JP5395395B2 - Production of cyclic amino acids by microorganisms - Google Patents
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Description
本発明は、医農薬化合物を創製する際の合成原料または中間体として重要な、光学活性環状アミノ酸の微生物を用いる製造方法に関する。 The present invention relates to a production method using an optically active cyclic amino acid microorganism, which is important as a synthetic raw material or intermediate in the creation of a pharmaceutical and agrochemical compound.
薬理活性を有する化合物の創製において、環状アミノ酸である(S)−ピペコリン酸や(S)−3−モルホリンカルボン酸等を分子内に含んだ化合物や、環状アミノ酸を合成中
間体または原料として利用した例は多い(非特許文献1、特許文献1〜8参照)。従って、光学純度の高い光学活性環状アミノ酸である(S)−ピペコリン酸、(S)−3−モル
ホリンカルボン酸、(R)−3‐チオモルホリンカルボン酸、5−ヒドロキシ-(S)-ピペコリン酸等は、合成医農薬品の原料として有用な化合物である。
In the creation of a compound having pharmacological activity, a compound containing (S) -pipecolic acid or (S) -3-morpholine carboxylic acid, which is a cyclic amino acid, in the molecule, or a cyclic amino acid was used as a synthetic intermediate or a raw material. There are many examples (see Non-Patent Document 1 and Patent Documents 1 to 8). Therefore, (S) -pipecolic acid, (S) -3-morpholine carboxylic acid, (R) -3-thiomorpholine carboxylic acid, 5-hydroxy- (S) -pipecolic acid, which are optically active cyclic amino acids with high optical purity Etc. are compounds useful as raw materials for synthetic medical pesticides.
光学活性アジリジン−2−カルボン酸誘導体を出発物質として、3段階の合成反応(2−クロロエタンの付加、ベンジル基の脱離およびトリエチルアミン環化剤として使用する環化反応)を経て製造する方法(非特許文献2、3参照)、
L−セリン誘導体から5段階の合成反応を経て製造する方法(非特許文献4参照)、
ジアミノ酸等からα位のアミノ基を脱アミノ化して1位に二重結合をもつ環状アミノ酸を生成する酵素(たとえばアミノ酸オキシダーゼ)と、シュードモナス属の微生物等から得られるN−メチル−L−アミノ酸デヒドロゲナーゼとを用いた酵素反応によって、L−4−オキサリジンから中間体の上記環状アミノ酸を経て(S)−3−モルホリンカルボン酸を製造する方法(特許文献9参照)が知られている。
A method of producing an optically active aziridine-2-carboxylic acid derivative as a starting material through a three-step synthesis reaction (addition of 2-chloroethane, elimination of benzyl group and cyclization reaction used as a triethylamine cyclizing agent) Patent Documents 2 and 3),
A method of producing from an L-serine derivative through a five-step synthesis reaction (see Non-Patent Document 4),
An enzyme (for example, an amino acid oxidase) that generates a cyclic amino acid having a double bond at the 1-position by deaminating the amino group at the α-position from a diamino acid, etc., and an N-methyl-L-amino acid obtained from a microorganism of the genus Pseudomonas A method for producing (S) -3-morpholinecarboxylic acid from L-4-oxalidine through the cyclic amino acid as an intermediate by an enzymatic reaction using dehydrogenase (see Patent Document 9) is known.
また、光学活性(S)−ピペコリン酸(L−ピペコリン酸と表記されることもある。)を製造する方法としては、
L−リジンやその誘導体を出発物質として、亜硝酸ナトリウムによるα位アミノ基のジアゾ化および水酸化バリウムや水酸化ナトリウムを環化剤として用いる環化反応によって(S)−ピペコリン酸を製造する方法(非特許文献5、特許文献10参照)、
L−α−アミノカプロン酸のε位にエチレンアセタールを持つ化合物を酸性条件下で還元して(S)−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献11参照)、
前述のようにシュードモナス属の微生物から得られるN−メチル−L−アミノ酸デヒドロゲナーゼなどを用いた酵素反応によってL−リジンからから(S)−ピペコリン酸を製
造する方法(特許文献9参照)、
アルカリゲネス属、プロデンシア属、プロテウス属、バチルス属、アグロバクテリウム属、モルガネラ属、プラノコッカス属の何れかに属する微生物を用いて菌体反応によってL−リジンから(S)−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献12参照)、
フラボバクテリウム属の微生物等が有するリジン−6−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子(lat)と大腸菌やコリネ型細菌等が有するピロリン−5−カルボン酸レ
ダクターゼをコードする遺伝子(proC)とが導入された組換え大腸菌を用いた培養変換によって、あるいはそのような組換え大腸菌の菌体破砕液を用いて、L−リジンからデルタ−1−ピペリデイン−2−カルボン酸を経て(S)−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献13参照)、
アグロバクテリウム属の微生物が有するオルニチンシクロデアミナーゼまたはこれと相同のストレプトミセス属の微生物が有する酵素を用いた酵素反応により、あるいはこれらの酵素をコードする遺伝子(ocd、pipA、rapL)が導入された組換え大腸菌の菌体破砕液
を用いて、L−リジンから(S)−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献14参照)、
ノイロスポラ属、シュードモナス属、大腸菌及びメタノール資化性菌などの微生物起源の、または豚腎などの動物起源のD−アミノ酸オキシダーゼと水素化ホウ素等の還元剤とを、D−またはDL−ピペコリン酸に作用させ、D−ピペコリン酸からΔ1−ピペリデイ
ン−2−カルボン酸への選択的な酸化と還元剤によるラセミ体の生成反応との共役反応により(S)−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献15参照)、
N−保護−D−ピペコリン酸誘導体を加水分解しうる酵素(D−アミノアシラーゼ)を用いた酵素反応により、または当該酵素を含有するアルスロバクター属の微生物を用いた菌体培養により、ラセミ体ピペコリン酸誘導体から(S)−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献16参照)、
アルカリゲネス属の微生物が有するN−アシル−ピペコリン酸アシラーゼを用いた酵素反応による、N−アセチル−(R,S)−ピペコリン酸の立体選択的な加水分解により(S)−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献17参照)、
シュードモナス属またはクレブシエラ属の微生物を用いた菌体反応により、あるいはこれらの微生物に含まれるS−アミノ酸アミダーゼを用いた酵素反応により、(R,S)−ピペコリン酸アミドから(S)−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献18参照)、
(±)−ピペコリン酸を溶媒中で光学分割剤としてのS−(−)−2−フェノキシプロピオン酸と反応させ、生成した難水溶性のS−(−)−ピペコリン酸・S−(−)−2−フェノキシプロピオン酸塩を回収し、これを酸で複分解することにより光学的に純粋なS−(−)−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献19参照)、
ハロゲン基を側鎖末端に有し、アミノ基がアセチル基等で保護されたアミノ酸誘導体(たとえば比較的安価なアセタミドマロン酸ジエチルから4段階の合成反応を経て得られるN−アセチル−2−アミノ−6−ブロモヘキサン酸)のラセミ体溶液に、アスペルギルス属の微生物が有するL−アミノアシラーゼを添加し、L−エナンチオマー特異的作用による脱アセチル化を行う酵素反応および分子内環化によって(S)−ピペコリン酸を製造する方法(特許文献20参照)が知られている。
Moreover, as a method for producing optically active (S) -pipecolic acid (sometimes referred to as L-pipecolic acid),
A method for producing (S) -pipecolic acid using L-lysine or a derivative thereof as a starting material and diazotization of an α-position amino group with sodium nitrite and a cyclization reaction using barium hydroxide or sodium hydroxide as a cyclizing agent (See Non-Patent Document 5 and Patent Document 10),
A method for producing (S) -pipecolic acid by reducing a compound having ethylene acetal at the ε-position of L-α-aminocaproic acid under acidic conditions (see Patent Document 11),
