JP5525776B2 - FISH cell image analysis method, FISH cell image analysis system, and FISH cell image analysis apparatus - Google Patents
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Description
本発明は、蛍光物質等で標識したヌクレオチドプローブを目的とする遺伝子とハイプリダイゼーションさせ、蛍光顕微鏡等で検出する「ＦＩＳＨ法」を用いた、細胞診断や分子細胞遺伝学研究などに用いるＦＩＳＨ細胞画像解析方法、ＦＩＳＨ細胞画像解析システム及びＦＩＳＨ細胞画像解析装置に関する。 The present invention relates to FISH cells used for cell diagnosis, molecular cytogenetic studies, etc., using the “FISH method” in which a nucleotide probe labeled with a fluorescent substance or the like is hybridized with a target gene and detected with a fluorescence microscope or the like. The present invention relates to an image analysis method, a FISH cell image analysis system, and a FISH cell image analysis apparatus.
従来、ＦＩＳＨ法を用いた癌の細胞診断や分子細胞遺伝学研究等の分野では、例えば、次の非特許文献１に記載の、自動化された蛍光顕微鏡をベースにした細胞画像取得装置や、特許文献１に記載の装置等を用いて、二次元細胞画像を取得し、その二次元細胞画像を元に目的の蛍光スポットの発光を画像処理にて検出し、その細胞に特定の遺伝子配列が含まれているか否かの判定や、染色体異常の検出が行われている。 Conventionally, in the fields of cancer cell diagnosis and molecular cytogenetics research using the FISH method, for example, a cell image acquisition device based on an automated fluorescence microscope described in Non-Patent Document 1 below, Using the device described in Document 1, obtain a two-dimensional cell image, detect the emission of the target fluorescent spot based on the two-dimensional cell image by image processing, and the cell contains a specific gene sequence And whether or not a chromosomal abnormality is detected.
例えば、細胞核内の染色体上において、癌関連遺伝子の遺伝的異常があるか否かを判定するために、細胞核全体をＤＡＰＩで染色し、続いて、コントロールとなるプローブを例えば、ＦＩＴＣで標識し、目的部位とハイブリダイズするプローブをＴｅｘａｓ Ｒｅｄ等で標識する。次いで、細胞内でハイブリダイズさせ、自動化された蛍光顕微鏡をベースにした、例えば、非特許文献１に記載の細胞画像取得装置などで、ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄそれぞれのチャネルに適した励起光を照射し、各々の励起光によって得られたカラーチャネル毎の蛍光画像を二次元細胞画像として取得し、その画像を元に目的とする蛍光スポットの発光を検出および測定し、その細胞に染色体異常が含まれているか否かを判定する。 For example, in order to determine whether or not there is a genetic abnormality of a cancer-related gene on a chromosome in the cell nucleus, the entire cell nucleus is stained with DAPI, and then a control probe is labeled with, for example, FITC, A probe that hybridizes to the target site is labeled with Texas Red or the like. Next, excitation light suitable for each channel of DAPI, FITC, and Texas Red is obtained using, for example, a cell image acquisition device described in Non-Patent Document 1 based on an automated fluorescence microscope that is hybridized in a cell. Irradiate and acquire a fluorescence image of each color channel obtained by each excitation light as a two-dimensional cell image, detect and measure the emission of the target fluorescent spot based on the image, and the cell has a chromosomal abnormality It is determined whether or not it is included.
しかしながら、従来の二次元細胞画像を用いたＦＩＳＨ法での細胞画像の解析には、次の(1)〜(4)に示すような問題があった。 However, analysis of cell images by the FISH method using conventional two-dimensional cell images has the following problems (1) to (4).
(1)細胞の三次元構造に伴う問題
三次元構造を有する細胞核内では、目的とする染色体自体が三次元的に配置されている。一般に、顕微鏡などの蛍光観察光学系を有する細胞画像取得装置では、焦点面での蛍光は明るく観察・撮像ができるが、焦点面から外れた蛍光は暗く、もしくは取得できないことが多い。しかるに、非特許文献１や特許文献１に記載の従来の細胞画像取得装置において撮像された二次元細胞画像は、三次元構造の細胞における一つのＺ位置での面に焦点を合わせて撮像した画像であり、その面には蛍光スポットが存在していない（即ち、蛍光スポットは焦点面から外れたＺ位置に存在する）場合がある。そのような場合、撮像された画二次元細胞画像には、上述のように取得すべき蛍光が非常に暗く、もしくは全く取得できない事態が発生し、その結果、コントロール及び目的部位が画像解析出来ず、目的部位が発現しているにもかかわらず、発現していない細胞として判断され、遺伝子配列等の判定について正しい判定を下すことができない。
(1) Problems associated with the three-dimensional structure of cells In a cell nucleus having a three-dimensional structure, the target chromosome itself is arranged three-dimensionally. In general, in a cell image acquisition apparatus having a fluorescence observation optical system such as a microscope, fluorescence at the focal plane can be observed and imaged brightly, but fluorescence off the focal plane is often dark or cannot be acquired. However, the two-dimensional cell image captured by the conventional cell image acquisition device described in Non-Patent Document 1 or Patent Document 1 is an image captured by focusing on a plane at one Z position in a cell having a three-dimensional structure. In some cases, the fluorescent spot does not exist on the surface (that is, the fluorescent spot exists at the Z position out of the focal plane). In such a case, the captured two-dimensional cell image has a situation where the fluorescence to be acquired is very dark or cannot be acquired as described above, and as a result, the control and the target site cannot be image-analyzed. Although the target site is expressed, it is determined as a cell that is not expressed, and a correct determination cannot be made regarding the determination of the gene sequence and the like.
(2)細胞の外側に存在するゴミ等による悪影響
また、細胞の外側で、かつ非常に近隣に蛍光を発してしまうゴミなどが存在する場合、目的部位の蛍光スポットとゴミとが重なり合った状態で撮像され、目的部位の発現なのかゴミなのかの判定が非常に困難になる。
(2) Adverse effects of dust on the outside of the cell.If there is dust on the outside of the cell and in the vicinity of the fluorescent light, the fluorescent spot at the target site and the dust are overlapped. It is very difficult to determine whether the target site is manifested or garbage.
(3)蛍光スポットがＺ方向に重なっている場合の問題
また、細胞核内で同一蛍光色の蛍光スポットがＺ方向に重なり合っている場合、スポットが実際には二つ存在するにもかかわらず、画像上では一つとして認識されてしまい、正しい結果を得られない。
(3) Problems when fluorescent spots overlap in the Z direction In addition, when fluorescent spots of the same fluorescent color overlap in the Z direction in the cell nucleus, the image is displayed even though there are actually two spots. It is recognized as one in the above, and the correct result cannot be obtained.
(4)蛍光波長の漏れこみによる悪影響
また、一般に、短波長側の蛍光が長波長側の蛍光に漏れこみを起すことがある。例えば、コントロールとなるプローブを緑色の蛍光を発するＦＩＴＣ等で染色し、目的部位とハイブリダイズするプローブを赤色の蛍光を発するＴｅｘａｓ Ｒｅｄで染色したとする。蛍光波長は、ＦＩＴＣ（５２０ｎｍ）の方がＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（６２０ｎｍ）よりも短波長である。また、このとき、コントロールの蛍光スポットが二つ光るものが正常細胞と定義し、コントロールの蛍光スポット二つと赤色の蛍光スポット二つの両方が光る細胞ががん細胞等の異常な細胞であると定義するものとする。その場合において、ＦＩＴＣ用の励起光を照射したときにＦＩＴＣの蛍光がＴｅｘａｓ Ｒｅｄに漏れこみ、本来はＴｅｘａｓ Ｒｅｄの励起波長のみで蛍光を発するはずのスポットが発光してしまうことが起こりうる。このような蛍光波長の漏れこみが生ずると、コントロールの蛍光スポットが四つ光っているように誤認識され、異常な細胞としてカウントから排除されてしまう。
(4) Adverse effects due to leakage of fluorescence wavelength In general, fluorescence on the short wavelength side may leak into fluorescence on the long wavelength side. For example, it is assumed that a probe serving as a control is stained with FITC that emits green fluorescence, and a probe that hybridizes with a target site is stained with Texas Red that emits red fluorescence. The fluorescence wavelength of FITC (520 nm) is shorter than that of Texas Red (620 nm). Also, at this time, a cell that emits two control fluorescent spots is defined as a normal cell, and a cell that emits both control fluorescent spots and two red fluorescent spots is defined as an abnormal cell such as a cancer cell. It shall be. In that case, when the excitation light for FITC is irradiated, the fluorescence of FITC leaks into Texas Red, and a spot that should originally emit fluorescence only with the excitation wavelength of Texas Red may be emitted. When such a leakage of the fluorescence wavelength occurs, it is erroneously recognized as if the four control fluorescent spots are shining, and is excluded from the count as an abnormal cell.
