JP5399119B2 - Yeast with reduced hydrogen sulfide production capacity - Google Patents
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Description
本発明は酵母の硫化水素生産能を低下させることに関する。特に本発明はアルコール飲料製造用酵母の硫化水素生産能を低下させることに関する。より具体的には、本発明はワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、シャンパン酵母、ビール酵母の硫化水素生産能を低下させることに関する。 The present invention relates to reducing the ability of yeast to produce hydrogen sulfide. In particular, the present invention relates to reducing the hydrogen sulfide producing ability of yeast for producing alcoholic beverages. More specifically, the present invention relates to reducing the hydrogen sulfide producing ability of wine yeast, sake yeast, shochu yeast, champagne yeast, and brewer's yeast.
酵母は様々な分野で利用されており、特にワイン、清酒、焼酎、ビール、発泡酒、酒税法上「ビール」または「発泡酒」に属さない、いわゆる第三のビール等のアルコール飲料の製造に有用である。アルコール飲料は一般にぶどう、麦芽、麹醗酵させた米等の種々の原料を酵母によって発酵させて製造される。アルコール飲料製造用の酵母として、例えば、ワイン製造用のワイン酵母、清酒製造用の清酒酵母、焼酎製造用の焼酎酵母、発泡性ワイン製造用のシャンパン酵母、ビール製造用のビール酵母（上面ビール酵母および下面ビール酵母を含む）等が知られている。生物学的に分類すれば、アルコール飲料製造用の酵母には、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae；S.セレビシアエ)、サッカロミセス・バヤヌス（Saccaromyces bayanus；S.バヤヌス）、サッカロミセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus；S.パストリアヌス)が含まれる。特にビール製造に使用されるビール酵母にはS.セレビシアエおよびS.パストリアヌスが含まれる。また、ビール酵母は歴史的にビール醸造過程で発酵後に見られるビール酵母の動態により、発酵後表面付近に浮き上がる「上面ビール酵母」と発酵後凝集して沈む「下面ビール酵母」とに区別されてきたが、現在では下面ビール酵母と上面ビール酵母とは生物学的分類において異なる種であり、上面ビール酵母は主としてS.セレビシアエに分類され、下面ビール酵母はS.セレビシアエとS.バヤヌスとの交雑体であると一般に認識されており、分類学上はS.パストリアヌスに分類されている。ビール醸造においては、発酵が終了して沈降した酵母を回収して次回の発酵に使用するため、下面ビール酵母がよく利用されており実用上特に有用である。
一般に酵母を用いたアルコール飲料製造の際に含硫化合物が生成されることがある。含硫化合物の中には、醸造酒等のアルコール飲料の品質を低下させるものがある。例えば、日光臭の原因物質MBT（3-メチル-2-ブテン-1-チオール）やネギ臭の原因物質2M3MB（2-メルカプト-3-メチル-1-ブタノール）がそれに該当する。これらがアルコール飲料の品質を低下させることがあるが、これらの含硫化合物は発酵中に酵母により生成される硫化水素が原因で生成されると考えられている。発酵中に発生する硫化水素は、酵母が硫酸イオンを利用してメチオニンを合成する過程で副次的に生成されると考えられている。また、このとき発生する硫化水素自体も硫黄臭の原因となり、アルコール飲料の品質に好ましくない影響を与える。例えば酵母を用いてビール、発泡酒、いわゆる第三のビール等のアルコール飲料を製造する場合に、3-メチル-2-ブテン-1-チオール（MBT）や2-メルカプト-3-メチル-1-ブタノール(2M3MB)等の含硫化合物が製品であるアルコール飲料の品質を低下させることがしばしば問題となっている。
Yeast is used in various fields, especially for the production of alcoholic beverages such as wine, refined sake, shochu, beer, happoshu, so-called third beer that does not belong to "beer" or "happoshu" under the liquor tax law. Useful. Alcoholic beverages are generally produced by fermenting various raw materials such as grapes, malt, fermented rice and the like with yeast. Examples of yeasts for producing alcoholic beverages include wine yeasts for producing wine, sake yeast for producing sake, shochu yeast for producing shochu, champagne yeast for producing sparkling wine, beer yeast for producing beer (upper beer yeast) And lower surface beer yeast). Biologically, yeast for alcoholic beverage production includes Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), Saccaromyces bayanus (S. bayanus), Saccharomyces pastorianus (S.). Pastorian). In particular, brewer's yeasts used in beer production include S. cerevisiae and S. pastorianus. Beer yeast has historically been differentiated between “upper brewer's yeast” that floats near the surface after fermentation and “lower brewer's yeast” that agglomerates and sinks after fermentation due to the dynamics of brewer's yeast found after fermentation in the brewing process. However, the lower brewer's yeast and the upper brewer's yeast are currently different species in biological classification, the upper brewer's yeast is mainly classified as S. cerevisiae, and the lower brewer's yeast is a cross between S. cerevisiae and S. bayanus. It is generally recognized as a body and is classified as S. pastorian on taxonomics. In beer brewing, the bottom beer yeast is often used and is particularly useful in practice because the yeast that has settled after the fermentation is collected and used for the next fermentation.
In general, sulfur-containing compounds may be produced during the production of alcoholic beverages using yeast. Some sulfur-containing compounds degrade the quality of alcoholic beverages such as brewed sake. For example, the causative substance MBT (3-methyl-2-butene-1-thiol) that causes sunlight odor and the causative substance 2M3MB (2-mercapto-3-methyl-1-butanol) that causes leeks are applicable. Although these can degrade the quality of alcoholic beverages, these sulfur-containing compounds are believed to be produced due to hydrogen sulfide produced by yeast during fermentation. Hydrogen sulfide generated during fermentation is thought to be produced as a secondary product in the process of yeast synthesizing methionine using sulfate ions. Moreover, the hydrogen sulfide itself generated at this time also causes a sulfur odor, which adversely affects the quality of the alcoholic beverage. For example, when producing alcoholic beverages such as beer, happoshu, so-called third beer using yeast, 3-methyl-2-butene-1-thiol (MBT) or 2-mercapto-3-methyl-1- It is often a problem for sulfur-containing compounds such as butanol (2M3MB) to reduce the quality of the product alcoholic beverage.
このような問題を解決するために、硫化物代謝に関与する酵素の遺伝子の発現を強化する方法（特許文献１〜３）、含硫アミノ酸アナログ耐性株から硫化水素生産能の低い酵母株を選抜する方法（特許文献４）、硫化水素生産能の低い酵母株を選抜するためのプライマーセット（特許文献５）等が報告されている。これらの技術は用いる酵母菌株や培地によって効果が異なり、普遍的に硫化水素産生を抑制するものとはいえない。例えば、特許文献３では、硫化水素を代謝するMET25(MET17)遺伝子を強発現させることにより産生する硫化水素量を低減できることを報告しているが、酵母菌株によってはその効果が全くでないことが報告されている（非特許文献１）。
アルコール飲料を製造する際の発酵液中の窒素源量と硫化水素産生量との関係については、発酵液中の窒素源量が少ないほど発酵中に産生される硫化水素量が多いことが報告されている（非特許文献２、３）。窒素成分量が減少すると認められると、酵母では次のような生体反応が生じると考えられている。酵母はアミノ酸（プロリン除く）やアンモニウム塩といった資化しやすい窒素源が欠乏すると、資化しにくい窒素源であるプロリン、アラントイン、尿素といった窒素源を資化するための酵素、および、これらの透過蛋白質等をコードする遺伝子群（NCR(Nitrogen Catabolite Repression)遺伝子群）の転写が活性化される。この遺伝子群の転写活性化に関与している転写活性化因子がGLN3である。この遺伝子産物の126から138のアミノ酸残基はα−へリックスモチーフであり、転写活性化に関与していると考えられている。また、この遺伝子産物の306から330のアミノ酸残基は多くの転写活性化因子に見られるジンクフィンガー（zinc finger；Znフィンガー）モチーフを有しており、NCR遺伝子群のプロモーター領域のGATAシークエンスへの結合に関与していると考えられている。さらに、510から720のアミノ酸残基は、栄養源シグナルに関与するタンパク質であるTorタンパク質との結合に関与すると考えられている（非特許文献４、５）。
実験室酵母S.セレビシアエについてはゲノム解読が完了しており、データベースも完備している（http://www.yeastgenome.org/）。GLN3遺伝子を破壊した実験室酵母株は既に報告されている（非特許文献６、７）。このデータベースからの情報に基づいて、下面ビール酵母のS.セレビシアエ型GLN3遺伝子(SC-GLN3)のヌクレオチド配列は配列番号１に記載された配列であり、GLN3タンパク質をコーディングするORF領域は配列番号１のヌクレオチド番号796から2986までであると考えられている。非特許文献６に記載されている実験室酵母のGLN3遺伝子破壊は、配列番号１のヌクレオチド番号1238から4398の領域を選択マーカー遺伝子と置換する、配列番号１のヌクレオチド番号770から4398の領域を選択マーカー遺伝子と置換する、または、配列番号1のヌクレオチド番号1238から1998を選択マーカー遺伝子と置換することによって行われている。そのような酵母ではNCR遺伝子群であるDAL1,DAL2,DAL7等の窒素源飢餓時（あるいは、資化しにくい窒素源のみである場合）の遺伝子発現誘導が生じないことが報告されている（非特許文献７）。
一方、上述したアルコール飲料製造用酵母の硫化水素産生とGLN3遺伝子との関連性についての報告はこれまでになされていない。
In order to solve such problems, methods for enhancing the expression of genes of enzymes involved in sulfide metabolism (
Regarding the relationship between the amount of nitrogen source in the fermented liquor and the amount of hydrogen sulfide produced when producing alcoholic beverages, it is reported that the smaller the amount of nitrogen source in the fermented liquid, the more hydrogen sulfide produced during fermentation. (Non-Patent Documents 2 and 3). If it is recognized that the amount of nitrogen component decreases, it is considered that the following biological reactions occur in yeast. When yeast lacks easily assimilable nitrogen sources such as amino acids (excluding proline) and ammonium salts, enzymes that assimilate nitrogen sources such as proline, allantoin, and urea, which are difficult to assimilate, and their permeation proteins, etc. Transcription of a gene group encoding NCR (Nitrogen Catabolite Repression (NCR) gene group) is activated. The transcriptional activator involved in the transcriptional activation of this gene group is GLN3. The amino acid residues 126 to 138 of this gene product are α-helix motifs and are thought to be involved in transcriptional activation. In addition, the amino acid residues 306 to 330 of this gene product have a zinc finger (Zn finger) motif found in many transcriptional activators, and the promoter region of the NCR gene cluster is linked to the GATA sequence. It is thought to be involved in binding. Furthermore, amino acid residues 510 to 720 are considered to be involved in binding to Tor protein, which is a protein involved in nutrient signal (Non-Patent Documents 4 and 5).
