JP5433159B2 - Microarray measurement method - Google Patents
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Description
本発明は、マイクロアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting hybridization between a probe polynucleotide and a target polynucleotide using a microarray.
多種多様な生物の遺伝子構造を明らかにするのみならず、その遺伝子機能をゲノムスケールで解明しようとする試みが行われつつあり、遺伝子機能を効率的に解析するための技術開発も急速に進んでいる。マイクロアレイは、スライドガラス等の担体に多数のポリヌクレオチドを所定の領域毎に整列固定させた高密度のアレイであり、遺伝子の塩基配列の決定、並びに遺伝子の発現、変異、多型性などの同時解析に非常に有用である。このマイクロアレイを用いた遺伝子情報の解析は、創薬研究、疾病の診断や予防法の開発などに極めて有用である。 In addition to clarifying the genetic structures of a wide variety of organisms, attempts are being made to elucidate their gene functions on a genome scale, and technological development for efficient analysis of gene functions is rapidly progressing. Yes. A microarray is a high-density array in which a large number of polynucleotides are aligned and fixed in a predetermined region on a carrier such as a glass slide. Determination of the base sequence of a gene and simultaneous expression, mutation, polymorphism, etc. Very useful for analysis. Analysis of genetic information using this microarray is extremely useful for drug discovery research, disease diagnosis and development of preventive methods.
マイクロアレイを用いた検出では、まず担体表面に高密度に整列したプローブポリヌクレオチドに対して、放射性同位体や蛍光色素で標識したターゲットポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる。このとき、プローブポリヌクレオチドと相補的な塩基配列をもつターゲットポリヌクレオチドは、プローブポリヌクレオチドと相補的にハイブリダイズするが、ハイブリダイズしなかったポリヌクレオチドは洗浄により除去される。 In detection using a microarray, first, a target polynucleotide labeled with a radioisotope or a fluorescent dye is hybridized to a probe polynucleotide arranged on a carrier surface at a high density. At this time, the target polynucleotide having a base sequence complementary to the probe polynucleotide hybridizes complementarily to the probe polynucleotide, but the unhybridized polynucleotide is removed by washing.
マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションの検出では、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などにより誤判定が起こる場合がある。しかし、その誤判定か否かの判断は、マイクロアレイを使用するユーザーに委ねられており、非常にあいまいであった。このような状況では検出器と反応装置と組み合わせた自動装置で多数の試料を処理することは不可能であった。 In detection of hybridization using a microarray, an erroneous determination may occur due to performance deterioration or poor cleaning for each microarray. However, the determination of whether or not it is a misjudgment is left to the user who uses the microarray and is very ambiguous. In such a situation, it was impossible to process a large number of samples with an automatic device combined with a detector and a reaction device.
特許文献１には、スポットの輝度が検出器の検出下限以下である場合や検出上限以上である場合に生じる判定誤差をなくすために、プローブＤＮＡを濃度を変えてスポットしたマイクロアレイを用い、特定の範囲の輝度を有するスポットの結果のみで判定する方法が記載されている。しかし、当該方法では、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などを判定することはできない。
In
本発明の課題は、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などを客観的に判定する手段を提供することである。 An object of the present invention is to provide a means for objectively determining performance degradation or poor cleaning for each microarray.
本発明者らは、プローブポリヌクレオチドが固定化されたスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを設けたマイクロアレイを用い、ハイブリダイゼーション反応して洗浄した後に、まず基準スポットの蛍光を測定することによりマイクロアレイごとの信頼性を判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors use a microarray provided with a reference spot on which a fluorescently labeled reference polynucleotide is immobilized in addition to a spot on which a probe polynucleotide is immobilized. It has been found that the reliability of each microarray can be determined by measuring the fluorescence of the reference spot, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。 That is, the present invention includes the following inventions.
（１）マイクアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法であって、
１）プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させる工程、
２）マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程、
３）基準スポットにおける蛍光を測定し、所定の値を満たせば測定可と判断する工程、及び
４）測定可と判断されたら、プローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光を測定する工程、
を含む、前記方法。
(1) A method for detecting hybridization between a probe polynucleotide and a target polynucleotide using a microphone array,
1) A step of bringing a fluorescently labeled target polynucleotide into contact with a microarray having at least one reference spot on which a fluorescently labeled reference polynucleotide is immobilized in addition to a plurality of spots on which a probe polynucleotide is immobilized ,
2) removing unreacted target polynucleotides by washing the microarray;
3) a step of measuring fluorescence at a reference spot and determining that measurement is possible if a predetermined value is satisfied; and 4) a step of measuring fluorescence at each spot to which the probe polynucleotide is immobilized if determined to be measurable.
Said method.
（２）基準ポリヌクレオチドの蛍光標識とターゲットポリヌクレオチドの蛍光標識が同一である、（１）記載の方法。 (2) The method according to (1), wherein the fluorescent label of the reference polynucleotide and the fluorescent label of the target polynucleotide are the same.
（３）マイクロアレイにおいて、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが整列して配置されており、基準スポットが少なくとも二箇所存在し、いずれか二箇所の基準スポットを結ぶ線を基準線として、基準スポットからの距離と基準線からの角度に基づいてプローブポリヌクレオチドの各スポットの位置が検出される、（１）又は（２）記載の方法。 (3) In the microarray, the spot of the probe polynucleotide and the reference spot are aligned, and there are at least two reference spots, and a line connecting any two reference spots is used as a reference line from the reference spot. The method according to (1) or (2), wherein the position of each spot of the probe polynucleotide is detected based on the distance and the angle from the reference line.
（４）プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されており、基準スポットが四角形の異なる頂点に存在する、（３）記載の方法。 (4) The method according to (3), wherein the probe polynucleotide spot and the reference spot are arranged in a lattice shape having a rectangular outer periphery, and the reference spot exists at different vertices of the square.