本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、細胞核内における蛍光スポットの三次元的な配置に影響されることなく、細胞外のゴミ等による発光と誤認識することなく、さらには蛍光波長の漏れこみ等にも影響されることなく、目的とする蛍光スポットを正確に検出することが可能なＦＩＳＨ細胞画像解析方法、ＦＩＳＨ細胞画像解析システム及びＦＩＳＨ細胞画像解析装置を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of such a conventional problem, and is misrecognized as light emission by extracellular dust or the like without being affected by the three-dimensional arrangement of fluorescent spots in the cell nucleus. And a FISH cell image analysis method, a FISH cell image analysis system, and a FISH cell image analysis apparatus capable of accurately detecting a target fluorescent spot without being affected by leakage of the fluorescence wavelength. It is intended to provide.
上記目的を達成するため、本発明によるＦＩＳＨ細胞画像解析方法は、ＦＩＳＨ法を用いた細胞画像解析方法であって、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子とを含有する複数の細胞が容器に播種された状態にするステップ、蛍光観察光学系を備えた細胞画像撮像装置を用いて、前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手するステップ、前記入手した画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築するステップ、前記三次元に構築した細胞区画の区画内と区画外を識別するステップ、前記三次元に構築し、認識した細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識するステップ、前記認識した第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定するステップ、前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止するステップを有し、前記長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止するステップは、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することにより行うことを特徴としている。 To achieve the above object, a FISH cell image analysis method according to the present invention is a cell image analysis method using the FISH method, which comprises a first fluorescent reporter molecule that reports on a predetermined cell compartment, a desired first A step of placing a plurality of cells containing a second fluorescent reporter molecule that reports on a gene sequence and a third fluorescent reporter molecule that reports on a desired second gene sequence in a container, fluorescence observation optics Using a cell imaging device equipped with a system, a plurality of cells are imaged with different Z coordinates on the same XY coordinates on the plurality of cells, and fluorescence signals from the respective fluorescent reporter molecules are automatically obtained. Obtaining as an image, constructing the cell compartment as a three-dimensional cell compartment using the obtained image, constructing in the three-dimensional A step of discriminating between the inside and outside of the cell compartment, a fluorescence signal from the second fluorescent reporter molecule, which is constructed in the three-dimensional and recognized within the compartment of the recognized cell compartment, from the third fluorescent reporter molecule Each of the fluorescence signals from the recognized second fluorescent reporter molecule and the recognized fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule are characterized by at least intensity and magnitude. The step of measuring the number of fluorescent or light emitting regions, to the fluorescent reporter molecule on the long wavelength side of the fluorescence emitted by the fluorescent reporter molecule on the short wavelength side of the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule The step of detecting leakage of light and preventing erroneous recognition that it is fluorescence emission of the long wavelength side, and the emission of fluorescence of the long wavelength side The step of preventing misrecognition of being present is by determining whether the XYZ coordinate positions of the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule are in the same position. It is characterized by performing.
また、本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析方法においては、前記測定した第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示するステップを有するのが好ましい。 Further, in the FISH cell image analysis method of the present invention, the conditions defined in advance using the characteristic quantities of the fluorescent signal from the second fluorescent reporter molecule and the fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule measured above. It is preferable to have a step of automatically measuring the number of cells satisfying the condition and displaying the measurement result.
また、本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析方法においては、前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手するステップは、前記蛍光観察光学系に共焦点光学系を有する前記細胞画像撮像装置を用いて行うのが好ましい。 In the FISH cell image analysis method of the present invention, the plurality of cells are imaged with a plurality of focal planes with different Z coordinates on the same XY coordinates, and fluorescence signals from the respective fluorescent reporter molecules are automatically detected. Preferably, the step of obtaining the image as an image is performed using the cell imaging device having a confocal optical system in the fluorescence observation optical system.
また、本発明によるＦＩＳＨ細胞画像解析システムは、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子を含有する複数の細胞の画像を取得する細胞画像撮像装置と、前記細胞画像撮像装置を介して取得された細胞画像を解析するコンピュータを備えた細胞画像解析装置を有する細胞画像解析システムであって、前記細胞画像撮像装置は、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を結像する蛍光観察光学系と、前記蛍光観察光学系を介して結像された細胞像を撮像する撮像素子を有し、前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手し、前記細胞画像解析装置は、前記コンピュータを、前記細胞画像撮像装置を介して入手された画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築する三次元細胞区画構築手段、前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する細胞区画識別手段、前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築され、前記細胞区画識別手段を介して認識された細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する蛍光シグナル認識手段、前記蛍光シグナル認識手段を介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定する特徴量測定手段、前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する誤認識防止手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを有し、前記誤認識防止手段は、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することを特徴としている。
In addition, the FISH cell image analysis system according to the present invention includes a first fluorescent reporter molecule that reports on a predetermined cell compartment, a second fluorescent reporter molecule that reports on a desired first gene sequence, and a desired second A cell image device comprising: a cell image capturing device that acquires images of a plurality of cells containing a third fluorescent reporter molecule that reports on a gene sequence; and a computer that analyzes the cell image acquired through the cell image capturing device. A cell image analysis system having an analysis device, wherein the cell image imaging device continuously changes a focus position with respect to a sample at a predetermined pitch in the Z direction to form an image of a sample at each focus position. An observation optical system, and an imaging element that captures a cell image formed through the fluorescence observation optical system, and the focal plane of the plurality of cells A plurality of images are taken with different Z coordinates on the same XY coordinates, and fluorescence signals from the respective fluorescent reporter molecules are automatically obtained as images, and the cell image analysis device includes the computer and the cell image imaging device. A three-dimensional cell compartment construction means for constructing the cell compartment as a three-dimensional cell compartment using the image obtained through the three-dimensional cell compartment construction means, and a cell compartment constructed in three dimensions via the three-dimensional cell compartment construction means; A cell compartment identification means for identifying outside the compartment; the second compartment constructed in three dimensions via the three-dimensional cell compartment construction means and present in the compartment of the cell compartment recognized via the cell compartment identification means; Fluorescence signal recognition means for automatically recognizing the fluorescence signal from the fluorescence reporter molecule and the fluorescence signal from the third fluorescence reporter molecule, respectively, via the fluorescence signal recognition means A feature amount for measuring at least intensity, size, fluorescence, or number of emission regions as a feature amount for each of the recognized fluorescence signal from the second fluorescent reporter molecule and the fluorescence signal from the third fluorescence reporter molecule. The measurement means detects the leakage of the fluorescence emitted from the short wavelength side fluorescent reporter molecule out of the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule into the long wavelength side fluorescent reporter molecule, Misrecognition prevention means for preventing misrecognition of fluorescence emission of wavelength side,
Have a image analysis software to function as the misrecognition preventing means, whether the second fluorescent reporter molecule, and each light-emitting to have XYZ coordinate position of the third fluorescent reporter molecule is in the same position It is characterized by determining whether or not .
また、本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析システムにおいては、前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記特徴量測定手段を介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する細胞数計測表示手段として機能させるのが好ましい。 In the FISH cell image analysis system of the present invention, the image analysis software further includes a fluorescence signal from a second fluorescent reporter molecule measured by the computer, the second fluorescence reporter molecule, and a third It is preferable to use each characteristic quantity of the fluorescent signal from the fluorescent reporter molecule to function as a cell number measurement display means for automatically measuring the number of cells that satisfy a predetermined condition and displaying the measurement result.
また、本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析システムにおいては、前記細胞画像撮像装置は、前記蛍光観察光学系に共焦点光学系を有するのが好ましい。 In the FISH cell image analysis system of the present invention, it is preferable that the cell image capturing apparatus has a confocal optical system in the fluorescence observation optical system.