A method for producing (S) -pipecolic acid from L-lysine by an enzymatic reaction using N-methyl-L-amino acid dehydrogenase obtained from a microorganism of the genus Pseudomonas as described above (see Patent Document 9),
A method for producing (S) -pipecolic acid from L-lysine by a cell reaction using a microorganism belonging to any of the genus Alkagenes, Prodencia, Proteus, Bacillus, Agrobacterium, Morganella, and Planococcus (See Patent Document 12),
A gene (lat) encoding lysine-6-aminotransferase possessed by microorganisms belonging to the genus Flavobacterium and a gene encoding proline-5-carboxylate reductase (proC) possessed by Escherichia coli or coryneform bacteria were introduced. (S) -Pipecolic acid is produced from L-lysine via delta-1-piperidein-2-carboxylic acid by culture conversion using recombinant Escherichia coli or by using such a disruption solution of recombinant Escherichia coli. Method (see Patent Document 13),
The genes (ocd, pipA, rapL) encoding these enzymes were introduced by enzymatic reaction using ornithine cyclodeaminase possessed by Agrobacterium microorganisms or enzymes possessed by Streptomyces microorganisms homologous thereto. A method for producing (S) -pipecolic acid from L-lysine using a cell disruption solution of recombinant Escherichia coli (see Patent Document 14),
D-amino acid oxidase derived from microorganisms such as Neurospora, Pseudomonas, Escherichia coli and methanol-utilizing bacteria, or animal origin such as pig kidney and a reducing agent such as borohydride are converted into D- or DL-pipecolic acid. A method of producing (S) -pipecolic acid by a coupling reaction between selective oxidation of D-pipecolic acid to Δ 1 -piperidein-2-carboxylic acid and a racemic formation reaction with a reducing agent (Patent Document) 15),
Racemate by enzymatic reaction using an enzyme (D-aminoacylase) capable of hydrolyzing an N-protected-D-pipecolic acid derivative, or by cell culture using an Arthrobacter microorganism containing the enzyme A method for producing (S) -pipecolic acid from a pipecolic acid derivative (see Patent Document 16),
Method for producing (S) -pipecolic acid by stereoselective hydrolysis of N-acetyl- (R, S) -pipecolic acid by an enzymatic reaction using N-acyl-pipecolic acid acylase possessed by a microorganism belonging to the genus Alkagenes (See Patent Document 17),
(S) -Pipecolic acid is converted from (R, S) -pipecolic acid amide by a cell reaction using Pseudomonas or Klebsiella microorganisms or by an enzymatic reaction using S-amino acid amidase contained in these microorganisms. A manufacturing method (see Patent Document 18),
(±) -Pipecolic acid is reacted with S-(−)-2-phenoxypropionic acid as an optical resolving agent in a solvent to form poorly water-soluble S-(−)-pipecolic acid · S-(−) A process for producing optically pure S-(-)-pipecolic acid by recovering 2-phenoxypropionate and metathesis with acid (see Patent Document 19),
An amino acid derivative having a halogen group at the end of the side chain and having an amino group protected with an acetyl group or the like (for example, N-acetyl-2-amino-6 obtained from a relatively inexpensive diethyl acetamidomalonate through a four-step synthesis reaction (S) -Pipecoline by enzymatic reaction and intramolecular cyclization in which L-aminoacylase possessed by microorganisms belonging to the genus Aspergillus is added to a racemic solution of (bromohexanoic acid) and deacetylation is performed by L-enantiomer specific action A method for producing an acid (see Patent Document 20) is known.
光学活性(R)−3−チオモルホリンカルボン酸を製造する方法としては、有機合成による方法(非特許文献2、3参照)や、L−4−チアリジンから酵素反応或いは菌体破砕液によって製造する方法(特許文献9、14参照)が知られている。 As a method for producing optically active (R) -3-thiomorpholine carboxylic acid, a method by organic synthesis (see Non-Patent Documents 2 and 3), an enzyme reaction from L-4-thalidine, or a cell disruption solution. A method (see Patent Documents 9 and 14) is known.
5−ヒドロキシ-(S)-ピペコリン酸を製造する方法としては5−ヒドロキシ−DL−リジンから酵素反応或いは菌体破砕液によって製造する方法(特許文献9、14参照)が知られている。
非特許文献2〜4記載の化学合成による光学活性(S)‐3‐モルホリンカルボン酸また
は(R)−3−チオモルホリンカルボン酸の製造方法では、各反応終了時に中間体を反応液から取り出す工程が必要であり、操作が煩雑であることから生産コストが高くなる問題点がある。非特許文献5記載の化学合成による(S)−ピペコリン酸の製造方法も反応工程数が多く操作が煩雑であり、特許文献11の製造方法は原料物質がL−リジンのように安価ではないという問題がある。特許文献19記載の光学分割剤を使用する製造方法では光学分割剤が高価であり、また非修飾ピペコリン酸のみを対象としていて(S)‐3‐モルホリンカルボン酸の製造には利用できないという問題がある。
In the method for producing optically active (S) -3-morpholine carboxylic acid or (R) -3-thiomorpholine carboxylic acid by chemical synthesis described in Non-Patent Documents 2 to 4, a step of removing an intermediate from the reaction solution at the end of each reaction Is necessary, and the operation is complicated. The production method of (S) -pipecolic acid by chemical synthesis described in Non-Patent Document 5 also has a large number of reaction steps and complicated operations, and the production method of Patent Document 11 is said that the raw material is not as inexpensive as L-lysine There's a problem. In the production method using the optical resolution agent described in Patent Document 19, the optical resolution agent is expensive, and only the unmodified pipecolic acid is targeted and cannot be used for the production of (S) -3-morpholinecarboxylic acid. is there.
