JP5419362B2

JP5419362B2 - 活性型ｃｄ４陽性ｔ細胞の検査方法

Info

Publication number: JP5419362B2
Application number: JP2008036053A
Authority: JP
Inventors: 哲治仲; 穣藤本
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2008-02-18
Filing date: 2008-02-18
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2028-02-18
Also published as: JP2009192481A

Description

本発明は、Ｋｒｅｍｅｎ２(kringle containing transmembrane protein 2)を指標とする活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞の検査方法に関する。

免疫は、細菌、ウイルスやガン細胞などを排除し、生体を守るための仕組みであるが、免疫過剰状態となると、喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患、慢性関節リウマチや慢性甲状腺炎などの自己免疫性疾患などの免疫性疾患に陥る。

免疫をつかさどる細胞として、抗体産生細胞であるＢ細胞と、細胞性免疫に関与するＴ細胞の２種に大別される。そのうち、Ｔ細胞はリンパ球の一種で、骨髄で産生された前駆細胞が胸腺での選択を経て分化成熟したものであり、抹消血中のリンパ球の７０〜８０％を占める。白血球やその他の細胞は、細胞表面に糖タンパクなどの種々の分子を発現している。発現タンパク質は、表面マーカーまたは表面抗原とよばれ、ＣＤ(cluster of differentiation)と表記される。ヘルパーＴ細胞は、リンホカインを産生するなどして、他のＴ細胞の機能発現を誘導したり、Ｂ細胞の分化成熟や抗体産生を誘導する機能を有し、ＣＤ４を発現している。このＣＤ４陽性Ｔ細胞は、後天性免疫不全症候群 (AIDS) の病原ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス (HIV)や、成人Ｔ細胞白血病(ATL)の病原ウイルスであるヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV-1)が感染する細胞である。ウイルス感染細胞などを破壊するＣＴＬ（キラーＴ細胞）は、ＣＤ８を発現している。また、胸腺から分化してくるレギュラトリーＴ細胞はＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３分子を発現して他のＴ細胞の活性を抑制する。その他、末梢で抗原特異的に誘導されてくるレギュラトリーＴ細胞や、ＣＤ８陽性Ｔ細胞から分化するレギュラトリーＴ細胞もある。

免疫反応は複雑な機構よりなり、その調節機構は細胞表面への分泌タンパク質や膜タンパク質が関与しているものと考えられる。

クリングルドメインは、３つのジスルフィド結合を有する特徴的構造を有し、クリングルドメインを含むタンパク質として、血液凝固・線溶に関連するタンパク質、例えばプロトロンビン、血液凝固第XII因子、ｔＰＡ、プラスミノゲンなどのセリンプロテアーゼがよく知られている。これらのセリンプロテアーゼは、血液凝固・線溶機能を介して創傷治癒に関与する他、細胞外マトリックスの融解を介した血管新生や癌の浸潤に関与したり、神経の生存や軸策伸長を促進する活性を有するなど、生命維持や高次神経機能において極めて重要な生物活性を有する。そこで、Kringle-ＳＡＧＥ法によりクリングルドメインを有する分子を高効率でクローニングし、新規クリングル分子としてＫｒｅｍｅｎが得られたことが報告されている。Ｋｒｅｍｅｎのうち、Ｋｒｅｍｅｎ１についてはＤＫＫ１(dickkof homolog 1) と高親和性を有し、癌に関連するWnt/β-cateninの拮抗因子として作用することなど、その機能についていくつか報告されている（非特許文献１、２）。Wnt/β-cateninは、細胞の分化を調節する因子であり、異常な活性化が癌を引き起こすことが考えられているが（非特許文献３）、免疫に関しては殆ど解明されていない。また、Ｋｒｅｍｅｎ２についても、その構造は解析されており、マウスのＫｒｅｍｅｎ２のアミノ酸および遺伝子配列情報は、GenBank accession No. NM_028416に開示されている。

しかし、免疫反応に関して効果的な膜タンパク質の解析は十分になされておらず、またＫｒｅｍｅｎ２についても、その作用は十分に解析されていなかった。
Journal of Cell Science 116, 2627-2634 (2003) Nature 417, 664-666 (2002) Immunity 26(2); 227-239 (2007)