（５）マイクロアレイにおいて、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が正方形又は長方形の格子状に整列して配置されており、基準スポットがその対角線上の頂点に二箇所存在し、
各基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、
前記交点と各基準スポットとを結ぶ二つの結線の長さを検出し、
前記結線の長さとスポット数から結線上の各スポット位置が検出される、（１）又は（２）記載の方法。
(5) In the microarray, the spot of the probe polynucleotide and the reference spot are arranged so that the outer periphery is aligned in a square or rectangular lattice, and there are two reference spots at the diagonal vertices;
Detect the intersection where two straight lines passing through each reference spot intersect perpendicularly,
Detecting the length of two connections connecting the intersection and each reference spot,
The method according to (1) or (2), wherein each spot position on the connection is detected from the length of the connection and the number of spots.
（６）工程２）の後かつ工程４）の前において、
すべてのスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
(6) After step 2) and before step 4),
For all spots, measuring the brightness of a certain range of positions from the center of the spot to obtain a plurality of background values;
A step of calculating a background representative value representing a plurality of obtained background values, and a spot having a difference greater than or equal to a predetermined value by calculating a difference between the background value and the background representative value for all spots. The method according to any one of (1) to (5), further comprising a step of determining that the measurement is impossible when the is present.
（７）工程２）の後かつ工程４）の前において、
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
バックグラウンド値を測定したすべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
(7) After step 2) and before step 4),
Measuring a plurality of spots, respectively, the brightness of a certain range of positions from the center of the spot to obtain a plurality of background values;
A step of calculating a background representative value representative of the obtained plurality of background values, and a difference between the background value and the background representative value for each spot where the background value is measured, The method according to any one of (1) to (5), further including a step of determining that measurement is impossible when a spot having the above difference exists.
（８）前記スポットの中心から一定の範囲が、スポットの中心位置から一定の距離以上で、スポット間隔長を一辺としスポットの中心位置を中心とした四角形の範囲内である（６）又は（７）に記載の方法。 (8) A certain range from the center of the spot is within a rectangular range centered on the center position of the spot with the spot interval length as one side and at a certain distance or more from the center position of the spot. ) Method.
（９）バックグラウンド代表値が、複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値である（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。 (9) The method according to any one of (6) to (8), wherein the background representative value is an average value or a median value of a plurality of background values.
（１０）工程２）の後かつ工程４）の前において、
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値をバックグラウンド代表値として算出する工程、
バックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
(10) After step 2) and before step 4),
Measuring a plurality of spots, respectively, the brightness of a certain range of positions from the center of the spot to obtain a plurality of background values;
Calculating an average value or median value of a plurality of background values as a background representative value;
The method according to any one of (1) to (5), further including a step of determining that measurement is impossible when the background representative value is equal to or greater than a predetermined value.
（１１）バックグラウンド代表値を、マイクロアレイにおけるスポット群の最外周に存在する複数のスポットのバックグラウンド値から算出することを特徴とする（６）〜（１０）のいずれかに記載の方法。 (11) The method according to any one of (6) to (10), wherein the background representative value is calculated from the background values of a plurality of spots existing on the outermost periphery of the spot group in the microarray.
（１２）基準スポットに固定化する蛍光標識したポリヌクレオチドの濃度が、１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である、（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。 (12) The method according to any one of (1) to (11), wherein the concentration of the fluorescently labeled polynucleotide immobilized on the reference spot is in the range of 100 nM to 250 nM.
本発明により、マイクロアレイごとの信頼性が判定でき、信頼性のあるマイクロアレイを用いて測定を実施することができる。従って、誤判定を抑えることができる。また、自動反応装置などと組み合わせることで、自動でマイクロアレイの測定を高い信頼性をもって実施できる。 According to the present invention, the reliability of each microarray can be determined, and measurement can be performed using a reliable microarray. Therefore, erroneous determination can be suppressed. In combination with an automatic reaction device, the microarray can be automatically and reliably measured.
本発明は、マイクアレイを用いてプローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting hybridization between a probe polynucleotide and a target polynucleotide using a microphone array.
本発明においてポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドが包含され、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸が包含される。ＤＮＡには、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡが包含される。また、核酸には、リン酸ジエステル部位を修飾した人工核酸；フラノース部位のグリコシル結合やヒドロキシル基を修飾した人工核酸；核酸塩基部位を修飾した人工核酸；および糖・リン酸骨格以外の構造を利用した人工核酸なども包含され、より具体的には、リン酸部位の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホロチオエート型、ホスホロジチオエート型、ホスホロジアミデート型、メチルホスホネート型またはメチルホスホノチオエート型の人工核酸；フラノース環上の置換基修飾型、糖環骨格が１炭素増炭したピラノース型、または多環式糖骨格型の人工核酸；ピリミジンＣ−５位修飾塩基型、プリンＣ−７位修飾塩基型、または環拡張修飾塩基型の人工核酸などが包含される。 In the present invention, the polynucleotide includes oligonucleotides, and includes nucleic acids including DNA and RNA. DNA includes single-stranded DNA and double-stranded DNA. For nucleic acids, artificial nucleic acids modified with phosphodiester sites; artificial nucleic acids modified with glycosyl bonds and hydroxyl groups at furanose sites; artificial nucleic acids modified with nucleobase sites; and structures other than sugar / phosphate skeletons And more specifically, phosphorothioate type, phosphorodithioate type, phosphorodiamidate type, methylphosphonate type or methylphosphonothioate type in which the oxygen atom of the phosphate moiety is replaced with a sulfur atom. Artificial nucleic acid: Substituent modified type on furanose ring, pyranose type with 1-carbon increase in sugar ring skeleton, or polycyclic sugar skeleton type artificial nucleic acid; pyrimidine C-5 position modified base type, purine C-7 position A modified base type or a ring-expanded modified base type artificial nucleic acid is included.