また、特許文献9に記載された、酵素反応によってジアミノ酸から(S)‐3‐モルホリンカルボン酸、(S)−ピペコリン酸、(R)‐3‐チオモルホリンカルボン酸、5−ヒド
ロキシ-(S)-ピペコリン酸など製造する方法は、収率が低いことに加え、酵素反応を行うための酵素が高価であったり、酵素の調製を菌体から行う必要があるなど、製造時の工程数増加・製造コスト増という問題がある。特許文献14記載の酵素反応を利用した(S)−ピペコリン酸、(R)−3−チオモルホリンカルボン酸、5−ヒドロキシ-(S)-ピペコリン酸などを製造する方法も、酵素反応を行うための酵素を遺伝子組み換え大腸菌の菌体破砕などにより調製する必要があり、製造時の工程数増加・製造コスト増という問題があるため、必ずしも満足できるものではない。酵素反応を利用してラセミ体から(S)−ピペコリン酸を製造する特許文献15〜17記載の方法もやはり、酵素の調製が煩雑で製造工程が多いという問題がある。特許文献20記載の方法には、酵素反応の基質となる化合物を有機合成により調製するため工程数が多いという問題もある。
In addition, as described in Patent Document 9, from an amino acid to (S) -3-morpholinecarboxylic acid, (S) -pipecolic acid, (R) -3-thiomorpholinecarboxylic acid, 5-hydroxy- (S ) -Pipecolic acid and other production methods increase the number of production steps, including low yields, expensive enzymes for enzyme reactions, and the need to prepare enzymes from cells・ There is a problem of increased manufacturing costs. The method for producing (S) -pipecolic acid, (R) -3-thiomorpholinecarboxylic acid, 5-hydroxy- (S) -pipecolic acid and the like using the enzyme reaction described in Patent Document 14 also performs the enzyme reaction. This enzyme is not necessarily satisfactory because it requires the preparation of the enzyme by disrupting the cells of genetically engineered Escherichia coli. The methods described in Patent Documents 15 to 17 for producing (S) -pipecolic acid from a racemate using an enzyme reaction also have the problem that the preparation of the enzyme is complicated and the production steps are many. The method described in Patent Document 20 also has a problem that the number of steps is large because a compound serving as a substrate for an enzyme reaction is prepared by organic synthesis.
さらに、特許文献12に記載された、自然界から分離されたアルカリゲネス属等に属す
る微生物を利用して(S)−ピペコリン酸を製造する方法では、菌体反応に使用する微生物の生産時の培養温度が20℃という低温であり、工業的に製造する場合にはコスト増要因となる。また、この菌体反応における最大生産量も約4.2g/Lと低く工業的に満足できるものではなかった。更に、L−リジン以外のジアミノ酸を原料にして(S)−ピペコリン酸以外の環状アミノ酸を製造することに関する記載が全く無いため、(S)‐3‐モ
ルホリンカルボン酸等の製造に応用できるかどうか不明である。
Furthermore, in the method for producing (S) -pipecolic acid using a microorganism belonging to the genus Alcigenes isolated from the natural world described in Patent Document 12, the culture temperature during production of the microorganism used for the cell reaction Is a low temperature of 20 ° C., which causes an increase in cost when industrially produced. Moreover, the maximum production amount in this bacterial cell reaction was as low as about 4.2 g / L, which was not industrially satisfactory. Furthermore, since there is no description regarding the production of cyclic amino acids other than (S) -pipecolic acid using diamino acids other than L-lysine as a raw material, can it be applied to the production of (S) -3-morpholine carboxylic acid and the like? Whether it is unknown.
特許文献13記載の遺伝子組換え大腸菌を利用した培養変換による(S)−ピペコリン酸の製造法についても、L−リジン以外のジアミノ酸を原料にして(S)−ピペコリン酸以外の環状アミノ酸を製造することに関する記載が全く無いため、(S)‐3‐モルホリン
カルボン酸等の製造に応用できるかどうか不明である。特許文献18記載のラセミ体ピペコールアミドからシュードモナス属またはクレブシエラ属の微生物を利用した菌体反応による(S)−ピペコリン酸製造方法には光学純度が低いという問題がある。
Regarding the method for producing (S) -pipecolic acid by culture conversion using genetically modified Escherichia coli described in Patent Document 13, a cyclic amino acid other than (S) -pipecolic acid is produced using a diamino acid other than L-lysine as a raw material. Since there is no description about what to do, it is unclear whether it can be applied to the production of (S) -3-morpholinecarboxylic acid and the like. The method for producing (S) -pipecolic acid by a cell reaction using a microorganism of the genus Pseudomonas or Klebsiella from racemic pipecol amide described in Patent Document 18 has a problem of low optical purity.
すなわち、本発明の目的は、自然界から分離された微生物またはその変異株を用いて、微生物変換により工業製法的に効率よく、安価に、各種のジアミノ酸から光学活性環状L−アミノ酸の生産方法を提供することにある。 That is, the object of the present invention is to provide a method for producing optically active cyclic L-amino acids from various diamino acids at low cost, efficiently and industrially by microbial conversion, using microorganisms isolated from nature or mutants thereof. It is to provide.
本発明者は、上記の目的を達成すべく鋭意研究を行った。その結果、本発明者により自然界の種々の分離源から分離された各種の微生物のうち、パラコッカス(Paracoccus)属に属する微生物、その中でもパラコッカス・エスピーAB10292(Paracoccus sp.AB10292)株またはその変異株であるパラコッカス・エスピーAB10302(Paracoccus sp.AB10302)株とパラコッカス属基準株が、各種のジアミノ酸から光学活性環状アミノ酸を生産することを発見し、本発明を完成した。 The present inventor has intensively studied to achieve the above object. As a result, among various microorganisms isolated from various natural sources by the present inventor, microorganisms belonging to the genus Paracoccus, among them, the strain of Paracoccus sp. AB10292 (Paracoccus sp. AB10292) or a mutant thereof It was discovered that a certain Paracoccus sp. AB10302 (Paracoccus sp. AB10302) strain and Paracoccus reference strain produce optically active cyclic amino acids from various diamino acids, and the present invention has been completed.