本発明は、免疫反応の調節因子として作用する効果的なタンパク質を提供することを課題とする。さらに、該免疫調節因子として作用するタンパク質の抗体を提供し、該抗体を含む過剰な免疫反応を制御しうる免疫性疾患治療剤を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、シグナルシークエンストラップ法を用いて脾臓およびリンパ節由来の細胞から分泌タンパク質をスクリーニングした。さらに、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をスクリーニングして配列を確認したところ、６３種類のタンパク質を同定することができ、そのうちのひとつがＫｒｅｍｅｎ２であった。Ｋｒｅｍｅｎ２について、更に解析を行ったところ、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞に特異的に分泌され、該細胞を検出する際の指標となりうることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下よりなる。
１．Ｋｒｅｍｅｎ２(kringle containing transmembrane protein 2)を指標とする活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の検査方法。
２．活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の検査方法が、抗Ｋｒｅｍｅｎ２抗体を用いることによる、前項１に記載の検査方法。

本発明のＫｒｅｍｅｎ２は抗ＣＤ３抗体で刺激したＣＤ４陽性Ｔ細胞に多く発現していることが確認された。また、ＣＤ４以外の他の表面抗原、例えばＣＤ８陽性Ｔ細胞やＢ細胞などには、発現しないことも確認された。これにより、Ｋｒｅｍｅｎ２は、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞の指標となりうることを確認できた。このことから、免疫過剰な状態を確認するための指標の一つとして利用することができる。さらに、Ｋｒｅｍｅｎ２に対する抗Ｋｒｅｍｅｎ２抗体を用いて抗原抗体反応をさせることで、補体活性が活性化され、過剰な免疫反応を引き起こす活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞を破壊し、除去することができる。これにより、免疫亢進状態により引き起こされる関節リウマチやエリテマトーデスなどの免疫性疾患の軽減・治療を行うことができる。

分泌タンパク質や膜タンパク質は、そのＮ末端に「シグナルペプチド」と呼ばれる疎水性の配列を有し、該配列をシグナルシークエンスという。シグナルシークエンストラップ法は、様々なタンパク質をコードするｃＤＮＡライブラリーから、シグナルシークエンスを有する分泌タンパク質および膜タンパク質を選択的に同定する目的で開発された方法である。Ｎ末端のシグナルシークエンス部分を欠失したトロンボポエチン受容体の部分長（ＭＰＬ）を有するベクター（例えばレトロウイルスベクターｐＭＸ）で、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを例えばＩＬ−３依存的に増殖する性質を有するＢａ／Ｆ３細胞に導入する。シグナルシークエンス部分を含む領域をコードするｃＤＮＡとの融合タンパク質が細胞表面に発現された場合にのみ、ＩＬ−３の添加なく増殖する性質を獲得するよう設計されているＢａ／Ｆ３細胞を用いて、ＩＬ−３非異存的に増殖するＢａ／Ｆ３細胞を指標とすることで、シグナルシークエンスを有するタンパク質を選択的に同定することができる。

本発明のＫｒｅｍｅｎ２(kringle containing transmembrane protein 2)は、上記シグナルシークエンス法により検出されたタンパク質の１つである。まず、マウスの脾臓およびリンパ節の細胞を、抗ＣＤ３抗体とh-TGF-β1で３日間刺激したのち、抗ＣＤ４抗体を担持した磁気ビーズを用いて、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）によりＣＤ４陽性細胞を分取した。その後、ＲＮＡを抽出したものについて、オリゴｄＴカラムでｍＲＮＡのみを精製し、ランダムヘキサマープライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。上記シグナルシークエンストラップ法により、該ｃＤＮＡライブラリーについてスクリーニングした結果、４３６クローンから２９０の配列データを取得することができ、６３種類のタンパク質を同定した。

上記６３種類のタンパク質について、各臓器および各細胞についてノザンブロット法によりさらに検討を進めた結果、脳、心臓、肝臓、胸腺および脾臓細胞からは検出されず、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に特異的に発現し、さらにＣＤ４陽性かつＣＤ２５陰性Ｔ細胞、すなわちレギュラトリーＴ細胞を除くＣＤ４陽性Ｔ細胞に特異的なタンパク質として、Ｋｒｅｍｅｎ２を検出した。

