JP5537876B2 - Evaluation method of thyroid disease by anti-pendrin antibody - Google Patents
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本発明は、抗ペンドリン抗体による甲状腺疾患の評価方法に関する。具体的には、本発明は、対象由来のサンプルにおける抗ペンドリン抗体の有無を測定して、抗ペンドリン抗体が存在する場合には対象が自己免疫性甲状腺疾患を有すると評価する方法に関する。 The present invention relates to a method for evaluating thyroid disease using an anti-pendrin antibody. Specifically, the present invention relates to a method for measuring the presence or absence of an anti-pendrin antibody in a subject-derived sample and evaluating that the subject has autoimmune thyroid disease when the anti-pendrin antibody is present.
グレーブス病（バセドウ病とも称される）および橋本甲状腺炎（橋本病とも称される）は、最も一般的な甲状腺の自己免疫疾患である。これらの疾患は、甲状腺において特異的または主として発現される自己抗原（膜タンパク質、分泌蛋白質など）に対する自己抗体が産生され、当該自己抗体によって自己の臓器、すなわち甲状腺が攻撃されることを特徴とする。これまでに存在が確認されている甲状腺の自己抗原は、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、サイログロブリン（ＴＧ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レセプター、ナトリウムヨード共輸送体（ＮＩＳ）である。 Graves 'disease (also called Graves' disease) and Hashimoto's thyroiditis (also called Hashimoto's disease) are the most common thyroid autoimmune diseases. These diseases are characterized in that autoantibodies against autoantigens (membrane proteins, secreted proteins, etc.) that are specifically or mainly expressed in the thyroid gland are produced, and that self-antibodies attack the internal organs, that is, the thyroid gland. . The thyroid autoantigens that have been confirmed so far are thyroid peroxidase (TPO), thyroglobulin (TG), thyroid stimulating hormone (TSH) receptor, and sodium iodine symporter (NIS).
ＴＧのような抗原は血中に分泌され、免疫細胞と容易に接触する。従って当該抗原レベルの上昇は、甲状腺炎またはがんにおいて見られるような、甲状腺濾胞損傷の有用な指標であり、抗ＴＧ抗体は甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎、炎症性甲状腺炎の有用な指標である。他の甲状腺抗原、例えばＴＰＯは甲状腺の濾胞内膜において発現する膜貫通タンパク質であり、循環系の免疫細胞に容易に接触することができない。しかし、組織損傷が生じたとき、当該抗原は免疫系によって速やかに認識されるため、抗ＴＰＯ抗体もまた、自己免疫性甲状腺炎、炎症性甲状腺炎の有用な指標である。現在、グレーブス病の診断のために、抗ＴＨＳレセプター抗体が使用され、橋本甲状腺炎の診断のために、抗ＴＰＯ抗体または抗ＴＧ抗体が使用されている。例えば、橋本甲状腺炎を有する患者群において約８０％が抗ＴＰＯ抗体または抗ＴＧ抗体陽性であるため、現在これらの抗体の測定を組合せて橋本甲状腺炎を診断している。 Antigens such as TG are secreted into the blood and easily come into contact with immune cells. Therefore, the increase in the antigen level is a useful indicator of thyroid follicular damage as seen in thyroiditis or cancer, and anti-TG antibody is a useful indicator of thyroiditis, autoimmune thyroiditis, inflammatory thyroiditis. It is. Other thyroid antigens, such as TPO, are transmembrane proteins expressed in the inner follicular membrane of the thyroid gland and cannot easily contact circulatory immune cells. However, when tissue damage occurs, the antigen is quickly recognized by the immune system, so anti-TPO antibodies are also useful indicators of autoimmune thyroiditis and inflammatory thyroiditis. Currently, anti-THS receptor antibodies are used for the diagnosis of Graves' disease, and anti-TPO antibodies or anti-TG antibodies are used for the diagnosis of Hashimoto's thyroiditis. For example, about 80% of patients with Hashimoto's thyroiditis are positive for anti-TPO antibody or anti-TG antibody, and thus Hashimoto's thyroiditis is currently diagnosed by combining these antibodies.
