JP5539236B2 - Fig4遺伝子変異を利用する方法 - Google Patents
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Description
本願は、2008年3月6日出願の米国仮特許出願第61/034,296号の優先権を主張するものであり、その全体の内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は国立衛生研究所の研究助成金GM24872号による政府の補助を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は神経学的疾患、特にFIG4遺伝子における変異に関係する。また、本発明はバリアントFIG4対立遺伝子を検出するためのアッセイ法、およびALSなどの疾患状態に伴うFIG4遺伝子多型および変異を検出するためのアッセイ法も提供する。
筋萎縮性側索硬化症(ALS、時にルー・ゲーリック病と呼ばれる)は、中枢神経系の神経細胞であり随意筋の動きを制御する運動ニューロンの変性により引き起こされる、進行性の、通常致死的な神経変性疾患である。運動ニューロン疾患のうちの1つは、上位および下位の両方の運動ニューロンが変性および死に、その結果筋肉への情報伝達が止まることにより体中に筋力低下および萎縮を引き起こす障害である。機能することができず、筋肉は次第に衰弱し、脱神経による線維束性収縮(攣縮)を発症し、ついには脱神経に起因する萎縮症を発症する。患者は最終的に、目を除く全ての随意運動を開始および制御する彼らの能力を喪失する。
[本発明1001]
被験者からの生物試料中のバリアントFIG4遺伝子の存在を検出する段階を含む、被験者の筋萎縮性側索硬化症を診断するための方法であって、該バリアントFIG4遺伝子がFIG4機能の喪失をもたらす、方法。
[本発明1002]
バリアントFIG4遺伝子がFIG4の切り詰めをもたらす、本発明1001の方法。
[本発明1003]
バリアントFIG4遺伝子が、早期停止コドンを生じる変異を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
バリアントFIG4遺伝子が、スプライシングの欠陥を生じる変異を含む、本発明1002の方法。
[本発明1005]
バリアントFIG4遺伝子が、c.547C>T、c.1207C>T、c.67-1G>T、c.1386+5G>T、c.157G>T、c.143A>G、1162A>G、c.1231A>G、c.1940T>G、c.272C>A、およびc.2705T>Cからなる群より選択される、本発明1002の方法。
[本発明1006]
被験者からの生物試料において、c.547C>T、c.1207C>T、c.67-1G>T、c.1386+5G>T、c.157G>T、c.143A>G、1162A>G、c.1231A>G、c.1940T>G、c.272C>A、およびc.2705T>Cからなる群より選択されるバリアントFIG4遺伝子の有無を検出する段階を含む、被験者のバリアントFIG4遺伝子を検出するための方法。
[本発明1007]
上記検出を用いて被験者における神経学的疾患の危険性を評価する、本発明1006の方法。
[本発明1008]
神経学的疾患がALSである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
バリアントFIG4遺伝子がFIG4切り詰め型変異体をコードする、本発明1006の方法。
[本発明1010]
前記変異がホモ接合性変異である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記変異がヘテロ接合性変異である、本発明1009の方法。
[本発明1012]
バリアントFIG4遺伝子が、R183X、I411V、Q403X、D48G、D53Y、R388G、I411V、Y647C、T34K、I902T、スプライシング変化、欠失、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸変化をコードする、本発明1006の方法。
[本発明1013]
生物試料が、血液試料、組織試料、尿試料、DNA試料、および羊水試料からなる群より選択される、本発明1006の方法。
[本発明1014]
被験者が、胚、胎児、新生仔動物、および若年動物からなる群より選択される、本発明1006の方法。
[本発明1015]
動物がヒトである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
バリアントFIG4遺伝子の存在の検出が、核酸検出アッセイ法の実施を含む、本発明1006の方法。
[本発明1017]