また、本発明によるＦＩＳＨ細胞画像解析装置は、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を結像する蛍光観察光学系と、前記蛍光観察光学系を介して結像された細胞像を撮像する撮像素子を有し、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子を含有する複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手する細胞画像撮像装置を有する細胞画像解析システムに備わる、該細胞画像撮像装置を介して取得された細胞画像を解析するコンピュータを備えた細胞画像解析装置であって、前記コンピュータを、前記細胞画像撮像装置を介して入手された画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築する三次元細胞区画構築手段、前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する細胞区画識別手段、前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築され、前記細胞区画識別手段を介して認識された細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する蛍光シグナル認識手段、前記蛍光シグナル認識手段を介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定する特徴量測定手段、前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する誤認識防止手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを有し、前記誤認識防止手段は、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することを特徴としている。
In addition, the FISH cell image analysis apparatus according to the present invention includes a fluorescence observation optical system that continuously changes the in-focus position with respect to the sample at a predetermined pitch in the Z direction, and forms an image of the sample at each in-focus position, and the fluorescence A first fluorescent reporter molecule that has an imaging device for imaging a cell image imaged through an observation optical system and reports a predetermined cell compartment, and a second fluorescence that reports a desired first gene sequence A plurality of cells containing a reporter molecule and a third fluorescent reporter molecule that reports on a desired second gene sequence are imaged with different focal planes on the same XY coordinates with different Z coordinates, Obtained via the cell image imaging device provided in the cell image analysis system having a cell image imaging device that automatically obtains the fluorescence signal from the reporter molecule as an image A cell image analyzing apparatus comprising a computer for analyzing a cell image, wherein the computer is constructed as a three-dimensional cell section using the image obtained through the cell image capturing apparatus as a three-dimensional cell section. Cell compartment construction means, cell compartment identification means for distinguishing inside and outside of the cell compartment constructed in three dimensions via the three-dimensional cell compartment construction means, and three-dimensionally via the three-dimensional cell compartment construction means The fluorescent signal from the second fluorescent reporter molecule and the fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule, which are constructed and recognized in the compartment of the cell compartment recognized through the cell compartment identification means, are respectively automatically obtained. A fluorescent signal recognizing means for recognizing, a fluorescent signal from the second fluorescent reporter molecule recognized through the fluorescent signal recognizing means, and a third fluorescent reporter component To the fluorescent signal from, as the feature quantity of each of at least the strength, size, of the fluorescence or feature amount measuring means for measuring a number of light-emitting region, wherein the second fluorescent reporter molecule third fluorescent reporter molecules , A false recognition prevention means for detecting the leakage of the fluorescence emitted by the fluorescent reporter molecule on the short wavelength side into the fluorescent reporter molecule on the long wavelength side to prevent erroneous recognition that the fluorescence is emitted from the long wavelength side,
Have a image analysis software to function as the misrecognition preventing means, whether the second fluorescent reporter molecule, and each light-emitting to have XYZ coordinate position of the third fluorescent reporter molecule is in the same position It is characterized by determining whether or not .
また、本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析装置においては、前記画像解析ソフトウェアは、前記コンピュータを、さらに、前記特徴量測定手段を介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する細胞数計測表示手段として機能させるのが好ましい。 In the FISH cell image analysis apparatus of the present invention, the image analysis software further includes a fluorescence signal from a second fluorescent reporter molecule measured by the computer, the second fluorescence reporter molecule, and a third It is preferable to use each characteristic quantity of the fluorescent signal from the fluorescent reporter molecule to function as a cell number measurement display means for automatically measuring the number of cells that satisfy a predetermined condition and displaying the measurement result.
本発明によれば、細胞核内における蛍光スポットの三次元的な配置に影響されることなく、細胞外のゴミ等による発光と誤認識することなく、さらには蛍光波長の漏れこみ等にも影響されることなく、目的とする蛍光スポットを正確に検出することができるＦＩＳＨ細胞画像解析方法、ＦＩＳＨ細胞画像解析システム及びＦＩＳＨ細胞画像解析装置が得られる。 According to the present invention, it is not affected by the three-dimensional arrangement of fluorescent spots in the cell nucleus, is not erroneously recognized as light emission by extracellular dust, etc., and is further affected by leakage of the fluorescence wavelength. The FISH cell image analysis method, the FISH cell image analysis system, and the FISH cell image analysis apparatus that can accurately detect the target fluorescent spot without any problem are obtained.
以下、図面に基づき、本発明の実施の形態を説明する。
図１は本発明の一実施形態にかかるＦＩＳＨ細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。図２は本実施形態のＦＩＳＨ細胞画像解析システムにおける処理手順を示すフローチャートで、(a)は細胞の標識から細胞画像の解析・出力までの全体の処理手順を示すフローチャート、(b)は細胞画像の解析及び出力処理における処理手順を示すフローチャートである。
本実施形態のＦＩＳＨ細胞画像解析システムは、細胞画像撮像装置１と細胞画像解析装置２を有する。
細胞画像撮像装置１は、例えば、コンフォーカル顕微鏡で構成されており、蛍光観察光学系１ａと、撮像素子１ｂを有する。
蛍光観察光学系１ａは、光源、照明レンズ、複数種類の励起フィルタをターレット等に備えた励起光切換手段、対物レンズ、吸収フィルタ、結像レンズ、ピンホール等、一般的なコンフォーカル蛍光顕微鏡における照明光学系及び観察光学系（図示省略）で構成され、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を撮像素子１ｂの撮像面に結像する。
撮像素子１ｂは、蛍光観察光学系１ａを介して結像された細胞像を撮像する。
そして、細胞画像撮像装置は、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子を含有する複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手する。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
FIG. 1 is a block diagram showing the overall configuration of a FISH cell image analysis system according to an embodiment of the present invention. FIG. 2 is a flowchart showing a processing procedure in the FISH cell image analysis system of this embodiment. (A) is a flowchart showing the entire processing procedure from cell labeling to cell image analysis / output. (B) is a cell image. It is a flowchart which shows the process sequence in an analysis and output process of this.
The FISH cell image analysis system of this embodiment includes a cell image imaging device 1 and a cell image analysis device 2.
The cell image imaging apparatus 1 is configured by, for example, a confocal microscope, and includes a fluorescence observation optical system 1a and an imaging element 1b.
The fluorescence observation optical system 1a is used in a general confocal fluorescence microscope such as a light source, an illumination lens, excitation light switching means including a plurality of types of excitation filters in a turret, an objective lens, an absorption filter, an imaging lens, a pinhole, and the like. It is composed of an illumination optical system and an observation optical system (not shown), and the focus position with respect to the sample is continuously changed at a predetermined pitch in the Z direction, and the image of the sample at each focus position is connected to the imaging surface of the image sensor 1b. Image.
The imaging element 1b captures a cell image formed through the fluorescence observation optical system 1a.
The cell imaging device reports a first fluorescent reporter molecule that reports on a predetermined cell compartment, a second fluorescent reporter molecule that reports on a desired first gene sequence, and a desired second gene sequence. For a plurality of cells containing the third fluorescent reporter molecule, a plurality of images are taken with different focal planes on the same XY coordinate with different Z coordinates, and fluorescence signals from the respective fluorescent reporter molecules are automatically obtained as images. .
細胞画像解析装置２は、コンピュータと、画像解析ソフトウェアを備えて構成されている。
画像解析ソフトウェアは、コンピュータを三次元細胞区画構築手段２ａ、細胞区画識別手段２ｂ、蛍光シグナル認識手段２ｃ、特徴量測定手段２ｄとして機能させ、さらには、誤認識防止手段２e、細胞数計測表示手段２ｆとして機能させるように構成されている。
三次元細胞区画構築手段２ａは、細胞画像撮像装置１を介して入手された画像を用いて細胞区画を三次元の細胞区画として構築する。
細胞区画識別手段２ｂは、三次元細胞区画構築手段２ａを介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する。
蛍光シグナル認識手段２ｃは、三次元細胞区画構築手段２ａを介して三次元に構築され、細胞区画識別手段２ｂを介して認識された細胞区画の区画内に存在する、第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する。
特徴量測定手段２ｄは、蛍光シグナル認識手段２ｃを介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定する。
誤認識防止手段２ｅは、第２の蛍光レポーター分子と第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する。
細胞数計測表示手段２ｆは、特徴量測定手段２ｄを介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する。
The cell image analysis apparatus 2 includes a computer and image analysis software.
The image analysis software causes the computer to function as a three-dimensional cell compartment construction means 2a, a cell compartment identification means 2b, a fluorescence signal recognition means 2c, and a feature quantity measurement means 2d, and further, a false recognition prevention means 2e, a cell number measurement display means It is configured to function as 2f.
The three-dimensional cell compartment construction means 2a constructs the cell compartment as a three-dimensional cell compartment using the image obtained via the cell image capturing device 1.
The cell compartment identification means 2b identifies the inside and outside of the cell compartment constructed three-dimensionally via the three-dimensional cell compartment construction means 2a.
The fluorescent signal recognition means 2c is constructed from a second fluorescent reporter molecule that is three-dimensionally constructed via the three-dimensional cell compartment construction means 2a and exists in the compartment of the cell compartment recognized via the cell compartment identification means 2b. And the fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule are automatically recognized.
The feature quantity measuring means 2d has at least intensity as a feature quantity for each of the fluorescence signal from the second fluorescent reporter molecule and the fluorescence signal from the third fluorescent reporter molecule recognized through the fluorescence signal recognition means 2c. Measure the size, the number of fluorescent or luminescent regions.
The misrecognition preventing means 2e detects the leakage of the fluorescence emitted from the fluorescent reporter molecule on the short wavelength side into the fluorescent reporter molecule on the long wavelength side among the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule. This prevents misrecognition of fluorescence emission on the long wavelength side.