しかしながら、自己免疫性ではなく炎症性の甲状腺疾患、例えば無痛性甲状腺炎または亜急性甲状腺炎を有する患者においても、抗ＴＰＯ抗体または抗ＴＧ抗体が陽性を示すことがあり（無痛性甲状腺炎（回復期を含む）では８０％程度、亜急性甲状腺炎では２０〜３０％が陽性）、また臨床的所見も自己免疫性甲状腺疾患と共通するところが多い。したがって、患者の甲状腺疾患が自己免疫性甲状腺疾患であるのか、炎症性甲状腺疾患であるのかを、既存の抗体によっては、確度よく鑑別することができなかった。 However, even in patients with inflammatory thyroid diseases rather than autoimmunity, such as indolent thyroiditis or subacute thyroiditis, anti-TPO antibodies or anti-TG antibodies may be positive (painless thyroiditis (recovery). (Including stage), about 80% is positive, and 20-30% is positive in subacute thyroiditis), and clinical findings are often in common with autoimmune thyroid disease. Therefore, it has not been possible to accurately distinguish whether a patient's thyroid disease is an autoimmune thyroid disease or an inflammatory thyroid disease, depending on existing antibodies.
一方、ペンドリンは、甲状腺、内耳、子宮、胎盤、肺、腎臓に存在が確認されている、ヨード輸送蛋白である。甲状腺など限られた臓器に発現していることから、臓器特異的自己免疫疾患の抗原として認識されることが知られており、例えばグレーブス病患者の８４％、橋本甲状腺炎患者の９８％にペンドリンに対する自己抗体が存在する（非特許文献１）。 On the other hand, pendrin is an iodotransport protein that has been confirmed to exist in the thyroid, inner ear, uterus, placenta, lung, and kidney. It is known to be recognized as an antigen for organ-specific autoimmune diseases because it is expressed in limited organs such as the thyroid gland. For example, 84% of Graves' disease patients and 98% of Hashimoto's thyroiditis patients have pendrin. There exists an autoantibody against (Non-patent Document 1).
本発明は、甲状腺疾患が自己免疫性であるか、炎症性であるかを確度よく鑑別することができる方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method capable of accurately distinguishing whether a thyroid disease is autoimmune or inflammatory.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究の結果、驚くべきことに、抗ペンドリン抗体が炎症性甲状腺患者においてほぼ陰性であるという知見を得て、かかる知見に基づき、対象サンプル中の抗ペンドリン抗体の有無によって甲状腺疾患を評価する方法を得た。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have surprisingly obtained the knowledge that anti-pendrin antibodies are almost negative in inflammatory thyroid patients, and based on such knowledge, A method for evaluating thyroid diseases by the presence or absence of anti-pendrin antibodies was obtained.
従って本発明は、対象における甲状腺疾患を評価する方法であって、対象由来のサンプル中の抗ペンドリン抗体の有無を測定して、対象由来のサンプル中に抗ペンドリン抗体が存在するとき対象が自己免疫性甲状腺疾患を有すると評価することを含む方法を提供する。 Accordingly, the present invention is a method for evaluating thyroid disease in a subject, wherein the presence or absence of an anti-pendrin antibody in a sample derived from the subject is measured, and the subject is autoimmune when the anti-pendrin antibody is present in the sample derived from the subject. A method comprising assessing having a thyroid disease is provided.
甲状腺疾患のバイオマーカーとして利用されている抗ＴＰＯ抗体または抗ＴＧ抗体が自己免疫性甲状腺疾患患者群と炎症性甲状腺疾患患者群のいずれにも測定され得るにも拘わらず、抗ペンドリン抗体はほぼ自己免疫性甲状腺疾患患者群においてのみ測定され、炎症性甲状腺疾患患者群および健常人群において測定されない。従って本発明によって、甲状腺疾患を有する患者の甲状腺疾患が自己免疫性であるか、炎症性であるかを確度よく、しかも他の抗体測定と組み合わせる必要なく、鑑別することができる。 Although anti-TPO antibody or anti-TG antibody used as a biomarker for thyroid disease can be measured in both autoimmune thyroid disease patient group and inflammatory thyroid disease patient group, anti-pendrin antibody is almost self It is measured only in the immune thyroid disease patient group, and is not measured in the inflammatory thyroid disease patient group and the healthy subject group. Therefore, according to the present invention, it is possible to accurately distinguish whether a thyroid disease of a patient having a thyroid disease is autoimmune or inflammatory without being combined with other antibody measurements.