本発明のＫｒｅｍｅｎ２は、以下に示す実施例の結果より非活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞、非活性型ＣＤ８陽性Ｔ細胞、活性型ＣＤ８陽性Ｔ細胞および活性型Ｂ細胞には発現せず、活性化ＣＤ４陽性Ｔ細胞に特異的に発現することが確認された。これにより、Ｋｒｅｍｅｎ２タンパク質が、活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞に特異的に発現しうる単一マーカー（指標）として機能しうることが、本発明により初めて見出された。このことは、Ｋｒｅｍｅｎ２が、活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞に起因する、免疫過剰状態により引き起こされる各種免疫疾患の指標となりうることを意味する。従来は、ＣＤ４とＣＤ２５やＣＤ６２Ｌなどの各種マーカーを組み合わせて検査することで、活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出してきたが、本発明のＫｒｅｍｅｎ２は、単一マーカーとして機能しうることで、活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞を検出できる指標となる点が優れている。

さらに、本発明は活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞を認識しうる抗Ｋｒｅｍｅｎ２抗体にも及ぶ。活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞表面のＫｒｅｍｅｎ２と、本発明の抗Ｋｒｅｍｅｎ２抗体との抗原抗体反応により、補体が作用して活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞を破壊し、処理することができる。この作用により、活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞に起因する過剰免疫反応を制御することができ、活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞に起因する免疫性疾患を治療することができる。従って、本発明は、抗Ｋｒｅｍｅｎ２抗体を有効成分として含む免疫性疾患治療剤または免疫抑制剤にも及ぶ。抗体の作製方法は、自体公知の一般的な手法による。

以下、本発明の理解を深めるために、本発明のＫｒｅｍｅｎ２の発明に至る経緯を実施例により説明し、本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。

（実施例１）Ｋｒｅｍｅｎ２のノザンブロッティング法による解析１
マウス（C57BL/6、６週齢、オス）のリンパ節、脳、心臓、肝臓、胸腺および脾臓の細胞を取得した。リンパ節および脾臓については、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）により、抗ＣＤ４抗体を担持するビーズを用いてＣＤ４陽性（以下、「ＣＤ４^＋」ともいう。）Ｔ細胞を分取した。さらに、ＣＤ４^＋Ｔ細胞であり、かつＣＤ２５陰性（ＣＤ２５⁻）Ｔ細胞を分取した。各細胞について、抗ＣＤ３抗体（0.5μｇ／ｍｌ）による３日間の刺激後にＲＮＡを抽出した。各細胞からのＲＮＡの抽出は、RNA-Bee^TM試薬（TEL-TEST社製）を用いて行った。

各細胞から抽出したＲＮＡについて、ディゴキシジェニン（ＤＩＧ）でラベルしたマウスＫｒｅｍｅｎ２プローブ（配列番号１）を用いて、ブロッティングを行った。ＤＩＧによるプローブのラベル化は、通常の方法に従った。また、ハウスキーピング遺伝子として、ＧＡＰＤＨについても、同様にブロッティングを行った。

マウスＫｒｅｍｅｎ２プローブ配列：ttcct cctcctcttc ccattgctgc tgcggctgca cggggcctca gcagggagcc tgcacagtcc aggcttgtcc gaatgcttcc aggtgaacgg cgctgactac cgaggccacc agaactacac cggcccacgc ggagctggac gcccttgtct tttctgggac cagacacagc agcacagcta cagcagcgcc agcgaccctc agggccgctg ggggttgggt gcgcataact tctgtaggaa cccagacggt gatgtgcagc cctggtgcta cgtggcagag acagaagagg gcatctactg gcgctactgt gatatcccca catgtcacat gcctgggtac ctgggctgct tcgtggactc tggggcaccc cctgctctca gtggtcccag tggcacctcc acaaagctca ctgtccaagt gtgccttcga ttctgccgca tgaagggcta ccagctggct ggtgtggagg ctggttatgc ctgcttctgt ggctctgaaa gtgacctggc ccgcggacgt ccagcccctg ccaccgactg tgaccagatc tgttttggcc acccaggcca gctctgtgga ggcgatggac gactaggcat ctatgaagtg tctgtgggct cctgccaggg aaactggtcg gctcctcaag gagtcatcta ctccccggat tttccggatg agtatggacc agaccggaac tgcagctggg tattgggcca actgggcgct gtgctagaac tcaccttccg cctcttcgag ttggctgatt ctcgagaccg gctggagcta cgcgacgtct cgtccggcaa cctactccgt gccttcgacg gcgcccatcc gccgcctccg ggaccgctgc gcctgcgcac tgctgcgctg ctgctcacct tccgcagcga cgcaagaggc catgctcaag gcttcgcgct cacctaccgc gggctgcagg atacagtgga gggcagagca tctccagagg attcaactga gagtctcgca g（配列番号１）