The cell count display means 2f uses the characteristic quantities of the fluorescent signal from the second fluorescent reporter molecule and the fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule, which are measured via the characteristic quantity measuring means 2d, in advance. The number of cells that meet the specified conditions is automatically measured and the measurement results are displayed.
次に、このように構成された本実施形態のＦＩＳＨ細胞画像解析システムを用いた細胞の標識から画像解析・出力までの全体の処理手順について説明する。
全体の処理は、図２(a)に示すように、細胞の標識（ステップＳ１）、細胞画像撮像装置１による細胞像の撮像（ステップＳ２）、細胞画像解析装置２による細胞画像の解析（ステップＳ３）、細胞画像解析装置２による解析結果の出力（ステップＳ４）の順で行う。
Next, an overall processing procedure from cell labeling to image analysis / output using the FISH cell image analysis system of the present embodiment configured as described above will be described.
As shown in FIG. 2 (a), the entire processing includes cell labeling (step S1), cell image capturing by the cell image capturing apparatus 1 (step S2), and cell image analysis by the cell image analyzing apparatus 2 (step This is performed in the order of S3) and the output of analysis results by the cell image analyzer 2 (step S4).
標識処理段階（ステップＳ１）
標識処理段階では、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子とを含有する複数の細胞が、例えば、マルチウェルプレート、ディッシュ、スライドガラスなどの容器に播種された状態にする。
具体的には、本実施形態では、所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子としてＤＡＰＩを用いて細胞核を染色する。また、第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子として、ＦＩＴＣを用いてコントロールとなるプローブを標識する。また、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子として、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄを用いて目的部位とハイブリダイズするプローブを標識する。そして、これらのレポーター分子を含有する複数の細胞が、例えば、マルチウェルプレートに播種された状態にする。
Labeling stage (step S1)
In the labeling step, a first fluorescent reporter molecule that reports on a given cell compartment, a second fluorescent reporter molecule that reports on a desired first gene sequence, and a third that reports on a desired second gene sequence. A plurality of cells containing the fluorescent reporter molecule are seeded in a container such as a multiwell plate, a dish or a slide glass.
Specifically, in this embodiment, cell nuclei are stained using DAPI as the first fluorescent reporter molecule that reports on a given cell compartment. In addition, as a second fluorescent reporter molecule that reports on the first gene sequence, a control probe is labeled using FITC. In addition, as a third fluorescent reporter molecule that reports on the desired second gene sequence, Texas Red is used to label a probe that hybridizes with the target site. Then, a plurality of cells containing these reporter molecules are seeded in, for example, a multiwell plate.
細胞の構造１
図３はＦＩＳＨ法でハイブリダイズされた細胞核と該細胞核内の蛍光スポットの一例を模式的に示す説明図であり、(a)はＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)に示される細胞核をＺ位置がａであるＸＹ平面で撮像したときの画像を示す図、(c)は(a)に示される細胞核をＺ位置がｂであるＸＹ平面で撮像したときの画像を示す図である。図３(a)中、αは細胞核、βはＦＩＳＨ法におけるコントロールと呼ばれる蛍光スポットである。
細胞核αは、ＤＡＰＩで染色されており、３５８ｎｍを中心波長とする励起光により、４６１ｎｍを中心波長とする蛍光を発する。この蛍光により、細胞の核の形状およびその存在を確認することができる。
蛍光スポットβは、どの細胞にも存在する特定のＤＮＡ配列と相補的な配列を持つプローブを蛍光物質の一つであるＦＩＴＣで標識したものであって、ハイブリダイズが正しく行われた細胞かどうかを見分ける指標となるものであり、４９４ｎｍを中心波長とする励起光により、５２０ｎｍを中心波長とする蛍光を発する。ＦＩＳＨ法を用いた細胞の認識および判定では、コントロールである蛍光スポットβが規定数だけ正しく発光している細胞を対象とする。ここでは、コントロールである蛍光スポットβが二つ発光している細胞が、判定の対象となる細胞であるものとする。
図３の例では、二つのコントロールである蛍光スポットβは、図３(a)に示すように、Ｚ方向に離散して存在している。このように、コントロールである蛍光スポットβがＺ方向に大きく離散して存在している場合には、撮像する細胞の焦点面のＺ位置によって確認できる発光数が変化し、例えば、図３(b)や、図３(c)に示すように、Ｚ位置がａ又はｂのいずれか一方であるＸＹ平面の画像では、コントロールである蛍光スポットβを一つだけしか確認できないことが起こり得る。
Cell structure 1
FIG. 3 is an explanatory view schematically showing an example of a cell nucleus hybridized by the FISH method and a fluorescent spot in the cell nucleus, (a) is a sectional view along the Z direction, and (b) is shown in (a). The figure which shows an image when the Z position is imaged on the XY plane whose Z position is a, (c) is a figure which shows the image when the cell nucleus shown in (a) is imaged on the XY plane where the Z position is b It is. In FIG. 3 (a), α is a cell nucleus and β is a fluorescent spot called a control in the FISH method.
The cell nucleus α is stained with DAPI, and emits fluorescence having a central wavelength of 461 nm by excitation light having a central wavelength of 358 nm. This fluorescence can confirm the shape of the cell nucleus and its presence.
Fluorescent spot β is a probe in which a probe having a sequence complementary to a specific DNA sequence present in any cell is labeled with FITC, which is one of the fluorescent substances, and is a cell that has been properly hybridized. The excitation light having the center wavelength of 494 nm emits fluorescence having the center wavelength of 520 nm. In the recognition and determination of cells using the FISH method, cells in which a prescribed number of fluorescent spots β as controls are correctly emitting light are targeted. Here, it is assumed that a cell in which two fluorescent spots β serving as controls emit light is a cell to be determined.
In the example of FIG. 3, the fluorescent spots β, which are two controls, exist discretely in the Z direction as shown in FIG. In this way, when the fluorescent spot β as a control is present in a largely discrete manner in the Z direction, the number of luminescence that can be confirmed changes depending on the Z position of the focal plane of the cell to be imaged, for example, FIG. ) And as shown in FIG. 3 (c), in the XY plane image in which the Z position is either a or b, only one fluorescent spot β as a control can be confirmed.
細胞の構造２
図４はＦＩＳＨ法でハイブリダイズされたコントロールの蛍光スポットと目的部位の蛍光スポットの両方が発光している細胞核の一例を示す説明図で、(a)はＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)に示される細胞核をＺ位置がａであるＸＹ平面で撮像したときの画像を示す図である。図４(a)中、γはＦＩＳＨ法によって蛍光を発する目的部位を示す蛍光スポットである。
蛍光スポットγは、例えば、がん細胞に特異的に発現する特定のＤＮＡ配列と相補的な配列を持つプロープを蛍光物質の一つであるＴｅｘａｓ Ｒｅｄで標識したものであり、５８７ｎｍを中心波長とする励起光により、６２０ｎｍを中心波長とする蛍光を発する。ここでは、二つのコントロールである蛍光スポットβと、二つのＴｅｘａｓ Ｒｅｄにより発光する蛍光スポットγの両方が発光している細胞ががん細胞として判定されるものとする。
図４の例では、二つのコントロールである蛍光スポットβは、図４(a)に示すように、ＸＹ座標が同じでＺ方向での位置が異なって存在している。このため、図４(b)に示すＺ位置がａであるＸＹ平面の画像では、コントロールである蛍光スポットβを一つだけしか確認できない。一方、二つの目的部位を示す蛍光スポットγは、ＸＹＺ方向に離散しているため、蛍光スポットγを二つとも判別できる。
Cell structure 2
FIG. 4 is an explanatory diagram showing an example of a cell nucleus in which both a control fluorescent spot and a target fluorescent spot hybridized by the FISH method emit light, (a) is a cross-sectional view along the Z direction, (b) These are figures which show an image when the cell nucleus shown by (a) is imaged by XY plane whose Z position is a. In FIG. 4A, γ is a fluorescent spot indicating a target site that emits fluorescence by the FISH method.
The fluorescent spot γ is obtained by, for example, labeling a probe having a sequence complementary to a specific DNA sequence specifically expressed in cancer cells with one of the fluorescent substances, Texas Red, and having a central wavelength of 587 nm. Fluorescence having a central wavelength of 620 nm is emitted by the excitation light. Here, it is assumed that a cell in which both a fluorescent spot β which is two controls and a fluorescent spot γ emitted by two Texas Reds emit light is determined as a cancer cell.
In the example of FIG. 4, the fluorescent spots β that are two controls exist as shown in FIG. 4A with the same XY coordinates and different positions in the Z direction. For this reason, in the image on the XY plane where the Z position is a shown in FIG. 4B, only one fluorescent spot β as a control can be confirmed. On the other hand, since the fluorescent spots γ indicating two target sites are discrete in the XYZ directions, both fluorescent spots γ can be distinguished.