患者の甲状腺疾患が炎症性であるか、自己免疫性であるかを鑑別することによって、例えば患者の診断を正確に行うことができ、したがって患者に適切な処置を行うことができる。 By distinguishing whether a patient's thyroid disease is inflammatory or autoimmune, for example, the patient can be diagnosed accurately and thus appropriate treatment can be performed on the patient.
第１の態様において本発明は、対象における甲状腺疾患を評価する方法であって、対象由来のサンプル中の抗ペンドリン抗体の有無を測定して、対象由来のサンプル中に抗ペンドリン抗体が存在するとき甲状腺疾患が自己免疫性甲状腺疾患であると評価することを含む方法に関する。 In a first aspect, the present invention is a method for evaluating thyroid disease in a subject, wherein the presence or absence of an anti-pendrin antibody in a sample derived from the subject is measured and the anti-pendrin antibody is present in the sample derived from the subject. It relates to a method comprising assessing that the thyroid disease is an autoimmune thyroid disease.
さらなる態様において本発明の方法は、抗ペンドリン抗体と免疫特異的に結合し得る物質、例えばペンドリンまたはそのフラグメントもしくは変異体と対象由来のサンプルとを接触させることを含む。抗ペンドリン抗体と免疫特異的に結合し得る物質には、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸分子、それらの糖誘導体などが含まれるが、これらに限定されない。抗ペンドリン抗体と免疫特異的に結合し得る物質は、当該技術分野において周知の方法によって、例えば放射性同位元素によって標識化されていてもよい。 In a further aspect, the methods of the invention comprise contacting a sample from a subject with a substance capable of immunospecifically binding to an anti-pendrin antibody, such as pendrin or a fragment or variant thereof. Substances that can immunospecifically bind to anti-pendrin antibodies include, but are not limited to, nucleic acids such as proteins, DNA or RNA, sugar derivatives thereof, and the like. The substance capable of immunospecifically binding to the anti-pendrin antibody may be labeled by a method well known in the art, for example, with a radioisotope.
あるいは、抗ペンドリン抗体と免疫特異的に結合し得る物質と特異的に結合し得る標識化した物質、例えばフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒトＩｇＧまたはビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧのような標識化した２次抗体を用いて、対象由来のサンプル中の抗ペンドリン抗体を可視化してもよい。かかる標識化した物質、特に標識化した２次抗体は、当該技術分野において周知である。 Alternatively, a labeled substance that can specifically bind to a substance that can immunospecifically bind to an anti-pendrin antibody, such as a labeled secondary such as a fluorescein isothiocyanate-conjugated goat anti-human IgG or a biotinylated goat anti-human IgG. The antibody may be used to visualize anti-pendrin antibodies in a sample from the subject. Such labeled substances, particularly labeled secondary antibodies, are well known in the art.
標識化する標識剤としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３Ｈ等の放射性同位元素、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光物質、化学発光物質などが含まれるが、これらに限定されない。 Examples of the labeling agent to be labeled include, but are not limited to, radioisotopes such as 125 I, 131 I, 35 S, 32 P, 3 H, fluorescent substances such as fluorescein or rhodamine, chemiluminescent substances, and the like. .
本発明において、対象は、哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、サル、ラット、マウス、ウサギなどを含むが、これらに限定されない。特に好ましい対象は、ヒトである。特に典型的な本発明の対象は、甲状腺疾患を有するか、あるいはそれを有する疑いのある対象である。 In the present invention, the subject includes, but is not limited to, mammals such as dogs, cats, horses, sheep, goats, cows, pigs, monkeys, rats, mice, rabbits and the like. A particularly preferred subject is a human. A particularly typical subject of the present invention is a subject who has or is suspected of having a thyroid disease.
