JP5539660B2 - Mucosal vaccine adjuvant - Google Patents
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Description
本発明は、粘膜ワクチン用アジュバントに関し、さらに粘膜ワクチン用アジュバント並びに粘膜ワクチンを含む、粘膜ワクチン組成物に関する。 The present invention relates to an adjuvant for mucosal vaccines, and further relates to a mucosal vaccine composition comprising an adjuvant for mucosal vaccines and a mucosal vaccine.
インフルエンザ等の感染症の予防にはワクチンが最も有効である。従来の注射によるワクチンは、全身レベルでの免疫を誘導するが、粘膜面での免疫（ＩｇＡ抗体の分泌）を誘導できない。全身系での免疫のみならず、感染がおこる場である粘膜面での免疫も誘導し、二段構えの防御を可能とする粘膜ワクチンの確立に大きな期待が寄せられている。鼻腔および口腔に始まる、上気道、腸管、泌尿生殖器などの粘膜面は、絶えず外界と接しており、アレルゲンや病原微生物と対峙して、正と負の免疫応答、つまり積極的排除と共生をうながし、外界との免疫学的恒常性を維持する粘膜免疫システムが存在する。この粘膜免疫システムを利用したワクチンが粘膜ワクチンである。粘膜ワクチンについて、総説的な報告がある（非特許文献１）。 Vaccines are the most effective in preventing influenza and other infectious diseases. Conventional injection vaccines induce immunity at the systemic level, but cannot induce mucosal immunity (IgA antibody secretion). There is great expectation for the establishment of a mucosal vaccine capable of inducing not only systemic immunity but also mucosal immunity where infection occurs, enabling two-stage protection. Mucosal surfaces such as the upper respiratory tract, intestinal tract, and genitourinary organs that begin in the nasal cavity and oral cavity are constantly in contact with the outside world, and are opposed to allergens and pathogenic microorganisms, urging positive and negative immune responses, ie, positive exclusion and symbiosis. There is a mucosal immune system that maintains immunological homeostasis with the outside world. A vaccine using this mucosal immune system is a mucosal vaccine. There is a review of mucosal vaccines (Non-Patent Document 1).
経粘膜的にワクチン抗原を単独投与した場合、抗原の物理的排除、免疫担当組織への不確実な抗原の送達などの弱点により、粘膜ワクチンは期待したほどの特異的免疫反応を粘膜に誘導できないといわれている。粘膜ワクチンの実用化に向けた工夫として、重要なのは免疫増強効果のある粘膜アジュバントおよびワクチン抗原の粘膜誘導組織への送達法の開発である。上述のように、粘膜ワクチンでは、ワクチン抗原単独の投与では効率よく免疫を誘導できないため、アジュバントの併用が不可欠である。免疫用アジュバントは、ウイルス、微生物、または合成物由来の抗原の存在下でワクチン等を投与したときに、免疫系の反応を増大させうる物質である。それらは、投与部位に続いて、リンパ節に多量のマクロファージを出現させ、特定の免疫グロブリン等の産生を増加させ、免疫防御機構に関与する多くの細胞を刺激する。 When a vaccine antigen is administered transmucosally alone, mucosal vaccine cannot induce specific immune response to the mucosa as expected due to weak points such as physical exclusion of antigen and uncertain delivery of antigen to immunocompetent tissues. It is said that. As a device for practical use of a mucosal vaccine, important is the development of a mucosal adjuvant having an immune enhancing effect and a method for delivering a vaccine antigen to a mucosal derived tissue. As described above, in the mucosal vaccine, immunity cannot be efficiently induced by administration of the vaccine antigen alone, and therefore, the combined use of an adjuvant is indispensable. An adjuvant for immunization is a substance that can increase the response of the immune system when a vaccine or the like is administered in the presence of an antigen derived from a virus, microorganism, or synthetic product. They cause a large amount of macrophages to appear in the lymph nodes following the administration site, increase production of specific immunoglobulins and the like, and stimulate many cells involved in immune defense mechanisms.
これまでに、粘膜ワクチン用のアジュバントとして、多くの報告があり、例えばベロ毒素１のＢサブユニットの５量体（特許文献１）、二本鎖ＲＮＡ(Poly(I:C))（特許文献２、特許文献３）、ＣｐＧ含有一本鎖デオキシヌクレオチド（特許文献４）等が開示されている。コレラ毒素等、細菌毒素が粘膜ワクチンアジュバントとして有効であることが報告されているものの、臨床応用等では重大な副作用を呈したことなどの理由により開発は断念されており、いまだ有効かつ安全な粘膜ワクチンアジュバントが実用化されているとはいえない。 So far, there have been many reports as adjuvants for mucosal vaccines, such as pentamer of B subunit of verotoxin 1 (Patent Document 1), double-stranded RNA (Poly (I: C)) (Patent Document) 2, Patent Document 3), CpG-containing single-stranded deoxynucleotides (Patent Document 4) and the like are disclosed. Bacterial toxins such as cholera toxin have been reported to be effective as mucosal vaccine adjuvants, but development has been abandoned due to serious side effects in clinical applications etc., and they are still effective and safe mucosa It cannot be said that a vaccine adjuvant has been put into practical use.