即ち本発明は、
式(I)
That is, the present invention
Formula (I)
−NR'C(O)R、−SiR及び−SiOR(R、R'及びR"は、同一のまたは相違する
、水素または2〜20の炭素原子を有する直鎖若しくは分枝鎖の飽和のまたは全体的に若しくは部分的に不飽和の炭化水素基を表す。)の内から選択する一個または数個の同じまたは異なる基によって置換されていてもよく、R'とR"は、それらを有する原子と共に環を形成していてもよい。]で示されるL−ジアミノ酸および/またはその塩類を、式(II)
-NR'C (O) R, -SiR and -SiOR (R, R 'and R "are the same or different, hydrogen or linear or branched saturated with 2-20 carbon atoms or Which represents a hydrocarbon group which is unsaturated in whole or in part.) R ′ and R ″ may be substituted by one or several of the same or different groups selected from And may form a ring. An L-diamino acid and / or a salt thereof represented by the formula (II)
本発明の微生物による環状アミノ酸の製造法は、培養が容易なパラコッカス属に属する微生物またはその変異株を利用して、安価なジアミノ酸から各種の光学活性環状L−アミノ酸への安定した生産・供給を実現するものであり、光学活性環状アミノ酸の製造効率の向上や製造コストの削減を図ることが可能となる。 The method for producing a cyclic amino acid using a microorganism of the present invention is a stable production / supply from an inexpensive diamino acid to various optically active cyclic L-amino acids using a microorganism belonging to the genus Paracoccus or a mutant thereof that can be easily cultured. It is possible to improve the production efficiency of optically active cyclic amino acids and reduce the production cost.
本発明で使用する式(I)で示されるL−ジアミノ酸および/またはその塩類、または式(I)で示されるL−ジアミノ酸および対応するD−ジアミノ酸、それらの塩類を様々な割合で含む鏡像体混合物は、市販品を購入して使用することができるし、公知の方法によって微生物による発酵生産物から製造することもできる。 The L-diamino acid represented by the formula (I) and / or its salt used in the present invention, or the L-diamino acid represented by the formula (I) and the corresponding D-diamino acid, and their salts in various proportions. The enantiomeric mixture to be contained can be used by purchasing a commercially available product, or can be produced from a fermentation product by a microorganism by a known method.
たとえば、L−4−オキサリジンであれば、L−4−オキサリジン一塩酸塩(和光純薬工業社製及びAldrich社製)が市販されており、非特許文献6に記載のように、Streptomyces chartreuseまたはStreptomyces erythrochromogenesに属する放線菌を培養し、培養液中
からL−4−オキサリジンおよび/またはその塩類を分離・精製することも可能である。また、新たにL−4−オキサリジン生産微生物を自然界から分離して製造に使用してもよい。発酵生産によってL−4−オキサリジンを製造することで、安価に出発物質としてのL−4−オキサリジンを容易に入手することができる。
For example, in the case of L-4-oxalidine, L-4-oxalidine monohydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries and Aldrich) is commercially available, and as described in Non-Patent Document 6, Streptomyces chartreuse or It is also possible to culture actinomycetes belonging to Streptomyces erythrochromogenes and to separate and purify L-4-oxalidine and / or its salts from the culture solution. Moreover, you may isolate | separate newly L-4- oxalidine production microorganisms from the natural world, and may use it for manufacture. By producing L-4-oxalidine by fermentation production, L-4-oxalidine as a starting material can be easily obtained at low cost.
L−リジン塩酸塩またはL−およびD−リジン塩酸塩混合物、L−4−チアリジン塩酸塩
および5−(R,S)ヒドロキシ−L−および5−(R,S)ヒドロキシ−D−リジン塩酸塩混合物は市販品(和光純薬工業社製など)を購入して使用することができる。
L-lysine hydrochloride or a mixture of L- and D-lysine hydrochloride, L-4-thialysine hydrochloride and 5- (R, S) hydroxy-L- and 5- (R, S) hydroxy-D-lysine hydrochloride As the mixture, a commercially available product (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) can be purchased and used.
本発明の方法で用いられる光学活性環状アミノ酸の生産菌は、パラコッカス属に属する微生物で、光学活性環状アミノ酸を産生する能力を有するものであれば、いかなる微生物でもよい。パラコッカス属に属する微生物としては、例えば、パラコッカス・ヴェルスタス NBRC14567(Paracoccus versutus)、パラコッカス・チオシアネイタス N
BRC14569(Paracoccus thiocyanatus)、パラコッカス・アミノフィルス NBRC16710(Paracoccus aminophilus)、パラコッカス・アミノボランス NBRC1
6711(Paracoccus aminovorans)、パラコッカス・コクリイ NBRC16713(Paracoccus kocurii)、パラコッカス・アルカリフィルス NBRC16719(Paracoccus alcaliphilus)、パラコッカス・セリニフィルス NBRC100798(Paracoccus
seriniphilus)、パラコッカス・コリエンシス NBRC102292(Paracoccus koreensis)、パラコッカス・パントトロフス NBRC102493(Paracoccus pantotrophus)、パラコッカス・デニトリフィカンス NBRC102528(Paracoccus denitr
ificans)、パラコッカス・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)、パラ
コッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)等があげられる。
The bacterium producing optically active cyclic amino acid used in the method of the present invention may be any microorganism that belongs to the genus Paracoccus and has the ability to produce an optically active cyclic amino acid. Examples of the microorganism belonging to the genus Paracoccus include, for example, Paracoccus verustus NBRC14567 (Paracoccus versutus), Paracoccus thiocyanata N
BRC14569 (Paracoccus thiocyanatus), Paracoccus aminophilus NBRC16710 (Paracoccus aminophilus), Paracoccus aminoborans NBRC1
6711 (Paracoccus aminovorans), Paracoccus cocriii NBRC16713 (Paracoccus kocurii), Paracoccus alkaliphilus NBRC16719 (Paracoccus alcaliphilus), Paracoccus cerinifilus NBRC10078 (Paracoccus)
seriniphilus), Paracoccus coriensis NBRC102292 (Paracoccus koreensis), Paracoccus pantotrophus NBRC102493 (Paracoccus pantotrophus), Paracoccus denitrificans NBRC102528 (Paracoccus denitr
ificans), Paracoccus sp. AB10292 (Paracoccus sp. AB10292), Paracoccus sp. AB10302 (Paracoccus sp. AB10302) and the like.