The genome of the laboratory yeast S. cerevisiae has been completed and the database is complete (http://www.yeastgenome.org/). Laboratory yeast strains that have disrupted the GLN3 gene have already been reported (Non-Patent Documents 6 and 7). Based on the information from this database, the nucleotide sequence of the S. cerevisiae GLN3 gene (SC-GLN3) of the bottom brewer's yeast is the sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and the ORF region encoding the GLN3 protein is SEQ ID NO: 1. Nucleotide number 796 to 2986. The GLN3 gene disruption of laboratory yeast described in Non-Patent Document 6 selects the region of nucleotide numbers 770 to 4398 of SEQ ID NO: 1, which replaces the region of nucleotide numbers 1238 to 4398 of SEQ ID NO: 1 with a selectable marker gene This is done by replacing the marker gene or by replacing nucleotide numbers 1238 to 1998 of SEQ ID NO: 1 with a selectable marker gene. It has been reported that such yeast does not induce gene expression during starvation of nitrogen sources such as the NCR genes DAL1, DAL2, and DAL7 (or when only nitrogen sources that are difficult to assimilate) (non-patented) Reference 7).
On the other hand, there has been no report on the relationship between the above-mentioned production of hydrogen sulfide in yeast for alcoholic beverage production and the GLN3 gene.
本発明により、硫化水素生産能が低下した酵母、特に硫化水素生産能が低下したアルコール飲料製造用酵母が提供される。特に、本発明により、硫化水素生産能が低下したビール酵母、特に硫化水素生産能が低下した下面ビール酵母が提供される。
本発明により、酵母、特にアルコール飲料製造用酵母ビールの硫化水素生産能を低下させる方法が提供される。また本発明により、ビール酵母、特に下面ビール酵母の硫化水素生産能を低下させる方法が提供される。
According to the present invention, there is provided a yeast for producing alcoholic beverages having a reduced hydrogen sulfide-producing ability, particularly a yeast for producing a hydrogen sulfide. In particular, according to the present invention, a brewer's yeast having a reduced hydrogen sulfide-producing ability, particularly a bottom brewer's yeast having a reduced hydrogen sulfide-producing ability is provided.
The present invention provides a method for reducing the hydrogen sulfide producing ability of yeast, particularly yeast beer for producing alcoholic beverages. In addition, the present invention provides a method for reducing the hydrogen sulfide producing ability of brewer's yeast, particularly lower surface brewer's yeast.
本発明はゲノム中のGLN3遺伝子が破壊されたアルコール飲料製造用酵母である。本発明は、ゲノム中のGLN3遺伝子が破壊されたビール酵母、特にゲノム中のGLN3遺伝子が破壊された下面ビール酵母でもある。
さらに、本発明はゲノム中のGLN3遺伝子にGLN3遺伝子中へDNA断片が挿入された結果GLN3遺伝子が破壊されたアルコール飲料製造用酵母である。本発明は、ゲノム中のGLN3遺伝子にDNA断片が挿入された結果GLN3遺伝子が破壊されたビール酵母、特に下面ビール酵母でもある。
本発明は、アルコール飲料製造用酵母ゲノム中のGLN3遺伝子を破壊することを含む、対応するGLN3遺伝子非破壊株に比較してアルコール飲料製造用酵母の硫化水素生産能を低下させる方法でもある。特に、本発明は、ビール酵母、特に下面ビール酵母ゲノム中のGLN3遺伝子を破壊することを含む、対応するGLN3遺伝子非破壊株に比較してビール酵母の硫化水素生産能を低下させる方法でもある。
また本発明はアルコール飲料製造用酵母のゲノム中のGLN3遺伝子にDNA断片を挿入することによってGLN3遺伝子を破壊することを含む、対応するGLN3遺伝子非破壊株に比較して酵母の硫化水素生産能を低下させる方法でもある。特に、本発明は、ビール酵母、特に下面ビール酵母のゲノム中のGLN3遺伝子にDNA断片を挿入することによってGLN3遺伝子を破壊することを含む、対応するGLN3遺伝子非破壊株に比較して酵母の硫化水素生産能を低下させる方法でもある。
特に、GLN3遺伝子に挿入されるDNA断片は好ましくはGLN3の機能と無関係のDNA断片である。
また、本発明は本発明のアルコール飲料製造用酵母による醗酵工程を含む、アルコール飲料の製造方法でもある。
The present invention is a yeast for alcoholic beverage production in which the GLN3 gene in the genome is disrupted. The present invention is also a brewer's yeast in which the GLN3 gene in the genome is disrupted, particularly a bottom brewer's yeast in which the GLN3 gene in the genome is disrupted.
Furthermore, the present invention is a yeast for alcoholic beverage production in which the GLN3 gene is disrupted as a result of the insertion of a DNA fragment into the GLN3 gene in the GLN3 gene in the genome. The present invention is also a brewer's yeast, particularly a lower brewer's yeast, in which the GLN3 gene is disrupted as a result of the insertion of a DNA fragment into the GLN3 gene in the genome.
The present invention is also a method for reducing the hydrogen sulfide-producing ability of a yeast for producing alcoholic beverages as compared to a corresponding non-destructed GLN3 gene strain, comprising disrupting the GLN3 gene in the yeast genome for producing alcoholic beverages. In particular, the present invention is also a method for reducing the hydrogen sulfide producing ability of brewer's yeast as compared to the corresponding non-destructed strain of GLN3 gene, comprising disrupting the GLN3 gene in the brewer's yeast, particularly the lower brewer's yeast genome.
The present invention also includes the ability of yeast to produce hydrogen sulfide as compared to the corresponding non-destructed strain of GLN3 gene, which comprises disrupting the GLN3 gene by inserting a DNA fragment into the GLN3 gene in the genome of yeast for alcoholic beverage production. It is also a method of reducing. In particular, the present invention relates to sulfidation of yeast as compared to the corresponding non-destructed strain of GLN3 gene comprising disrupting the GLN3 gene by inserting a DNA fragment into the GLN3 gene in the genome of brewer's yeast, particularly lower brewer's yeast. It is also a method of reducing the hydrogen production capacity.
In particular, the DNA fragment inserted into the GLN3 gene is preferably a DNA fragment unrelated to the function of GLN3.
Moreover, this invention is also a manufacturing method of an alcoholic beverage including the fermentation process by the yeast for alcoholic beverage manufacture of this invention.
本発明によれば、用いる酵母菌株、培養温度、培地組成等による影響を低く抑えつつ、効果的にアルコール飲料製造用酵母の硫化水素生成能、特にビール酵母の硫化水素生成能を抑制することができる。本発明の酵母（特に下面ビール酵母）および方法は、窒素源が比較的少ない条件で酵母による醗酵を行なう場合に酵母による硫化水素生成を抑制するために特に有用である。本発明の酵母および方法は、ワイン、清酒、焼酎、発泡性ワイン、ビール、発泡酒、いわゆる第三のビール等の製造において酵母による硫化水素生成を抑制するのに有用である。 According to the present invention, it is possible to effectively suppress the hydrogen sulfide producing ability of yeast for alcoholic beverage production, in particular, the hydrogen sulfide producing ability of brewer's yeast, while keeping the influence of the yeast strain used, the culture temperature, the medium composition, etc. low. it can. The yeast (especially bottom brewer's yeast) and method of the present invention are particularly useful for suppressing hydrogen sulfide production by the yeast when fermentation is carried out under conditions where the nitrogen source is relatively low. The yeast and method of the present invention are useful for suppressing hydrogen sulfide production by yeast in the production of wine, sake, shochu, sparkling wine, beer, sparkling wine, so-called third beer and the like.