インターロイキン１８（ＩＬ−１８）ポリペプチドとサポニンアジュバントおよび免疫原性組成物を哺乳動物に投与して、抗原に対する免疫応答を増強する方法について開示がある（特許文献５）。しかしながら、ここではＩＬ−１８単独での粘膜アジュバントとしての使用に関しては、開示されていない。 There is disclosed a method for enhancing an immune response to an antigen by administering an interleukin 18 (IL-18) polypeptide, a saponin adjuvant and an immunogenic composition to a mammal (Patent Document 5). However, there is no disclosure here regarding the use of IL-18 alone as a mucosal adjuvant.
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を免疫原性組成物としたとき、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＧＭ−ＣＳＦから選択される各種サイトカインを組み合わせて、マウスに経鼻投与した場合に、皮下投与した場合と比べて、血清、膣洗浄液、糞便および唾液中により高いＩｇＡの産生を認め、これらの物質の組み合わせが粘膜アジュバントとして機能しうることが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、個々のインターロイキン単独で用いた場合の効果については、ＩｇＧの産生を調べているのみであって、ＩｇＡについては開示がない。 When human immunodeficiency virus (HIV) is used as an immunogenic composition, when various cytokines selected from IL-1, IL-12, IL-18 and GM-CSF are combined and administered to mice nasally In comparison with the case of subcutaneous administration, higher production of IgA was observed in serum, vaginal lavage fluid, feces and saliva, and it has been reported that a combination of these substances can function as a mucosal adjuvant (Non-patent Document 2). . However, only the production of IgG is examined for the effects of using individual interleukins alone, and there is no disclosure of IgA.
新世代のアジュバントについて報告があるが（非特許文献３）、より有効かつ安全な粘膜ワクチンアジュバントシステムが確立できれば、感染症に対するワクチンの開発に大きく寄与することになる。 Although there is a report on a new generation of adjuvant (Non-patent Document 3), if a more effective and safe mucosal vaccine adjuvant system can be established, it will greatly contribute to the development of a vaccine against infectious diseases.
本発明は、有効かつ安全な粘膜ワクチン用アジュバントを提供することを課題とする。より具体的には、コレラ毒素などの細菌毒素を用いることなく、有効で安全な粘膜ワクチン用アジュバントを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an effective and safe adjuvant for mucosal vaccines. More specifically, an object of the present invention is to provide an effective and safe adjuvant for mucosal vaccines without using bacterial toxins such as cholera toxin.
本発明の発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、インターロイキン３３（ＩＬ−３３）に着目し、粘膜ワクチン用アジュバントとしての機能を有することを見出し、本発明を完成した。 The inventors of the present invention have intensively studied to solve the above-mentioned problems. As a result, the inventors have focused on interleukin 33 (IL-33) and found that it has a function as an adjuvant for mucosal vaccine. completed.
本発明は、すなわち以下よりなる。
１．インターロイキン３３（ＩＬ−３３）からなる粘膜ワクチン用アジュバント。
２．ＩｇＡ誘導用の請求項１に記載の粘膜ワクチン用アジュバント。
３．前項１または２に記載の粘膜ワクチン用アジュバントを含む粘膜ワクチン用補助剤。
４．粘膜ワクチンを有効成分とし、さらに前項１または２に記載の粘膜ワクチン用アジュバントを含む粘膜ワクチン組成物。
５．粘膜ワクチンが、経粘膜感染病原体由来の抗原物質を含む前項４に記載の粘膜ワクチン組成物。
６．経粘膜感染病原体が、インフルエンザウイルスである前項５に記載の粘膜ワクチン組成物。
７．前項６に記載の粘膜免疫ワクチン組成物を含む、点鼻用または経口用の粘膜ワクチン製剤。
The present invention comprises the following.
1. An adjuvant for mucosal vaccine comprising interleukin 33 (IL-33).
2. The adjuvant for mucosal vaccines according to claim 1 for IgA induction.
3. 3. An auxiliary agent for mucosal vaccine comprising the adjuvant for mucosal vaccine according to item 1 or 2.
4). A mucosal vaccine composition comprising a mucosal vaccine as an active ingredient and further comprising the adjuvant for mucosal vaccine according to item 1 or 2.
5. 5. The mucosal vaccine composition according to item 4, wherein the mucosal vaccine contains an antigenic substance derived from a transmucosal infectious agent.
6). 6. The mucosal vaccine composition according to item 5 above, wherein the transmucosal infectious agent is an influenza virus.