バリアントFIG4遺伝子の存在の検出が、ポリペプチド検出アッセイ法を含む、本発明1006の方法。
[本発明1018]
以下の段階を含む方法:
(a) ALSの症状を示す動物を試験化合物と接触させる段階であって、該動物が、c.547C>T、c.1207C>T、c.67-1G>T、c.1386+5G>T、c.157G>T、c.143A>G、1162A>G、c.1231A>G、c.1940T>G、c.272C>A、およびc.2705T>Cからなる群より選択されるバリアントFIG4遺伝子を有する、段階;ならびに
(b) 該試験化合物の非存在下と比較し、該試験化合物の存在下での症状低下の有無を判定する段階。
[本発明1019]
前記動物が非ヒト哺乳動物である、本発明1018の方法。
発明の理解を助けるために、用語の定義を以下に挙げる。
本発明は神経学的疾患、特にFIG4遺伝子における変異に関係する。また、本発明はバリアントFIG4対立遺伝子を検出するためのアッセイ法、およびALSなどの疾患状態に伴うFIG4遺伝子多型および変異を検出するためのアッセイ法も提供する。
一部の態様において、本発明はFIG4のバリアント対立遺伝子の有無に基づき、ALSまたは関連する状態を診断する方法を提供する。
以下に記述するように、本発明の一部の態様が進展する間に実施された実験の結果、ALSに関連するバリアントFIG4対立遺伝子が同定された。従って、一部の態様において、本発明は疾患状態と関連するFIG4変異対立遺伝子を提供する。一部の態様において、機能喪失を引き起こす、FIG4における任意の変異が検出される。一部の態様において、この変異は、切り詰めを引き起こす(例えば、停止コドン、スプライシングバリアント等)。他の態様において、変異は、タンパク質フォールディング、mRNA、またはタンパク質輸送、または翻訳後修飾を含む問題を引き起こす。例えば、一部の態様では、FIG4変異対立遺伝子は、エクソン6におけるR183X(c.547C>T)、エクソン11におけるI411T(c.1231A>G)、エクソン11におけるQ403X(c.1207C>T)、イントロン1におけるスプライス部位バリアント(c.67-1G>T)、エクソン12におけるスプライス部位バリアント(c.1386+5G/T)、エクソン2におけるD53Y(c.157G>T)、エクソン2におけるD48G(c.143A>G)、エクソン11におけるR388G(c.1162A>G)、エクソン11におけるI411V(c.1231A>G)、エクソン17におけるY647C(c.1940T>G)、T34K(c.272C>A)、およびエクソン23におけるI902T(c.2705T>C)をコードする対立遺伝子を含むが、それらに限定されない(表2および3、ならびに図1参照)。一部の態様において、患者はFIG4においてヘテロ接合性変異を有する(例えば複合ヘテロ接合体)。一部の態様において、患者ではFIG4タンパク質の切り詰めを引き起こす任意のFIG4の変異が見られ、それはホモ接合状態またはヘテロ接合状態で存在する。
一部の態様において、本発明はFIG4核酸またはポリペプチドの野生型またはバリアント(例えば変異体または多型)の存在を検出する方法を提供する。FIG4変異体の検出は疾患(例えばALS)の診断に利用できる。
FIG4核酸またはポリペプチドを含むいかなる患者試料も、本発明の方法に従い検査することができる。非限定的な例を挙げると、試料は組織、血液、尿、精液、あるいはその分画(例えば血漿、血清、唾液、毛髪)などである。
本発明のFIG4バリアントは、当業者の間で知られる多様な核酸検出技法を使い、ゲノムDNAまたはmRNAとして検出することができる。検出技法としては、核酸配列決定、核酸ハイブリダイゼーション、核酸増幅などがあるが、それらに限定されない。
これらに限定されない核酸配列決定技法の例として、チェーンターミネーター配列決定法(Sanger法)とダイターミネーター配列決定法があるが、ただしそれらに限定されない。当業者の間で認識されるように、RNAの方が細胞中で安定性が低く、ヌクレアーゼにより切断されやすいため、実験上、RNAは通常、配列決定の前にDNAに逆転写される。