本発明において、対象由来のサンプルは、対象の細胞、細胞培養物、唾液、尿、便、涙液、皮膚、粘膜、血液、血漿、血清などを含むが、これらに限定されない。抗ペンドリン抗体は主に血液中に存在するため、特に好ましいサンプルは血液、血漿または血清、最も好ましくは血清である。これらのサンプルの採取および調製方法は当該技術分野において周知である。採取した血液サンプルは、必要により前処理するか、またはＰＢＳなどで希釈した後、本発明の方法に供してもよい。 In the present invention, the sample derived from the subject includes, but is not limited to, the subject's cells, cell culture, saliva, urine, stool, tears, skin, mucous membrane, blood, plasma, serum and the like. Particularly preferred samples are blood, plasma or serum, most preferably serum, since anti-pendrin antibodies are mainly present in the blood. Methods for collecting and preparing these samples are well known in the art. The collected blood sample may be pretreated if necessary or diluted with PBS or the like and then subjected to the method of the present invention.
本発明において、対象由来のサンプル中の抗ペンドリン抗体の有無を測定するための手段は、抗ペンドリン抗体との免疫特異的結合を利用したアッセイによって測定することができる。例えば、使用することができる手段には、競合および非競合アッセイ系、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素抗体法、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル内沈降反応、凝集アッセイ、補体捕捉アッセイ、免疫放射アッセイ、蛍光イムノアッセイ、および標識化抗体でのＦＡＣＳ分析が含まれるが、これらに限定されない。これらのアッセイは当業者に既知である（例えば、抗体の実験技術ＩおよびＩＩ、廣川書店参照、その全体を参照により本明細書の一部とする）。 In the present invention, the means for measuring the presence or absence of an anti-pendrin antibody in a sample derived from a subject can be measured by an assay utilizing immunospecific binding with an anti-pendrin antibody. For example, means that can be used include competitive and non-competitive assay systems, Western blots, radioimmunoassays, enzyme antibody methods, ELISA (enzyme immunoassay), sandwich ELISA, immunoprecipitation, precipitation reactions, intragel precipitation reactions, This includes but is not limited to agglutination assays, complement capture assays, immunoradiation assays, fluorescent immunoassays, and FACS analysis with labeled antibodies. These assays are known to those skilled in the art (see, eg, Experimental Techniques I and II for antibodies, see Yodogawa Shoten, hereby incorporated by reference in its entirety).
好ましくは、ウェスタンブロット法は、例えばペンドリンまたはそのフラグメントを過剰発現させた細胞、例えばＣＯＳ−７細胞、大腸菌細胞、ＨＥＫ細胞など、好ましくはＣＯＳ−７細胞から抽出した膜タンパク質、または合成、純化したペンドリンをゲル上で電気泳動し、ゲルからメンブレンに写し、対象由来のサンプル、例えば血清と接触させ、標識化２次抗体と共にインキュベートした後、標識の有無を測定することによって、実施することができる。典型的には、例えば本明細書の実施例に記載のとおりにウェスタンブロット法を実施することができる。 Preferably, Western blotting is a membrane protein extracted from, for example, COS-7 cells, eg, COS-7 cells, E. coli cells, HEK cells, etc., preferably overexpressed pendrin or a fragment thereof, or synthesized, purified Pendrin can be electrophoresed on a gel, transferred from the gel to a membrane, contacted with a sample of interest, such as serum, incubated with a labeled secondary antibody, and then measured for the presence or absence of the label . Typically, Western blotting can be performed, for example, as described in the Examples herein.