7). 7. A nasal or oral mucosal vaccine preparation comprising the mucosal immune vaccine composition according to item 6.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、経粘膜感染病原体由来抗原に対して、ＩｇＧ、ならびに各アイソタイプであるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体を効率よく誘導することが確認された。ＩｇＧ２ａ抗体を効率よく誘導することから、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、液性免疫のみならず、細胞性免疫も増強しうることが示唆された。さらにin vivoの系において、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントおよび抗原を経鼻的に投与したところ、唾液、膣洗浄液および糞便において効率的にＩｇＡを産生することが確認された。このことから、ＩＬ−３３を経鼻的に投与した場合でも、口腔、膣、腸粘膜等の全身粘膜面において抗原特異的ＩｇＡが分泌され、ＩＬ−３３は優れた粘膜ワクチン用アジュバントといえる。さらに、ＩＬ−３３はサイトカインの一種であり、副作用の少ない粘膜ワクチン用アジュバントといえる。 Mucosal vaccine adjuvant of the present invention is to provide transmucosal infectious pathogen-derived antigens, IgG, and to induce IgG 1 and IgG 2a antibodies efficiently is each isotype was confirmed. Since the IgG 2a antibody was efficiently induced, it was suggested that the adjuvant for mucosal vaccine of the present invention can enhance not only humoral immunity but also cellular immunity. Furthermore, when the mucosal vaccine adjuvant and antigen of the present invention were administered intranasally in an in vivo system, it was confirmed that IgA was efficiently produced in saliva, vaginal lavage fluid and feces. Therefore, even when IL-33 is administered nasally, antigen-specific IgA is secreted on the whole body mucosa such as the oral cavity, vagina and intestinal mucosa, and IL-33 can be said to be an excellent mucosal vaccine adjuvant. Furthermore, IL-33 is a kind of cytokine and can be said to be an adjuvant for mucosal vaccine with few side effects.
本発明の、粘膜ワクチン用アジュバントは、サイトカインの一種であるＩＬ−３３からなる。ＩＬ−３３は、ＩＬ−１およびＩＬ−１８とともに、ＩＬ−１ファミリーに属するといわれている。ＩＬ−１は、マクロファージや血管内皮から産生される炎症性サイトカインとして知られている。ＩＬ−１にはＩＬ−１α、ＩＬ−１βが存在し、ともにＴＮＦ−αと同様に強い炎症反応を惹起し、代謝を亢進し血圧低下を引き起こす。 The adjuvant for mucosal vaccine of the present invention consists of IL-33 which is a kind of cytokine. IL-33 is said to belong to the IL-1 family together with IL-1 and IL-18. IL-1 is known as an inflammatory cytokine produced from macrophages and vascular endothelium. IL-1 includes IL-1α and IL-1β, both of which induce a strong inflammatory reaction, similar to TNF-α, increase metabolism and cause a decrease in blood pressure.
一方、ＩＬ−１８は、Ｔヘルパー１（Th1）細胞を刺激し、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の発現を誘導することが報告されている（J. Immunology, 168, 2282-2287 (2002)）。また、ＩＬ−３３は、Toll-ＩＬ−１受容体（TIR）ドメイン含有受容体ＳＴ２と結合し、Ｔヘルパー２（Th2）免疫調節活性を有することが報告されている（Immunity, 23, 479-490 (2005)）。Ｔｈ１はＩＦＮγやＩＬ−２などを産生して、主にＴ細胞系の活性化に働き、Ｔｈ２はＩＬ−４やＩＬ−６などを産生して、主にＢ細胞系の活性化に働くといわれている。ＩＬ−３３の核内標的はまだ明らかになっていないが、炎症組織におけるＩＬ−３３の発現、核内リプレッサー活性、ＳＴ２の競合活性から、ＩＬ−３３はＩＬ−１とは異なり、炎症を軽減する可能性があることが示唆される。したがって、ＩＬ−１、ＩＬ−１８およびＩＬ−３３は、同じＩＬ−１ファミリーに属するものの、個々のサイトカインの機能は異なり、不明な点も多く残されている。 On the other hand, IL-18 has been reported to stimulate T helper 1 (Th1) cells and induce the expression of interferon γ (IFNγ) (J. Immunology, 168, 2282-2287 (2002)). In addition, IL-33 has been reported to bind to the Toll-IL-1 receptor (TIR) domain-containing receptor ST2 and have T helper 2 (Th2) immunomodulatory activity (Immunity, 23, 479- 490 (2005)). Th1 produces IFNγ, IL-2, etc., mainly acting on the activation of T cell lines, and Th2 produces IL-4, IL-6, etc., mainly acting on the activation of B cell lines. It is said. Although the nuclear target of IL-33 has not yet been clarified, IL-33 differs from IL-1 in that it has inflammation due to IL-33 expression in the inflamed tissue, nuclear repressor activity, and competitive activity of ST2. It is suggested that there is a possibility of mitigation. Therefore, although IL-1, IL-18, and IL-33 belong to the same IL-1 family, the functions of individual cytokines are different, and many unclear points remain.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントとして機能するＩＬ−３３は、GenBank Accession No. #Q8BVZ5（Ser 109-Ile 266）に示すアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列のうち１〜複数個のアミノ酸配列残基が、置換、欠失、付加または導入された配列からなるアミノ酸配列を有する。 IL-33 that functions as an adjuvant for mucosal vaccines of the present invention has the amino acid sequence shown in GenBank Accession No. # Q8BVZ5 (Ser 109-Ile 266), or one to a plurality of amino acid sequence residues among the amino acid sequences. It has an amino acid sequence consisting of a substituted, deleted, added or introduced sequence.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントの作製方法は、特に限定されない。粘膜ワクチン用アジュバントとして機能するＩＬ−３３は、例えば天然物由来であってもよいが、遺伝子組換法によっても作製することができる。遺伝子組換法による作製方法は、自体公知の方法によることができる。 