上述のように、細胞は立体構造を有し、蛍光スポットの位置もＸＹＺ方向に離散して存在することがあり、蛍光スポットがＺ方向に重なっている場合にはＸＹ平面からは重なっている一方の蛍光スポットの確認が漏れてしまうおそれがあるので、正しい細胞判定を行うためには、細胞の三次元構造を考慮に入れた解析が必要である。 As described above, the cells have a three-dimensional structure, and the positions of the fluorescent spots may exist discretely in the XYZ directions. When the fluorescent spots overlap in the Z direction, they overlap from the XY plane. Therefore, in order to make a correct cell determination, an analysis taking into consideration the three-dimensional structure of the cell is necessary.
撮像処理段階（ステップＳ２）
そこで、本発明者は、細胞を三次元で撮像し、三次元で解析する方法として本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析方法を着想するに至った。
撮像処理段階では、コンフォーカル顕微鏡で構成された細胞画像撮像装置１の蛍光観察光学系１ａが、各チャネルの蛍光ごとに、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を結像し、撮像素子１ｂが蛍光観察光学系１ａを介して結像された細胞像を撮像することにより、複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手する。
Imaging process stage (step S2)
Therefore, the present inventor has come up with the FISH cell image analysis method of the present invention as a method of imaging a cell in three dimensions and analyzing it in three dimensions.
In the imaging processing stage, the fluorescence observation optical system 1a of the cell image imaging device 1 configured with a confocal microscope continuously changes the focal position with respect to the sample at a predetermined pitch in the Z direction for each fluorescence of each channel. An image of the sample at each in-focus position is formed, and the image pickup device 1b picks up a cell image formed through the fluorescence observation optical system 1a, so that the focal plane is set on the same XY coordinates for a plurality of cells. A plurality of images are taken with different Z coordinates, and the fluorescence signal from each fluorescent reporter molecule is automatically obtained as an image.
図５はＦＩＳＨ法によってハイプリダイズされた一つの細胞核αと、その内部で発現しているコントロールである蛍光スポットβおよび目的部位の蛍光スポットγと、細胞核αの周辺に存在するコントロールである蛍光スポットβと同じ蛍光を発する異物δを示している、細胞核αのＺ方向に沿う断面図である。図５はさらに、細胞核αを含む周囲を、同じＸＹ座標上でＺ位置がａからｔまで異なる複数の焦点面で、ａからtの順番で撮像する一例を示している。蛍光撮像に際しては、共焦点光学系を用いる。共焦点光学系を用いると、一般的な結像光学系よりも、Ｚ方向の分解能を２０倍程度向上させることができ、焦点位置以外からの蛍光の影響を大幅に軽減することができるので好ましい。 FIG. 5 shows one cell nucleus α hyper-hybridized by the FISH method, a fluorescent spot β which is a control expressed in the cell nucleus, a fluorescent spot γ at a target site, and a fluorescent spot which is a control present around the cell nucleus α. It is sectional drawing which follows the Z direction of the cell nucleus (alpha) which has shown the foreign material (delta) which emits the same fluorescence as (beta). FIG. 5 further shows an example in which the periphery including the cell nucleus α is imaged in the order of a to t on a plurality of focal planes having different Z positions from a to t on the same XY coordinates. A confocal optical system is used for fluorescence imaging. Use of the confocal optical system is preferable because the resolution in the Z direction can be improved by about 20 times compared to a general imaging optical system, and the influence of fluorescence from other than the focal position can be greatly reduced. .
図６は図５に示す各Ｚ位置で撮像したＸＹ平面の画像を夫々示す説明図であり、Ｚ方向の複数の焦点面で撮像された細胞核およびその周辺の画像を示している。撮像されたaからtまでの各Ｚ位置での画像（図６では途中省略している画像がある）には、夫々、各Ｚ位置の焦点面で捉えられた各蛍光スポット（蛍光スポットβ，γ）が撮像されている。また、各Ｚ位置での画像は、細胞の各Ｚ位置での断面を示している。
本来、細胞の断面を撮像するときは、各励起光毎に光学系を切り替え、各々の蛍光色ごとに冷却ＣＣＤカメラなどで撮像する。本実施形態では、ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣ，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄの三色の蛍光を発することになるので、断面ごとに三枚ずつの画像を取得する。なお、図６においては、説明の便宜上、同じＺ位置ごとに各蛍光画像を重ね合わせて表示している。
図５及び図６に示す例では、Ｚ位置が異なるごとに、蛍光スポットが細胞核αの内部に存在することが確認できる画像と、細胞核αの外部に存在することが確認できる画像が得られている。
FIG. 6 is an explanatory diagram showing images on the XY plane taken at each Z position shown in FIG. 5, and shows cell nuclei taken at a plurality of focal planes in the Z direction and their surrounding images. The captured images at the respective Z positions from a to t (there are images that are omitted in the middle of FIG. 6) are the respective fluorescent spots (fluorescent spots β, γ) is imaged. Moreover, the image in each Z position has shown the cross section in each Z position of a cell.
Originally, when imaging a cross section of a cell, the optical system is switched for each excitation light, and imaging is performed with a cooled CCD camera or the like for each fluorescent color. In this embodiment, since fluorescence of three colors of DAPI, FITC, and Texas Red is emitted, three images are acquired for each cross section. In FIG. 6, for the convenience of explanation, the respective fluorescence images are superimposed and displayed for each same Z position.
In the example shown in FIG. 5 and FIG. 6, every time the Z position is different, an image that can confirm that the fluorescent spot exists inside the cell nucleus α and an image that can confirm that the fluorescent spot exists outside the cell nucleus α are obtained. Yes.
解析処理段階（ステップＳ３）
三次元座標上での細胞区画構築（ステップＳ３ 1 ）
解析処理段階では、まず、細胞画像解析装置２の三次元細胞区画構築手段２ａが、細胞画像撮像装置１を介して入手された画像を用いて細胞区画を三次元の細胞区画として構築する。
図７はＺ方向に異なる複数の焦点面で撮像された細胞核の画像を用いて細胞核を三次元に構築する手法の一例を示す説明図で、(a)はＺ方向に異なる複数の焦点面で撮像された細胞核の画像における隣接する部分をつなぎ合わせる状態を概念的に示す図、(b)は(a)の手法により三次元に構築された細胞核を示す図である。図7の画像は、ＤＡＰＩ用の励起フィルタおよび吸収フィルタおよびダイクロイックミラー等で構成された光学系により撮像されている。
ここで、三次元細胞区画構築手段２ａは、まず、適当な閾値を用いて、各Ｚ位置での細胞核画像の二値化を行い、このＺ位置での細胞核の特定を行う。ここでの閾値とは、ピクセルの輝度の閾値と、ピクセルの輝度の閾値で決められた輝度以上をもつピクセルの集合体の大きさ範囲（Ｍａｘ Ａｒｅａ，Ｍｉｎ Ａｒｅａ）の閾値の両方を意味する。本実施形態の細胞画像解析装置では、これらの閾値はユーザーが予め規定のＧＵＩ等から設定することができるようになっている。
三次元細胞区画構築手段２ａは、次いで、各Ｚ位置で特定された細胞核領域を用いて、Ｚ方向に隣接する二値化の結果を比較し、各Ｚ位置での画像における細胞核領域がＺ方向に連続する部分および細胞核領域が不連続となるＺ位置を判定することで、細胞核の三次元構造を構築する。この処理により、細胞核領域の内側、外側を三次元に識別でき、細胞核のＸＹＺ座標領域が決定される。
Analysis processing stage (step S3)
Construction of cell compartments on 3D coordinates (step S3 1 )
In the analysis processing stage, first, the three-dimensional cell compartment construction means 2a of the cell image analyzer 2 constructs a cell compartment as a three-dimensional cell compartment using the image obtained via the cell image imaging device 1.
FIG. 7 is an explanatory view showing an example of a method for constructing a cell nucleus three-dimensionally using images of cell nuclei captured at a plurality of focal planes different in the Z direction. FIG. 7A shows a plurality of focal planes different in the Z direction. The figure which shows notionally the state which connects the adjacent part in the imaged cell nucleus image, (b) is a figure which shows the cell nucleus constructed | assembled three-dimensionally by the method of (a). The image in FIG. 7 is captured by an optical system including a DAPI excitation filter, an absorption filter, a dichroic mirror, and the like.
Here, the three-dimensional cell compartment construction means 2a first binarizes the cell nucleus image at each Z position using an appropriate threshold, and specifies the cell nucleus at this Z position. Here, the threshold value means both the threshold value of the pixel luminance and the threshold value of the size range (Max Area, Min Area) of the pixel aggregate having the luminance determined by the pixel luminance threshold value or higher. In the cell image analysis apparatus of this embodiment, these threshold values can be set in advance by a user from a prescribed GUI or the like.