あるいは別の好ましい測定手段として、標識化抗体を用いた蛍光イムノアッセイまたはＦＡＣＳ分析を実施することができる。標識化抗体を用いた蛍光イムノアッセイまたはＦＡＣＳ分析は、例えばペンドリンまたはそのフラグメントをトランスフェクトした細胞、例えばＣＯＳ−７細胞、大腸菌細胞、ＨＥＫ細胞など、好ましくはＣＯＳ−７細胞または対照細胞を固定し、対照由来のサンプル、例えばヒト由来の血清とインキュベートし、さらに蛍光標識化２次抗体、例えばフルオレセインイソチオシアネート結合ヤギ抗ヒトＩｇＧとインキュベートして、蛍光顕微鏡またはフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いてペンドリンを検出することによって実施することができる。 Alternatively, as another preferable measurement means, fluorescent immunoassay or FACS analysis using a labeled antibody can be performed. Fluorescent immunoassay or FACS analysis using labeled antibodies can be performed, for example, by fixing cells transfected with pendrin or fragments thereof, such as COS-7 cells, E. coli cells, HEK cells, preferably COS-7 cells or control cells, Incubate with a control-derived sample, such as human serum, and further with a fluorescently labeled secondary antibody, such as fluorescein isothiocyanate-conjugated goat anti-human IgG, and use pendrin with a fluorescence microscope or flow cytometer (FACS). It can be implemented by detecting.
特に好ましい対象由来のサンプル中の抗ペンドリン抗体の有無を測定するための手段は、ウェスタンブロット法である。ウェスタンブロット法によると、バンドの位置によってその蛋白の全長各部位に対する抗体であることが確認でき、抗体の非特異的な結合や、断片に対する結合などを区別することができるため、より正確に対象由来のサンプル中の抗ペンドリン抗体の有無を測定することができる。 A particularly preferred means for measuring the presence or absence of anti-pendrin antibodies in a sample from a subject is Western blotting. According to Western blotting, the position of the band can be confirmed to be an antibody against each full-length site of the protein, and nonspecific binding of antibodies and binding to fragments can be distinguished, so the target can be more accurately identified. The presence or absence of the anti-pendrin antibody in the sample derived from it can be measured.
かかる対象由来のサンプル中の抗ペンドリン抗体の有無の測定によって、対象が自己免疫性甲状腺疾患を有するか否かを評価することができる。対象由来のサンプル中に抗ペンドリン抗体が測定される場合、当該対象は自己免疫性甲状腺疾患を有する可能性があり、逆に抗ペンドリン抗体が測定されない場合、当該対象は自己免疫性でない、すなわち炎症性甲状腺疾患もしくは他の疾患を有するか、または疾患を有さないと評価することができる。 Whether or not a subject has autoimmune thyroid disease can be evaluated by measuring the presence or absence of anti-pendrin antibodies in a sample derived from the subject. If anti-pendrin antibody is measured in a sample from the subject, the subject may have autoimmune thyroid disease, and conversely, if anti-pendrin antibody is not measured, the subject is not autoimmune, i.e. inflammation It can be assessed as having or without a thyroid thyroid disease or other disease.
従って、好ましい態様において、本発明は、対象における甲状腺疾患を評価する方法であって、対象由来の血清中の抗ペンドリン抗体の有無を測定して、対象由来の血清中に抗ペンドリン抗体が存在するとき甲状腺疾患が自己免疫性甲状腺疾患であると評価することを含む方法に関する。 Accordingly, in a preferred embodiment, the present invention is a method for evaluating thyroid disease in a subject, wherein the presence or absence of an anti-pendrin antibody in the serum from the subject is present, and the anti-pendrin antibody is present in the subject-derived serum. Sometimes relates to a method comprising assessing that the thyroid disease is an autoimmune thyroid disease.
より好ましい態様において、本発明は、ヒト対象における甲状腺疾患を評価する方法であって、ペンドリンまたはそのフラグメントを過剰発現させたＣＯＳ−７細胞から抽出した膜タンパク質を用いたウェスタンブロット法によってヒト血清中の抗ペンドリン抗体の有無を測定して、ヒト血清中に抗ペンドリン抗体が存在するとき甲状腺疾患が自己免疫性甲状腺疾患であると評価することを含む方法に関する。 In a more preferred embodiment, the present invention is a method for assessing thyroid disease in a human subject, wherein the protein is detected in human serum by Western blotting using a membrane protein extracted from COS-7 cells overexpressing pendrin or a fragment thereof. The present invention relates to a method comprising measuring the presence or absence of an anti-pendrin antibody and evaluating that the thyroid disease is an autoimmune thyroid disease when the anti-pendrin antibody is present in human serum.