The method for producing the adjuvant for mucosal vaccine of the present invention is not particularly limited. IL-33 that functions as an adjuvant for mucosal vaccines may be derived from natural products, for example, but can also be produced by a genetic recombination method. The production method by the gene recombination method can be a method known per se.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、粘膜ワクチン用補助剤として使用することができる。粘膜ワクチン用補助剤として使用する場合は、通常、粘膜ワクチンと共に、または前記粘膜ワクチンの投与に前後して、経鼻投与あるいは経口投与など、慣用的な態様で投与することができる。特に経鼻的に投与するのが好ましい。本発明のアジュバントは粘膜ワクチンと共に、通常、液状あるいは粉末状の形態で、鼻腔内あるいは口腔内に滴下、噴霧あるいはスプレーすることにより投与される。このようにして投与される本発明の粘膜ワクチン用補助剤の剤型としては、例えば、液剤、懸濁剤、粉末剤などが挙げられる。液剤としては、精製水、緩衝液などに溶解したものなどが挙げられる。懸濁剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カゼインなどと共に精製水、緩衝液などに懸濁させたものなどが挙げられる。粉末剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどとともによく混合したものなどが挙げられる。これらの製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、保湿剤、溶解剤などを必要に応じて添加することができる。 The adjuvant for mucosal vaccine of the present invention can be used as an auxiliary agent for mucosal vaccine. When used as an auxiliary agent for mucosal vaccine, it can usually be administered in a conventional manner such as nasal administration or oral administration together with or before or after administration of the mucosal vaccine. It is particularly preferable to administer nasally. The adjuvant of the present invention is administered together with the mucosal vaccine, usually in liquid or powder form, by dropping, spraying or spraying into the nasal cavity or oral cavity. Examples of the dosage form of the auxiliary agent for mucosal vaccine of the present invention to be administered in this way include liquids, suspensions, powders and the like. Examples of the liquid agent include those dissolved in purified water, buffer solution and the like. Examples of the suspending agent include those suspended in purified water, buffer solution and the like together with methylcellulose, hydroxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, gelatin, casein and the like. Examples of the powder include those mixed well with methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and the like. In these preparations, absorption promoters, surfactants, preservatives, stabilizers, moisture-proofing agents, moisturizing agents, solubilizing agents and the like that are usually used can be added as necessary.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって適宜決定することができる。投与対象は、粘膜ワクチンに含まれる抗原物質の種類に応じて適宜決定することができ、例えばヒトのほか、ヒト以外の哺乳類、鳥類、甲殻類などに投与することができる。本発明の粘膜ワクチン用アジュバントの投与量は、いわゆる当業者により慣用的に決定することができる。 The dosage of the mucosal vaccine adjuvant of the present invention can be appropriately determined depending on the subject to be administered, the administration method, the dosage form, and the like. The administration target can be appropriately determined according to the type of antigenic substance contained in the mucosal vaccine, and can be administered to, for example, humans, mammals other than humans, birds, crustaceans, and the like. The dose of the mucosal vaccine adjuvant of the present invention can be routinely determined by a so-called person skilled in the art.
ここで、粘膜ワクチンとは、経粘膜感染病原体由来の抗原物質を含み、粘膜免疫システムを利用したワクチンをいい、いわゆる当業者が用いる一般的な意味で定義される。本発明の粘膜ワクチンに含まれる抗原物質は、経粘膜感染病原体由来であればよく特に限定されないが、天然物由来であっても良いし、遺伝子組換等の手法により人為的に作製されたものであっても良い。経粘膜感染病原体は特に限定されないが、例えばインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、結核菌、コレラ菌、日本脳炎ウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、黄熱病ウイルス、風疹ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス等が例示され、好ましくはインフルエンザウイルスやヒト免疫不全ウイルスが挙げられ、最も好適にはインフルエンザウイルスが挙げられる。
また粘膜ワクチンの作製方法は、自体公知の方法、または今後開発される方法を適用することができ、特に限定されない。
Here, the mucosal vaccine refers to a vaccine that contains an antigenic substance derived from a transmucosal infectious agent and uses a mucosal immune system, and is defined in a general sense used by those skilled in the art. The antigenic substance contained in the mucosal vaccine of the present invention is not particularly limited as long as it is derived from a transmucosal infectious agent, but may be derived from a natural product or artificially prepared by a technique such as genetic recombination. It may be. The transmucosal infectious agent is not particularly limited. For example, influenza virus, human immunodeficiency virus (HIV), poliovirus, Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae, Japanese encephalitis virus, smallpox virus, measles virus, yellow fever virus, rubella virus, A Examples include hepatitis B virus and hepatitis B virus, preferably influenza virus and human immunodeficiency virus, and most preferably influenza virus.