本発明により、硫化水素生成能が抑制されたアルコール飲料製造用酵母、特に硫化水素生成能が抑制されたビール酵母が提供される。特に好ましい態様において、ビール酵母は下面ビール酵母である。本明細書において「アルコール飲料製造用酵母」とは工業的または商業的にアルコール飲料製造に用いられる酵母を意味し、例えば、ワイン製造用のワイン酵母、清酒製造用の清酒酵母、焼酎製造用の焼酎酵母、発泡性ワイン製造用のシャンパン酵母、ビール製造用のビール酵母（上面ビール酵母および下面ビール酵母を含む）等が含まれる。これらのアルコール飲料製造用酵母は、実験室酵母株に比較してそれぞれのアルコール飲料製造に特に適した種々の特性を有している一方、実験室酵母株に比較して硫化水素産生能が高い酵母も存在し、その硫化水素産生能がアルコール飲料製造過程において問題となることもある。
特に、本明細書において「ビール酵母」とは、ビール、発泡酒および第三のビール等の製造に使用されることのある酵母を意味し、特に「下面ビール酵母」とは、ビールおよび発泡酒等の製造に使用されることのあるS.セレビシアエ(SC)とS.バヤヌス(SB)の自然交雑体であって、S.パストリアヌスに分類される酵母を意味する。
本発明の硫化水素生成能が抑制されたアルコール飲料製造用酵母、特にビール酵母は、酵母ゲノム中のGLN3遺伝子の機能を抑制することによって作成することができる。
上述のように、下面ビール酵母のSC-GLN3遺伝子のヌクレオチド配列が明らかになっており（配列番号１）、SC-Gln3タンパク質をコードするORF領域は配列番号１のヌクレオチド番号794からヌクレオチド番号2986までであると考えられている。ORFから翻訳されるSC-Gln3のアミノ酸配列を配列番号２に示す。さらに、下面ビール酵母のゲノム解読の結果（特許文献５）およびSC-GLN3遺伝子とのヌクレオチド配列の相同性に基づいてSB型GLN3遺伝子(SB-GLN3)のヌクレオチド配列も推定することができる。推定されたSB-GLN3のヌクレオチド配列を配列番号３に示す。SB-Gln3タンパク質をコードするORF領域は配列番号３のヌクレオチド番号582からヌクレオチド番号2771までであると考えられる。SB-Gln3の予想されたアミノ酸配列を配列番号４に示す。SB-Gln3のアミノ酸数は729であり、SC-Gln3のアミノ酸数730とほぼ同じである。実験室酵母S.セレビシアエ、他のアルコール飲料製造用酵母のGLN3遺伝子もこれらの配列情報に基づいて作製した適切なプローブを用いて得ることができる。
実験室酵母のゲノムデータベース(SGD: Saccharomyces Genome Database)によると、SC-GLN3のプロモーター領域の制御領域として、配列番号１のヌクレオチド番号595-601がDNA結合タンパク質REB1の結合領域であると考えられており、配列番号１のヌクレオチド番号652-658が転写活性化因子GCN4の結合領域と考えられている。SB-GLN3のプロモーター領域においてもGCN4の結合領域の配列はよく保存されている（配列番号3の445-451）。
According to the present invention, there is provided a yeast for alcoholic beverage production in which hydrogen sulfide production ability is suppressed, particularly beer yeast in which hydrogen sulfide production ability is suppressed. In a particularly preferred embodiment, the brewer's yeast is a bottom brewer's yeast. In the present specification, “yeast for alcoholic beverage production” means yeast used industrially or commercially for alcoholic beverage production. For example, wine yeast for wine production, sake yeast for sake production, and shochu production. Shochu yeast, champagne yeast for producing sparkling wine, beer yeast for beer production (including upper surface beer yeast and lower surface beer yeast) and the like are included. These yeasts for producing alcoholic beverages have various characteristics particularly suitable for producing each alcoholic beverage compared to laboratory yeast strains, while having higher hydrogen sulfide producing ability than laboratory yeast strains. Yeast also exists, and its ability to produce hydrogen sulfide can be a problem in the process of producing alcoholic beverages.
In particular, in the present specification, “beer yeast” means yeast that may be used in the production of beer, happoshu, and third beer, and particularly “bottom beer yeast” means beer and happoshu. It means a natural hybrid of S. cerevisiae (SC) and S. bayanus (SB), which is sometimes used for the production of S. pastorianus.
The yeast for producing alcoholic beverages, particularly brewer's yeast, in which the ability to produce hydrogen sulfide of the present invention is suppressed can be prepared by suppressing the function of the GLN3 gene in the yeast genome.
As described above, the nucleotide sequence of the SC-GLN3 gene of the lower surface brewer's yeast has been clarified (SEQ ID NO: 1), and the ORF region encoding the SC-Gln3 protein is from nucleotide number 794 to nucleotide number 2986 of SEQ ID NO: 1. It is considered to be. The amino acid sequence of SC-Gln3 translated from ORF is shown in SEQ ID NO: 2. Furthermore, the nucleotide sequence of the SB-type GLN3 gene (SB-GLN3) can also be estimated based on the results of genome decoding of the lower brewer's yeast (Patent Document 5) and the nucleotide sequence homology with the SC-GLN3 gene. The deduced nucleotide sequence of SB-GLN3 is shown in SEQ ID NO: 3. The ORF region encoding the SB-Gln3 protein is considered to be nucleotide number 582 to nucleotide number 2771 of SEQ ID NO: 3. The predicted amino acid sequence of SB-Gln3 is shown in SEQ ID NO: 4. SB-Gln3 has 729 amino acids, which is almost the same as SC-Gln3's 730 amino acids. The GLN3 gene of laboratory yeast S. cerevisiae and other yeast for producing alcoholic beverages can also be obtained using appropriate probes prepared based on these sequence information.
According to the laboratory yeast genome database (SGD: Saccharomyces Genome Database), nucleotide numbers 595-601 of SEQ ID NO: 1 are considered to be the binding region of DNA-binding protein REB1 as the regulatory region of the promoter region of SC-GLN3. Thus, nucleotide numbers 652-658 of SEQ ID NO: 1 are considered to be the binding region of the transcriptional activator GCN4. Even in the promoter region of SB-GLN3, the sequence of the binding region of GCN4 is well conserved (445-451 of SEQ ID NO: 3).
GLN3遺伝子のヌクレオチド配列およびそれによってコードされるGln3タンパク質のアミノ酸配列の情報に基づいて酵母ゲノム中のGLN3遺伝子の機能を抑制することができる。そのような抑制は例えばGLN3遺伝子を破壊すること、より具体的には、例えばGLN3遺伝子の発現を転写または翻訳レベルで阻害することまたはGln3の機能を失わせることによって行なうことができる。本明細書において、GLN3遺伝子の破壊とは、GLN3遺伝子の機能をGLN3遺伝子非破壊親株のGLN3遺伝子の機能に比較して少なくとも80％以下、好ましくは60％以下、特に好ましくは40％以下まで低下させることをいう。たとえば、Gln3の標的遺伝子のプロモーターにレポーター遺伝子を接続した構築物を作製して酵母細胞に導入し、その構築物の転写量を測定することによりGLN3遺伝子が破壊されたか否かを測定することができる。 Based on the information on the nucleotide sequence of the GLN3 gene and the amino acid sequence of the Gln3 protein encoded thereby, the function of the GLN3 gene in the yeast genome can be suppressed. Such repression can be performed, for example, by disrupting the GLN3 gene, more specifically, for example, by inhibiting the expression of the GLN3 gene at the transcriptional or translational level, or by loss of Gln3 function. In the present specification, GLN3 gene disruption means that the function of GLN3 gene is reduced to at least 80% or less, preferably 60% or less, particularly preferably 40% or less compared to the function of GLN3 gene of the non-destructed parent strain of GLN3 gene. It means to make it. For example, it is possible to determine whether the GLN3 gene has been destroyed by preparing a construct in which a reporter gene is connected to the promoter of the target gene of Gln3, introducing the construct into a yeast cell, and measuring the transcription level of the construct.
そのような遺伝子破壊は、例えば、GLN3遺伝子の全体または一部を欠失させること、GLN3遺伝子中にDNA断片を挿入すること、特にGLN3遺伝子中へGLN3の機能と無関係の核酸断片を挿入すること、GLN3遺伝子の制御領域に該領域の機能を失わせる核酸断片、たとえば遺伝子の発現制御機能を有しない核酸断片を挿入すること、発現されるタンパク質が野生型Gln3の機能を有しないようにGLN3遺伝子を改変することによって行なうことができる。遺伝子の改変は、Gln3タンパク質におけるアミノ酸の付加、欠失、置換等を生じさせるように行うことができるが、これらに限定されない。そのような改変は、例えばEMSなどの変異原処理による変異の導入などによっても行なうことができる。DNA断片のGLN3遺伝子への挿入は、ある実施態様においてはGLN3のリーディングフレームを破壊するような態様で挿入され、その結果、コードされ得るタンパク質のアミノ酸配列がGln3と著しく異なるものとなり、このタンパク質はGln3の転写因子としての活性を有しない。別の実施態様においては、DNA断片のGLN3遺伝子への挿入は、GLN3によってコードされるGln3中に天然のGln3の対応する領域とは異なるアミノ酸配列が挿入または付加され、その結果Gln3の転写因子としての活性が失われる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチド、コサプレッション、RNAiによってGLN3遺伝子の機能を転写後抑制することによってもGLN3の機能を抑制することができる。 Such gene disruptions include, for example, deleting all or part of the GLN3 gene, inserting a DNA fragment into the GLN3 gene, especially inserting a nucleic acid fragment unrelated to the function of GLN3 into the GLN3 gene. , Inserting a nucleic acid fragment that loses the function of the region into the control region of the GLN3 gene, such as a nucleic acid fragment that does not have the gene expression control function, and the GLN3 gene so that the expressed protein does not have the function of wild-type Gln3 This can be done by modifying. The gene modification can be performed so as to cause addition, deletion, substitution, and the like of amino acids in the Gln3 protein, but is not limited thereto. Such modification can also be performed by introducing mutations by mutagen treatment such as EMS. The insertion of the DNA fragment into the GLN3 gene is in some embodiments inserted in a manner that disrupts the reading frame of GLN3, resulting in a significantly different amino acid sequence of the protein that can be encoded from Gln3, It has no activity as a transcription factor of Gln3. In another embodiment, the insertion of the DNA fragment into the GLN3 gene results in insertion or addition of a different amino acid sequence from the corresponding region of native Gln3 into Gln3 encoded by GLN3, so that Gln3 serves as a transcription factor for Gln3. Activity is lost. Moreover, the function of GLN3 can also be suppressed by suppressing the function of the GLN3 gene after transcription by antisense oligonucleotide, cosuppression, or RNAi.