本明細書において、フラグメントは、親化合物の一部であって、親化合物と同等の性質、例えば同じ抗原−抗体結合能を発揮し得る化合物を意味する。例えばペンドリンのフラグメントとは、本明細書において使用するとき、ペンドリン化合物の分子構造の一部であって、抗ペンドリン抗体との結合能を有する化合物を意味する。 As used herein, a fragment means a compound that is a part of a parent compound and can exhibit the same properties as the parent compound, for example, the same antigen-antibody binding ability. For example, a pendrin fragment, as used herein, means a compound that is part of the molecular structure of a pendrin compound and has the ability to bind to an anti-pendrin antibody.
別の態様において、本発明は、ペンドリンまたはそのフラグメントを含有する甲状腺疾患の評価用組成物であって、対象由来のサンプルと当該組成物を接触させて抗ペンドリン抗体の有無を測定したとき、抗ペンドリン抗体の存在が自己免疫性甲状腺疾患の指標となることを特徴とする組成物を提供する。 In another aspect, the present invention provides a composition for evaluating thyroid disease containing pendrine or a fragment thereof, wherein when the presence or absence of an anti-pendrin antibody is measured by contacting a sample from a subject with the composition. Provided is a composition characterized in that the presence of a pendrin antibody is an indicator of autoimmune thyroid disease.
好ましい態様において、上記本発明の組成物は、少なくとも１種の担体物質を含んでいてもよい。担体物質は、液体であっても固体であってもよく、例えば水、エタノールのようなアルコール、紙、綿などの天然もしくは合成繊維、ポリマー、例えば、ポリエステル、ポリエーテル、ポリオレフィン、ポリアルキレンオキシド、ポリアミド、ポリウレタン、多糖類、セルロースおよびポリイソプレンなど、またはこれらの２種以上の組合せを含むが、これらに限定されない。典型的には、担体物質は、界面活性剤、例えば水溶性界面活性剤、特に両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤、例えば卵黄リゾレシチン、Ｔｗｅｅｎ（Ｔｗｅｅｎ２０、４０、６０、８０、８５など；ナカライテスク社）、Ｓｐａｎ（Ｓｐａｎ２０、８０、８５、８０など；ナカライテスク社）、Ｂｒｉｊ（Ｂｒｉｊ３５、５８など；ナカライテスク社）、（ｎ）ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＣＦ−１０、Ｎ−１０１、Ｘ−１００、Ｘ−１１４、Ｘ−３０５、Ｘ−４０５、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０など；ナカライテスク社）等の水溶液である。
In a preferred embodiment, the composition of the present invention may contain at least one carrier material. The carrier material may be liquid or solid, for example water, alcohols such as ethanol, natural or synthetic fibers such as paper, cotton, polymers such as polyesters, polyethers, polyolefins, polyalkylene oxides, Including, but not limited to, polyamides, polyurethanes, polysaccharides, cellulose and polyisoprene, or combinations of two or more thereof. Typically, the carrier material is a surfactant, such as a water-soluble surfactant, particularly an amphoteric surfactant or a nonionic surfactant, such as egg yolk lysolecithin, Tween (
さらに、本発明の組成物は、増量剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、抗菌剤などの添加剤を含んでいてもよい。また、本発明の組成物は、上記界面活性剤の水溶液である洗浄液と当該組成物を本発明の方法に使用するための指示書と共に、本発明の方法に使用し得るキットを構成してもよい。 Furthermore, the composition of the present invention may contain additives such as extenders, solubilizers, stabilizers, pH adjusters, buffers, preservatives, antioxidants and antibacterial agents. Further, the composition of the present invention may constitute a kit that can be used in the method of the present invention together with a cleaning solution that is an aqueous solution of the surfactant and instructions for using the composition in the method of the present invention. Good.
当該組成物を対象由来のサンプルと接触させて、抗ペンドリン抗体の有無を測定することによって、対象が自己免疫性甲状腺疾患を有するか否かを評価することができる。 Whether or not the subject has autoimmune thyroid disease can be evaluated by contacting the composition with a sample derived from the subject and measuring the presence or absence of an anti-pendrin antibody.