A method for producing a mucosal vaccine is not particularly limited, and a method known per se or a method developed in the future can be applied.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、経粘膜感染病原体由来抗原に対してＩｇＧ、ならびに各アイソタイプであるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体を効率よく誘導することができる。ＩｇＧ２ａ抗体を効率よく誘導することから、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、液性免疫のみならず、細胞性免疫も増強しうることが示唆される。さらに、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントおよび抗原は、経鼻投与などの局所投与の場合でも、口腔、膣、腸粘膜等の全身粘膜面において、抗原特異的ＩｇＡが分泌され得る。 The adjuvant for mucosal vaccines of the present invention can efficiently induce IgG and respective isotypes IgG 1 and IgG 2a antibodies against antigens derived from transmucosal infectious agents. Since the IgG 2a antibody is efficiently induced, it is suggested that the adjuvant for mucosal vaccine of the present invention can enhance not only humoral immunity but also cellular immunity. Furthermore, the adjuvant for mucosal vaccine and antigen of the present invention can secrete antigen-specific IgA on the whole body mucosal surface such as the oral cavity, vagina and intestinal mucosa even in the case of local administration such as nasal administration.
本発明は、粘膜ワクチンを有効成分とし、さらに本発明の粘膜ワクチン用アジュバントを含む粘膜ワクチン組成物にもおよび、さらには粘膜ワクチン組成物を含む粘膜ワクチン製剤にも及ぶ。 The present invention extends to a mucosal vaccine composition comprising a mucosal vaccine as an active ingredient and further comprising the mucosal vaccine adjuvant of the present invention, and further to a mucosal vaccine formulation comprising a mucosal vaccine composition.
本発明の粘膜ワクチン製剤は、経鼻投与あるいは経口投与など、慣用的な態様で投与することができる。特に経鼻的な投与が好ましい。粘膜ワクチン製剤は、通常、液状または粉末状の形態で、鼻腔内あるいは口腔内に滴下、噴霧あるいはスプレーすることにより投与される。このようにして投与される本発明の粘膜ワクチン製剤の剤型としては、例えば、液剤、懸濁剤、粉末剤などが挙げられる。液剤としては、精製水、緩衝液などに溶解したものなどが挙げられる。懸濁剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カゼインなどと共に精製水、緩衝液などに懸濁させたものなどが挙げられる。粉末剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどとともによく混合したものなどが挙げられる。これらの製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、保湿剤、溶解剤などを必要に応じて添加することができる。 The mucosal vaccine preparation of the present invention can be administered in a conventional manner such as nasal administration or oral administration. Intranasal administration is particularly preferred. The mucosal vaccine preparation is usually administered in the form of liquid or powder by dropping, spraying or spraying into the nasal cavity or oral cavity. Examples of the dosage form of the mucosal vaccine preparation of the present invention to be administered in this way include liquids, suspensions, powders and the like. Examples of the liquid agent include those dissolved in purified water, buffer solution and the like. Examples of the suspending agent include those suspended in purified water, buffer solution and the like together with methylcellulose, hydroxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, gelatin, casein and the like. Examples of the powder include those mixed well with methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and the like. In these preparations, absorption promoters, surfactants, preservatives, stabilizers, moisture-proofing agents, moisturizing agents, solubilizing agents and the like that are usually used can be added as necessary.
本発明の粘膜ワクチン製剤の投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって適宜決定することができる。投与対象は、粘膜ワクチンに含まれる抗原物質の種類に応じて適宜決定することができ、例えばヒトのほか、ヒト以外の哺乳類、鳥類、甲殻類などに投与することができる。 The dosage of the mucosal vaccine preparation of the present invention can be appropriately determined depending on the subject to be administered, the administration method, the dosage form and the like. The administration target can be appropriately determined according to the type of antigenic substance contained in the mucosal vaccine, and can be administered to, for example, humans, mammals other than humans, birds, crustaceans, and the like.