本発明においてプローブポリヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、目的遺伝子を検出するために用いられるポリヌクレオチドであって、目的遺伝子に対応するポリヌクレオチドまたはその断片と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさす。プローブポリヌクレオチドとしては、通常、合成オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ、それらの断片、ならびにそれらを変性させたもの（例えば、一本鎖を二本鎖に変性させたもの）等が用いられる。プローブポリヌクレオチドは、通常３〜５０００塩基、好ましくは１０〜１０００塩基を有する。マイクロアレイに固定化するプローブポリヌクレオチドの濃度は、通常１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である。 In the present invention, the probe polynucleotide has a meaning usually used in the art and is a polynucleotide used for detecting a target gene, and specifically hybridizes with a polynucleotide corresponding to the target gene or a fragment thereof. This refers to a polynucleotide that is soyed. As the probe polynucleotide, synthetic oligonucleotides, cDNA and genomic DNA, fragments thereof, and those obtained by denaturing them (for example, those obtained by modifying a single strand into a double strand) are used. The probe polynucleotide usually has 3 to 5000 bases, preferably 10 to 1000 bases. The concentration of the probe polynucleotide immobilized on the microarray is usually in the range of 100 nM to 250 nM.
本発明においてターゲットポリヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、検出対象であるポリヌクレオチドをさす。ターゲットは標的と称される場合もある。通常、被検試料由来のポリヌクレオチドおよびそれを基にして酵素的に合成されたポリヌクレオチド、具体的には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ａＲＮＡ、それらの断片、ならびにそれらを変性させたもの等が用いられる。 In the present invention, the target polynucleotide has a meaning usually used in the art and refers to a polynucleotide to be detected. A target may be referred to as a target. Usually, a polynucleotide derived from a test sample and a polynucleotide synthesized enzymatically based on the polynucleotide, specifically, mRNA, cDNA, aRNA, a fragment thereof, and a modified one thereof are used. .
ハイブリダイズまたはハイブリダイゼーションは、当技術分野で通常用いられる意味を有し、相補的な配列を持つポリヌクレオチド同士、例えば、一本鎖のＤＮＡ同士、一本鎖のＲＮＡ同士、または一本鎖のＤＮＡと一本鎖のＲＮＡが適切な条件下で二本鎖を形成することをいう。 Hybridization or hybridization has the meaning normally used in the art, and polynucleotides having complementary sequences, for example, single-stranded DNAs, single-stranded RNAs, or single-stranded It means that DNA and single-stranded RNA form a double strand under appropriate conditions.
本発明においては、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを用いる。標識方法や標識の種類は、プローブポリヌクレオチドとターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検出できるものであれば特に制限されず、当技術分野で公知である。例えば、ターゲットポリヌクレオチドを合成または増幅する際に蛍光標識を共有結合させた基質（主にＵＴＰ）を取り込ませることにより、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを得ることができる。蛍光標識としては、Ｃｙ３およびＣｙ５などのＣｙＤｙｅ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ローダミン、テキサスレッド、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸなどが挙げられる。 In the present invention, a fluorescently labeled target polynucleotide is used. The labeling method and the type of label are not particularly limited as long as hybridization between the probe polynucleotide and the target polynucleotide can be detected, and is known in the art. For example, a fluorescently labeled target polynucleotide can be obtained by incorporating a substrate (mainly UTP) to which a fluorescent label is covalently bonded when synthesizing or amplifying the target polynucleotide. Examples of fluorescent labels include CyDye such as Cy3 and Cy5, FITC, RITC, rhodamine, Texas Red, TET, TAMRA, FAM, HEX, ROX and the like.
本発明では、マイクロアレイとして、プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上、好ましくは少なくとも２箇所、より好ましくは２〜４箇所、さらに好ましくは２箇所有するマイクロアレイを用いる。基準スポットに固定化する蛍光標識したポリヌクレオチドの濃度は、通常１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲である。 In the present invention, as a microarray, in addition to a plurality of spots on which probe polynucleotides are immobilized, one or more reference spots on which fluorescently labeled reference polynucleotides are immobilized, preferably at least two, more preferably A microarray having 2 to 4 locations, more preferably 2 locations, is used. The concentration of the fluorescently labeled polynucleotide immobilized on the reference spot is usually in the range of 100 nM to 250 nM.
本発明においては、上記マイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させ、洗浄により未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去した後、基準ポリヌクレオチドの蛍光を測定する。基準ポリヌクレオチドは蛍光標識を有することから、ターゲットポリヌクレオチドがハイブリダイズしなくとも蛍光が検出されるはずである。蛍光が検出されない、または蛍光の値が低いということは、基準ポリヌクレオチドがマイクロアレイから失われていること、すなわち、その他のプローブポリヌクレオチドも同様に失われていることを意味する。従って、基準ポリヌクレオチドの蛍光を測定し、所定の値を満たすかどうか判定することにより、マイクロアレイが劣化しているか否か、換言すればマイクロアレイの信頼性を判断することができる。 In the present invention, the above-described microarray is brought into contact with a fluorescently labeled target polynucleotide, and the unreacted target polynucleotide is removed by washing, and then the fluorescence of the reference polynucleotide is measured. Since the reference polynucleotide has a fluorescent label, fluorescence should be detected even if the target polynucleotide is not hybridized. If no fluorescence is detected or the value of fluorescence is low, it means that the reference polynucleotide is lost from the microarray, ie other probe polynucleotides are lost as well. Therefore, by measuring the fluorescence of the reference polynucleotide and determining whether or not a predetermined value is satisfied, whether or not the microarray has deteriorated, in other words, the reliability of the microarray can be determined.
