number: AK068566. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 13 is shown in SEQ ID NO: 14. The sequence of the ZIM motif in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 14 is shown in SEQ ID NO: 27.
SEQ ID NO: 15 is disclosed on the database as Accession Number: AK099557. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 15 is shown in SEQ ID NO: 16. The sequence of the ZIM motif in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 16 is shown in SEQ ID NO: 28.
SEQ ID NO: 17 is disclosed on the database as Accession Number: AK107750. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 17 is shown in SEQ ID NO: 18. The sequence of the ZIM motif in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 18 is shown in SEQ ID NO: 29.
SEQ ID NO: 19 is disclosed on the database as Accession Number: AK069326. The deduced amino acid sequence encoded by SEQ ID NO: 19 is shown in SEQ ID NO: 20. The sequence of the ZIM motif in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20 is shown in SEQ ID NO: 30.
上記配列番号に記載のポリヌクレオチドは、公知技術によって調製することができる。例えば、イネ組織抽出物からtotal mRNAを調製し、上記配列番号に記載の塩基配列をもとにプライマーを設計し、RACE法等を行って上記配列番号の完全長cDNAを得ることができる。またはイネ組織抽出物からcDNAライブラリーを作製し、上記配列番号に記載の塩基配列をもとにプローブを設計し、ハイブリダイゼーション法によって得ることもできる。さらには、上記配列番号に記載の塩基配列をもとに、人工的に合成してもよい。 The polynucleotide described in the above SEQ ID NO can be prepared by a known technique. For example, total mRNA is prepared from a rice tissue extract, a primer is designed based on the base sequence described in the above SEQ ID NO, and a RACE method or the like is performed to obtain a full-length cDNA having the above SEQ ID NO. Alternatively, a cDNA library can be prepared from a rice tissue extract, a probe can be designed based on the base sequence described in the above SEQ ID NO, and obtained by a hybridization method. Further, it may be artificially synthesized based on the base sequence described in the above SEQ ID NO.
また本願発明の方法は、上記配列番号に記載の塩基配列と類似する配列であって、上記配列番号に記載の塩基配列と同等の機能、すなわち、植物の生育を促進する活性を有するポリヌクレオチドを使用することもできる。したがって本発明のポリヌクレオチドは、上記配列番号に記載の塩基配列と類似する配列であって、植物の生育を促進する活性を有するポリヌクレオチドを包含する。このようなポリヌクレオチドは、植物の生育を促進する活性を有する限り、天然から調製されたものでも人工的に調製されたものでもよい。例えば、上記配列番号のオーソログ、ホモログ、人工的に変異をいれたものであってもよい。このようなポリヌクレオチドの例として、「配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」および「配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に1または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド」を挙げることができる。 Further, the method of the present invention provides a polynucleotide having a sequence similar to the base sequence described in the above SEQ ID No. and having a function equivalent to the base sequence described in the above SEQ ID No., that is, an activity for promoting plant growth. It can also be used. Therefore, the polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide having a sequence similar to the base sequence described in the above SEQ ID NO and having an activity of promoting plant growth. Such a polynucleotide may be prepared from nature or artificially prepared as long as it has an activity of promoting plant growth. For example, orthologues, homologues of the above sequence numbers, or artificially mutated ones may be used. Examples of such polynucleotides include “stringent conditions to the complementary strand of the base sequence described in any of SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19. Hybridizing polynucleotide ”and“ SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 with one or more amino acid substitutions or insertions, And a polynucleotide comprising a base sequence encoding a protein comprising a deleted or added amino acid sequence.