本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。 In order to help understanding of the present invention, the present invention will be specifically described with reference to the following examples. However, it is needless to say that the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）インフルエンザ抗原に対するＩＬ−３３の抗体誘導
BALB/cマウス（６〜８週齢、雌性）に、遺伝子組換インフルエンザＨＡタンパク質抗原(baculovirus-expressed recombinant hemagglutinin (HA) derived from New Cal/99 virus, Protein Sciences社)（１μｇ）を粘膜ワクチンとし、ＩＬ−３３(Recombinant Mouse IL-33, R&D systems社)（１μｇ）を粘膜ワクチン用アジュバントとして混合したものを非麻酔下で経鼻投与した。抗原物質およびＩＬ−３３の投与は４週間隔で２回行った。粘膜ワクチン用アジュバントを併用しない系、および本発明の粘膜ワクチンアジュバントの代わりに、公知の粘膜ワクチン用アジュバントであるコレラ毒素Ｂサブユニット(CTB；List Biological Laboratories社)を０．２、１．０および５．０μｇ投与した系を比較対照の系とした。
(Example 1) Antibody induction of IL-33 against influenza antigen
BALB / c mice (6-8 weeks of age, female) were treated with mucosal vaccine using recombinant influenza HA protein antigen (baculovirus-expressed recombinant hemagglutinin (HA) derived from New Cal / 99 virus, Protein Sciences) (1 μg) A mixture of IL-33 (Recombinant Mouse IL-33, R & D systems) (1 μg) as an adjuvant for mucosal vaccine was administered nasally under non-anesthesia. Antigen substance and IL-33 were administered twice at 4-week intervals. A system that does not use an adjuvant for mucosal vaccines, and instead of the mucosal vaccine adjuvant of the present invention, cholera toxin B subunit (CTB; List Biological Laboratories) 0.2, 1.0 and The system administered with 5.0 μg was used as a control system.
最終免疫後２週目にマウス眼窩静脈より採血し、１１０００ｒｐｍで１５分間遠心後、上清を回収した試料について抗ＨＡタンパク質ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡの系で測定した。
ＨＡ溶液（上記遺伝子組換インフルエンザＨＡタンパク質抗原を５０ｍＭの重炭酸塩緩衝液(Sigma-Aldrich社)に溶解したもの、２μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡ用プレートに加え、４℃で一晩放置することで固相した。ＰＢＳで２倍希釈したBlock Ace(R)(大日本住友製薬)を用いて室温で１時間ブロッキングした後、各濃度に調製した試料を加えてインキュベートした（室温、２時間）。これらのプレートを０．０５％Tween(R)系界面活性剤含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ） で洗浄後、０．２μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ標識ＩｇＧ抗体（ＳＢＡ）を加えてインキュベートした （室温、２時間）。プレートを洗浄した後、０．５μｇ／ｍＬに希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン(ZYMED LAB社)を加え、さらに室温で１時間反応させた。再度、洗浄操作を行い、最後に蒸留水で洗浄した後、基質液（TMBZ ; 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン、ナカライテスク社）を１００μＬ／ｍＬ添加した。２ＮのＨ２ＳＯ４を５０μＬ／ｗｅｌｌ添加することにより発色反応を停止させ、吸光波長４５０ｎｍ、副波長６９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
Two weeks after the final immunization, blood was collected from the orbital vein of the mouse, centrifuged at 11000 rpm for 15 minutes, and the anti-HA protein IgG antibody was measured with an ELISA system for the sample from which the supernatant was collected.
HA solution (dissolved in the above recombinant HA protein antigen in 50 mM bicarbonate buffer (Sigma-Aldrich), 2 μg / mL) was added to the ELISA plate and left at 4 ° C. overnight. Solid phase. After blocking at room temperature for 1 hour using Block Ace (R) (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) diluted 2-fold with PBS, samples prepared at various concentrations were added and incubated (room temperature, 2 hours). After washing the plates with 0.05% Tween (R) surfactant containing PBS (PBST), was added and incubated HRP-labeled IgG antibody prepared in 0.2μg / mL (SBA) (room temperature, 2 hours ). After the plate was washed, HRP-labeled streptavidin (ZYMED LAB) diluted to 0.5 μg / mL was added, and the mixture was further reacted at room temperature for 1 hour. The washing operation was performed again, and finally, the substrate was washed with distilled water, and then a substrate solution (TMBZ; 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine, Nacalai Tesque) was added at 100 μL / mL. The coloring reaction was stopped by adding 50 μL / well of 2N H 2 SO 4 , and the absorbance at an absorption wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 690 nm was measured.
上記の結果、インフルエンザＨＡタンパク質抗原（１μｇ）の単独投与では、ＨＡ特異的血中ＩｇＧは殆ど誘導されなかったのに対し、ＩＬ−３３（１μｇ）を粘膜ワクチン用アジュバントとした場合は、ＣＴＢ（１μｇ）とほぼ同程度のＨＡ特異的ＩｇＧを誘導することが確認された（図１）。 As a result, when the influenza HA protein antigen (1 μg) was administered alone, HA-specific blood IgG was hardly induced, whereas when IL-33 (1 μg) was used as an adjuvant for mucosal vaccine, CTB ( 1 μg) was confirmed to induce approximately the same level of HA-specific IgG (FIG. 1).