GLN3遺伝子の機能と無関係のDNA断片には、例えば、Gln3タンパク質が標的とする遺伝子群に対して転写因子としての機能を発現しないDNA断片が含まれ、特に、いかなるタンパク質もコードしないDNA断片および選択マーカー遺伝子DNA断片等が含まれる。GLN3遺伝子の全体または一部の欠失はGln3タンパク質が発現しない、または発現されたタンパク質がGln3タンパク質と同じ転写因子活性を有しないように行われる。実験室酵母では宿主の栄養要求性変異を相補する遺伝子、例えば、URA3遺伝子等が選択マーカー遺伝子として用いられることが多く、本発明のアルコール飲料製造用酵母においてもそのようなマーカー遺伝子を利用することができる。しかしながら、下面ビール酵母の場合のように一般に栄養要求性変異株がない場合は、薬剤に耐性を酵母に付与する遺伝子が選択マーカー遺伝子として好ましい。具体的には、酵母細胞において機能するプロモーター、たとえば酵母のアルコール脱水素酵素（ADH1）またはホスホグリセレートキナーゼ（PGK）のプロモーターの下流に接続したアミノグリコシド系抗生物質耐性遺伝子（例えばG418耐性を与える大腸菌apt2（非特許文献９）等が利用できる。選択マーカー遺伝子断片をGLN3遺伝子領域に挿入した場合は、そのマーカーを標識にしてGLN3遺伝子が破壊された酵母細胞を簡便に選択することができる。 DNA fragments unrelated to the function of the GLN3 gene include, for example, DNA fragments that do not express a function as a transcription factor for the gene group targeted by the Gln3 protein. Marker gene DNA fragments and the like are included. Deletion of all or part of the GLN3 gene is performed such that the Gln3 protein is not expressed or the expressed protein does not have the same transcription factor activity as the Gln3 protein. In laboratory yeast, a gene that complements the host's auxotrophic mutation, such as the URA3 gene, is often used as a selection marker gene, and such a marker gene should also be used in the yeast for producing alcoholic beverages of the present invention. Can do. However, when there is generally no auxotrophic mutant as in the case of bottom beer yeast, a gene that imparts resistance to the drug to the yeast is preferred as the selectable marker gene. Specifically, an aminoglycoside antibiotic resistance gene (for example, E. coli that confers G418 resistance) connected downstream of a promoter that functions in yeast cells, such as the yeast alcohol dehydrogenase (ADH1) or phosphoglycerate kinase (PGK) promoter. apt2 (Non-patent Document 9), etc. When a selectable marker gene fragment is inserted into the GLN3 gene region, yeast cells in which the GLN3 gene is disrupted can be easily selected using the marker as a label.
Gln3はα-ヘリックス構造を有するZnフィンガー型の転写因子であり、α-ヘリックス領域（SC-Gln3およびSB-Gln3のアミノ酸残基番号126-138）およびZnフィンガーモチーフ領域（SC-Gln3のアミノ酸残基番号306-330、SB-Gln3のアミノ酸残基番号305-329）はGln3の転写因子としての活性に極めて重要であると考えられる。従って、GLN3遺伝子の欠失には、例えば、α−へリックスモチーフを構成する領域（SC-Gln3およびSB-Gln3のアミノ酸残基番号126-138）、Znフィンガーモチーフを構成する領域（SC-Gln3のアミノ酸残基番号306-330、SB-Gln3のアミノ酸残基番号305-329）、特にZnフィンガーモチーフ中に存在するCys残基の少なくとも一つ、栄養源シグナルに関与するTorタンパク質との結合に関与すると考えられる領域（SC−Gln3のアミノ酸残基番号510-720、SB-Gln3のアミノ酸残基番号509-719）における欠失が含まれる。GLN3遺伝子の改変には、例えば、上記α−へリックスモチーフ、Znフィンガーモチーフおよび栄養源シグナルに関与するTorタンパク質との結合に関与すると考えられる領域中のアミノ酸を非保存的に改変する改変が含まれる。特にZnフィンガーモチーフ領域内に存在するCysがCysまたはHis以外のアミノ酸へ置換されるような改変はGln3の転写因子としての活性を失わせるであろう。 Gln3 is a zinc finger type transcription factor with an α-helical structure. The α-helix region (amino acid residues 126-138 of SC-Gln3 and SB-Gln3) and the Zn finger motif region (residues of SC-Gln3) Base numbers 306-330 and amino acid residues 305-329 of SB-Gln3 are considered to be extremely important for the activity of Gln3 as a transcription factor. Therefore, for deletion of the GLN3 gene, for example, a region constituting an α-helix motif (amino acid residues 126-138 of SC-Gln3 and SB-Gln3), a region constituting a Zn finger motif (SC-Gln3 Amino acid residues 306-330, SB-Gln3 amino acid residues 305-329), especially at least one Cys residue present in the Zn finger motif, for binding to Tor protein involved in nutrient signal Deletions in the regions that are thought to be involved (amino acid residues 510-720 of SC-Gln3, amino acid residues 509-719 of SB-Gln3) are included. Modifications of the GLN3 gene include, for example, modifications that non-conservatively modify amino acids in the above-mentioned α-helix motif, Zn finger motif, and regions thought to be involved in binding to Tor proteins involved in nutrient signals It is. In particular, modification in which Cys present in the Zn finger motif region is replaced with an amino acid other than Cys or His will cause Gln3 to lose its activity as a transcription factor.
非保存的改変には、例えば、一つのアミノ酸を異なる分類の別のアミノ酸に対して置換することが含まれる（例えば、グリシン、セリン、スレオニン、シシテイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンのような極性アミノ酸とアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンのような非極性アミノ酸との置換、グリシン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミオンのような非電荷親水性アミノ酸とアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンのような疎水性アミノ酸との置換、又は、アルギニン、リジン、ヒスチジンのような塩基性アミノ酸とグルタミン酸またはアスパラギン酸のような酸性アミノ酸との置換、等）。このような遺伝子の改変技術は当業者にはよく知られたものである。例えば、酵母の遺伝子破壊株はゲノム挿入型形質転換の一形態として報告されており（非特許文献８）、形質転換に用いたDNAがゲノムの相同領域で相同的に組み換えを生じてゲノムへ挿入される際、挿入されたゲノム側にコードされた遺伝子が破壊される。
本発明においてはGLN3遺伝子の機能を十分に低下させることが好ましいため、ゲノム中にGLN3遺伝子のコピーが複数存在する場合、または相同遺伝子が存在する場合は、それらの少なくとも１コピー、好ましくは２コピー以上を破壊するのが好ましく、GLN3遺伝子の全コピーを破壊することが最も好ましい。GLN3遺伝子の１以上のコピーを破壊するためには、胞子分離体に対して遺伝子破壊を行なうのが有利である。例えば、下面ビール酵母においては少なくともゲノム中のSC型GLN3遺伝子の少なくとも１コピーを破壊することが好ましく、ゲノム中のSC型GLN3遺伝子およびSB型GLN3遺伝子の両方をそれぞれ１コピー以上破壊することがより好ましい。
Non-conservative modifications include, for example, substitution of one amino acid for another amino acid of a different class (eg, glycine, serine, threonine, cystein, tyrosine, asparagine, glutamine, aspartic acid, glutamic acid, Replacement of polar amino acids such as lysine, arginine and histidine with nonpolar amino acids such as alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and proline, uncharged such as glycine, serine, threonine, asparagine and glutamion Replacement of hydrophilic amino acids with hydrophobic amino acids such as alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and proline, or basic amino acids such as arginine, lysine and histidine Substitution of an acidic amino acid such as glutamic acid or aspartic acid, etc.). Such gene modification techniques are well known to those skilled in the art. For example, a gene-disrupted strain of yeast has been reported as a form of genome insertion transformation (Non-patent Document 8), and the DNA used for transformation is homologously recombined in the homologous region of the genome and inserted into the genome. In doing so, the gene encoded on the inserted genome side is destroyed.
In the present invention, it is preferable to sufficiently reduce the function of the GLN3 gene. Therefore, when there are multiple copies of the GLN3 gene in the genome, or when there are homologous genes, at least one copy, preferably two copies thereof. It is preferred to destroy the above, and most preferably to destroy all copies of the GLN3 gene. In order to disrupt one or more copies of the GLN3 gene, it is advantageous to perform gene disruption on the spore isolate. For example, in the lower brewer's yeast, it is preferable to destroy at least one copy of the SC-type GLN3 gene in the genome, and it is more preferable to destroy both the SC-type GLN3 gene and the SB-type GLN3 gene in the genome. preferable.
本発明において、GLN3遺伝子を破壊することにより、同一の方法で測定した場合に、遺伝的操作をした酵母における硫化水素生産能が遺伝子破壊操作を行なわない同じ株の酵母と比較して少なくとも80％以下、好ましくは60％以下、特に好ましくは40％以下まで低下した場合にGLN3遺伝子が破壊されたと認識される。従って、本発明の、GLN3遺伝子が破壊された酵母は、対応するGLN3遺伝子非破壊株に比較して少なくとも80％以下、好ましくは60％以下、特に好ましくは40％以下まで硫化水素生産能が抑制されている。ある実施態様において、本発明の酵母は、対応するGLN3遺伝子非破壊株に比較して硫化水素生産能が10％以下にまで低下し、また別の実施態様では５％以下まで低下している。硫化水素生産能は、例えば酵母をSD培地（２％グルコース、0.67% Yeast nitrogenbase アミノ酸不含有、窒素源はアンモニウム塩）で培養し、対数増殖期の酵母菌体（細胞濃度約２〜５×107細胞/ml）を、一部は窒素源飢餓培地（２％グルコース、0.17% Yeast nitrogenbase アミノ酸不含有、硫酸アンモニウム無し）に移し、一部はSD培地に移し、更に25℃で1時間培養する。それぞれの培地を採取して炎光光度検出器を備えたガスクロマトグラフィー（GC-FPD）等で培地中に溶存している硫化水素量を測定することによって決定することが出来る。
さらに、必要であれば、ビール等のアルコール飲料醸造条件下における酵母の硫化水素産生能を測定することもできる。たとえば、ビール製造に用いられる一般的な麦汁に、初期のビール酵母濃度を2×107細胞/mlになるようにして、15℃で発酵を開始する。各時間に醗酵液を採取し、GC-FPD等で培養液中に溶存している硫化水素量を測定することができる。また、醗酵期間中及び発酵試験終了後の発酵液中におけるMBTおよび2M3MBの量をGC-FPD等により測定してもよい。ワイン酵母、清酒酵母、焼酎酵母、シャンパン酵母等の他のアルコール飲料製造用酵母についても同様に硫化水素産生能を測定することができる。
In the present invention, by measuring the same method by disrupting the GLN3 gene, the ability to produce hydrogen sulfide in a genetically engineered yeast is at least 80% compared to the same strain yeast that does not undergo the gene disruption operation. Hereinafter, it is recognized that the GLN3 gene is disrupted when it is reduced to preferably 60% or less, particularly preferably 40% or less. Therefore, the yeast in which the GLN3 gene is disrupted according to the present invention has a hydrogen sulfide production ability suppressed to at least 80% or less, preferably 60% or less, particularly preferably 40% or less, compared to the corresponding GLN3 gene non-disrupted strain. Has been. In one embodiment, the yeast of the present invention has a hydrogen sulfide production capacity that is reduced to 10% or less compared to the corresponding GLN3 gene non-disrupted strain, and in another embodiment, it is reduced to 5% or less. For example, yeast is cultured in SD medium (2% glucose, 0.67% Yeast nitrogenbase amino acid-free, nitrogen source is ammonium salt), and yeast cells in the logarithmic growth phase (cell concentration: about 2 to 5 × 10) 7 cells / ml) is partly transferred to nitrogen source starvation medium (2% glucose, 0.17% Yeast nitrogenbase amino acid free, no ammonium sulfate), partly transferred to SD medium and further incubated at 25 ° C. for 1 hour. It can be determined by collecting each medium and measuring the amount of hydrogen sulfide dissolved in the medium by gas chromatography (GC-FPD) equipped with a flame photometric detector.