上記パラコッカス属に属する微生物の中で、パラコッカス・エスピー AB10292
(Paracoccus sp. AB10292)株は、本発明者が神奈川県伊勢原市より採取した土壌から新たに分離した菌株である。このAB10292株の菌学的諸性質を次に記載する。
Among the above microorganisms belonging to the genus Paracoccus, Paracoccus sp AB10292
(Paracoccus sp. AB10292) strain is a strain newly isolated from soil collected by the present inventor from Isehara City, Kanagawa Prefecture. The mycological properties of this AB10292 strain are described below.
(A)形態的特徴
(1)細胞形態:桿菌で大きさは0.1〜1.1×1.1〜2.0μm
(2)ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地上での生育:生育は良好。コロニー形状は円形、隆起状態は半球状、コロニー周縁は全縁状であり、色調は光沢を帯びたクリーム色である。
(A) Morphological features (1) Cell morphology: Neisseria gonorrhoeae and size is 0.1-1.1 × 1.1-2.0 μm
(2) Growth on soy bean, casein, digest agar medium: Growth is good. The colony shape is circular, the raised state is hemispherical, the periphery of the colony is an entire edge, and the color tone is a glossy cream color.
(B)生理生化学的性状
(1)グラム染色: −
(2)OFテスト: −
(3)好気条件での生育: +
(4)嫌気条件での生育: −
(5)生育温度:
10℃ +
27℃ +
37℃ −
(6)カタラーゼ: +
(7)オキシダーゼ: +
(8)ウレアーゼ: −
(9)硝酸塩還元性: +
(10)脱窒反応: −
(11)6%食塩耐性: −
(12)β‐ガラクトシダーゼ: −
(13)アルギニンジヒドロラーゼ: −
(14)L−リジンデカルボキシラーゼ: −
(15)L−オルニチンデカルボキシラーゼ: −
(16)クエン酸の利用性: −
(17)硫化水素産生: −
(18)トリプトファミナーゼ: −
(19)インドール産生: −
(20)アセトイン産生: −
(21)ゼラチナーゼ: −
(22)各種糖から酸の生成:
D−グルコース −
D−マンニトール −
D−ソルビトール −
D−メリビオース −
L−ラムノース −
L−アラビノース −
シュークロース −
ミオ‐イノシトール −
D−アミダグリン −
(23)炭素源の資化性
D−グルコース +
D−キシロース +
D−マンニトール −
D−フルクトース −
シュークロース −
ミオ‐イノシトール −
以上のとおりAB10292株の主性状は、グラム陰性の桿菌で好気条件にて生育し、カタラーゼ、オキシダーゼ、硝酸塩還元性が陽性であり、ウレアーゼ、脱窒反応が陰性であった。
(B) Physiological and biochemical properties (1) Gram staining: −
(2) OF test: −
(3) Growth under aerobic conditions: +
(4) Growth under anaerobic conditions: −
(5) Growth temperature:
10 ° C +
27 ° C +
37 ° C-
(6) Catalase: +
(7) Oxidase: +
(8) Urease: −
(9) Nitrate reducibility: +
(10) Denitrification reaction: −
(11) 6% salt tolerance: −
(12) β-galactosidase: −
(13) Arginine dihydrolase: −
(14) L-lysine decarboxylase: −
(15) L-ornithine decarboxylase: −
(16) Availability of citric acid: −
(17) Hydrogen sulfide production: −
(18) Tryptophaminase: −
(19) Indole production: −
(20) Acetoin production: −
(21) Gelatinase: −
(22) Acid production from various sugars:
D-glucose −
D-mannitol-
D-sorbitol-
D-melibiose-
L-rhamnose-
L-arabinose-
Sucrose-
Myo-Inositol −
D-amidagrine −
(23) Utilization of carbon sources
D-glucose +
D-xylose +
D-mannitol-
D-fructose-
Sucrose-
Myo-Inositol −
As described above, the main characteristics of the AB10292 strain were gram-negative bacilli that grew under aerobic conditions, were positive for catalase, oxidase, and nitrate reduction, and were negative for urease and denitrification.
さらに16Sリボゾームの塩基配列解析結果から、本菌株はパラコッカス属に近縁の細菌であると考えられた。しかし、表1に示すようにパラコッカス属基準株との相同性の一致率は低いため、16Sリボゾームの塩基配列解析結果から種まで特定することは困難であった。 Furthermore, from the results of the base sequence analysis of 16S ribosome, this strain was considered to be a bacterium closely related to the genus Paracoccus. However, as shown in Table 1, since the homology coincidence with the Paracoccus genus reference strain is low, it was difficult to specify the species from the result of the base sequence analysis of 16S ribosome.
Journal of Systematic Bacteriology 誌を参考にして、上記5菌株とAB10292株との生理・生化学的比較試験を行った。
With reference to Journal of Systematic Bacteriology, a comparative physiological and biochemical test was conducted between the above five strains and AB10292 strain.
その結果、パラコッカス・デニトリフィカンス NBRC102528(Paracoccus denitrificans)及びパラコッカス・アミノボランス NBRC16711(Paracoccus aminovorans)とはAB10292株が脱窒反応活性を持たない点、37℃での生育ができない点で異なった。 As a result, it was different from Paracoccus denitrificans NBRC102528 (Paracoccus denitrificans) and Paracoccus aminoborans NBRC16711 (Paracoccus aminovorans) in that the AB10292 strain does not have denitrification activity and cannot grow at 37 ° C.
パラコッカス・アルカリフィルス NBRC16719(Paracoccus alcaliphilus)とはAB10292株がウレアーゼ活性を持たない点、37℃での生育ができない点で異なり、パラコッカス・セリニフィルス NBRC100798(Paracoccus seriniphilus)とはAB10292株が生育可能なソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地でパラコッカス・セリニフィルス NBRC100798(Paracoccus seriniphilus)が生育できない点から明らかに異なるものであった。 It differs from Paracoccus alkalifilus NBRC16719 (Paracoccus alcaliphilus) in that AB10292 strain does not have urease activity and cannot grow at 37 ° C. This was clearly different from the point that Paracoccus seriniphilus NBRC100808 (Paracoccus seriniphilus) cannot grow on the casein digest agar medium.