基準ポリヌクレオチドの蛍光標識は、特に制限されないが、ターゲットポリヌクレオチドの蛍光標識と同じものを用いるのが好ましい。同じものを用いることで、同じ検出器を用いて双方の蛍光標識を一括して測定することができ、迅速且つ簡便に測定を実施できる。 The fluorescent label of the reference polynucleotide is not particularly limited, but the same fluorescent label as that of the target polynucleotide is preferably used. By using the same thing, both fluorescent labels can be measured collectively using the same detector, and the measurement can be performed quickly and easily.
本発明で用いるマイクロアレイにおいては、好ましくは、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットとが整列して、好ましくは格子状に配置されている。そして、好ましくは基準スポットが少なくとも二箇所存在し、いずれか二箇所の基準スポットを結ぶ線を基準線として、基準スポットからの距離及び基準線からの角度に基づいてプローブポリヌクレオチドの各スポットの位置（スポットの中心）が検出される。より具体的には、基準スポットからの距離及び基準線からの角度（各スポットと基準スポットを結ぶ線と基準線とがなす角度）、並びに所望によりスポットピッチ等から各スポットの中心位置を決定することができる。 In the microarray used in the present invention, the spot of the probe polynucleotide and the reference spot are preferably aligned and preferably arranged in a lattice pattern. Preferably, there are at least two reference spots, and the position of each spot of the probe polynucleotide based on the distance from the reference spot and the angle from the reference line, with the line connecting any two reference spots as the reference line (Spot center) is detected. More specifically, the center position of each spot is determined based on the distance from the reference spot, the angle from the reference line (the angle formed by the line connecting each spot and the reference spot and the reference line), and the spot pitch if necessary. be able to.
また、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットを、外周が正方形又は長方形の格子状に整列して配置し、基準スポットをその対角線上の向かい合う頂点に二箇所存在させることができる。この場合には、それぞれの基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、この交点とそれぞれの二箇所の基準スポットを結ぶ二つの結線を検出する。そして、結線の長さを算出しこの距離を、あらかじめ決定されている（四角形の外周上のスポット数−１）の数で割ることで、結線上の各スポット間隔が求められ、このスポット間隔から各スポット位置を検出することができる。例えば、スポットが４行×４列のマイクロアレイを用いたとする。このときは結線上のスポット数は４点である。結線の長さが９００μｍだったとすると、９００÷（４−１）＝３００となり、スポット間隔は３００μｍとなる。これを用いて、基準スポットから結線上に３００μｍ移動したところをスポットの中心とすることができ、さらにこの中心から結線上に３００μｍ移動したところが次のスポットの中心となる。 In addition, the probe polynucleotide spot and the reference spot can be arranged in a grid with a square or rectangular outer periphery, and two reference spots can exist at opposite vertices on the diagonal line. In this case, an intersection where two straight lines passing through the respective reference spots intersect perpendicularly is detected, and two connections connecting the intersection and the respective two reference spots are detected. Then, by calculating the length of the connection and dividing this distance by the predetermined number of spots (the number of spots on the outer periphery of the square-1), each spot interval on the connection is obtained. Each spot position can be detected. For example, assume that a microarray having 4 rows × 4 columns of spots is used. At this time, the number of spots on the connection is four. If the length of the connection is 900 μm, 900 ÷ (4-1) = 300, and the spot interval is 300 μm. Using this, the center of the spot can be determined by moving 300 μm from the reference spot onto the connection, and the center of the next spot can be determined by moving 300 μm from the center onto the connection.
基準線を構成する二箇所の基準スポットは、マイクロアレイ上に整列したスポット群において、遠い位置に存在することが好ましい。プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットは、外周が四角形の格子状に配置されており（例えば、図１）、基準スポットが四角形の異なる頂点に存在することが好ましい。 The two reference spots constituting the reference line are preferably present at distant positions in the spot group aligned on the microarray. It is preferable that the probe polynucleotide spot and the reference spot are arranged in a square lattice shape (for example, FIG. 1), and the reference spot is present at different vertices of the square.
プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットにおける蛍光を測定するための検出器としては、例えば、蛍光レーザー顕微鏡、冷却ＣＣＤカメラ及びコンピュータを連結した蛍光スキャニング装置が用いられ、マイクロアレイ上の蛍光強度を自動的に測定することができる。ＣＣＤカメラの代わりに共焦点型または非焦点型のレーザーを用いてもよい。これにより、画像データが得られる。得られたデータから、マイクロアレイ上に固定化されたプローブポリヌクレオチドに対して相補性を有するターゲットポリヌクレオチドを同定することができ、これに基づいて遺伝子発現プロファイルを作成したり、ポリヌクレオチドの塩基配列を決定したりすることが可能になる。 As a detector for measuring the fluorescence at the probe polynucleotide spot and the reference spot, for example, a fluorescence scanning device connected with a fluorescence laser microscope, a cooled CCD camera and a computer is used to automatically measure the fluorescence intensity on the microarray. Can be measured. A confocal laser or a non-focus laser may be used instead of the CCD camera. Thereby, image data is obtained. From the obtained data, target polynucleotides that are complementary to the probe polynucleotides immobilized on the microarray can be identified, and gene expression profiles can be created based on these target polynucleotides. Can be determined.
本発明の一実施形態では、マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程の後、実際の測定、すなわちプローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光の測定の前に、さらに以下の工程を実施することが好ましい。下記工程は、基準スポットにおける蛍光測定の前に実施してもよいし、後に実施してもよい。 In one embodiment of the invention, after the step of removing unreacted target polynucleotide by washing the microarray, before the actual measurement, i.e. the measurement of fluorescence at each spot where the probe polynucleotide is immobilized. Further, it is preferable to carry out the following steps. The following steps may be performed before or after the fluorescence measurement at the reference spot.