Further, if necessary, the ability of yeast to produce hydrogen sulfide under conditions for brewing alcoholic beverages such as beer can also be measured. For example, fermentation is started at 15 ° C. in a common wort used for beer production with an initial brewer's yeast concentration of 2 × 10 7 cells / ml. The fermentation broth is collected at each time, and the amount of hydrogen sulfide dissolved in the culture broth can be measured by GC-FPD or the like. Further, the amounts of MBT and 2M3MB in the fermentation broth during the fermentation period and after completion of the fermentation test may be measured by GC-FPD or the like. Similarly, the ability to produce hydrogen sulfide can be measured for other yeast for producing alcoholic beverages such as wine yeast, sake yeast, shochu yeast, and champagne yeast.
下面ビール酵母の場合、例えば以下のような方法で下面ビール酵母のゲノムにおいて、SC型およびSB型GLN3遺伝子を破壊することができる。
上述のようにSC-GLN3のヌクレオチド配列は配列番号１に、SC-Gln3のアミノ酸配列は配列番号２に示され、SB-GLN3のヌクレオチド配列は配列番号３に、SB-Gln3のアミノ酸配列は配列番号４に示された通りである。これらの配列情報から分かるように、SC-GLN3遺伝子とSB-GLN3遺伝子のORF中、少なくともα−へリックスモチーフのアミノ酸配列（SC-GLN3 アミノ酸残基126-138, SB-GLN3アミノ酸残基126-138）、Znフィンガーモチーフのアミノ酸配列（SC-Gln3のアミノ酸残基306-330, SB-Gln3のアミノ酸残基305-329）は両者で完全に保存されている。これらの配列情報に基づいて適切なPCRプライマーを設計して、いずれのGLN3遺伝子もTAクローニングすることができる。たとえば、SC-GLN3のTAクローニングのためのPCRにはプライマー１（配列番号５）とプライマー２（配列番号６）を、SB-GLN3のTAクローニングのためのPCRにはプライマー３（配列番号７）および４（配列番号８）を用いることができる。
In the case of bottom brewer's yeast, for example, the SC-type and SB-type GLN3 genes can be disrupted in the genome of the bottom brewer's yeast by the following method.
As described above, the nucleotide sequence of SC-GLN3 is shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of SC-Gln3 is shown in SEQ ID NO: 2, the nucleotide sequence of SB-GLN3 is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of SB-Gln3 is a sequence. This is as indicated by number 4. As can be seen from these sequence information, at least the amino acid sequence of α-helix motif (SC-GLN3 amino acid residues 126-138, SB-GLN3 amino acid residues 126- in the ORF of SC-GLN3 gene and SB-GLN3 gene) 138), the amino acid sequence of the Zn finger motif (amino acid residues 306-330 of SC-Gln3, amino acid residues 305-329 of SB-Gln3) is completely conserved in both. Any GLN3 gene can be TA cloned by designing appropriate PCR primers based on these sequence information. For example, primer 1 (SEQ ID NO: 5) and primer 2 (SEQ ID NO: 6) are used for PCR for TA cloning of SC-GLN3, and primer 3 (SEQ ID NO: 7) is used for PCR for TA cloning of SB-GLN3. And 4 (SEQ ID NO: 8) can be used.
次に、クローニングされたSC-GLN3およびSB-GLN3遺伝子のORF（タンパク質のコーディング領域）にある制限酵素部位を利用して、たとえば、インビトロジェン社のゲートウェイ・ベクター変換システム（Gateway Vector Conversion System）のリーディング・フレーム・カセット（Reading Frame Cassette）を組み込んで同システムでいうデスティネーション（Destination）ベクターを作製することが出来る。次に、適切なマーカー遺伝子、例えば、上述のapt2にADH1遺伝子のプロモーターを接続したDNA断片（配列番号９）あるいは、酵母(S.セレビシアエ)の転写因子YAP1にPGK（ホスホグリレセレートキナーゼ）のプロモーターを接続したDNA断片（PPGK-YAP1、配列番号１０）を挿入して同システムでいうエントリー（Entry）ベクターを作製することができる。このEntryベクターと前述のDestinationベクターとの間で前述のGatewayシステムを用いて組換えを起こさせることにより、GLN3遺伝子破壊用のプラスミドを得ることができる。PADH1-apt2 DNA断片は例えばプラスミドpYcDE-ΔG11（非特許文献９）を鋳型としたPCRを用いて得ることができ、PPGK-YAP1 DNA断片は例えばプラスミドYEp-PGKp-YAP1（非特許文献１０）を鋳型としてPCR用いて得ることができる。 Next, using the restriction enzyme sites in the ORF (protein coding region) of the cloned SC-GLN3 and SB-GLN3 genes, for example, reading the Gateway Vector Conversion System from Invitrogen. -A Destination vector referred to in the system can be produced by incorporating a reading frame cassette. Next, an appropriate marker gene, for example, a DNA fragment (SEQ ID NO: 9) in which the promoter of the ADH1 gene is connected to the above-mentioned apt2 or a transcription factor YAP1 of yeast (S. cerevisiae) is added with PGK (phosphoglycerate kinase). DNA fragment was connected to the promoter (P PGK -YAP1, SEQ ID NO: 10) can be inserted and to produce an entry (entry) vectors referred to in this system. A plasmid for GLN3 gene disruption can be obtained by causing recombination between this Entry vector and the above Destination vector using the above Gateway system. A P ADH1 -apt2 DNA fragment can be obtained by PCR using, for example, the plasmid pYcDE-ΔG11 (Non-patent Document 9) as a template, and a P PGK -YAP1 DNA fragment can be obtained by, for example, the plasmid YEp-PGKp-YAP1 (Non-patent Document 10). ) As a template.
作製したGLN3破壊用プラスミドを鋳型として、適切なプライマー例えば上記プライマー１および２、またはプライマー３および４を用いてPCRによって増幅して得ることができる。増幅された断片で常法に従って酵母を形質転換することが出来る。酵母の形質転換は、プロトプラスト法、リチウム法、電気パルス法等の公知の方法によって行なうことができる。形質転換体の選択は導入した選択マーカー遺伝子の性質に依存して選択することができる。たとえば、選択マーカー遺伝子がapt2の場合は抗生物質G-418耐性を指標とし、YAP1の場合はセルレニン耐性を指標として形質転換体を選択することができる。
用いた遺伝子破壊用プラスミドと同じ配列を有している筈であるので、サザンハイブリダイゼーション、または、適切なプライマー、例えばSC-GLN3あるいは、SB-GLN3のDNA配列（配列番号１あるいは、配列番号３）と選択マーカーとした遺伝子の配列（配列番号９あるいは、配列番号１０）を含むプライマーを用いたPCRによって増幅産物が得られることにより、所望の形質転換体が得られたことを確認することができる。
下面ビール酵母以外のアルコール飲料製造用酵母についても同様な手順でGLN3遺伝子破壊酵母を作成することができる。
Using the prepared plasmid for disrupting GLN3 as a template, it can be obtained by amplification by PCR using appropriate primers such as
Since it should have the same sequence as the plasmid for gene disruption used, Southern hybridization, or an appropriate primer such as the DNA sequence of SC-GLN3 or SB-GLN3 (SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 ) And the gene sequence used as a selectable marker (SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10) to obtain an amplified product by PCR, thereby confirming that the desired transformant was obtained. it can.
GLN3 gene-disrupted yeast can be prepared by the same procedure for yeast for alcoholic beverage production other than bottom beer yeast.
このようにして作製した形質転換酵母の硫化水素生産能を測定することができる。また、MBTおよび2M3MBのような、アルコール飲料製造において発生し得る望ましくない含硫化合物についても上述したように測定することができ、本発明の酵母が好ましい特性を有することを確認することができる。例えば、本発明のある実施態様においては、SC型GLN3遺伝子、または、SC型およびSB型の両GLN3遺伝子を破壊したビール酵母株はGLN3非破壊親株に比較して硫化水素生産能が10％以下まで低下する。この実施態様においては含硫化合物であるMBTは親株の60％以下にまで低下し、2M3MBは親株の15％以下にまで低下している。本発明の硫化水素生成能が抑制されたアルコール飲料製造用酵母は、硫化水素生産能の低下が温度および培地組成等の外部環境による影響を受けにくく、安定して硫化水素産生が抑制される。 The ability of the transformed yeast thus produced to produce hydrogen sulfide can be measured. In addition, undesirable sulfur-containing compounds such as MBT and 2M3MB that can occur in alcoholic beverage production can also be measured as described above, and it can be confirmed that the yeast of the present invention has favorable characteristics. For example, in one embodiment of the present invention, the brewer's yeast strain in which the SC-type GLN3 gene or both the SC-type and SB-type GLN3 genes are disrupted has a hydrogen sulfide production capacity of 10% or less compared to the non-destructive parent strain of GLN3. To fall. In this embodiment, the sulfur-containing compound MBT is reduced to 60% or less of the parent strain, and 2M3MB is reduced to 15% or less of the parent strain. In the yeast for producing alcoholic beverages with reduced hydrogen sulfide production ability according to the present invention, the decrease in hydrogen sulfide production ability is hardly affected by the external environment such as temperature and medium composition, and the production of hydrogen sulfide is stably suppressed.