以下に本発明の実施例を開示するが、実施例は本発明を説明するためにのみ存在し、本発明の範囲を如何なる意味においても限定しない。 Examples of the present invention will be disclosed below, but the examples are provided only for illustrating the present invention and do not limit the scope of the present invention in any way.
ウェスタンブロット
グレーブス病を有する患者１００人、橋本甲状腺炎を有する患者４０人、無痛性甲状腺炎を有する患者４０人、亜急性甲状腺炎を有する患者４０人および正常人４０人から血液を採取して、血清を得た。次いで、ＣＯＳ−７細胞にペンドリンを過剰発現したのち、ＲＩＰＡバッファー（１×ＰＢＳ、１％ Nonidet P-40、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ）で抽出し得られたタンパク質を７．５％ポリアクリルアミドで泳動する。泳動したゲルよりペンドリンをニトロセルロース膜にブロットする。次いで、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリエチレンソルビタンモノラウレート（ＴＢＳ−Ｔ）と５％無脂肪乾燥乳を補ったＴｒｉｓ緩衝化食塩水（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で患者血清と、ペンドリンをブロットした膜を２時間インキュベートしたのち、洗浄する。ビオチニル化２次抗体、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体（１：５，０００希釈）とインキュベートし、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓで発光させたバンドを測定する。
測定結果を濃度分析によって評価し、１：５００に希釈したウサギ抗ペンドリン血清を対照として用いて同様に測定した抗ペンドリン抗体の濃度を１００％として、各測定濃度を百分率で求める。
Blood was collected from 100 patients with Western blot Graves disease, 40 patients with Hashimoto's thyroiditis, 40 patients with indolent thyroiditis, 40 patients with subacute thyroiditis and 40 normal persons, Serum was obtained. Next, after overexpressing pendrin in COS-7 cells, the protein obtained by extraction with RIPA buffer (1 × PBS, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS) Is run on 7.5% polyacrylamide. Pendrine is blotted onto a nitrocellulose membrane from the gel that has been run. Then in Tris-buffered saline (10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl) supplemented with 0.1% (vol / vol) polyethylene sorbitan monolaurate (TBS-T) and 5% non-fat dry milk. Incubate the patient serum and the membrane blotted with pendrin for 2 hours and then wash. Incubate with biotinylated secondary antibody followed by streptavidin-HRP complex (1: 5,000 dilution) and measure the bands emitted with ECL-Plus.
The measurement results are evaluated by concentration analysis, and the concentration of each anti-pendrin antibody measured in the same manner using rabbit anti-pendrin serum diluted 1: 500 as a control is taken as 100%, and each measured concentration is determined in percentage.
結果を図１および図２に示す。
図１は、各疾患のウエスタンブロット法による抗ペンドリン抗体測定の結果の典型例を示す。グレーブス病では陽性例、陰性例ともに存在する。橋本病では実施した中で１例のみ陰性でほぼ全例陽性であった。無痛性甲状腺炎回復期および亜急性甲状腺炎では全例陰性であった。
図２は、１：５００に希釈したウサギ抗ペンドリン血清を対照（１００％）として用い、各疾患の血清を用いて得られたバンド濃度と、対照血清により得られたバンド濃度とを比較して定量化した数値を抗体力価としてグラフに示した。グレーブス病では。陽性率は８４％である。橋本病では陽性率は９８％である。正常人、無痛性甲状腺炎回復期および亜急性甲状腺炎では全例陰性であった。
The results are shown in FIG. 1 and FIG.
FIG. 1 shows a typical example of the results of anti-pendrin antibody measurement by Western blotting for each disease. There are both positive and negative cases in Graves' disease. In Hashimoto's disease, only one case was negative and almost all cases were positive. All patients were negative in the indolent thyroiditis recovery phase and subacute thyroiditis.
FIG. 2 shows a comparison of the band concentration obtained with the serum of each disease and the band concentration obtained with the control serum using rabbit anti-pendrin serum diluted 1: 500 as a control (100%). The quantified numerical value was shown in the graph as antibody titer. In Graves' disease. The positive rate is 84%. In Hashimoto's disease, the positive rate is 98%. All subjects were negative in the normal, indolent thyroiditis recovery phase, and subacute thyroiditis.
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