The three-dimensional cell compartment construction means 2a then compares the binarization results adjacent to each other in the Z direction using the cell nucleus regions specified at each Z position, and the cell nucleus area in the image at each Z position is the Z direction. The three-dimensional structure of the cell nucleus is constructed by determining the Z position where the continuous part and the cell nucleus region become discontinuous. By this processing, the inside and outside of the cell nucleus region can be identified in three dimensions, and the XYZ coordinate region of the cell nucleus is determined.
続いて、三次元細胞区画構築手段２ａは、コントロールである蛍光スポットおよび目的部位の蛍光スポットに対し細胞核と同様の解析を行い、三次元に構築する。図７の細胞核画像と同様に同じＺ位置で撮像された色別の蛍光スポット画像が撮像されるので、これらの画像に対しても、適当な閾値を用いて、各Ｚ位置での蛍光スポット画像の二値化を行い、このＺ位置での各蛍光スポットの特定を行う。ここでの閾値も、ピクセルの輝度の閾値と、ピクセルの輝度の閾値で決められた輝度以上をもつピクセルの集合体の大きさ範囲（Ｍａｘ Ａｒｅａ，Ｍｉｎ Ａｒｅａ）の閾値の両方を意味する。本実施形態の細胞画像解析装置では、これらの閾値もユーザーが予め規定のＧＵＩ等から設定することができるようになっている。
三次元細胞区画構築手段２ａは、次いで、各Ｚ位置で特定された各蛍光スポットの領域を用いて、Ｚ方向に隣接する二値化の結果を比較し、各Ｚ位置での画像における各蛍光スポット領域がＺ方向に連続する部分および各蛍光スポット領域が不連続となるＺ位置を判定することで、各蛍光スポットの三次元構造を構築し、夫々一個の蛍光スポットとして識別する。この処理により、コントロールである蛍光スポットおよび目的部位の蛍光スポットのＸＹＺ座標領域が決定される。
Subsequently, the three-dimensional cell compartment construction means 2a performs the same analysis on the fluorescence spot as the control and the fluorescence spot at the target site in the three-dimensional manner. Since the fluorescent spot images for each color picked up at the same Z position as in the cell nucleus image of FIG. 7 are picked up, the fluorescent spot image at each Z position is also used for these images using an appropriate threshold value. Are binarized, and each fluorescent spot at this Z position is specified. The threshold value here also means both the threshold value of the pixel luminance and the threshold value of the size range (Max Area, Min Area) of the aggregate of pixels having the luminance determined by the pixel luminance threshold or higher. In the cell image analysis apparatus of this embodiment, these threshold values can also be set in advance by a user from a prescribed GUI or the like.
The three-dimensional cell compartment construction means 2a then compares the binarization results adjacent to each other in the Z direction by using the areas of the respective fluorescent spots specified at the respective Z positions, and each fluorescence in the image at each Z position. By determining the portion where the spot area is continuous in the Z direction and the Z position where each fluorescent spot area is discontinuous, the three-dimensional structure of each fluorescent spot is constructed and each is identified as one fluorescent spot. By this processing, the XYZ coordinate areas of the fluorescent spot as a control and the fluorescent spot at the target site are determined.
細胞区画の内外の識別（ステップＳ３ 2 ）
次いで、細胞区画識別手段２ｂが、三次元細胞区画構築手段２ａを介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する。
Identification of inside and outside of cell compartment (step S3 2 )
Next, the cell compartment identification means 2b identifies the inside and outside of the cell compartment constructed in three dimensions via the three-dimensional cell compartment construction means 2a.
第２、第３の蛍光シグナルの認識（ステップＳ３ 3 ）
次いで、蛍光シグナル認識手段２ｃが、三次元細胞区画構築手段２ａを介して三次元に構築され、細胞区画識別手段２ｂを介して認識された細胞区画の区画内に存在する、第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する。例えば、細胞核と各蛍光スポットが上記二種類の画像解析により三次元に構築された後、蛍光シグナル認識手段２ｃは、各蛍光スポットが、識別された細胞核のＸＹＺ座標領域内に存在するか否かを三次元構築された細胞核画像の情報と照
らし合わせて判定する。
Recognition of second and third fluorescent signals (step S3 3 )
Next, a second fluorescent reporter in which the fluorescent signal recognition means 2c is three-dimensionally constructed via the three-dimensional cell compartment construction means 2a and is present in the compartment of the cell compartment recognized via the cell compartment identification means 2b The fluorescent signal from the molecule and the fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule are automatically recognized. For example, after the cell nucleus and each fluorescent spot are three-dimensionally constructed by the above two types of image analysis, the fluorescent signal recognition means 2c determines whether each fluorescent spot exists within the XYZ coordinate region of the identified cell nucleus. Are compared with the information of the three-dimensionally constructed cell nucleus image.
誤認識チェック（ステップＳ３ 4 ）
図８はＦＩＳＨにおける短波長側の蛍光の長波長側への漏れこみの一例を示す説明図で、(a)はＦＩＴＣの励起光でコントロールの蛍光スポットを発光させているときに、目的部位の蛍光スポットが短波長側の蛍光の漏れこみによって発光している状態を示す図、(b)はＴｅｘａｓ Ｒｅｄの励起光を照射したときに発光する目的部位の蛍光スポットを示す図である。
本来であれば、目的部位の蛍光スポットγが発光するのは、ＦＩＴＣの励起光でコントロールである蛍光スポットβの蛍光を発光させているときではなく、図８(b)に示すように、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄの励起光を照射したときである。しかし、短波長側の蛍光が、長波長側の蛍光に漏れこんで長波長側の蛍光物質が発光してしまう現象がまれに起こる。
False recognition check (step S3 4 )
FIG. 8 is an explanatory diagram showing an example of leakage of short-wavelength fluorescence into the long-wavelength side in FISH. (A) is a diagram showing the target site when a control fluorescent spot is emitted with the excitation light of FITC. The figure which shows the state which the fluorescence spot is light-emitted by the leakage of the fluorescence of the short wavelength side, (b) is a figure which shows the fluorescence spot of the target site light-emitted when irradiated with the excitation light of Texas Red.
Originally, the fluorescent spot γ at the target site emits light not when the fluorescence spot β, which is a control, is emitted by the excitation light of FITC, but as shown in FIG. 8B, Texas. This is when the red excitation light is irradiated. However, a phenomenon occurs in which the short-wavelength fluorescence leaks into the long-wavelength fluorescence and the long-wavelength fluorescent material emits light.
本実施形態の細胞画像解析装置では、このような蛍光の漏れこみによる蛍光スポットの誤検出を防ぐことができるようにしている。
即ち、誤認識防止手段２ｅが、第２の蛍光レポーター分子と第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する。
具体的には、上述した三次元座標上での細胞区画構築（ステップＳ３1）〜第２、第３の蛍光シグナルの認識（ステップＳ３3）の処理手順によって、三次元に構築され、且つ、細胞区画の区画内に存在するものと認識された、ＦＩＴＣで発光する細胞核内のコントロールである蛍光スポットのＸＹＺ座標とＴｅｘａｓ Ｒｅｄで発光する目的部位の蛍光スポットのＸＹＺ座標とを比較する。そして、ＦＩＴＣで発光する蛍光スポットのＸＹＺ座標とＴｅｘａｓ Ｒｅｄで発光する目的部位の蛍光スポットのＸＹＺ座標が同一の場合、このＸＹＺ座標が同じ蛍光スポットをコントロールの蛍光スポットではなく、目的部位の蛍光スポットとして認識する。
In the cell image analysis apparatus of this embodiment, it is possible to prevent erroneous detection of fluorescent spots due to such fluorescent leakage.
That is, the misrecognition preventing means 2e detects the leakage of the fluorescence emitted from the short wavelength side fluorescent reporter molecule to the long wavelength side fluorescent reporter molecule, of the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule. Thus, it is possible to prevent misrecognition of the emission of fluorescence on the long wavelength side.