本発明の硫化水素生産能の抑制が確認された酵母はGLN3遺伝子非破壊親株と同程度またはそれ以上に良好な醸造特性を有しており、酵母の一般的な利用法に従って親株と同様に使用することができる。例えば、ワイン、清酒、焼酎、発泡性ワイン、ビール、発泡酒、および、いわゆる第三のビール等のアルコール飲料の製造において、これらに使用される一般的な原料を用いて通常の方法に従って本発明の酵母による醗酵を行い、醗酵物を常法に従って処理してこれらのアルコール飲料を製造することができる。
以下の実施例において本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらの実施例の範囲に限られないことは言うまでもない。
Yeast confirmed to suppress the ability to produce hydrogen sulfide of the present invention has the same or better brewing characteristics as the non-disrupted parent strain of GLN3 gene, and is used in the same manner as the parent strain according to the general usage of yeast. can do. For example, in the production of alcoholic beverages such as wine, sake, shochu, sparkling wine, beer, sparkling wine, and so-called third beer, the present invention is used according to a conventional method using general raw materials used for these. These alcoholic beverages can be produced by performing fermentation using yeast and treating the fermented product according to a conventional method.
The present invention will be described more specifically in the following examples, but it goes without saying that the present invention is not limited to the scope of these examples.
下面ビール酵母GLN3遺伝子破壊株の作製
１）SC-GLN3およびSB-GLN3のクローニング
タカラバイオ社製のPerfectshotを用いて増幅されたPCR断片をTAクローニングすることにより、SC型GLN3遺伝子（SC-GLN3）及びSB型GLN3遺伝子（SB-GLN3）のそれぞれの断片を得た。
下面ビール酵母ヴァイヘンシュテファン(Weihenstephan)34/70のゲノムDNAを鋳型として、SC-GLN3増幅用プライマー１（TGACTTTTCCGCCAAAGAAGAGGACCTCG：配列番号５）および２（TATTATACGATTGGCTGTTCATGAGGACC：配列番号６）、またはSB-GLN3増幅用プライマー３（TGGCGAGACAGTGGAAGGTTAAAGAGAGG：配列番号７）および４（TTGGAGAAGGTTTTGGTAAAATCGGGACC：配列番号８）を用いて、Applied Biosytems社製サーマルサイクラーを用いてPCRを行った。
PCR条件は以下の通り
SC-GLN3 amplification primer 1 (TGACTTTTCCGCCAAAGAAGAGGACCTCG: SEQ ID NO: 5) and 2 (TATTATACGATTGGCTGTTCATGAGGACC: SEQ ID NO: 6), or SB-GLN3 amplification primer PCR was performed using 3 (TGGCGAGACAGTGGAAGGTTAAAGAGAGG: SEQ ID NO: 7) and 4 (TTGGAGAAGGTTTTGGTAAAATCGGGACC: SEQ ID NO: 8) using a thermal cycler manufactured by Applied Biosytems.
PCR conditions are as follows
PCR終了後、直ちに、インビトロジェン社製のTOPO-TAクローニングキットを用いて、PCR産物4μL、塩溶液1μL、TOPOイソメラーゼが結合したプラスミドpCR2.1溶液1μLを室温で5分間反応させライゲーションを行った。当該反応液2μLで大腸菌のコンピテントセルを形質転換し、プラスミドを抽出し、挿入DNAの末端ヌクレオチド配列を決定し、目的産物が挿入されていることを確認した。SC-GLN3またはSB-GLN3がクローニングされたプラスミドpCR2-SCGLN3及びpCR2-SBGLN3がそれぞれ得られた（図１、図２）。 Immediately after the completion of PCR, using a TOPO-TA cloning kit manufactured by Invitrogen, 4 μL of PCR product, 1 μL of salt solution, and 1 μL of plasmid pCR2.1 solution bound with TOPO isomerase were reacted at room temperature for 5 minutes for ligation. E. coli competent cells were transformed with 2 μL of the reaction solution, the plasmid was extracted, the terminal nucleotide sequence of the inserted DNA was determined, and it was confirmed that the target product was inserted. Plasmids pCR2-SCGLN3 and pCR2-SBGLN3 in which SC-GLN3 or SB-GLN3 was cloned were respectively obtained (FIGS. 1 and 2).
２）Destination ベクターの構築
構築したプラスミドpCR2-SCGLN3及び、pCR2-SBGLN3のORF内にある制限酵素部位を利用し、インビトロジェン社のGateway TechnologyでのDestinationベクターを構築した。すなわち、プラスミドpCR2-SCGLN3あるいは、pCR2-SBGLN3、それぞれ約10μgを、制限酵素Nde I（認識部位：配列番号１のヌクレオチド番号1097-1102）あるいは、Cla I（認識部位：配列番号３のヌクレオチド番号936-941）、それぞれ約50ユニット、37℃、約1時間で切断し、タカラバイオ社製Blunting kitを用いて平滑化した。その後、平滑化した各プラスミド約100ngをインビトロジェン社製Gateway Vector Conversion Systemでの、Reading Frame Cassette （配列番号１５） 10ngと、タカラバイオ社製T4 DNAリガーゼ350ユニットとを室温で１時間反応させ、ccdB耐性の大腸菌コンピテントセル、インビトロジェン社製One Shot ccdB Survival T1 Phage-Resistant細胞を形質転換し、DestinationベクターであるプラスミドpCR2-SCGLN3ccdBとpCR2-SBGLN3ccdBを構築した（図１、図２）。
2) Construction of Destination Vector Using the constructed plasmid pCR2-SCGLN3 and the restriction enzyme site in the ORF of pCR2-SBGLN3, a Destination vector was constructed at Gateway Technology of Invitrogen. That is, about 10 μg each of plasmid pCR2-SCGLN3 or pCR2-SBGLN3 was added to restriction enzyme Nde I (recognition site: nucleotide number 1097-1102 of SEQ ID NO: 1) or Cla I (recognition site: nucleotide number 936 of SEQ ID NO: 3). -941), each cut at about 50 units, 37 ° C. for about 1 hour, and smoothed using a Blunting kit manufactured by Takara Bio Inc. Thereafter, about 100 ng of each smoothed plasmid was reacted with 10 ng of Reading Frame Cassette (SEQ ID NO: 15) in the Gateway Vector Conversion System manufactured by Invitrogen and 350 units of T4 DNA ligase manufactured by Takara Bio at room temperature for 1 hour, and ccdB Resistant Escherichia coli competent cells, One Shot ccdB Survival T1 Phage-Resistant cells manufactured by Invitrogen were transformed to construct plasmids pCR2-SCGLN3ccdB and pCR2-SBGLN3ccdB which are Destination vectors (FIGS. 1 and 2).
３）Entryベクターの構築
下面ビール酵母SC-GLN3及びSB-GLN3遺伝子破壊の際の形質転換マーカーとして、アミノグリコシド系抗生物質をリン酸化する酵素をコードする大腸菌の遺伝子(apt2)に酵母（S.セレビシアエ）ADH1（アルコール脱水素酵素）遺伝子のプロモーターを接続したDNA断片（PADH1-apt2、配列番号９）、あるいは、酵母(S.セレビシアエ)の転写因子YAP1にPGK（ホスホグリレセレートキナーゼ）のプロモーターを接続したDNA断片（PPGK-YAP1、配列番号１０）を用いた。apt2遺伝子は、形質転換酵母に抗生物質G-418に耐性をもたらし、YAP1遺伝子は、形質転換酵母に薬剤セルレニンに対する耐性を付与する。PADH1-apt2を有するプラスミドpYcDE-ΔG11を鋳型として、プライマー５（GGATCCGGGATCGAAGAAATGATGGTAAA：配列番号１１）とプライマー６（AAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTC：配列番号１２）を用いてPCRでPADH1-apt2のDNA断片を増幅し、増幅された断片をインビトロジェン社製プラスミドpCR8にTAクローニングしてインビトロジェン社のGateway TechnologyでいうEntryベクターであるpCR8-apt2を得た（図１）。PCRの条件は前述したものと同じである。PPGK-YAP1についても同様に、同DNA断片を有するプラスミドYEp-PGKp-YAP1を鋳型として、プライマー７（CGATTTGGGCGCGAATCCTTTATTTTGGC：配列番号１３）とプライマー８（AGTTACCCAGTTTTCCATAAAGTTCCCGC：配列番号１４）を用いてPCRで増幅し、pCR8にTAクローニングしてインビトロジェン社のGateway TechnologyでいうEntryベクターであるpCR8-YAP1を得た（図２）。
3) Construction of Entry vector As a transformation marker for the disruption of the SC-GLN3 and SB-GLN3 genes of the lower brewer's yeast, the yeast (S. cerevisiae) was transformed into the E. coli gene (apt2) encoding an enzyme that phosphorylates aminoglycoside antibiotics. ) ADH1 (alcohol dehydrogenase) DNA fragment was connected to the promoter of the gene (P ADH1 -apt2, SEQ ID NO: 9), or the promoter of the PGK (phosphoglycerate receptacle rate kinase) to the transcription factor YAP1 yeast (S. cerevisiae) A DNA fragment (P PGK -YAP1, SEQ ID NO: 10) was used. The apt2 gene confers resistance to the antibiotic G-418 in the transformed yeast, and the YAP1 gene confers resistance to the drug cerulenin in the transformed yeast. Using the plasmid pYcDE-ΔG11 having P ADH1 -apt2 as a template, the DNA fragment of P ADH1 -apt2 is amplified by PCR using primer 5 (GGATCCGGGATCGAAGAAATGATGGTAAA: SEQ ID NO: 11) and primer 6 (AAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTC: SEQ ID NO: 12). The obtained fragment was TA-cloned into plasmid pCR8 manufactured by Invitrogen to obtain pCR8-apt2, which is an entry vector referred to by Gateway Technology of Invitrogen (FIG. 1). PCR conditions are the same as described above. Similarly, the P PGK -YAP1, plasmid YEp-PGKp-YAP1 having the same DNA fragment as a template, a primer 7 (CGATTTGGGCGCGAATCCTTTATTTTGGC: SEQ ID NO: 13) and primer 8: PCR-amplified using a (EijititiACCCAGTTTTCCATAAAGTTCCCGC SEQ ID NO: 14) Then, TA cloning into pCR8 yielded pCR8-YAP1, which is an entry vector in Gateway Technology of Invitrogen (FIG. 2).