上記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25%ホルムアミド、より厳しい条件では50%ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するポリヌクレオチドの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素(例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 Those skilled in the art can appropriately select the stringent hybridization conditions. For example, 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 × SSC, 50 mM HEPES (pH 7.0), 10 × Denhardt's solution, hybridization solution containing 20 μg / ml denatured salmon sperm DNA at 42 ° C. After overnight prehybridization, add a labeled probe and incubate at 42 ° C. overnight. The cleaning solution and temperature conditions for the subsequent cleaning are about 1xSSC, 0.1% SDS, 37 ° C, more severe conditions are about 0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C, and more severe conditions are about 0.2xSSC. , 0.1% SDS, about 65 ° C. ”. Thus, isolation of a polynucleotide having high homology with the probe sequence can be expected as the conditions for washing for hybridization become more severe. However, combinations of the above SSC, SDS, and temperature conditions are exemplary, and those skilled in the art will understand the above or other factors that determine the stringency of hybridization (eg, probe concentration, probe length, hybridization reaction). It is possible to achieve the same stringency as above by appropriately combining the time and the like.
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、通常、上記配列番号に示されたアミノ酸配列と高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40%以上、好ましくは60%以上、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、さらに好ましくは少なくとも95%以上、さらに好ましくは少なくとも97%以上(例えば、98から99%)の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。 A polypeptide encoded by a polynucleotide isolated using such a hybridization technique usually has high homology with the amino acid sequence shown in the above SEQ ID NO. High homology means at least 40% or more, preferably 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably at least 95% or more, more preferably at least 97% or more (for example, 98% or more). To 99%) sequence homology. The identity of the amino acid sequence is determined by, for example, the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). Can be determined by. Based on this algorithm, a program called BLASTX has been developed (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). When the amino acid sequence is analyzed by BLASTX, the parameters are, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific techniques for these analysis methods are known (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.).
また上記変異を導入されたポリヌクレオチドは、上記配列番号記載の塩基配列に、PCRによる変異導入法やカセット変異法などの当業者に周知の遺伝子改変方法を施し、部位特異的にまたはランダムに変異を導入することによって調製することができる。または上記配列番号記載の塩基配列に変異を導入した配列を、市販の核酸合成装置によって合成することも可能である。上記変異は、該ポリヌクレオチドを植物で過剰発現することにより植物の生育を促進する活性を有している限り、どの位置に導入されてもよい。好ましくは、変異はZIMモチーフ以外の位置に導入され、この場合、ZIMモチーフ配列は該ポリヌクレオチド中にそのまま維持される。 In addition, the polynucleotide into which the mutation is introduced is subjected to site-specific or random mutation by subjecting the base sequence described in the above SEQ ID No. to gene modification methods well known to those skilled in the art such as PCR-mediated mutation introduction and cassette mutation. Can be prepared by introducing. Alternatively, it is also possible to synthesize a sequence in which a mutation is introduced into the base sequence described in the above SEQ ID No. using a commercially available nucleic acid synthesizer. The mutation may be introduced at any position as long as it has an activity of promoting the growth of the plant by overexpressing the polynucleotide in the plant. Preferably, the mutation is introduced at a position other than the ZIM motif, in which case the ZIM motif sequence remains intact in the polynucleotide.
上記のようにして調製したポリヌクレオチドを植物で過剰発現することにより植物の生育を促進する活性を有しているかどうかの確認は、該調製したポリヌクレオチドを植物に導入して栽培し、コントロールと比較して草丈、根、または稈の伸長、種子肥大、花成誘導、出穂の促進が観察されるかどうかを評価すればよい。具体的には実施例2に記載の方法によって行うことができる。 Confirmation of whether or not the polynucleotide prepared as described above has the activity of promoting the growth of the plant by over-expressing the plant in the plant is introduced and cultivated by introducing the prepared polynucleotide into the plant, In comparison, it may be evaluated whether plant height, root or cocoon elongation, seed enlargement, flowering induction, and heading promotion are observed. Specifically, it can be carried out by the method described in Example 2.
本発明のポリヌクレオチドを植物内で過剰発現させるには、本発明のポリヌクレオチドを適当なプロモーターの下流に機能的に連結し、該プロモーターと連結した本発明のポリヌクレオチドをエレクトロポーレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム感染法等の公知方法によって植物細胞、種子、配偶子、受精卵、またはカルスに導入すればよい。 In order to overexpress the polynucleotide of the present invention in a plant, the polynucleotide of the present invention is operably linked downstream of an appropriate promoter, and the polynucleotide of the present invention linked to the promoter is electroporated, particle What is necessary is just to introduce | transduce into a plant cell, a seed, a gamete, a fertilized egg, or a callus by well-known methods, such as a cancer method, a polyethyleneglycol method, an Agrobacterium infection method.