その結果、図１に示すように、脳、心臓、肝臓、胸腺および脾臓由来細胞には、Ｋｒｅｍｅｎ２の発現は確認することができなかったが、ＣＤ４^＋Ｔ細胞にＫｒｅｍｅｎ２の発現が認められ、さらにＣＤ４^＋かつＣＤ２５⁻Ｔ細胞にはＫｒｅｍｅｎ２が強く発現していることが確認された。

（実施例２）Ｋｒｅｍｅｎ２のノザンブロッティング法による解析２
実施例１と同様のマウスのリンパ節および脾臓細胞から、ＭＡＣＳによりＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を分取し、さらにＢ細胞を分取した。まず、抗ＣＤ４抗体を担持するビーズで分画したものを非活性型ＣＤ４^＋Ｔ細胞とし、残りをさらに抗ＣＤ９０抗体を担持するビーズで分画したものを非活性型ＣＤ８^＋Ｔ細胞とし、残りは非活性型Ｂ細胞とした。各細胞について、刺激せずＲＮＡを抽出した。

次に、上記ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（各１μｇ／ｍｌ）で固定化した９６穴プレートに、細胞数１×１０^６個／ｍｌを１００μｌ播種した。さらにマウスＩＬ−２を最終濃度で１０ｎｇ／ｍＬになるように加え、ＲＰＭＩ−１６４０培地（胎児ウシ血清ＦＣＳ）１０ｖ／ｖ％添加）を用いて４日間、３７℃で培養して刺激したものを、活性型ＣＤ４^＋Ｔ細胞および活性型ＣＤ８^＋Ｔ細胞とした。また、Ｂ細胞については、ＬＰＳ（リポ多糖, Lipopolysaccharide）を２μｇ／ｍＬ加えて同様に４日間培養して刺激したものを活性型Ｂ細胞とした。刺激後の各細胞からＲＮＡを抽出した。

各細胞からのＲＮＡの抽出およびＫｒｅｍｅｎ２の検出は、実施例１と同様に行った。また、ハウスキーピング遺伝子として、Ｇ３ＰＤＨについても、同様にブロッティングを行った。

その結果、図２に示すように、非活性型のＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＢ細胞並びに活性型のＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＢ細胞にはＫｒｅｍｅｎ２の発現は認められなかったが、活性型のＣＤ４^＋Ｔ細胞にのみＫｒｅｍｅｎ２の発現を認めた。これにより、Ｋｒｅｍｅｎ２は、活性型ＣＤ４^＋Ｔ細胞の単一マーカーになりうることが確認された。

（実施例３）ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）上のＫｅｍｅｎ２の確認
ヒト末梢血からＰＢＭＣを分取し、以下の刺激によりＰＢＭＣ上のＫｒｅｍｅｎ２の発現を調べた。

ＰＢＭＣを、９６穴プレートに、細胞数１×１０^６個／ｍｌの濃度で２．５ｍＬ播種し、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（各１μｇ／ｍＬ）、およびマウスＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＬＰＳ（２μｇ／ｍＬ）を加え、ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＦＣＳ１０ｖ／ｖ％添加）を用いて４日間３７℃で培養し、刺激した。刺激後の細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１％のトリトンＸ−１００、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０％のグリセロール、１ｍＭの［ｐ-アミジノフェニル］メタンスルホニルフルオライドハイドロクロライド、１μｇ／ｍｌのロイペプチンおよび１μｇ／ｍｌのペプスタチンを含む５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液［ｐＨ７．６］）で処理し、ウェスタンブロッティング法により解析した。検出にあたっては、抗ヒトＫｒｅｍｅｎ２抗体（Ｒ＆Ｄ社）を用いた。