Specifically, the cell compartment is constructed in three dimensions by the processing procedure from the above-described cell compartment construction on the three-dimensional coordinates (step S3 1 ) to the recognition of the second and third fluorescent signals (step S3 3 ), and The XYZ coordinates of the fluorescent spot, which is recognized as being present in the cell compartment, and is a control in the cell nucleus that emits light by FITC, is compared with the XYZ coordinate of the fluorescent spot of the target site that emits light by Texas Red. When the XYZ coordinates of the fluorescent spot emitting light by FITC and the XYZ coordinates of the target spot emitting light by Texas Red are the same, the fluorescent spot having the same XYZ coordinate is not the control fluorescent spot, but the fluorescent spot of the target part. Recognize as
特徴量測定（ステップＳ３ 5 ）
次いで、特徴量測定手段２ｄが、蛍光シグナル認識手段２ｃ、誤認識防止手段２ｅを介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定し、例えば、蛍光レポーター分子ごとの蛍光スポットの個数、蛍光スポットの平均輝度、蛍光スポット領域の大きさ等を算出する。
このようにして測定、算出されたデータは、例えば、図９に示すような表で一覧表示することができる。図９の表中、“Ｗｅｌｌ”はマルチウェルプレートにおける各ウェルの番号、“Ｔｏｔａｌ”は各ウェルにおいて認識された細胞の総個数、“Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ”は各ウェルにおいてＴｅｘａｓ Ｒｅｄが発光している細胞の個数、“Ｃｅｌｌ％”は（各ウェルにおいてＴｅｘａｓ Ｒｅｄが発光している細胞の個数）／（各ウェルにおいて認識された細胞の総個数）を示している。
Feature quantity measurement (Step S3 5)
Next, the feature amount measuring unit 2d performs the fluorescence signal from the second fluorescent reporter molecule and the fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule recognized through the fluorescent signal recognizing unit 2c and the erroneous recognition preventing unit 2e. As each feature quantity, at least the intensity, size, number of fluorescent or luminescent regions are measured, and for example, the number of fluorescent spots for each fluorescent reporter molecule, the average luminance of fluorescent spots, the size of fluorescent spot regions, etc. are calculated. .
The data measured and calculated in this way can be displayed as a list in a table as shown in FIG. 9, for example. In the table of FIG. 9, “Well” is the number of each well in the multi-well plate, “Total” is the total number of cells recognized in each well, and “Texas Red” is the cell in which Texas Red emits light in each well. "Cell%" indicates (number of cells emitting Texas Red in each well) / (total number of cells recognized in each well).
細胞数計測・表示（ステップ４）
次いで、細胞数計測表示手段２ｆが、特徴量測定手段２ｄを介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する。
このとき、コントロールである蛍光スポット数が予めユーザーが設定した規定数を満たしている細胞を、抽出・カウントし、かつ、その抽出した細胞のうち、目的部位の蛍光スポットが発光している細胞の数をカウントして表示するようにするとよい。
Cell count / display (Step 4)
Next, the cell number counting display means 2f uses the feature quantities of the fluorescence signal from the second fluorescent reporter molecule and the fluorescence signal from the third fluorescence reporter molecule measured via the feature quantity measuring means 2d. The number of cells that satisfy a predetermined condition is automatically measured and the measurement result is displayed.
At this time, the number of cells in which the number of fluorescent spots as a control satisfies a specified number set in advance by the user is extracted and counted, and among the extracted cells, cells whose fluorescent spots at the target site emit light. It is good to count and display the number.
さらに、本実施形態の細胞画像解析装置は、対物レンズのＺ方向への移動量の値を補正して、細胞核内のＺ方向の位置情報を演算出力する機能を有するようにするのが望ましい。
図１０に示すように、対物レンズの屈折率ｎ１と、細胞が載置される例えばマルチウェルプレート等の細胞培養容器の底面部の屈折率ｎ２の違いから、細胞内部に結ばれる焦点のＺ方向への移動距離Ｌ２と、実際の対物レンズの移動距離Ｌ１とが異なる場合がある。例えば、細胞の厚みが１００μｍあるときにおいて、その細胞の底面と上面とに焦点を合わせるための対物レンズの移動距離が８０μｍとなる場合がある。一般的に、対象物の厚みの情報を入手する場合、その情報源として焦点を合わせた対物レンズのＺ方向への移動量を用いることが多い。しかし、上述のように、対物レンズのＺ方向への移動量と対象物の厚みとが一致しない場合があるため、対物レンズの屈折率とマルチウェルプレートのような細胞培養容器の底面部の屈折率との差に基づく所定の補正値を用いて、対物レンズのＺ方向への移動量の値を補正して、細胞核内のＺ方向の位置情報を演算出力する機能を備えるようにするとよい。
Furthermore, it is desirable that the cell image analysis apparatus of the present embodiment has a function of calculating and outputting position information in the Z direction within the cell nucleus by correcting the value of the amount of movement of the objective lens in the Z direction.
As shown in FIG. 10, the Z direction of the focal point connected to the inside of the cell from the difference between the refractive index n1 of the objective lens and the refractive index n2 of the bottom surface of the cell culture container such as a multiwell plate on which the cells are placed. There are cases where the moving distance L2 to and the actual moving distance L1 of the objective lens are different. For example, when the thickness of the cell is 100 μm, the moving distance of the objective lens for focusing on the bottom surface and the top surface of the cell may be 80 μm. In general, when obtaining information on the thickness of an object, the amount of movement of the focused objective lens in the Z direction is often used as the information source. However, as described above, the amount of movement of the objective lens in the Z direction and the thickness of the object may not match, so the refractive index of the objective lens and the refraction of the bottom surface of a cell culture container such as a multiwell plate A function of calculating and outputting position information in the Z direction in the cell nucleus by correcting the value of the amount of movement of the objective lens in the Z direction using a predetermined correction value based on the difference from the rate may be provided.
本実施形態の細胞画像解析方法、細胞画像解析システム、及び細胞画像解析装置によれば、同じ細胞をＺ方向に複数枚撮像し、細胞核の三次元形状を構築し、細胞核の内側と外側の領域を認識し、細胞核に含まれているＦＩＳＨ法により蛍光を発する蛍光スポットを三次元で解析することが出来るため、蛍光スポットが重なって判別不能となることが無く、細胞全体から蛍光スポットを検出することができ、さらに、細胞の外側のゴミによる発光を誤認識することが無いので、正確なＦＩＳＨ法での細胞解析が出来る。 According to the cell image analysis method, cell image analysis system, and cell image analysis apparatus of the present embodiment, a plurality of images of the same cell are taken in the Z direction, a three-dimensional shape of the cell nucleus is constructed, and areas inside and outside the cell nucleus The fluorescent spot that emits fluorescence by the FISH method contained in the cell nucleus can be analyzed in three dimensions, so that the fluorescent spot does not overlap and cannot be discriminated, and the fluorescent spot is detected from the whole cell. Furthermore, since there is no misrecognition of luminescence due to dust outside the cell, cell analysis can be performed accurately by the FISH method.
本発明のＦＩＳＨ細胞画像解析方法、ＦＩＳＨ細胞画像解析システム及びＦＩＳＨ細胞画像解析装置は、ＦＩＳＨ法を用いて細胞診断や細胞遺伝子学研究を行う分野に有用である。 The FISH cell image analysis method, FISH cell image analysis system, and FISH cell image analysis apparatus of the present invention are useful in the field of performing cell diagnosis and cytogenetics research using the FISH method.
１ 細胞画像撮像装置
１ａ 蛍光観察光学系
１ｂ 撮像素子
２ 細胞画像解析装置
２ａ 三次元細胞区画構築手段
２ｂ 細胞区画識別手段
２ｃ 蛍光シグナル認識手段
２ｄ 特徴量測定手段
２ｅ 誤認識防止手段
２ｆ 細胞数計測表示手段
α 細胞核
β コントロールである蛍光スポット
γ 目的部位の蛍光スポット
δ コントロールである蛍光スポットと同じ蛍光を発する異物
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Cell image imaging device 1a Fluorescence observation optical system 1b Image pick-up element 2 Cell image analyzer 2a Three-dimensional cell division construction means 2b Cell division identification means 2c Fluorescence signal recognition means 2d Feature quantity measurement means 2e False recognition prevention means 2f Cell number measurement display Means α Cell nucleus β Control fluorescent spot γ Target site fluorescent spot δ Control Foreign spot emitting the same fluorescence
Claims (8)
所定の細胞区画についてレポートする第１の蛍光レポーター分子と、所望の第１の遺伝子配列についてレポートする第２の蛍光レポーター分子と、所望の第２の遺伝子配列についてレポートする第３の蛍光レポーター分子とを含有する複数の細胞が容器に播種された状態にするステップ、
蛍光観察光学系を備えた細胞画像撮像装置を用いて、前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手するステップ、
前記入手した画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築するステップ、
前記三次元に構築した細胞区画の区画内と区画外を識別するステップ、
前記三次元に構築し、認識した細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子から蛍光シグナルを夫々自動的に認識するステップ、
前記認識した第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定するステップ、
前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止するステップを有し、
前記長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止するステップは、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することにより行うことを特徴とするＦＩＳＨ細胞画像解析方法。 A cell image analysis method using a FISH method,
A first fluorescent reporter molecule that reports on a given cell compartment; a second fluorescent reporter molecule that reports on a desired first gene sequence; and a third fluorescent reporter molecule that reports on a desired second gene sequence; A plurality of cells containing a seeded state in a container;
Using a cell imaging device equipped with a fluorescence observation optical system, a plurality of cells are imaged with different Z coordinates on the same XY coordinates on the focal plane, and fluorescence signals from the respective fluorescent reporter molecules are obtained. The step of automatically obtaining as an image,
Constructing the cell compartment as a three-dimensional cell compartment using the obtained image;
Identifying inside and outside of the three-dimensionally constructed cell compartments;
Automatically recognizing a fluorescent signal from the second fluorescent reporter molecule and a fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule present in the compartment of the recognized and recognized cell compartment, respectively,
Measuring at least the intensity, the size, the number of fluorescence or light-emitting regions as the respective characteristic amounts for the fluorescent signal from the recognized second fluorescent reporter molecule and the fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule;
Among the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule, the leakage of the fluorescence emitted by the fluorescent reporter molecule on the short wavelength side to the fluorescent reporter molecule on the long wavelength side is detected, Having a step of preventing misrecognition of fluorescence emission,
The step of preventing misrecognition that the fluorescence is emitted from the long wavelength side is such that the XYZ coordinate positions at which the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule emit light are the same. A FISH cell image analysis method, which is performed by determining whether or not there is .