上記プロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモーター、イネのアクチンプロモーターやElongation factor 1βプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーターなどを挙げることができるが、これらに限定されない。また、特定器官について特に生育を促進させたい場合は、組織特異的に発現するプロモーターを用いることもできる。例えば、花器官特異的遺伝子のプロモーターを用いれば、本発明のポリヌクレオチドの生育促進効果を多収性に集中させることも可能と考えられる。 Examples of the promoter include, but are not limited to, the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter, the rice actin promoter, the elongation factor 1β promoter, the corn ubiquitin promoter, and the like. In addition, when it is desired to promote the growth of a specific organ, a promoter that can be expressed in a tissue-specific manner can be used. For example, if a promoter of a flower organ-specific gene is used, it is considered possible to concentrate the growth promoting effect of the polynucleotide of the present invention on high yield.
アグロバクテリウム法を行う際は、バイナリーベクターまたは中間ベクターを用いることができる。バイナリーベクターの具体例として、pBI系ベクター(例えば、実施例で使用したpRiceFOX)、pPZP系(Hajdukiewicz, P., Svab, Z. and Maliga, P. (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology 25(6): 989-94.)、pCAMBIA系(ベクター骨格:pPZPベクター; URL: http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html)、pSMA系(Igasaki, T., Mohri, T., Ichikawa, H. and Shinohara, K. (2000) Plant Cell Reports 19: 448-453.)を挙げることができるが、これらに限定されない。使用するベクターは、ハイグロマイシン耐性やカナマイシン耐性等の選抜マーカーが搭載されていてもよい。 When performing the Agrobacterium method, a binary vector or an intermediate vector can be used. Specific examples of binary vectors include pBI vectors (eg, pRiceFOX used in the Examples), pPZP systems (Hajdukiewicz, P., Svab, Z. and Maliga, P. (1994) The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary Plant for Molecular Transformation. Plant Molecular Biology 25 (6): 989-94.), pCAMBIA system (vector backbone: pPZP vector; URL: http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585. html), pSMA system (Igasaki, T., Mohri, T., Ichikawa, H. and Shinohara, K. (2000) Plant Cell Reports 19: 448-453.), but is not limited thereto. The vector to be used may be equipped with a selection marker such as hygromycin resistance or kanamycin resistance.
本発明のポリヌクレオチドが導入された植物は、該ポリヌクレオチドの過剰発現により生育が促進されるため、本発明のポリヌクレオチドは生育が促進された植物の製造に利用できる。生育促進は、草丈、根、または稈の伸長、種子肥大、花成誘導、出穂の促進といった形質で確認できる。該導入当代から得た繁殖材料(例えば、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)から植物を再生することにより、生育が促進された植物を大量生産することが可能になる。またこの形質は後代に安定に伝達されることが確認されていることから、形質転換当代を交配させて得られた種子からも、生育が促進された植物を生産することができる。 Since the plant into which the polynucleotide of the present invention is introduced is promoted by overexpression of the polynucleotide, the polynucleotide of the present invention can be used for the production of a plant whose growth is promoted. Growth promotion can be confirmed by traits such as plant height, root or pod elongation, seed enlargement, flower induction, and heading promotion. It is possible to mass-produce plants whose growth has been promoted by regenerating plants from propagation materials (for example, fruits, cuttings, tubers, tuberous roots, strains, callus, protoplasts, etc.) obtained from this introduction. . In addition, since it has been confirmed that this trait is stably transmitted to progeny, a plant whose growth is promoted can also be produced from seeds obtained by mating the current generation.
本発明のポリヌクレオチドは、使用説明書とともに適切な容器に梱包し、植物の生育促進剤または生育促進用キットとして加工し流通させることも可能である。 The polynucleotide of the present invention can be packaged in an appropriate container together with instructions for use, and processed and distributed as a plant growth promoter or a growth promotion kit.