複数、好ましくはすべてのスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
バックグラウンド値を測定したすべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程。
Measuring a plurality of, preferably all of the spots, the luminance at a certain range of positions from the center of the spot to obtain a plurality of background values;
A step of calculating a background representative value representative of the obtained plurality of background values, and a difference between the background value and the background representative value for each spot where the background value is measured, A step of determining that measurement is impossible when there is a spot having the above difference.
ここで、スポットには、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットの双方が包含される。バックグラウンド値を得る複数のスポットとしては、マイクロアレイに整列して配置されたスポットのうち、少なくとも外周を形成するスポットすべてについてバックグラウンド値を測定することが好ましい。また、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定する必要はないが、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定してもよい。バックグラウンド値を測定する複数のスポットは、例えば、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されている場合、通常、少なくとも四角形の頂点の２スポット、好ましくは少なくとも四角形の頂点の４スポット、より好ましくは最外周のスポットすべてである。より具体的には、１６行×１６列のスポットであったときの最外周の６０スポット、又は１６行×１６列のスポットであったときの全スポットである２５６スポットである。 Here, the spots include both probe polynucleotide spots and reference spots. As the plurality of spots for obtaining the background value, it is preferable to measure the background value for at least all the spots forming the outer periphery among the spots arranged in alignment in the microarray. Further, it is not necessary to measure the background value for all spots, but the background value may be measured for all spots. The plurality of spots for measuring the background value are, for example, when the probe polynucleotide spot and the reference spot are arranged in a lattice having a square outer periphery, usually at least two spots at the top of a square, preferably at least a square. The four spots at the top of each, more preferably all the spots on the outermost periphery. More specifically, there are 60 spots on the outermost periphery when the spot is 16 rows × 16 columns, or 256 spots which are all spots when the spot is 16 rows × 16 columns.
スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、バックグラウンド値とする際、中心から一定の範囲は、スポットの大きさとスポット間隔等に基づいて適宜設定される。例えば、図４に示すように、スポットの中心から一定の距離以上で、スポット間隔長を一辺としスポットの中心位置を中心とした四角形の範囲内とすることができる。例えば、スポット中心から７０μｍ以上で一辺が１０００μｍの四角形の範囲内、好ましくはスポット中心から７０μｍ以上で一辺が３８０μｍの四角形の範囲内である。また、一定の範囲の位置のスポット全て又は一部について輝度を測定した平均値をバックグラウンド値としてもよいし、一定の範囲の位置の一スポットのみの輝度を測定してそれをバックグラウンド値としてもよい。 When measuring the luminance at a position within a certain range from the center of the spot to obtain a background value, the certain range from the center is appropriately set based on the size of the spot, the spot interval, and the like. For example, as shown in FIG. 4, it can be within a rectangular range centered on the center position of the spot with the spot interval length as one side at a certain distance or more from the center of the spot. For example, it is in the range of a square of 70 μm or more from the center of the spot and 1000 μm on one side, preferably in the range of a square of 70 μm or more from the center of the spot and 380 μm on one side. The average value obtained by measuring the luminance of all or part of the spots in a certain range may be used as the background value, or the luminance of only one spot in the certain range may be measured and used as the background value. Also good.
スポットの中心の位置決め方法は特に制限されないが、例えば、各スポットにおいて、所定の蛍光強度（例えば、３０００以上）を有する部分を検出し、その部分の中心とすることができる。あるいは、二箇所の基準スポットの中心を結ぶ線を基準線とし、基準スポットからの距離及び基準線からの角度、並びにスポットピッチ等から各スポットの中心位置を決定してもよい。 The method for positioning the center of the spot is not particularly limited. For example, in each spot, a portion having a predetermined fluorescence intensity (for example, 3000 or more) can be detected and set as the center of the portion. Alternatively, a line connecting the centers of two reference spots may be used as a reference line, and the center position of each spot may be determined from the distance from the reference spot, the angle from the reference line, the spot pitch, and the like.
バックグラウンド代表値は、測定した複数のバックグラウンド値を代表する値であれば特に制限されないが、好ましくは複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値である。 The background representative value is not particularly limited as long as it is a value representing a plurality of measured background values, but is preferably an average value or a median value of a plurality of background values.
すべてのスポットについて、又は、バックグラウンド値を測定した全てのスポットについてのバックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合は、スポット周囲のバックグラウンド値にばらつきが大きいと判定でき、従って、当該マイクロアレイは洗浄不良であり、信頼性に欠けることから測定不可と判断することができる。ここで、所定の値は、条件等によって異なるが、例えば、画像の表示が１６ビット諧調であるときは１０００以上に設定することができる。画像の表示が例えば８ビット諧調であるときは、１０００よりも小さい値を設定することになる。 Calculate the difference between the background value and the background representative value for all spots or for all spots for which the background value was measured, and if there is a spot with a difference greater than or equal to the specified value, Therefore, it can be determined that measurement is impossible because the microarray is poorly cleaned and lacks reliability. Here, the predetermined value varies depending on conditions and the like, but can be set to 1000 or more, for example, when the display of the image is 16-bit gradation. For example, when the display of the image is 8-bit gradation, a value smaller than 1000 is set.
本発明の別の実施形態では、マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程の後、実際の測定、すなわちプローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光の測定の前に、さらに以下の工程を実施することが好ましい。下記工程は、基準スポットにおける蛍光測定の前に実施してもよいし、後に実施してもよい。 In another embodiment of the present invention, after the step of removing unreacted target polynucleotide by washing the microarray, before the actual measurement, i.e. the measurement of fluorescence at each spot where the probe polynucleotide is immobilized. In addition, it is preferable to carry out the following steps. The following steps may be performed before or after the fluorescence measurement at the reference spot.