前記細胞画像撮像装置は、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を結像する蛍光観察光学系と、前記蛍光観察光学系を介して結像された細胞像を撮像する撮像素子を有し、前記複数の細胞に対し、焦点面を同じＸＹ座標上でＺ座標を異ならせて複数撮像し、前記各蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを自動的に画像として入手し、
前記細胞画像解析装置は、前記コンピュータを、
前記細胞画像撮像装置を介して入手された画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築する三次元細胞区画構築手段、
前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する細胞区画識別手段、
前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築され、前記細胞区画識別手段を介して認識された細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する蛍光シグナル認識手段、
前記蛍光シグナル認識手段を介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定する特徴量測定手段、
前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する誤認識防止手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを有し、
前記誤認識防止手段は、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することを特徴とするＦＩＳＨ細胞画像解析システム。 A first fluorescent reporter molecule that reports on a given cell compartment; a second fluorescent reporter molecule that reports on a desired first gene sequence; and a third fluorescent reporter molecule that reports on a desired second gene sequence A cell image analysis system having a cell image analysis device comprising a cell image imaging device for acquiring images of a plurality of cells contained therein and a computer for analyzing a cell image acquired via the cell image imaging device,
The cell imaging device includes a fluorescence observation optical system that continuously changes a focus position with respect to a sample at a predetermined pitch in the Z direction and forms an image of the sample at each focus position, and the fluorescence observation optical system. An imaging device for imaging the imaged cell image, and imaging a plurality of the plurality of cells with different focal planes on the same XY coordinates with different Z coordinates, and fluorescence signals from the respective fluorescent reporter molecules Automatically as an image,
The cell image analysis apparatus includes the computer,
Three-dimensional cell compartment construction means for constructing the cell compartment as a three-dimensional cell compartment using an image obtained via the cell imaging device;
A cell compartment identification means for identifying the inside and outside of the cell compartment constructed in three dimensions via the three-dimensional cell compartment construction means;
A fluorescence signal from the second fluorescent reporter molecule, which is three-dimensionally constructed through the three-dimensional cell compartment construction means and is present in the compartment of the cell compartment recognized through the cell compartment identification means; Fluorescent signal recognition means for automatically recognizing the fluorescent signal from the fluorescent reporter molecule of
With respect to the fluorescence signal from the second fluorescence reporter molecule and the fluorescence signal from the third fluorescence reporter molecule that are recognized through the fluorescence signal recognition means, at least intensity, magnitude, fluorescence, or luminescence as the respective characteristic quantities Feature quantity measuring means for measuring the number of regions;
Among the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule, the leakage of the fluorescence emitted by the fluorescent reporter molecule on the short wavelength side to the fluorescent reporter molecule on the long wavelength side is detected, False recognition prevention means for preventing false recognition of fluorescence emission,
Have a image analysis software to function as,
The misrecognition preventing means determines whether or not the XYZ coordinate positions where the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule emit light are at the same position, respectively. Cell image analysis system.
前記特徴量測定手段を介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する細胞数計測表示手段として機能させることを特徴とする請求項４に記載のＦＩＳＨ細胞画像解析システム。 The image analysis software further includes the computer,
The number of cells that satisfy a predetermined condition by using the respective characteristic amounts of the fluorescent signal from the second fluorescent reporter molecule and the fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule measured through the characteristic amount measuring means 5. The FISH cell image analysis system according to claim 4 , wherein the FISH cell image analysis system according to claim 4 is made to function as a cell number measurement display unit that automatically measures and displays the measurement result.
前記コンピュータを、
前記細胞画像撮像装置を介して入手された画像を用いて前記細胞区画を三次元の細胞区画として構築する三次元細胞区画構築手段、
前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築された細胞区画の区画内と区画外を識別する細胞区画識別手段、
前記三次元細胞区画構築手段を介して三次元に構築され、前記細胞区画識別手段を介して認識された細胞区画の区画内に存在する、前記第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルを夫々自動的に認識する蛍光シグナル認識手段、
前記蛍光シグナル認識手段を介して認識された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルに対し、夫々の特徴量として、少なくとも強度、大きさ、蛍光若しくは発光領域の数を測定する特徴量測定手段、
前記第２の蛍光レポーター分子と前記第３の蛍光レポーター分子のうち、短波長側の蛍光レポーター分子が発する蛍光の、長波長側の蛍光レポーター分子への漏れこみを検出して、長波長側の蛍光の発光であるとの誤認識を防止する誤認識防止手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを有し、
前記誤認識防止手段は、前記第２の蛍光レポーター分子、および前記第３の蛍光レポーター分子の夫々発光しているＸＹＺ座標位置が、同一位置にあるか否かを判定することを特徴とするＦＩＳＨ細胞画像解析装置。 A fluorescence observation optical system that continuously changes the in-focus position with respect to the sample at a predetermined pitch in the Z direction, and forms an image of the sample at each in-focus position, and a cell image formed through the fluorescence observation optical system A first fluorescent reporter molecule that reports on a predetermined cell compartment, a second fluorescent reporter molecule that reports on a desired first gene sequence, and a desired second gene sequence For a plurality of cells containing the third fluorescent reporter molecule to be reported, a plurality of images are taken with different Z coordinates on the same XY coordinate, and the fluorescence signals from the respective fluorescent reporter molecules are automatically converted into images. Cell image provided with a cell image analysis system having a cell image imaging device to be obtained, and provided with a computer for analyzing a cell image acquired via the cell image imaging device An analysis apparatus,
The computer,
Three-dimensional cell compartment construction means for constructing the cell compartment as a three-dimensional cell compartment using an image obtained via the cell imaging device;
A cell compartment identification means for identifying the inside and outside of the cell compartment constructed in three dimensions via the three-dimensional cell compartment construction means;
A fluorescence signal from the second fluorescent reporter molecule, which is three-dimensionally constructed through the three-dimensional cell compartment construction means and is present in the compartment of the cell compartment recognized through the cell compartment identification means; Fluorescent signal recognition means for automatically recognizing the fluorescent signal from the fluorescent reporter molecule of
With respect to the fluorescence signal from the second fluorescence reporter molecule and the fluorescence signal from the third fluorescence reporter molecule that are recognized through the fluorescence signal recognition means, at least intensity, magnitude, fluorescence, or luminescence as the respective characteristic quantities Feature quantity measuring means for measuring the number of regions;
Among the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule, the leakage of the fluorescence emitted by the fluorescent reporter molecule on the short wavelength side to the fluorescent reporter molecule on the long wavelength side is detected, False recognition prevention means for preventing false recognition of fluorescence emission,
Have a image analysis software to function as,
The misrecognition preventing means determines whether or not the XYZ coordinate positions where the second fluorescent reporter molecule and the third fluorescent reporter molecule emit light are at the same position, respectively. Cell image analyzer.
前記特徴量測定手段を介して測定された第２の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナル、第３の蛍光レポーター分子からの蛍光シグナルの夫々の特徴量を用いて、予め規定した条件を満たす細胞の数を自動的に計測しその計測結果を表示する細胞数計測表示手段として機能させることを特徴とする請求項７に記載のＦＩＳＨ細胞画像解析装置。 The image analysis software further includes the computer,
The number of cells that satisfy a predetermined condition by using the respective characteristic amounts of the fluorescent signal from the second fluorescent reporter molecule and the fluorescent signal from the third fluorescent reporter molecule measured through the characteristic amount measuring means The FISH cell image analysis apparatus according to claim 7 , wherein the FISH cell image analysis apparatus according to claim 7 is made to function as a cell number measurement display unit that automatically measures and displays the measurement result.
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