（実施例２）
実施例１と同手法によりマウスに経鼻免疫し、採血したときの、血中の各アイソタイプであるＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ２ａ抗体を、実施例１と同手法にて測定した。ＨＲＰ標識ＩｇＧ抗体（ＳＢＡ）の代わりに、ＨＲＰ標識ＩｇＧ１抗体（ＳＢＡ社製）およびＨＲＰ標識ＩｇＧ２ａ抗体（ＳＢＡ社製）を用いて各々０．２μｇ／ｍＬの抗体溶液を調製し、測定した。
(Example 2)
IgG 1 antibody and IgG 2a antibody, which are each isotype in blood, were measured by the same method as in Example 1 when mice were nasally immunized and blood was collected by the same method as in Example 1. In place of the HRP-labeled IgG antibody (SBA), an HRP-labeled IgG 1 antibody (manufactured by SBA) and an HRP-labeled IgG 2a antibody (manufactured by SBA) were each prepared and measured for 0.2 μg / mL antibody solution. .
上記の結果、ＩＬ−３３（１μｇ）を粘膜ワクチン用アジュバントとした場合は、インフルエンザＨＡタンパク質抗原（１μｇ）の単独投与に比べて、ＨＡ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのいずれも、より誘導されていることが確認された。特に、ＩｇＧ１については、ＣＴＢ（５μｇ）をアジュバントとした場合よりも多く誘導されていることが確認された（図２）。これにより、ＩＬ−３３の投与で抗原特異的抗体産生能（液性免疫）がより増強されたことが確認された。また、ＩｇＧ２ａについてもＣＴＢ（１μｇ）とほぼ同程度に誘導することが確認された（図２）。これにより、ＩＬ−３３は細胞性免疫についても増強効果があることが示唆された。 As a result of the above, when IL-33 (1 μg) was used as an adjuvant for mucosal vaccine, both HA-specific IgG 1 and IgG 2a were more induced than the single administration of influenza HA protein antigen (1 μg). It was confirmed that In particular, it was confirmed that IgG 1 was induced more than when CTB (5 μg) was used as an adjuvant (FIG. 2). Thereby, it was confirmed that administration of IL-33 further enhanced the antigen-specific antibody producing ability (humoral immunity). In addition, it was confirmed that IgG 2a was induced to almost the same extent as CTB (1 μg) (FIG. 2). This suggested that IL-33 also has an enhancing effect on cellular immunity.
（実施例３）
実施例１と同手法によりマウスに経鼻免疫したときの、全身の粘膜面での抗ＨＡタンパク質ＩｇＡ抗体を測定した。最初の経鼻免疫後６週目に、唾液、膣洗浄液および糞便抽出液を採取し、ＩｇＡ抗体量を測定した。
(Example 3)
Anti-HA protein IgA antibody was measured on the mucosal surface of the whole body when mice were immunized intranasally by the same method as in Example 1. Six weeks after the first nasal immunization, saliva, vaginal lavage fluid and fecal extract were collected and the IgA antibody level was measured.
唾液、膣洗浄液および糞便抽出液は、以下の方法により回収し、調製した。
１）唾液の回収法；ピロカルピン塩酸塩（和光特級）をＰＢＳに溶解して終濃度０．２、ｇ／ｍＬとなるように調製した。BALB/cマウスにピロカルピン塩酸塩を１ｍＬ／マウスで腹腔内投与を行い、唾液を回収した。
２）膣洗浄液の調製法；マウス膣腔内を１００μＬのＰＢＳで洗浄後、４℃にて１４０００ｒｐｍで２０分間遠心操処理し、上清を回収して膣洗浄液を調製した。
３）糞便抽出液の調製法；糞便に１００ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳを加え、４℃で２ 時間激しく攪拌した。得られた懸濁液を４℃にて１４０００ｒｐｍで２０分間遠心処理し、上清を回収して糞便抽出液を調製した。
Saliva, vaginal lavage fluid and fecal extract were collected and prepared by the following method.
1) Saliva collection method: Pilocarpine hydrochloride (Wako Special Grade) was dissolved in PBS to prepare a final concentration of 0.2, g / mL. Pilocarpine hydrochloride was intraperitoneally administered to BALB / c mice at 1 mL / mouse, and saliva was collected.
2) Preparation method of vaginal washing solution: The inside of the mouse vaginal cavity was washed with 100 μL of PBS, centrifuged at 14,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected to prepare a vaginal washing solution.
3) Preparation method of stool extract: PBS was added to stool so as to be 100 mg / mL, and the mixture was vigorously stirred at 4 ° C. for 2 hours. The obtained suspension was centrifuged at 14,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected to prepare a fecal extract.
ＩｇＡ抗体量は実施例１と同手法によりＥＬＩＳＡの系で測定した。ＨＲＰ標識ＩｇＧ抗体（ＳＢＡ）の代わりに、ビオチン標識ＩｇＡ抗体(Southern Biotech社)を用いた。また、試料および抗体についてインキュベーションは、各々３７℃で２時間行った。 The amount of IgA antibody was measured by ELISA in the same manner as in Example 1. Instead of HRP-labeled IgG antibody (SBA), biotin-labeled IgA antibody (Southern Biotech) was used. In addition, the sample and the antibody were each incubated at 37 ° C. for 2 hours.