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値をバックグラウンド代表値として算出する工程、
バックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には測定不可と判断する工程。
Measuring a plurality of spots, respectively, the brightness of a certain range of positions from the center of the spot to obtain a plurality of background values;
Calculating an average value or median value of a plurality of background values as a background representative value;
A step of determining that measurement is impossible when the background representative value is equal to or greater than a predetermined value.
ここで、スポットには、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットの双方が包含される。バックグラウンド値を得る複数のスポットとしては、マイクロアレイに整列して配置されたスポットのうち、少なくとも外周を形成するスポットすべてについてバックグラウンド値を測定することが好ましい。また、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定する必要はないが、すべてのスポットについてバックグラウンド値を測定してもよい。バックグラウンド値を測定する複数のスポットは、例えば、プローブポリヌクレオチドのスポットと基準スポットが、外周が四角形の格子状に配置されている場合、通常、少なくとも四角形の頂点の２スポット、好ましくは少なくとも四角形の頂点の４スポット、より好ましくは最外周のスポットすべてである。より具体的には、１６行×１６列のスポットであったときの最外周の６０スポット、又は１６行×１６列のスポットであったときの全スポットである２５６スポットである。 Here, the spots include both probe polynucleotide spots and reference spots. As the plurality of spots for obtaining the background value, it is preferable to measure the background value for at least all the spots forming the outer periphery among the spots arranged in alignment in the microarray. Further, it is not necessary to measure the background value for all spots, but the background value may be measured for all spots. The plurality of spots for measuring the background value are, for example, when the probe polynucleotide spot and the reference spot are arranged in a lattice having a square outer periphery, usually at least two spots at the top of a square, preferably at least a square. The four spots at the top of each, more preferably all the spots on the outermost periphery. More specifically, there are 60 spots on the outermost periphery when the spot is 16 rows × 16 columns, or 256 spots which are all spots when the spot is 16 rows × 16 columns.
スポットの中心から一定の距離、及び中心の決定方法については、上述のとおりである。 The fixed distance from the center of the spot and the method for determining the center are as described above.
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値であるバックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には、スポット周囲のバックグラウンド値が全体的に大きいと判定でき、従って、当該マイクロアレイは洗浄不良であり、信頼性に欠けることから測定不可と判断することができる。ここで、所定の値は、条件等によって異なるが、例えば、１０００以上に設定することができる。 If the background representative value, which is the average value or median value of a plurality of background values, is greater than or equal to a predetermined value, it can be determined that the background value around the spot is large overall, and thus the microarray is poorly washed. Yes, it can be determined that measurement is impossible due to lack of reliability. Here, the predetermined value varies depending on conditions and the like, but can be set to 1000 or more, for example.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to a following example.
実施例１ 担体の調製
３ｍｍ角のシリコン基板にイオン化蒸着法を用いて、下記の条件で２層のＤＬＣ層の製膜を行った。
Example 1 Preparation of Support A two-layer DLC layer was formed on a 3 mm square silicon substrate using the ionized vapor deposition method under the following conditions.
得られた表面にＤＬＣ層を有するシリコン基板上に、下記の条件でアンモニアプラズマを用いて、アミノ基を導入した。 An amino group was introduced onto a silicon substrate having a DLC layer on the obtained surface using ammonia plasma under the following conditions.
１４０ｍＭ 無水コハク酸及び０．１Ｍ ホウ酸ナトリウムを含む１−メチル−２−ピロリドン溶液に３０分間浸漬し、カルボキシル基を導入した。０．１Ｍ リン酸カリウムバッファー、０．１Ｍ １−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、２０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシイミドを含む溶液に３０分間浸漬し、活性化を行い、シリコン基板表面にＤＬＣ層及び化学修飾基としてのＮ−ヒドロキシスクシイミド基を有する担体を得た。 It was immersed in a 1-methyl-2-pyrrolidone solution containing 140 mM succinic anhydride and 0.1 M sodium borate for 30 minutes to introduce carboxyl groups. It is activated by immersing in a solution containing 0.1 M potassium phosphate buffer, 0.1 M 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide, 20 mM N-hydroxysuccinimide for 30 minutes. A carrier having a DLC layer and an N-hydroxysuccinimide group as a chemical modification group on the substrate surface was obtained.
実施例２ マイクロアレイの作製
プローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡをそれぞれＳｏｌ．６に溶解し（２５０ｎＭ）、実施例１で作製した担体上に図１のような配置でスポット（日立ソフトウエア製 ＳＰＢＩＯ）した。基準ＤＮＡはＣｙＤｙｅ（Ｃｙ５）で標識されたものを用いた。スポットピッチは、２８０μｍとした。プローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡにおけるＤＮＡの配列は、以下のとおりである。
プローブＤＮＡ：ＴＴＧＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＣＴＴＣＧＣＴＣ（配列番号１）
基準ＤＮＡ：ＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴ（配列番号２）
Example 2 Production of Microarray Probe DNA and reference DNA were respectively prepared in Sol. 6 (250 nM), and spotted (SPBIO manufactured by Hitachi Software Co., Ltd.) on the carrier prepared in Example 1 in the arrangement as shown in FIG. The reference DNA used was labeled with CyDye (Cy5). The spot pitch was 280 μm. The DNA sequences in the probe DNA and the reference DNA are as follows.