説明に役立つ非限定的な核酸ハイブリダイゼーション技法例としては、in situハイブリダイゼーション法(ISH)、マイクロアレイ法、サザンまたはノーザンブロット法があるが、それらに限定されない。in situハイブリダイゼーション法(ISH)は、標識した相補的DNAまたはRNA鎖をプローブとして使い、組織(in situ)の一部または断片、あるいは組織が十分小さい場合は、組織全体(ホールマウントISH)の特異的DNAまたはRNA配列の位置を決定する。DNA ISHは染色体の構造決定に使用できる。RNA ISHは組織断片またはホールマウント内でmRNAその他の転写物の量を測定し、位置を決定するために使われる。標的転写物を固定し、プローブとの接触の可能性を改善するために、試料細胞は処理される。温度を上げてプローブと標的配列の間でハイブリッドを形成させ、残ったプローブを洗浄して除去する。放射標識塩基、蛍光標識塩基、抗体標識塩基のいずれかで標識したプローブに関し、それぞれオートラジオグラフィー法、蛍光顕微鏡法、免疫組織化学法を使い、組織中の位置を決定し、定量化する。ISHでは複数のプローブを使い、それらを放射能活性または非放射性標識で標識し、複数の転写物を同時に検出することもできる。
一部の態様では、FIG4核酸配列の検出のために、マイクロアレイ法を使う。マイクロアレイ法の例としては、DNAマイクロアレイ法(例えばcDNAマイクロアレイ法やオリゴヌクレオチド・マイクロアレイ法)、タンパク質マイクロアレイ法、組織マイクロアレイ法、形質移入または細胞マイクロアレイ法、化合物マイクロアレイ法、抗体マイクロアレイ法などがあるが、それらに限定されない。遺伝子チップ、DNAチップ、またはビオチップと通称されるDNAマイクロアレイは、固体表面(例えばガラス、プラスチック、シリコンチップ)に付着した微視的DNAスポットの集合でアレイを形成したもので、同時に数千個の遺伝子の発現プロファイル決定つまり発現レベルのモニタリングを行うことを目的とする。付着したDNAセグメントはプローブと呼ばれ、1つのDNAマイクロアレイで数千のプローブを使用できる。マイクロアレイ法は、疾患細胞と正常細胞の遺伝子発現を比較し、疾患遺伝子を同定するために利用できる。マイクロアレイには多様な作製方法があり、それにはスライドガラスに先が尖ったピンでプリントする方法、事前に作製したマスクを使うフォトリソグラフィ法、可動式マイクロミラーデバイスを使うフォトリソグラフィ法、インクジェットプリント、微小電極アレイでの電気化学的方法などが含まれるが、それらに限定されない。
検出の前または検出と同時に、FIG4核酸を増幅することができる。説明に役立つ非限定的な核酸増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)、転写介在増幅法(TMA)、リガーゼ連鎖反応法(LCR)、鎖置換増幅法(SDA)、核酸配列ベース増幅法(NASBA)などがあるが、それらに限定されない。当業者の間では、特定の増幅法(例えばPCR)で、増幅に先立ちRNAをDNAに逆転写する必要がある(例えばRT-PCR)のに対し、他の増幅法では、RNAを直接増幅する(例えばTMAとNASBA)ことが認識されている。
未増幅または増幅後のFIG4核酸は、従来の手法で検出できる。例えば、核酸は検出を可能にするために標識したプローブとハイブリッドを形成させ、その結果生じたハイブリッドを測定することにより、検出できる。検出方法の説明に役立つ非限定的な例を以下に掲げる。
他の態様において、バリアントFIG4ポリペプチドが検出される(例えば実施例1で説明するものを含むが、それに限定されない)。以下に記述するものを含め、ただしそれらに限定せず、切り詰められたFIG4ポリペプチドまたは変異を起こしたFIG4ポリペプチドを検出するために、何らかの適切な方法を使うことができる。
本発明は、ある個体が野生型またはバリアント(例えば変異または多型)のFIG4を持つか否かを決定するためのキットも提供する。一部の態様において、キットは被験者におけるALS発症の危険性の有無を決定するために役立つ。診断キットは多様な方法で作製される。一部の態様において、キットは変異FIG4対立遺伝子またはタンパク質を特異的に検出するために有用であるか、必要であるか、十分である最低1種の試薬を含む。好ましい態様において、キットはFIG4ポリペプチドにおける切り詰めを検出するための試薬を含む。好ましい態様において、試薬は変異を含む核酸との間でハイブリッドを形成し、変異を含まない核酸とは結合しない核酸である。他の好ましい態様において、試薬は変異を含むDNAの領域を増幅するためのプライマーである。さらに他の態様において、試薬は野生型、切り詰め型、バリアントのいずれかのFIG4タンパク質と優先的に結合する抗体である。
例えば、一部の態様において、検出アッセイ法により得た生データ(例えばある種のFIG4対立遺伝子またはポリペプチドの有無あるいは量)を、医師のための適中率データに読み換えるために、コンピュータによる分析プログラムを使用する。医師は適切な手段により、適中率データにアクセスすることができる。従って、一部の好ましい態様において、本発明は遺伝学や分子生物学の訓練を受けていない医師が、生データを理解する必要がないという、さらなる利点を提供する。データは最も役立つ形式で、医師に対して直接提示される。その後、医師は直ちにその情報を利用し、患者の治療を最適化することができる。