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
[実施例1] イネFOX hunting systemによるトランスジェニック植物の作出
遺伝子過剰発現用バイナリーベクター pRiceFOX上のトウモロコシ由来ユビキチン1遺伝子プロモーター(PUbi1)の下流に多種多様な完全長cDNAを接続し、該プラスミド混合物をアグロバクテリウムに導入し、イネcDNAアグロバクテリウム・ライブラリーを作製した。pRiceFOXベクターは選抜マーカーとしてP35S-HPT(CaMV 35Sプロモーターの発現制御下にあるハイグロマイシン耐性遺伝子)を有する。pRiceFOXベクターの構造を図1に示す。該ライブラリーを迅速形質転換法(WO 2005/092082、Toki, S., Hara, N., Ono, K., Onodera, H., Tagiri, A., Oka, S. and Tanaka, H. (2006) Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice. Plant J. 47: 969-976.)によりイネ(日本晴)に形質転換し、ハイグロマイシン剤に耐性を示す多数のFOXイネ系統(本明細書において、遺伝子を導入した形質転換カルスから再分化したイネ(形質転換当代)をT1と称する)を作出した。
上記FOXイネ系統の表現型を観察したところ、有意に生育が促進された系統(AB323およびAG163)の出現を確認した(図2)。AB323およびAG163イネ系統に導入されたcDNAをゲノミックPCRおよびダイレクトシークエンシング法を用いて解析したところ、両系統に同一のcDNA(アクセッション番号AK067971)が導入されていたことが判明した。AK067971は、187アミノ酸からなるタンパク質をコードし、ZIMモチーフを有する。AK067971の塩基配列を配列番号:1に示す。配列番号:1のうち、ORFは第108位から第671位である。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited to these Examples.
[Example 1] Production of transgenic plant by rice FOX hunting system Binary vector for gene overexpression A variety of full-length cDNAs are connected downstream of the maize ubiquitin 1 gene promoter (PUbi1) on pRiceFOX, and the plasmid mixture is Introduced into Agrobacterium, rice cDNA Agrobacterium library was prepared. The pRiceFOX vector has P35S-HPT (hygromycin resistance gene under the control of CaMV 35S promoter expression) as a selection marker. The structure of the pRiceFOX vector is shown in FIG. The library was transformed rapidly (WO 2005/092082, Toki, S., Hara, N., Ono, K., Onodera, H., Tagiri, A., Oka, S. and Tanaka, H. (2006 ) Early infection of scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation of rice. Plant J. 47: 969-976.) In the description, rice (transformation generation) regenerated from the transformed callus into which the gene was introduced was created.
Observation of the phenotype of the FOX rice line confirmed the appearance of lines (AB323 and AG163) whose growth was significantly promoted (FIG. 2). Analysis of the cDNA introduced into the AB323 and AG163 rice lines using genomic PCR and direct sequencing revealed that the same cDNA (accession number AK067971) was introduced into both lines. AK067971 encodes a protein consisting of 187 amino acids and has a ZIM motif. The base sequence of AK067971 is shown in SEQ ID NO: 1. In SEQ ID NO: 1, the ORF is from position 108 to position 671.
[実施例2] AK067971過剰発現イネ系統の表現型解析
過剰発現型AK067971 cDNAが導入されたAB323およびAG163系統の後代の特性をさらに解析した。AB323系統(T3)における表現型を図3に示す。播種後12日目のAB323系統幼植物体では、根の伸長促進が観察された。種子では特に胚乳の肥大が認められ、この表現型は後代に安定に伝達された(図3、表1)。また、草丈、稈長、種子重量、個体当たりの収量についても、コントロールと比較して有意に高い値が得られた(図4)。
[Example 2] Phenotypic analysis of AK067971 overexpressing rice line The characteristics of the progenies of AB323 and AG163 lines into which the overexpressed AK067971 cDNA was introduced were further analyzed. The phenotype in the AB323 line (T3) is shown in FIG. In the AB323 strain seedlings 12 days after sowing, the promotion of root elongation was observed. In seeds, endosperm hypertrophy was observed, and this phenotype was stably transmitted to progeny (FIG. 3, Table 1). In addition, the plant height, culm length, seed weight, and yield per individual were significantly higher than the control (FIG. 4).