Probe DNA: TTGTCCCGCGCCGGGCTTCGCTC (SEQ ID NO: 1)
Reference DNA: ACTGGCCGTCGTTTTAACAACGT (SEQ ID NO: 2)
６０℃で３時間ベーキングを実施した後に、次の手順で洗浄した。まず、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中、室温で、攪拌しながら１５分間洗浄し、続いて、同溶液を用いて６０℃に加熱しながら５分間洗浄し、超純水にてリンスした。再度にエアーにて吹き付け乾燥し、プローブＤＮＡ及び基準ＤＮＡがスポットされたマイクロアレイを作製した。 After baking at 60 ° C. for 3 hours, washing was performed by the following procedure. First, it was washed in 2 × SSC / 0.2% SDS at room temperature with stirring for 15 minutes, followed by washing for 5 minutes while heating to 60 ° C. using the same solution and rinsing with ultrapure water. . Again, air was blown and dried to prepare a microarray spotted with the probe DNA and the reference DNA.
上記実施例１及び２の手順に従って、２つのマイクロアレイ、すなわち、マイクロアレイ１及びマイクロアレイ２を作製した。
Two microarrays, that is,
実施例３ ターゲットＤＮＡとのハイブリダイゼーション
ラムダファージのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記プローブＤＮＡとハイブリダイズする領域を以下のプライマーセットを用いてＰＣＲで増幅した。
プライマー１：ＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＣＣＣＧＴＴＣＴＧＣ（配列番号３）
プライマー２：ＡＡＴＡＡＣＣＧＡＣＡＣＧＧＧＣＡＧＡＣ（配列番号４）
標識は、ＣｙＤｙｅ（Ｃｙ５）を用いて行った。ＰＣＲ溶液の組成は以下のとおりとした。
Example 3 Hybridization with Target DNA Using lambda phage genomic DNA as a template, the region hybridized with the probe DNA was amplified by PCR using the following primer set.
Primer 1: ACAGGGAATGCCCGTTCTGC (SEQ ID NO: 3)
Primer 2: AATAACCGACACGGGCAGAC (SEQ ID NO: 4)
Labeling was performed using CyDye (Cy5). The composition of the PCR solution was as follows.
得られたＰＣＲ産物１μｌを、ハイブリダイズ溶液２μｌに溶かし（最終濃度１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液）、実施例２で作製したマイクロアレイ１及び２にそれぞれ滴下し、湿箱に入れて４５℃で１時間インキュベートした。２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ、続いて２×ＳＳＣで洗浄し、乾燥した。
1 μl of the obtained PCR product was dissolved in 2 μl of the hybridization solution (
実施例４ マイクロアレイの信頼性の判定及びハイブリダイゼーションの検出
蛍光の測定は、図２に示すような検出器を用いて実施した。レーザーで励起光をマイクロアレイ全面に照射した。蛍光フィルターにより、目的の波長以外の波長を有する光をカットした。
Example 4 Determination of microarray reliability and detection of hybridization Measurement of fluorescence was carried out using a detector as shown in FIG. The entire surface of the microarray was irradiated with excitation light with a laser. Light having a wavelength other than the target wavelength was cut with a fluorescent filter.
まず、基準スポットの蛍光を測定した。基準スポットにおいて、８０００以上の蛍光強度を有する部分を検出し、その部分の中心を決定し、基準スポットの中心とした。基準スポットにおいて、８０００以上の蛍光強度が検出されなかった場合は、測定不可と判定することとした。マイクロアレイ１においては、基準スポット１（Ｙ＝８、Ｘ＝１）で８５００の蛍光強度が検出され、基準スポット２（Ｙ＝８、Ｘ＝８）で８１９７の蛍光強度が検出された。マイクロアレイ２においては、基準スポット１（Ｙ＝８、Ｘ＝１）で７１６８の蛍光強度が検出され、基準スポット２（Ｙ＝８、Ｘ＝８）で７２４３の蛍光強度が検出された。従って、マイクロアレイ１は測定可と判断し、マイクロアレイ２は測定不可と判断した。
First, the fluorescence of the reference spot was measured. In the reference spot, a part having a fluorescence intensity of 8000 or more was detected, the center of the part was determined, and the center of the reference spot was determined. If no fluorescence intensity of 8000 or more was detected at the reference spot, it was determined that measurement was impossible. In the
また、上記２つのマイクロアレイにおいて、二箇所の基準スポットの中心を結ぶ線を基準線とし、基準スポットからの距離及び基準線からの角度（各スポットと基準スポットを結ぶ線と基準線とがなす角度）、並びにスポットピッチから各スポットの中心位置を決定した。 In the above two microarrays, a line connecting the centers of two reference spots is used as a reference line, and a distance from the reference spot and an angle from the reference line (an angle formed by a line connecting each spot and the reference spot and the reference line). ), And the center position of each spot was determined from the spot pitch.
なお、各スポットの中心位置から２２０μｍの位置以上から、スポット間隔（２８０μｍ）長を１辺とした四角形（中心はスポット中心と同じ）の内部で囲まれるピクセルの輝度をバックグラウンド値算出対象とすることができる。最外周の全スポットのバックグラウンド値を測定し、その平均値をバックグラウンド代表値として求めた。これが所定の値（１５００）より高い場合、マイクロアレイの洗浄不良と判断し、測定不可と判断することとした。 It should be noted that the luminance of pixels surrounded by a rectangle (center is the same as the spot center) with a side of the spot interval (280 μm) as one side from the position of 220 μm or more from the center position of each spot is set as a background value calculation target. be able to. The background value of all spots on the outermost periphery was measured, and the average value was determined as the background representative value. When this was higher than a predetermined value (1500), it was determined that the microarray was poorly washed and it was determined that measurement was impossible.
また、最外周すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差をそれぞれ算出し、所定の値（１０００）以上の差を有するスポットが存在する場合にもマイクロアレイの洗浄不良と判断し、測定不可と判断することとした。 In addition, the difference between the background value and the background representative value (average value) is calculated for all the spots on the outermost circumference, and even when there is a spot having a difference of a predetermined value (1000) or more, the microarray is poorly cleaned. Therefore, it was decided that measurement was impossible.