パラコッカス・アミノフィルス NBRC16710(Paracoccus aminophilus)とは
硝酸塩還元活性をAB10292株が硝酸塩還元活性を持つ点で異なった。以上の結果から、生理・生化学的性状の比較を行っても種まで特定することは困難であった。
It differs from Paracoccus aminophilus NBRC16710 (Paracoccus aminophilus) in that the AB10292 strain has nitrate reducing activity. From the above results, it was difficult to identify the species even if the physiological and biochemical properties were compared.
従って、本発明者は本菌株をパラコッカス・エスピー(Paracoccus sp.)と同定し、パラコッカス・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)と命名した。なお、この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所生物寄託センターに寄託申請され、平成20年7月16日、FERM P―21605号として受託されている。 Therefore, the present inventor identified this strain as Paracoccus sp. And named it Paracoccus sp. AB10292. The strain was applied for deposit at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Biodeposition Center and was commissioned as FERM P-21605 on July 16, 2008.
ここまで光学活性環状アミノ酸生産菌パラコッカス・エスピー AB10292(Parac
occus sp.AB10292)株について説明したが、一般的には菌類の菌学上の性状は極めて変化しやすく、一定したものではない。菌類は、自然的あるいは通常行われている紫外線照射、X線照射、変異誘発剤(例えば、N−メチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニジンおよびエチルメタンスルホネート等)または遺伝子組換えを用いる人為的変異手段により変異することは周知の事実である。このような自然変異株ならびに人工変異株も含め、パラコッカス属に属し、光学活性環状アミノ酸を生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。
So far optically active cyclic amino acid producing bacteria Paracoccus sp AB10292 (Parac
occus sp. AB10292) strains have been described, but in general the fungiological properties of fungi are very variable and are not constant. Fungi are natural or commonly used UV irradiation, X-ray irradiation, mutagenesis agents (for example, N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine, ethylmethanesulfonate, etc.) or artificial recombination using genetic recombination. It is a well-known fact that mutation is performed by means of mutation. All strains belonging to the genus Paracoccus and capable of producing optically active cyclic amino acids, including such natural mutants and artificial mutants, can be used in the present invention.
その具体的な例として、パラコッカス・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)株の高濃度L-リジン塩酸塩耐性変異株であるパラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株があげられる。なお、この変異株は、独立行政法人産
業技術総合研究所生物寄託センターに寄託申請され、平成20年7月16日、FERM P―21606号として受託されている。
Specific examples thereof include the Paracoccus sp. AB10302 strain, which is a high-concentration L-lysine hydrochloride-resistant mutant strain of the Paracoccus sp. AB10292 (Paracoccus sp. AB10292) strain. This mutant strain was applied for deposit at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Biodeposit Center and was commissioned as FERM P-21606 on July 16, 2008.
これらの微生物を培養中に、直接ジアミノ酸を培養液に添加させ、ジアミノ酸の大部分が光学活性アミノ酸に変換されるまで培養を行う。これらの微生物を培養して菌体をえた後、ジアミノ酸をふくむ反応液中に菌体を懸濁して、反応させてもよい。また、これらの微生物の突然変異体や遺伝子組換え体あるいはそれらの菌体処理物等を本発明に使用することができる。 During culturing of these microorganisms, diamino acid is added directly to the culture solution, and culturing is carried out until most of the diamino acid is converted to optically active amino acid. After culturing these microorganisms to obtain microbial cells, the microbial cells may be suspended in a reaction solution containing a diamino acid and reacted. In addition, mutants or gene recombinants of these microorganisms or processed microbial cells thereof can be used in the present invention.
本発明の培養変換および菌体反応に使用する菌体の生産で使用されるジアミノ酸以外の培地成分としては、炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子及び使用する微生物が要求する栄養物質を含有する培地であればいずれであってもよい。炭素源としては、グルコース、キシロース、マルトース、グリセリン、デンプン、デキストリン、水飴、糖蜜、動・植物油等の光学活性環状アミノ酸生産菌が利用可能なものが使用可能である。窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、魚粉、コーンスティープリカー、酵母エキス、アミノ酸、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム等光学活性環状アミノ酸生産菌が利用可能なものを使用できる。また、必要により微量金属塩、例えばコバルト、鉄、ニッケル、マンガン等を添加できる。また、6‐アミノヘキサン酸のような光学活性環状アミノ酸の生産を促進するような無機および有機物を適当に添加することが出来る。また、硫酸アンモニウムのような無機窒素源を添加しない培地で、且つジアミノ酸を添加しない培地を使用しても菌体反応に使用可能な菌体を生産することができる。 Medium components other than diamino acids used in the production of cells used for the culture conversion and cell reaction of the present invention include carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, growth factors and nutrients required by the microorganisms used. Any medium may be used as long as it contains. As the carbon source, those which can use optically active cyclic amino acid producing bacteria such as glucose, xylose, maltose, glycerin, starch, dextrin, starch syrup, molasses, animal / vegetable oil and the like can be used. As the nitrogen source, use can be made of soybean powder, wheat germ, fish meal, corn steep liquor, yeast extract, amino acids, sodium nitrate, ammonium nitrate and other optically active cyclic amino acid producing bacteria. If necessary, a trace metal salt such as cobalt, iron, nickel, manganese or the like can be added. In addition, inorganic and organic substances that promote the production of optically active cyclic amino acids such as 6-aminohexanoic acid can be appropriately added. Moreover, even if it uses the culture medium which does not add an inorganic nitrogen source like ammonium sulfate and does not add a diamino acid, the microbial cell which can be used for a microbial cell reaction can be produced.
本発明の培養変換における培養は好気条件下で、静置培養、振とう培養、攪拌培養等で行う。通常培養温度は15〜40℃の範囲であるが、多くの場合24〜30℃で培養する。培養中のpHは3.0〜8.0の範囲で行なうのが好ましく、必要に応じて培養液中のpH調整を行ってもよいし、炭酸カルシウムのようなpH調整剤を添加してもよい。ジアミノ酸および/またはその塩類は初発に添加してもよいし、培養途中から一度に或いは少量ずつ添加してもよい。培養日数は通常1〜14日間であるが、培養中の光学活性環状アミノ酸蓄積量が最高に達したときに培養を停止し、培養液から生産物を一般的な方法に準じて採取する。これらの培地組成、培地の液性、培養温度、撹拌速度および通気量等の培養条件は、使用する菌株の種類および外部条件等に応じて好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選抜する。液体培養において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。 The culture in the culture conversion of the present invention is carried out under aerobic conditions, such as stationary culture, shaking culture, and stirring culture. Usually, the culture temperature is in the range of 15 to 40 ° C, but in many cases the culture is performed at 24 to 30 ° C. The pH during the culture is preferably in the range of 3.0 to 8.0, and the pH in the culture solution may be adjusted as necessary, or a pH adjusting agent such as calcium carbonate may be added. Good. Diamino acids and / or salts thereof may be added at the beginning, or may be added at a time or in small portions from the middle of the culture. The culture period is usually 1 to 14 days, but when the amount of optically active cyclic amino acid accumulation during culture reaches the maximum, the culture is stopped, and the product is collected from the culture solution according to a general method. The culture conditions such as medium composition, medium liquidity, culture temperature, agitation speed, and aeration rate are adjusted or selected for convenience so that preferable results can be obtained according to the type of strain used and external conditions. When there is foaming in liquid culture, antifoaming agents such as silicon oil, vegetable oil and surfactant are conveniently used.