本発明は単離した抗体または抗体断片(例えばFAB断片)を提供する。抗体はFIG4タンパク質の検出を可能にするために作製される。抗体は種々の免疫原を使い作製できる。ある態様において、免疫原はヒトFIG4ペプチドであり、ヒトFIG4タンパク質を認識する抗体が作られる。そのような抗体には、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fab断片、Fab発現ライブラリー、組み換え(例えばキメラ、ヒト化など)抗体が含まれるが、タンパク質を認識できる限りにおいて、それらに限定されない。従来の抗体または抗血清作製方法に従い、本発明のタンパク質を抗原として使い、抗体を作製することができる。
本発明はFIG4タンパク質の発現、産生、機能を変える遺伝子治療に適した方法と組成物も提供する。前述のように、本発明はヒトFIG4遺伝子を提供し、他の種からFIG4遺伝子を獲得する方法を提供する。従って、以下に記述する方法は、一般に多数の種にまたがり適用可能である。一部の態様は、被験者にFIG4の野生型対立遺伝子(すなわち、FIG4疾患を起こす変異を含まない対立遺伝子)を提供することにより、遺伝子治療を行うことに関するものである。そのような治療を必要とする被験者は、前述の方法により特定される。
本発明では、外来性FIG4遺伝子およびその相同体、変異体、バリアントを含む遺伝子導入動物の作製を意図する。好ましい態様において、遺伝子導入動物は野生型動物と比較し、変化した表現型を示す。一部の態様において、変化した表現型では、野生型でのFIG4発現レベルと比較し、FIG4遺伝子のmRNAの過剰発現が見られる。他の態様においては、変化した表現型で、野生型での内在性FIG4発現レベルと比較し、内在性FIG4遺伝子のmRNAの発現が低下する。一部の好ましい態様において、遺伝子導入動物はFIG4の変異(例えば切り詰め)対立遺伝子を含む。そのような表現型の有無を分析する方法としては、ノーザンブロット法、mRNA保護アッセイ法、RT-PCR法などがある。他の態様において、遺伝子導入マウスはFIG4遺伝子のノックアウト変異を持つ。好ましい態様において、遺伝子導入動物はALS病の表現型を示す。
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および側面を実証し、さらに明確に説明するために提供するものであり、それにより本発明の範囲が限定されると解釈しないものとする。
A. 方法
ALS患者
全ての患者は、ヨーロッパ人祖先の患者であった。発病年齢は、SALS患者は53±15歳(平均±SD、n=79)(中央値54歳)、FALS患者は55±15歳(中央値55歳)(n=62)であった。罹病期間は、SALS患者では4.8±4年、およびFALS患者では3.4±3.2年であった。男女比は、SALS患者では2:1、およびFALS患者では1:1.3であった。疾患発症部位は、SALS患者では23%が延髄、43%が上肢、28%が下肢、および7%が複数部位であり、FALS患者では27%が延髄、31%が上肢、37%が下肢、および5%が複数部位であった。
神経学的に正常な、対照としての192個体からのゲノムDNAを、コリエル研究所から入手した(パネル NDPT006およびNDPT009、それぞれ96点の試料)。個人的にも家族歴にも神経学的疾患が存在しない、60歳より年齢が上の111の対照の集合が、以前に記載されている。ALS患者の配偶者は、92の対照を提供した。重複する神経学的に正常な対照としてのさらなる163人の個体はコリエルから入手した;これらは上記のコリエルパネルと重複していなかった。
FIG4のコード配列およびスプライス部位における病原性変異について患者をスクリーニングするために、FIG4の23のエクソンをゲノムDNAから増幅した。11のエクソンを、全ての患者において直接的に配列決定した(エクソン2、7、8、9、10、17、18、19、20、21、および23)。残った12のエクソンを、まずCSGE (conformation sensitive gel electrophoresis)により試験した。CSGEゲル上で異常な移動度を有する産物を、次に配列決定した。第2の部位の変異を同定するために、表1の、3人の患者からの全てのFIG4のエクソンを配列決定した。全てのFIG4のエクソンは、188人の対照としての個体から配列決定した。
ALSにおけるFIG4の役割を評価するために、88の孤発例、109の家族性症例、および500を上回る民族的に一致した対照をスクリーニングした。FIG4の23のエクソンを、ゲノムDNAから増幅し、ヘテロ二本鎖分析および直接配列決定の組み合わせにより試験した。FIG4遺伝子における多型SNPに関連する観察された対立遺伝子頻度を表1に示す。