４）GLN3遺伝子破壊用プラスミドの構築
前述したインビトロジェン社のGateway TechnologyでいうDestinationベクターであるプラスミドpCR2-SCGLN3またはpCR2-SBGLN3と、インビトロジェン社のGateway TechnologyでいうEntryベクターであるpCR8-apt2またはpCR8-YAP1をそれぞれ300ng混合し、インビトロジェン社製LRクロナーゼを反応させ、SC-GLN3遺伝子破壊用プラスミドであるpCR2-SCGLN3Δapt2、および、SB-GLN3遺伝子破壊用プラスミドであるpCR2-SBGLN3ΔYAP1を得た（図１、図２）。
4) Construction of plasmid for disrupting GLN3 gene Plasmid pCR2-SCGLN3 or pCR2-SBGLN3 which is the destination vector in the Gateway Technology of Invitrogen, and pCR8-apt2 or pCR8-YAP1 which is the entry vector in the Gateway Technology of Invitrogen 300 ng of each was mixed and reacted with LR clonase made by Invitrogen to obtain pCR2-SCGLN3Δapt2, which is a plasmid for SC-GLN3 gene disruption, and pCR2-SBGLN3ΔYAP1, which is a plasmid for SB-GLN3 gene disruption (FIG. 1, FIG. 1). 2).
５）下面ビール酵母GLN3遺伝子破壊株の作製
作製したSC-GLN3遺伝子破壊用プラスミドpCR2-SCGLN3Δapt2を鋳型に用い、プライマー１（配列番号５）とプライマー２（配列番号６）を用い、あるいは、作製したSB-GLN3遺伝子破壊用プラスミドpCR2-SBGLN3ΔYAP1を鋳型に用い、プライマー３（配列番号７）とプライマー４（配列番号８）を用いてPCRを行なった。PCRの条件は前述したものと同じである。次に、増幅したDNA断片を用いて下面ビール酵母の形質転換を行った。
形質転換に用いた下面ビール酵母は、Weihenstephan34/70の胞子分離体W-1Bである。対数増殖期の酵母菌体を集菌洗浄した後、109細胞/mlになるように懸濁した酵母細胞液0.1mLに、0.2M酢酸リチウム溶液0.1mLを加え、室温で1時間反応させた後、反応液0.1mLに、70%ポリエチレングリコール4000溶液0.1mLを加え、懸濁し、PCRで増幅したDNA断片を約20μg加え、室温で1時間反応させた。その後、42℃の水槽で、5分間処理した後、集菌洗浄し、SC-GLN3遺伝子破壊の場合は、YPD培地(1% 酵母エキストラクト, 2%ペプトン, 2%グルコース)、SB-GLN3遺伝子破壊の場合は、SD培地（2% グルコース、0.67% Yeast Nitrogenbaseアミノ酸不含有）に懸濁し、室温で１時間から１昼夜培養し、選択培地（SC-GLN3遺伝子破壊の場合は抗生物質G-418 200μg/mL含有したYPD培地(1% 酵母エキストラクト, 2% ペプトン, 2% グルコース、2%寒天)、SB-GLN3遺伝子破壊の場合は、セルレニン2μg/mL含有したSD培地(2% グルコース 0.67% Yeast Nitrogenbase アミノ酸不含有、2%寒天)に塗布し、形成されたコロニーから形質転換株を選択した。得られた形質転換体のゲノム挿入状態を調べた。
5) Preparation of bottom brewer's yeast GLN3 gene disruption strain The prepared SC-GLN3 gene disruption plasmid pCR2-SCGLN3Δapt2 was used as a template, and primer 1 (SEQ ID NO: 5) and primer 2 (SEQ ID NO: 6) were used. PCR was carried out using primer pCR2-SBGLN3ΔYAP1 as a template and primer 3 (SEQ ID NO: 7) and primer 4 (SEQ ID NO: 8). PCR conditions are the same as described above. Next, the bottom brewer's yeast was transformed using the amplified DNA fragment.
The bottom brewer's yeast used for transformation is Weihenstephan34 / 70 spore isolate W-1B. After collecting and washing the yeast cells in the logarithmic growth phase, 0.1 mL of 0.2 M lithium acetate solution was added to 0.1 mL of yeast cell suspension suspended at 10 9 cells / ml, and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, 0.1 mL of a 70% polyethylene glycol 4000 solution was added to 0.1 mL of the reaction solution, suspended, and about 20 μg of the DNA fragment amplified by PCR was added and reacted at room temperature for 1 hour. Then, after treatment for 5 minutes in a water bath at 42 ° C, the cells are collected and washed. In the case of SC-GLN3 gene disruption, YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose), SB-GLN3 gene In the case of disruption, the suspension is suspended in SD medium (2% glucose, 0.67% Yeast Nitrogenbase amino acid-free), cultured at room temperature for 1 hour to overnight, and selective medium (antibiotic G-418 in the case of SC-GLN3 gene disruption). YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose, 2% agar) containing 200 μg / mL.In the case of SB-GLN3 gene disruption, SD medium containing 2 μg / mL of cerulenin (0.67% of 2% glucose) Yeast Nitrogenbase (amino acid-free, 2% agar), and transformants were selected from the formed colonies.
形質転換株は、用いたプラスミドpCR2-SCGLN3Δapt2あるいはpCR2-SBGLN3ΔYAP1と同じDNA配列を有しているので、SC-GLN3遺伝子破壊の場合は、プライマー１（配列番号５）とプライマー９（TAAACTCGTTTTTTCGGCGCCGCAAAGCC：配列番号１６）を、あるいは、プライマー２（配列番号６）とプライマー１０（GGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCC：配列番号１７）を、SB-GLN3遺伝子破壊の場合は、プライマー３（配列番号７）とプライマー１１（TCGATAAGAGGCCACGTGCTTTATGAGGG：配列番号１８）を、あるいは、プライマー４（配列番号８）とプライマー１２（TAAGGAAGGCTCTTTACTAAGGTGTTCGG：配列番号１９）を、用いたPCRによって増幅産物が得られる。これらのプライマーの組み合わせでは、親株ではPCRの増幅産物は得られないことから、形質転換株であるかを判断することができる。さらに、PCRの増幅産物のDNA配列を決定し、形質転換に用いたプラスミドpCR2-SCGLN3Δapt2あるいはpCR2-SBGLN3ΔYAP1と同じDNA配列であるかを調べることで、形質転換株であること、および、想定した領域に用いたDNAが下面ビール酵母ゲノムに挿入されていることを確認した。 Since the transformant has the same DNA sequence as the plasmids pCR2-SCGLN3Δapt2 or pCR2-SBGLN3ΔYAP1 used, primer 1 (SEQ ID NO: 5) and primer 9 (TAAACTCGTTTTTTCGGCGCCGCAAAGCC: SEQ ID NO: in the case of SC-GLN3 gene disruption) 16) or primer 2 (SEQ ID NO: 6) and primer 10 (GGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCC: SEQ ID NO: 17), and in the case of SB-GLN3 gene disruption, primer 3 (SEQ ID NO: 7) and primer 11 (TCGATAAGAGGCCACGTGCTTTATGAGGG: SEQ ID NO: 18 ), Or alternatively, PCR using primer 4 (SEQ ID NO: 8) and primer 12 (TAAGGAAGGCTCTTTACTAAGGTGTTCGG: SEQ ID NO: 19) yields an amplification product. With these primer combinations, PCR amplification products cannot be obtained from the parent strain, so it can be determined whether or not it is a transformed strain. Furthermore, by determining the DNA sequence of the PCR amplification product and checking whether it is the same DNA sequence as the plasmid pCR2-SCGLN3Δapt2 or pCR2-SBGLN3ΔYAP1 used for transformation, it is a transformed strain and the assumed region It was confirmed that the DNA used in was inserted into the lower surface brewer's yeast genome.
下面ビール酵母GLN3遺伝子破壊株の硫化水素生産能および含硫化合物生成量
１）窒素飢餓条件下での硫化水素産生抑制
以上のような方法で造成したSC-GLN3遺伝子破壊ビール酵母、SB-GLN3遺伝子破壊酵母、SC-GLN3/SB-GLN3二重遺伝子破壊ビール酵母と親株であるビール酵母の胞子分離体B-1Bを、25℃のSD培地(2% グルコース, 0.67% Yeast Nitrogenbase アミノ酸不含有、（内、0.5%硫酸アンモニウム）)の培養で、対数増殖期（酵母細胞濃度２〜５×107 cells/mL）に、集菌洗浄し、一方を、25℃のSD培地で続けて培養を継続し、もう一方を、25℃の窒素源飢餓培地(2% グルコース, 0.17% Yeast Nitrogenbase、アミノ酸不含有、硫酸アンモニウム不含有)で培養し、1時間後の硫化水素濃度を測定した。硫化水素の測定は、培養液を約７mL採取し、3000rpm 10分間の遠心分離によって、酵母を分離した培養液5mLをスターラーバーの入ったバイアル瓶に入れ、塩化ナトリウム1.0gを加え、3N塩酸100μL、内部標準液(硫化エチルメチル10 mg/mL) 50μLを加え、アルミキャップで密栓し、室温10分間でスターラーバーを回転させて、塩化ナトリウムを溶解させる。ヘッドスペースGC-FPDによって、内部標準比から培養液中の溶存硫化水素濃度を定量した。その結果を表１に示す。
The ability to produce hydrogen sulfide and the amount of sulfur-containing compounds produced by GLN3 gene-disrupted strains on the bottom beer yeast 1) Suppression of hydrogen sulfide production under nitrogen starvation conditions SC-GLN3 gene-disrupted beer yeast, SB-GLN3 gene, constructed as described above Disrupted yeast, SC-GLN3 / SB-GLN3 double-gene disrupted brewer's yeast and parent brewer's spore isolate B-1B, 25 ° C SD medium (2% glucose, 0.67% Yeast Nitrogenbase no amino acids, ( In the culture of 0.5% ammonium sulfate)), the cells are collected and washed in the logarithmic growth phase (yeast cell concentration 2-5 × 10 7 cells / mL), and one of them is continued in the SD medium at 25 ° C. The other was cultured in a nitrogen source starvation medium (2% glucose, 0.17% Yeast Nitrogenbase, amino acid-free, ammonium sulfate-free) at 25 ° C., and the hydrogen sulfide concentration after 1 hour was measured. For the measurement of hydrogen sulfide, collect about 7 mL of the culture solution, centrifuge at 3000 rpm for 10 minutes, add 5 mL of the culture solution from which the yeast had been separated into a vial containing a stirrer bar, add 1.0 g of sodium chloride, and add 100 μL of 3N hydrochloric acid. Add 50 μL of internal standard solution (ethyl methyl sulfide 10 mg / mL), seal with an aluminum cap, and rotate the stir bar at room temperature for 10 minutes to dissolve sodium chloride. The dissolved hydrogen sulfide concentration in the culture solution was quantified from the internal standard ratio by headspace GC-FPD. The results are shown in Table 1.