上記の結果、ＩＬ−３３（１μｇ）を粘膜ワクチン用アジュバントとした場合は、インフルエンザＨＡタンパク質抗原（１μｇ）の単独投与に比べて、各粘膜面でＩｇＡが、より誘導されていることが確認された（図３）。このことから、抗原およびＩＬ−３３を経鼻投与した場合でも、全身の粘膜面でＩｇＡが誘導されていることが認められた。 As a result, when IL-33 (1 μg) was used as an adjuvant for mucosal vaccines, it was confirmed that IgA was more induced on each mucosal surface compared to single administration of influenza HA protein antigen (1 μg). (FIG. 3). From this, it was confirmed that IgA was induced on the mucosal surface of the whole body even when the antigen and IL-33 were administered nasally.
以上詳述したように、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、経粘膜感染病原体由来抗原に対して、ＩｇＧ、ならびに各アイソタイプであるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体を効率よく誘導することが確認された。ＩｇＧ２ａ抗体を効率よく誘導することから、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、液性免疫のみならず、細胞性免疫も増強しうることが示唆された。さらに、in vivoの系において、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントおよび抗原を経鼻的に投与したところ、唾液、膣洗浄液および糞便抽出液中に効率的にＩｇＡを産生されることが確認された。このことからＩＬ−３３を経鼻的に投与した場合でも、口腔、膣、腸粘膜等の全身粘膜面において抗原特異的ＩｇＡが分泌され、ＩＬ−３３は優れた粘膜ワクチン用アジュバントといえる。さらに、ＩＬ−３３はサイトカインの一種であるため、副作用の少ない粘膜ワクチン用アジュバントといえる。 As described above in detail, mucosal vaccine adjuvant of the present invention is to provide transmucosal infectious pathogen-derived antigens, IgG, and to induce IgG 1 and IgG 2a antibodies efficiently is each isotype was confirmed. Since the IgG 2a antibody was efficiently induced, it was suggested that the adjuvant for mucosal vaccine of the present invention can enhance not only humoral immunity but also cellular immunity. Furthermore, when the mucosal vaccine adjuvant and antigen of the present invention were administered intranasally in an in vivo system, it was confirmed that IgA was efficiently produced in saliva, vaginal lavage fluid, and fecal extract. Therefore, even when IL-33 is administered nasally, antigen-specific IgA is secreted on the whole body mucosa such as the oral cavity, vagina and intestinal mucosa, and IL-33 can be said to be an excellent mucosal vaccine adjuvant. Furthermore, since IL-33 is a kind of cytokine, it can be said to be an adjuvant for mucosal vaccines with few side effects.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、経粘膜感染する病原体に対するワクチンとともに投与したときに、粘膜ＩｇＡの誘導が期待でき、有効と考えられる。また、Ｔｈ１タイプの免疫応答（ＩＦＮγ産生、ＩｇＧ２ａ産生）が誘導できていることから、細胞性免疫（ＣＴＬ）が誘導されていると考えられ、ＩｇＡ等の抗体誘導だけでは防ぐことの出来ないと考えられているＨＩＶ感染等にも有効性が期待される。 The adjuvant for mucosal vaccines of the present invention can be expected to induce mucosal IgA when administered together with vaccines against pathogens that transmucosally infect, and is considered effective. In addition, since Th1 type immune responses (IFNγ production, IgG 2a production) can be induced, it is considered that cellular immunity (CTL) is induced and cannot be prevented only by induction of antibodies such as IgA. Effectiveness is also expected for HIV infection, which is considered to be.
最近では、抗原の種類により、現行の皮下注射ワクチンよりも気道の粘膜経由で投与されるワクチンのほうが有効且つ安全であるともいわれている。本発明の粘膜免疫用アジュバントを粘膜ワクチン用補助剤として粘膜ワクチンとともに用いるか、または粘膜ワクチンと本発明の粘膜ワクチン用アジュバントを含む粘膜ワクチン製剤を用いることにより、より効果的に免疫能を増強することができる。 Recently, depending on the type of antigen, it is said that a vaccine administered via the mucous membrane of the airway is more effective and safer than the current subcutaneous injection vaccine. By using the mucosal immunity adjuvant of the present invention together with the mucosal vaccine as an auxiliary agent for the mucosal vaccine, or by using a mucosal vaccine preparation containing the mucosal vaccine and the adjuvant for mucosal vaccine of the present invention, the immunity is enhanced more effectively. be able to.
粘膜ワクチンは、注射などによらず、経鼻投与や経口投与が可能であるので、注射器等の医療器具を用いることなく投与することができ、経済的である。さらには侵襲的方法によらずに投与可能であることから、投与される者にとっても負担が軽いものである。本発明の粘膜ワクチン用アジュバントを用いることにより、粘膜ワクチンの投与の可能性が拡大し、有用である。 The mucosal vaccine can be administered nasally or orally regardless of injection or the like, and thus can be administered without using a medical device such as a syringe and is economical. Furthermore, since it can be administered without depending on an invasive method, the burden on the administered person is light. By using the adjuvant for mucosal vaccine of the present invention, the possibility of administration of mucosal vaccine is expanded and useful.
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