本発明の菌体反応に使用する菌体の培養は、好気条件下で、静置培養、振とう培養、攪拌培養等で行う。通常培養温度は15〜40℃の範囲であるが、多くの場合24〜30℃で培養する。培養中のpHは3.0〜8.0の範囲で行なうのが好ましく、必要に応じて培養液中のpH調整を行ってもよいし、炭酸カルシウムのようなpH調整剤を添加してもよい。ジアミノ酸や6‐アミノヘキサン酸のような変換活性を増強する物質は、初発に添
加してもよいし、培養途中から一度に或いは少量ずつ添加してもよい。培養日数は通常12時間〜7日間であるが、菌体反応時に環状アミノ酸を変換できる活性を有した微生物が生育したときに培養を停止し、培養液から菌体を一般的な方法に準じて回収する。これらの培地組成、培地の液性、培養温度、撹拌速度および通気量等の培養条件は、使用する菌株の種類および外部条件等に応じて好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選抜する。液体培養において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。
Cultivation of the microbial cells used for the microbial cell reaction of the present invention is carried out under aerobic conditions, such as stationary culture, shaking culture, and stirring culture. Usually, the culture temperature is in the range of 15 to 40 ° C, but in many cases the culture is performed at 24 to 30 ° C. The pH during the culture is preferably in the range of 3.0 to 8.0, and the pH in the culture solution may be adjusted as necessary, or a pH adjusting agent such as calcium carbonate may be added. Good. Substances that enhance the conversion activity, such as diamino acids and 6-aminohexanoic acid, may be added at the beginning, or may be added at once or in small portions from the middle of the culture. The culture period is usually 12 hours to 7 days, but the culture is stopped when a microorganism having an activity capable of converting a cyclic amino acid during the cell reaction grows, and the cell is removed from the culture solution according to a general method. to recover. The culture conditions such as medium composition, medium liquidity, culture temperature, agitation speed, and aeration rate are adjusted or selected for convenience so that preferable results can be obtained according to the type of strain used and external conditions. When there is foaming in liquid culture, antifoaming agents such as silicon oil, vegetable oil and surfactant are conveniently used.
菌体反応は好気条件下で、振とう条件、通気攪拌条件等で行う。通常反応温度は15〜40℃の範囲であるが、多くの場合25〜37℃で反応する。混合液中のpHは3.0〜8.0の範囲で行なうのが好ましく、緩衝液中か或いは必要に応じて反応液中のpH調整を行っても良い。ジアミノ酸は初発に添加しても良いし、反応途中から一度に或いは少量ずつ添加しても良い。また、環状アミノ酸の生産効率を高めるために、培地中にグルコースやキシロース等の糖類、有機酸、アミノ酸、無機塩類、微量元素、界面活性剤等の生産効率を高められる物質を添加して反応を行っても良い。混合日数は通常6時間〜7日間であるが、混合液中の光学活性環状アミノ酸蓄積量が最高に達したときに反応を停止し、反応液から生産物を一般的な方法に準じて採取する。これらの反応液組成、反応温度、撹拌速度および通気量等の混合反応条件は、使用する菌株の種類や使用するジアミノ酸および外部条件等に応じて好ましい結果が得られるように便宜調節あるいは選抜する。液体反応において発泡がある場合はシリコン油、植物油および界面活性剤等の消泡剤を便宜使用する。 The bacterial cell reaction is carried out under aerobic conditions, shaking conditions, aeration stirring conditions, and the like. Usually, the reaction temperature is in the range of 15 to 40 ° C, but in many cases the reaction is carried out at 25 to 37 ° C. The pH in the mixed solution is preferably in the range of 3.0 to 8.0, and the pH in the reaction solution may be adjusted in the buffer solution or as necessary. The diamino acid may be added at the beginning, or may be added at a time or in small portions from the middle of the reaction. In addition, in order to increase the production efficiency of cyclic amino acids, substances that can increase the production efficiency, such as sugars such as glucose and xylose, organic acids, amino acids, inorganic salts, trace elements, and surfactants, are added to the medium to react. You can go. The mixing period is usually 6 hours to 7 days, but the reaction is stopped when the accumulated amount of optically active cyclic amino acid in the mixed solution reaches the maximum, and the product is collected from the reaction solution according to a general method. . The mixing reaction conditions such as the composition of the reaction solution, the reaction temperature, the stirring speed, and the aeration rate are conveniently adjusted or selected so that preferable results are obtained according to the type of strain used, the diamino acid used and the external conditions. . When there is foaming in the liquid reaction, an antifoaming agent such as silicon oil, vegetable oil and surfactant is conveniently used.
培養液や菌体反応液からの光学活性環状アミノ酸の精製は通常の方法で行う。具体的な精製方法としては遠心分離装置や膜分離装置または菌体凝集剤で菌体とろ液を分離或いは溶液をアルカリ性にして菌体を溶菌した後、ろ液あるいは溶菌液から光学活性環状アミノ酸をイオン交換樹脂法、電気透析法、カラムクロマトグラフィー法、晶析法などを用いるか、あるいはこれらを組み合わせて精製できる。 Purification of the optically active cyclic amino acid from the culture solution or bacterial cell reaction solution is carried out by a usual method. As a specific purification method, the bacterial cells and the filtrate are separated by a centrifugal separator, a membrane separator, or a bacterial flocculant, or the solution is made alkaline and the bacterial cells are lysed. An ion exchange resin method, an electrodialysis method, a column chromatography method, a crystallization method, or the like can be used, or a combination thereof can be used for purification.
本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこの具体例に限定されるものではない。
本実施例では、(S)−3−モルホリンカルボン酸及び(S)−ピペコリン酸の定量分
析及び光学純度分析を以下の方法で実施した。
The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these specific examples.