その結果、図３に示すように、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２で刺激した場合は、ＩＬ−４の刺激の有無にかかわらずＫｒｅｍｅｎ２の発現を認めたが、ＬＰＳで刺激した場合は、ＩＬ−４の刺激の有無にかかわらず、Ｋｒｅｍｅｎ２の発現は認められなかった。これにより、Ｋｒｅｍｅｎ２はヒトにおいてもＴ細胞活性化によって発現が誘導されることが確認された。

（実施例４）Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＫｅｍｅｎ２の確認
ヒト由来Ｊｕｒｋａｔ細胞（白血病細胞）について、以下の刺激によりＫｒｅｍｅｎ２の発現を調べた。Ｊｕｒｋａｔ細胞をＦＣＳ１０ｖ／ｖ％を含むＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて１日間３７℃で培養した後、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−４、並びにp-３８ＭＡＰキナーゼインヒビター（SB203580：Sigma社）で刺激した。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体刺激の場合は、各々１０μｇ／ｍＬ加えて一晩培養し、ＩＬ−４刺激の場合は１００ｎｇ／ｍＬ加えて一晩培養し、SB203580刺激の場合は、p-３８ＭＡＰキナーゼインヒビターの最終濃度で５μＭを加えて培養した。各刺激した細胞についてＲＮＡの抽出を行った。ＲＮＡの抽出は、実施例２と同様に行った。検出は、Ｋｒｅｍｅｎ２についてＲＴ−ＰＣＲを行い検出した。

ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーは、以下を用いた。
プライマー１：ACACCTGAGATGCTGTGCTG（配列番号２）
プライマー２：CAAAGACCTCCGAAACCAGA（配列番号３）
ＲＴ−ＰＣＲは、９８℃１０秒後、５９℃０秒、７２℃３０秒を３７サイクル行い実施した。

その結果、図４に示すように、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体で刺激した場合は、ＩＬ−４およびＳＢの刺激の有無にかかわらずＫｒｅｍｅｎ２の発現を認めたが、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体で刺激しなかった場合は、ＩＬ−４およびＳＢの刺激の有無にかかわらず、Ｋｒｅｍｅｎ２の発現は認められなかった。
これにより、Ｋｒｅｍｅｎ２の発現誘導には活性化が重要であることがヒト由来白血病細胞においても確認された。

以上説明したように、本発明によりＫｒｅｍｅｎ２は活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に特異的に発現し、例えば非活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞や、ＣＤ８^＋Ｔ細胞には発現しないことから、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞の単一のマーカー（指標）となりうることが確認された。これにより、Ｋｒｅｍｅｎ２は、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に起因する免疫過剰による免疫性疾患を検出する指標として使用することができる。また、Ｋｒｅｍｅｎ２が活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞の単一の指標となりうることから、Ｋｒｅｍｅｎ２に対する抗体を用いて抗原抗体反応を行わせることにより、補体の作用により活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞を消滅させることができ、活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に起因する免疫過剰による免疫性疾患の治療薬または免疫抑制剤の有効成分として用いることができる。さらには、Ｋｒｅｍｅｎ２に対する抗体を用いることにより薬剤を活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞に対して作用させるターゲッティング療法を行うことも可能である。

マウス細胞におけるＫｒｅｍｅｎ２発現のノザンブロッティングによる解析結果を示す図である。（実施例１）マウス細胞におけるＫｒｅｍｅｎ２発現のノザンブロッティングによる解析結果を示す図である。（実施例２）ヒト細胞におけるＫｒｅｍｅｎ２発現のウェスタンブロッティングによる解析結果を示す図である。（実施例３）Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＫｒｅｍｅｎ２発現のＲＴ−ＰＣＲによる解析結果を示す図である。（実施例４）

Claims

Ｋｒｅｍｅｎ２(kringle containing transmembrane protein 2)を指標とする活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の検査方法。
活性型ＣＤ４陽性Ｔ細胞の検査方法が、抗Ｋｒｅｍｅｎ２抗体を用いることによる、請求項１に記載の検査方法。