最外周の全スポットのバックグラウンド値の測定結果、並びにバックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差を以下の表に示す。 The measurement results of the background values of all the spots on the outermost periphery, and the difference between the background value and the background representative value (average value) are shown in the following table.
マイクロアレイ１では、最外周の全スポットのバックグラウンド値の平均値は３９１．５７であった。一方、マイクロアレイ２では、最外周の全スポットのバックグラウンド値の平均値は１８７１．１４であった。従って、マイクロアレイ１は測定可と判断し、マイクロアレイ２は測定不可と判断した。
In the
また最外周の全スポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差を測定した結果、マイクロアレイ１では、所定の値（１０００）以上の差を有するスポットは存在しなかった。一方、マイクロアレイ２では、所定の値（１０００）以上の差を有するスポットが存在した。従って、マイクロアレイ１は測定可と判断し、マイクロアレイ２は測定不可と判断した。
In addition, as a result of measuring the difference between the background value and the background representative value (average value) for all the spots on the outermost periphery, in the
マイクロアレイ１及び２の蛍光画像を図３に示す。マイクロアレイ２は洗浄不良であることが蛍光画像から明らかである。以上から、本発明の方法により、ユーザーが蛍光画像を見て判断することなく、マイクロアレイごとの性能劣化や洗浄不良などを客観的に判定できることが示された。
The fluorescence images of
なお、上記実施例では最外周すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差をそれぞれ算出したが、最外周すべてのスポットのみではなく、マイクロアレイ上の全てのスポットのバックグラウンド値とバックグラウンド代表値（平均値）の差をそれぞれ算出して処理を行うこともできる。この場合には、より精度が高い判断が可能となる。 In the above embodiment, the difference between the background value and the background representative value (average value) is calculated for all the spots on the outermost circumference, but the background of all spots on the microarray is not the only spot on the outermost circumference. Processing can also be performed by calculating the difference between the ground value and the background representative value (average value). In this case, determination with higher accuracy is possible.
Claims (12)
１）プローブポリヌクレオチドが固定化された複数のスポットに加えて、蛍光標識された基準ポリヌクレオチドが固定化された基準スポットを一箇所以上有するマイクロアレイに、蛍光標識されたターゲットポリヌクレオチドを接触させる工程、
２）マイクロアレイを洗浄することにより、未反応のターゲットポリヌクレオチドを除去する工程、
３）基準スポットにおける蛍光を測定し、所定の値を満たせば測定可と判断する工程、及び
４）測定可と判断されたら、プローブポリヌクレオチドが固定化された各スポットにおける蛍光を測定する工程、
を含む、前記方法。 A method for detecting hybridization of the probe polynucleotide and a target polynucleotide using a micro array,
1) A step of bringing a fluorescently labeled target polynucleotide into contact with a microarray having at least one reference spot on which a fluorescently labeled reference polynucleotide is immobilized in addition to a plurality of spots on which a probe polynucleotide is immobilized ,
2) removing unreacted target polynucleotides by washing the microarray;
3) a step of measuring fluorescence at a reference spot and determining that measurement is possible if a predetermined value is satisfied; and 4) a step of measuring fluorescence at each spot to which the probe polynucleotide is immobilized if determined to be measurable.
Said method.
各基準スポット上を通る二つの直線が垂直に交わる交点を検出し、
前記交点と各基準スポットとを結ぶ二つの結線の長さを検出し、
前記結線の長さとスポット数から結線上の各スポット位置が検出される、請求項１又は２記載の方法。 In the microarray, the spot of the probe polynucleotide and the reference spot are arranged so as to be arranged in a lattice of a square or a rectangle on the outer periphery, and the reference spot exists at two vertices on the diagonal line,
Detect the intersection where two straight lines passing through each reference spot intersect perpendicularly,
Detecting the length of two connections connecting the intersection and each reference spot,
The method according to claim 1, wherein each spot position on the connection is detected from the length of the connection and the number of spots.
すべてのスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
すべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 After step 2) and before step 4),
For all spots, measuring the brightness of a certain range of positions from the center of the spot to obtain a plurality of background values;
A step of calculating a background representative value representing a plurality of obtained background values, and a spot having a difference greater than or equal to a predetermined value by calculating a difference between the background value and the background representative value for all spots. The method of any one of Claims 1-5 which further includes the process of determining that a measurement is impossible when there exists.
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
得られた複数のバックグラウンド値を代表するバックグラウンド代表値を算出する工程、及び
バックグラウンド値を測定したすべてのスポットについて、バックグラウンド値とバックグラウンド代表値の差をそれぞれ算出し、所定の値以上の差を有するスポットが存在する場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 After step 2) and before step 4),
Measuring a plurality of spots, respectively, the brightness of a certain range of positions from the center of the spot to obtain a plurality of background values;
A step of calculating a background representative value representative of the obtained plurality of background values, and a difference between the background value and the background representative value for each spot where the background value is measured, The method according to any one of claims 1 to 5, further comprising a step of determining that measurement is impossible when there is a spot having the above difference.
複数のスポットについて、スポットの中心から一定の範囲の位置の輝度をそれぞれ測定して、複数のバックグラウンド値を得る工程、
複数のバックグラウンド値の平均値又はメディアン値をバックグラウンド代表値として算出する工程、
バックグラウンド代表値が所定の値以上の場合には測定不可と判断する工程
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 After step 2) and before step 4),
Measuring a plurality of spots, respectively, the brightness of a certain range of positions from the center of the spot to obtain a plurality of background values;
Calculating an average value or median value of a plurality of background values as a background representative value;
The method according to claim 1, further comprising a step of determining that measurement is impossible when the background representative value is equal to or greater than a predetermined value.
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