また、AB323およびAG163系統以外に、pRiceFOXベクターにAK067971を個別導入したプラスミド(AK067971-FOX)を野生型イネに再導入して、AK067971-FOXイネ系統をさらに取得した。これら新規AK067971-FOXイネ系統の表現型を調査したところ、AB323およびAG163系統と同様の生育促進形質が再現された。また新規系統の出穂日についても、AB323およびAG163系統と同様、野生型(非組換え体)に比べて約10日間早くなることが判明した(図5)。 In addition to the AB323 and AG163 lines, a plasmid (AK067971-FOX) in which AK067971 was individually introduced into the pRiceFOX vector was reintroduced into wild-type rice to further obtain the AK067971-FOX rice line. When the phenotypes of these novel AK067971-FOX rice lines were investigated, the same growth-promoting traits as the AB323 and AG163 lines were reproduced. Also, the heading date of the new line was found to be about 10 days earlier than that of the wild type (non-recombinant) as in the AB323 and AG163 lines (FIG. 5).
[実施例3] AK067971遺伝子ホモログ導入系統の表現型解析
AK067971の他にZIMモチーフを持つ遺伝子が存在するかどうか、塩基配列データベースを検索した。その結果、複数のイネ遺伝子にZIMモチーフが存在することが判明した(表2)。さらに、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、バレイショ(Solanum tuberosum)、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、キュウリ(Cucumis sativus)、アサガオ(Ipomoea nil)、トマト(Lycopersicon esculentum)、ゼニゴケ(Marchantia polymorpha)にもZIMモチーフを持つ遺伝子が見出された(表2)。ZIMモチーフを有する遺伝子群は、主としてZIMモチーフを有するが、GATA型Zinc Fingerドメインが存在せず、CCTモチーフと高い相同性を有する領域を持たない1型と、ZIMモチーフ、CCTモチーフおよびGATA型Zinc Fingerドメインの3つの構造を有する2型に大別される。AK067971遺伝子は1型に属する(図6A)。これらのZIMモチーフ遺伝子ファミリーメンバーを植物に過剰発現させた場合も、AK067971-FOXイネで観察された効果と同様の効果が期待された。
そこで、AK067971以外でZIMモチーフを持つことが確認されたイネ遺伝子のうち、9種のホモログ(AK107854, AK070649, AK061602, AK073589, AK068566, AK099557, AK108738, AK069326, AK107750)についてAK067971との相同性を比較したところ、アミノ酸レベルでの相同性は、AK107854: 45.3%, AK070649: 39.0%, AK061602: 44.0%, AK073589: 41.4%, AK068566: 20.5%, AK099557: 24.5%, AK108738: 26.7%, AK069326: 21.1%, AK107750: 27.2%であった(図6B)。相同性の高い順にpRiceFoxベクターに組み込み、イネに形質転換した。4種のホモログAK107854、AK070649、 AK061602、AK073589を導入したT1再分化当代植物群は、草丈、稈長、種子重量とも、AK067971導入系統と同等またはそれ以上の値を示した(図7)。これらのことから、ZIMモチーフ遺伝子を有するAK067971近縁遺伝子においても、過剰発現により植物の生育促進をもたらすことが明らかになった。
[Example 3] Phenotypic analysis of AK067971 gene homolog introduction line
The nucleotide sequence database was searched for the presence of a gene having a ZIM motif in addition to AK067971. As a result, it was found that ZIM motifs exist in a plurality of rice genes (Table 2). In addition, Arabidopsis thaliana, potato (Solanum tuberosum), Bensamiana tobacco (Nicotiana benthamiana), cucumber (Cucumis sativus), morning glory (Ipomoea nil), tomato (Lycopersicon esculentum), and Zenigoke (Marchantia polymorpha) Genes with a were found (Table 2). The gene group with the ZIM motif mainly has the ZIM motif, but has no GATA type Zinc Finger domain and does not have a region having high homology with the CCT motif, and the ZIM motif, CCT motif and GATA type Zinc It is roughly divided into two types having three structures of Finger domains. The AK067971 gene belongs to type 1 (FIG. 6A). When these ZIM motif gene family members were overexpressed in plants, the same effects as those observed in AK067971-FOX rice were expected.