表１．GLN3遺伝子破壊酵母の硫化水素産生量
GLN3遺伝子破壊酵母の産生硫化水素量が抑制されていることが確認された。特に、SC-GLN3遺伝子破壊株、及び、SC-GLN3/SB-GLN3遺伝子二重破壊酵母において硫化水素産生抑制効果は大きかった。 It was confirmed that the amount of hydrogen sulfide produced by the GLN3 gene disrupted yeast was suppressed. In particular, the effect of suppressing the production of hydrogen sulfide was large in the SC-GLN3 gene disruption strain and the SC-GLN3 / SB-GLN3 gene double disruption yeast.
２）ビール発酵条件における硫化水素産生抑制効果
麦汁で馴らしの培養が終了した、SC-GLN3遺伝子破壊ビール酵母、SB-GLN3遺伝子破壊酵母、SC-GLN3/SB-GLN3二重遺伝子破壊ビール酵母と親株であるビール酵母の胞子分離体B-1Bをそれぞれ２Lの麦汁に移し、初期細胞濃度を2×107細胞/mLとなるようにして、15℃にて醗酵を開始し、ビール発酵条件下での硫化水素産生を調べた。各時間に醗酵液を採取し、醗酵液中に溶存している硫化水素を１）と同様にしてGC-PFDで測定した。その結果を図３に示す。GLN3遺伝子破壊体酵母の産生硫化水素量は抑制され、特に、SC-GLN3破壊体酵母及びSC-GLN3/SB-GLN3遺伝子二重破壊体において産生硫化水素の抑制効果は大きかった。
2) Suppressive effect of hydrogen sulfide production under beer fermentation conditions SC-GLN3 gene-disrupted brewer's yeast, SB-GLN3 gene-disrupted yeast, SC-GLN3 / SB-GLN3 double-gene disrupted brewer's yeast after culturing in wort Transfer the spore isolate B-1B of brewer's yeast, the parent strain, to 2 liters of wort, start fermentation at 15 ° C. with an initial cell concentration of 2 × 10 7 cells / mL, and beer fermentation conditions Underlying hydrogen sulfide production was investigated. The fermentation broth was collected at each time, and hydrogen sulfide dissolved in the fermentation broth was measured by GC-PFD in the same manner as 1). The result is shown in FIG. The amount of produced hydrogen sulfide in the GLN3 gene disrupted yeast was suppressed, and in particular, the effect of suppressing the produced hydrogen sulfide in the SC-GLN3 disrupted yeast and the SC-GLN3 / SB-GLN3 gene double disrupted was large.
さらに、日光臭の原因物質MBTやネギ臭の原因物質2M3MBも測定した。試料500mLに、0.1M Trisに溶解させた2mM p-HMB(p-ヒドロキシ水銀安息香酸)25mLと20mM tert-ブチル-4-メトキシフェノール(BHA)エタノール溶液 500μL、内部標準液である500ng/mL 4-メトキシ-2-メチル-2-メルカプトブタン(4M4M2MB)エタノール溶液100mLを添加し、密栓して、スターラーバーで室温10分間、強く攪拌した。含硫化合物は水銀化合物であるp-HMBに吸着する。この反応物をDowex-1（強陰イオン交換樹脂）カラムに吸着させた後、0.2mM tert-ブチル-4-メトキシフェノールを含んだ0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH6)100mLでカラムを洗浄した後、10mg/ml L-システイン塩酸塩一水和物を含んだ0.1M 酢酸ナトリム緩衝液(pH6) 100mLで含硫化合物をカラムから溶出させる。溶出液を、酢酸エチル0.5mL、ジクロロメタン 5mLで２回抽出し、有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、窒素ガスにて100μLまで濃縮し、質量分析計を搭載したGC分析に供した。日光臭の原因物質MBT（3-メチル-2-ブテン-1-チオール）やネギ臭の原因物質2M3MB（2-メルカプト-3-メチル-1-ブタノール）の量を内部標準比から定量した。その結果を表２に示す。 Furthermore, the causative substance MBT causing sunlight odor and the causative substance 2M3MB causing leeks were measured. In 500 mL of sample, 25 mL of 2 mM p-HMB (p-hydroxymercurybenzoic acid) dissolved in 0.1 M Tris and 500 μL of 20 mM tert-butyl-4-methoxyphenol (BHA) ethanol solution, 500 ng / mL as an internal standard solution 4 -Methoxy-2-methyl-2-mercaptobutane (4M4M2MB) in ethanol (100 mL) was added, sealed, and stirred vigorously with a stir bar for 10 minutes at room temperature. Sulfur-containing compounds adsorb to p-HMB, a mercury compound. After this reaction product was adsorbed on a Dowex-1 (strong anion exchange resin) column, the column was washed with 100 mL of 0.1 M sodium acetate buffer (pH 6) containing 0.2 mM tert-butyl-4-methoxyphenol. The sulfur-containing compound is eluted from the column with 100 mL of 0.1 M sodium acetate buffer (pH 6) containing 10 mg / ml L-cysteine hydrochloride monohydrate. The eluate was extracted twice with 0.5 mL of ethyl acetate and 5 mL of dichloromethane, and the organic solvent layer was dehydrated with anhydrous sodium sulfate, concentrated to 100 μL with nitrogen gas, and subjected to GC analysis equipped with a mass spectrometer. The amount of sun odor causative substance MBT (3-methyl-2-butene-1-thiol) and leek odor causative substance 2M3MB (2-mercapto-3-methyl-1-butanol) was quantified from the internal standard ratio. The results are shown in Table 2.
表２．ビール醸造条件下における、GLN3遺伝子破壊酵母の含硫化合物生産量
GLN3遺伝子破壊酵母、特に、SC-GLN3破壊酵母及びSC-GLN3/SB-GLN3遺伝子二重破壊酵母において含硫化合物量が減少することが確認された。 It was confirmed that the amount of sulfur-containing compounds decreased in GLN3 gene disrupted yeast, particularly SC-GLN3 disrupted yeast and SC-GLN3 / SB-GLN3 gene double disrupted yeast.
Claims (9)
i）ゲノム中のGLN3遺伝子が破壊されたアルコール飲料製造用酵母、
ii）ビール酵母である、i）記載の酵母、
iii）GLN3遺伝子が配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、i）またはii）記載の酵母、
iv）配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド番号796〜2986の配列であり、配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号３のヌクレオチド番号582〜2771の配列である、iii）記載の酵母。
v）破壊がGLN3遺伝子中へのDNA断片の挿入による、i）〜iv）のいずれかに記載の酵母、
vi）下面ビール酵母である、ii）〜v）のいずれかに記載の酵母。 A method for producing an alcoholic beverage, comprising a fermentation step using any one of the following i) to vi) :
i) Yeast for alcoholic beverage production in which the GLN3 gene in the genome is disrupted,
ii) The yeast according to i), which is a brewer's yeast,
iii) the yeast according to i) or ii), wherein the GLN3 gene encodes a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
iv) The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is the sequence of nucleotide numbers 796 to 2986 of SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is the nucleotide sequence of nucleotide numbers 582 to 2771 of SEQ ID NO: 3 The yeast according to iii), which is a sequence.
v) the yeast according to any one of i) to iv), wherein the disruption is by insertion of a DNA fragment into the GLN3 gene;
vi) The yeast according to any one of ii) to v), which is a bottom beer yeast .
i）ゲノム中のGLN3遺伝子が破壊されたアルコール飲料製造用酵母、
ii）ビール酵母である、i）記載の酵母、
iii）GLN3遺伝子が配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、i）またはii）記載の酵母、
iv）配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号１のヌクレオチド番号796〜2986の配列であり、配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号３のヌクレオチド番号582〜2771の配列である、iii）記載の酵母。
v）破壊がGLN3遺伝子中へのDNA断片の挿入による、i）〜iv）のいずれかに記載の酵母、
vi）下面ビール酵母である、ii）〜v）のいずれかに記載の酵母。 Use of any of the following i) to vi) in alcoholic beverage production:
i) Yeast for alcoholic beverage production in which the GLN3 gene in the genome is disrupted,
ii) The yeast according to i), which is a brewer's yeast,
iii) the yeast according to i) or ii), wherein the GLN3 gene encodes a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4,
iv) The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is the sequence of nucleotide numbers 796 to 2986 of SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is the nucleotide sequence of nucleotide numbers 582 to 2771 of SEQ ID NO: 3 The yeast according to iii), which is a sequence.
v) the yeast according to any one of i) to iv), wherein the disruption is by insertion of a DNA fragment into the GLN3 gene;
vi) The yeast according to any one of ii) to v), which is a bottom beer yeast .
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| JP2010246440A (en) | 2010-11-04 |
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