全ての患者および対照は、ヨーロッパ民族であった。SALS、散発性ALS;FALS、家族性ALS。対照の頻度、試験した対照DNA試料の数で割ったヘテロ接合性の個体の数。配列クロマトグラムについては、図1を参照。
FIG4の役割を評価するために、364の孤発例および109の家族性症例を含む473人の患者からのDNAをスクリーニングした。全ての患者および対照は、ヨーロッパ人祖先の患者および対照であった。SALS症例は、National Institute of Neurological Disorders and StrokeのパネルNDPT025(長期のALS生存者)、NDPT026(延髄での発症)、およびNDPT029(上肢での発症)(Web Resources参照)からの個体、ならびに、53±15歳で発症し(平均±SD)、罹病期間が4.8±4年、男女比が2:1である、Massachusetts General Hospitalからの92人のSALS患者を含んだ。疾患発症部位は23%が延髄、43%が上肢、28%が下肢、および7%が複数部位であった。FALS患者は55±15歳で発症し(中央値55歳)、罹病期間が3.4±3.2年であり、男女比は1:1.3であった。FALS患者は以前にSOD1における変異について試験され、彼らの疾患発症部位は、27%が延髄、31%が上肢、37%が下肢、および5%が複数部位であった。
PolyPhenスコアは以下の通り:1、良性;2、害のある可能性あり;3、ほぼ確実に害がある。SIFTスコアは以下の通り:1、許容的;2、タンパク質構造に影響。10のバリアントのうち最初の5つおよびR388Gは病原性である可能性が高い。「n.a.」は該当無し(ミスセンスではない)を示す。これらの患者の臨床的な記述については、表S1 SALS、プレート1p1. FALS、プレート1p2を参照。
Claims (14)
- 被験者からの生物試料中のバリアントFIG4遺伝子の有無を検出するためのプローブで、被験者からの生物試料をアッセイする段階を含む、被験者の筋萎縮性側索硬化症(ALS)の存在の決定を補助する方法であって、
該プローブはc.547C>T、c.1207C>Tおよびc.67-1G>Tからなる群より選択された変異を含むバリアントFIG4遺伝子を検出することができ、
該バリアントFIG4遺伝子がFIG4機能の喪失をもたらし、そして、
該バリアントFIG4遺伝子の存在が、ALSの存在を示す、
前記方法。 - 被験者からの生物試料において、c.1207C>Tおよびc.67-1G>Tからなる群より選択されるバリアントFIG4遺伝子の有無を検出する段階を含む、被験者のバリアントFIG4遺伝子を検出するための方法。
- 上記検出を用いて被験者における神経学的疾患の危険性を評価する、請求項2記載の方法。
- 神経学的疾患が筋萎縮性側索硬化症(ALS)である、請求項3記載の方法。
- バリアントFIG4遺伝子がFIG4切り詰め型変異体をコードする、請求項2記載の方法。
- 前記変異がホモ接合性変異である、請求項5記載の方法。
- 前記変異がヘテロ接合性変異である、請求項5記載の方法。
- バリアントFIG4遺伝子が、Q403X、スプライシング変化、欠失、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸変化をコードする、請求項2記載の方法。
- 生物試料が、血液試料、組織試料、尿試料、DNA試料、および羊水試料からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
- 被験者が、胚、胎児、新生仔動物、および若年動物からなる群より選択される、請求項2記載の方法。
- 動物がヒトである、請求項10記載の方法。
- バリアントFIG4遺伝子の存在の検出が、核酸検出アッセイ法の実施を含む、請求項2記載の方法。
- バリアントFIG4遺伝子の存在の検出が、ポリペプチド検出アッセイ法を含む、請求項2記載の方法。
- 被験者からの生物試料中のバリアントFIG4遺伝子の有無を検出するためのプローブで、被験者からの生物試料をアッセイする段階を含む、被験者の筋萎縮性側索硬化症(ALS)の危険性を評価するための方法であって、
該プローブはc.547C>T、c.1207C>T及びc.67-1G>Tからなる群より選択された変異を含むバリアントFIG4遺伝子を検出することができ、
該バリアントFIG4遺伝子がFIG4機能の喪失をもたらし、そして、
該バリアントFIG4遺伝子の存在が、ALSの危険性を示す、
前記方法。
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