9 rice homologs other than AK067971 that were confirmed to have the ZIM motif (AK107854, AK070649, AK061602, AK073589, AK068566, AK099557, AK108738, AK069326, AK107750) were compared with AK067971. As a result, homology at the amino acid level is AK107854: 45.3%, AK070649: 39.0%, AK061602: 44.0%, AK073589: 41.4%, AK068566: 20.5%, AK099557: 24.5%, AK108738: 26.7%, AK069326: 21.1% , AK107750: 27.2% (FIG. 6B). They were incorporated into pRiceFox vector in descending order of homology and transformed into rice. The T1 re-differentiated generation plant group into which four kinds of homologs AK107854, AK070649, AK061602, and AK073589 were introduced showed values equivalent to or higher than those of the AK067971 introduced line in terms of plant height, culm length, and seed weight (FIG. 7). From these results, it has been clarified that overexpression of AK067971-related gene having ZIM motif gene also promotes plant growth.
Claims (12)
(a)植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
(b)該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を再生する工程。 The method of claim 1, comprising the following steps (a) and (b) :
(A) a polynucleotide encoding a protein having an activity of promoting plant growth and containing a ZIM motif in the amino acid sequence and not including a typical CCT motif and a GATA-type Zinc Finger domain, or a vector retaining the polynucleotide (B) A step of regenerating a plant body from the seed, fertilized egg, plant cell, or callus .
(a)植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
(b)該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を再生する工程
(c)該植物体由来の繁殖材料(種子以外)から植物体を再生する工程。 A method for producing a plant whose growth is promoted, comprising the following steps (a) to (c) :
(A) a polynucleotide encoding a protein having an activity of promoting plant growth and containing a ZIM motif in the amino acid sequence and not including a typical CCT motif and a GATA-type Zinc Finger domain, or a vector retaining the polynucleotide (B) introducing into plant seed, fertilized egg, plant cell or callus (b) regenerating plant body from the seed, fertilized egg, plant cell, or callus (c) propagation material derived from the plant body (other than seed) ) The process of regenerating the plant body .
(a)植物の生育を促進する活性を有しアミノ酸配列中にZIMモチーフを含み典型的CCTモチーフ及びGATA型Zinc Fingerドメインを含まないタンパク質をコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを保持するベクターを、植物の種子、受精卵、植物細胞またはカルスに導入する工程
(b)該種子、受精卵、植物細胞、またはカルスから植物体を作出する工程
(c)該植物体から得られた該ポリヌクレオチドを有する種子から、ZIMモチーフを有する遺伝子を過剰発現する植物を作出する工程。 A method for producing a plant whose growth is promoted, comprising the following steps (a) to (c) :
(A) a polynucleotide encoding a protein having an activity of promoting plant growth and containing a ZIM motif in the amino acid sequence and not including a typical CCT motif and a GATA-type Zinc Finger domain, or a vector retaining the polynucleotide (B) introducing into a plant seed, fertilized egg, plant cell or callus (b) producing a plant from the seed, fertilized egg, plant cell or callus (c) the polynucleotide obtained from the plant from the seeds with a step of producing a plant overexpressing a gene having a ZIM motifs.
(a)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
(c)50%ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行い、その後、0.2xSSC、0.1% SDS、65℃で洗浄する条件下で、配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド
(d)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に1または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。 A polynucleotide encoding a protein having an activity to promote plant growth and containing a ZIM motif in the amino acid sequence and not a typical CCT motif and a GATA-type zinc finger domain is any of the following (a) to (d): The method according to claim 1, wherein :
(A) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 containing the coding region of the base sequence described in (b) SEQ ID NO: 2, A polynucleotide comprising a base sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence of any of 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 (c) 50% formamide, 4 × SSC, 50 mM Hybridization was carried out by incubation overnight at 42 ° C in a hybridization solution containing HEPES (pH 7.0), 10x Denhardt's solution, 20 μg / ml denatured salmon sperm DNA, and then 0.2xSSC, 0.1% SDS, 65 A polynucleotide that hybridizes to the complementary strand of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 under conditions of washing at 0 ° C. (d ) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 amino acids Column one or more amino acid substitutions, insertions, deletions, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein consisting added in the amino acid sequence.
(a)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
(c)50%ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行い、その後、0.2xSSC、0.1% SDS、65℃で洗浄する条件下で、配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド
(d)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に1または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。 The isolated poly (1) to (d) below, which has an activity of promoting plant growth and encodes a protein containing a ZIM motif in the amino acid sequence and not a typical CCT motif and a GATA-type zinc finger domain: A transformed plant body with enhanced growth, including transformed cells overexpressing nucleotides :
(A) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 containing the coding region of the base sequence described in (b) SEQ ID NO: 2, A polynucleotide comprising a base sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence of any of 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 (c) 50% formamide, 4 × SSC, 50 mM Hybridization was carried out by incubation overnight at 42 ° C in a hybridization solution containing HEPES (pH 7.0), 10x Denhardt's solution, 20 μg / ml denatured salmon sperm DNA, and then 0.2xSSC, 0.1% SDS, 65 A polynucleotide that hybridizes to the complementary strand of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 under conditions of washing at 0 ° C. (d ) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 amino acids Column one or more amino acid substitutions, insertions, deletions, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein consisting added in the amino acid sequence.
(a)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
(c)50%ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行い、その後、0.2xSSC、0.1% SDS、65℃で洗浄する条件下で、配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド
(d)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に1または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。 A polynucleotide according to any one of (a) to (d) below , which encodes a protein having an activity to promote plant growth and containing a ZIM motif in the amino acid sequence and not a typical CCT motif and a GATA-type zinc finger domain: A plant growth promoter containing :
(A) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 containing the coding region of the base sequence described in (b) SEQ ID NO: 2, A polynucleotide comprising a base sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence of any of 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 (c) 50% formamide, 4 × SSC, 50 mM Hybridization was carried out by incubation overnight at 42 ° C in a hybridization solution containing HEPES (pH 7.0), 10x Denhardt's solution, 20 μg / ml denatured salmon sperm DNA, and then 0.2xSSC, 0.1% SDS, 65 A polynucleotide that hybridizes to the complementary strand of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 under conditions of washing at 0 ° C. (d ) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 amino acids Column one or more amino acid substitutions, insertions, deletions, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein consisting added in the amino acid sequence.
(a)配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載された塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド
(c)50%ホルムアミド、4×SSC、50mM HEPES (pH7.0)、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行い、その後、0.2xSSC、0.1% SDS、65℃で洗浄する条件下で、配列番号:1,3,5,7,9,11,13,15,17,または19のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチド
(d)配列番号:2,4,6,8,10,12,14,16,18,または20のいずれかに記載のアミノ酸配列に1または複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。 A polynucleotide according to any one of (a) to (d) below , which encodes a protein having an activity to promote plant growth and containing a ZIM motif in the amino acid sequence and not a typical CCT motif and a GATA-type zinc finger domain: A plant growth promotion kit containing :
(A) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 containing the coding region of the base sequence described in (b) SEQ ID NO: 2, A polynucleotide comprising a base sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence of any of 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 (c) 50% formamide, 4 × SSC, 50 mM Hybridization was carried out by incubation overnight at 42 ° C in a hybridization solution containing HEPES (pH 7.0), 10x Denhardt's solution, 20 μg / ml denatured salmon sperm DNA, and then 0.2xSSC, 0.1% SDS, 65 A polynucleotide that hybridizes to the complementary strand of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, or 19 under conditions of washing at 0 ° C. (d ) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or 20 amino acids Column one or more amino acid substitutions, insertions, deletions, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding a protein consisting added in the amino acid sequence.
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