In this example, quantitative analysis and optical purity analysis of (S) -3-morpholinecarboxylic acid and (S) -pipecolic acid were carried out by the following methods.
培養液上清或いは混合液上清中の定量分析は高速液体クロマトグラフィーを用い内部標準法にて算出した。分析条件は以下のとおりである。
カラム :YMC社製 Hydrosphere C18(内径4.6mm、長さ25cm)
カラム温度 :40℃
検出器 :UV検出器
測定波長 :410nm
溶媒 :A液;アセトニトリル:水(0.04%リン酸)=35:65
B液;アセトニトリル:水(0.04%リン酸)=80:20
流速 :1.0ml/min
グラジエント:測定開始から5分後までA液100%、30分後にA液80%・B液20%となるよう直線的グラジエントを行い、30分から35分までB液100%で溶媒を流した。
内部標準 :2−アミノエタノール
サンプル調製:測定液1mlに活性炭を10mg添加して1分間よく撹拌し、15000rpmで10分間遠心分離を行って遠心上清を得た。その上清中の(S)−3−モル
ホリンカルボン酸または(S)−ピペコリン酸濃度が1mg/ml以下になるよう蒸留水で
希釈し、その希釈液10μl、0.5mg/ml濃度の2−アミノエタノール溶液(0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液)90μl、186mg/ml濃度の2,4−ジニトロフ
ルオエロベンゼン溶液(メタノール溶液)50μl、エタノール400μlを混合撹拌後、室温で1時間放置して誘導体化した。
溶出時間 :(S)−3−モルホリンカルボン酸 13.6(min)
(S)−ピペコリン酸 26.7(min)
2−アミノエタノール 9.9(min)
(S)−3−モルホリンカルボン酸及び(S)−ピペコリン酸の光学純度分析法はキラ
ルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで行った。分析条件は以下の通りである。
カラム :ダイセル社製 CHIRALPAK WH(内径4.6mm、長さ25cm)
カラム温度 :50℃
検出器 :UV検出器
測定波長 :254nm
溶媒 :0.25mM硫酸銅水溶液
流速 :1.0ml/min
溶出時間 :(R)−3−モルホリンカルボン酸 36.9(min)
(S)−3−モルホリンカルボン酸 43.9(min)
(R)−ピペコリン酸 13.7(min)
(S)−ピペコリン酸 20.7(min)
1H‐および13C‐NMRは特に指示がない限り、重水(D2O)の溶液で、日本電子(株)社
製の核磁気共鳴装置(モデルJNM−LA300)を使用して測定した。
Quantitative analysis in the culture supernatant or the mixture supernatant was calculated by internal standard method using high performance liquid chromatography. The analysis conditions are as follows.
Column: YMC Hydrosphere C18 (4.6mm ID, 25cm length)
Column temperature: 40 ° C
Detector: UV detector Measurement wavelength: 410 nm
Solvent: Liquid A; acetonitrile: water (0.04% phosphoric acid) = 35: 65
Liquid B; acetonitrile: water (0.04% phosphoric acid) = 80: 20
Flow rate: 1.0 ml / min
Gradient: A linear gradient was performed so that solution A was 100% from the start of measurement to 5 minutes, and solution A was 80% and solution B was 20% after 30 minutes, and the solvent was flowed from solution B to 100% from 30 minutes to 35 minutes.
Internal standard: 2-aminoethanol Sample preparation: 10 mg of activated carbon was added to 1 ml of the measurement solution, and the mixture was stirred well for 1 minute, and centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes to obtain a centrifugal supernatant. The supernatant was diluted with distilled water so that the concentration of (S) -3-morpholinecarboxylic acid or (S) -pipecolic acid was 1 mg / ml or less, and 10 μl of the diluted solution was added at a concentration of 0.5 mg / ml. Aminoethanol solution (0.1 M aqueous sodium hydrogen carbonate solution) 90 μl, 186 mg / ml 2,4-dinitrofluorobenzene solution (methanol solution) 50 μl, ethanol 400 μl are mixed and stirred, then left at room temperature for 1 hour for derivatization did.
Elution time: (S) -3-morpholinecarboxylic acid 13.6 (min)
(S) -Pipecolic acid 26.7 (min)
2-Aminoethanol 9.9 (min)
The optical purity analysis method for (S) -3-morpholinecarboxylic acid and (S) -pipecolic acid was performed by high performance liquid chromatography using a chiral column. The analysis conditions are as follows.
Column: CHIRALPAK WH manufactured by Daicel (inner diameter 4.6mm, length 25cm)
Column temperature: 50 ° C
Detector: UV detector Measurement wavelength: 254 nm
Solvent: 0.25 mM copper sulfate aqueous solution Flow rate: 1.0 ml / min
Elution time: (R) -3-morpholinecarboxylic acid 36.9 (min)
(S) -3-morpholinecarboxylic acid 43.9 (min)
(R) -Pipecolic acid 13.7 (min)
(S) -Pipecolic acid 20.7 (min)
Unless otherwise indicated, 1 H- and 13 C-NMR were measured in a solution of heavy water (D 2 O) using a nuclear magnetic resonance apparatus (model JNM-LA300) manufactured by JEOL Ltd.
[実施例1]
パラコッカス・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)株を利用した、培養変換による(S)−3−モルホリンカルボン酸の製造
L−4−オキサリジン一塩酸塩3g/L、酵母エキス2g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム1g/L、塩化マンガン4水和物 80μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラ
スコに入れ、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、更にその培地中にパラコッカス
・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)株をスラントから一白金耳接種した。合計10本の三角フラスコを27℃で3日間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養した。培養終了後、培養液中の(S)−3−モルホリンカルボン酸濃度を測定したところ、375mg/Lであった。
[Example 1]
Production of (S) -3-morpholinecarboxylic acid by culture conversion using Paracoccus sp. AB10292 (Paracoccus sp. AB10292) strain L-4-oxalidine monohydrochloride 3 g / L, yeast extract 2 g / L, sodium chloride 1 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, manganese chloride tetrahydrate 100 ml of 80 μg / L, pH 8.0 medium was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask with baffle and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before the inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask, and a strain of Paracoccus sp. AB10292 (Paracoccus sp. AB10292) was inoculated from the slant into the medium. A total of 10 Erlenmeyer flasks were subjected to aerobic culture at 27 ° C. for 3 days on a rotary shaker at 180 rpm. After completion of the culture, the (S) -3-morpholinecarboxylic acid concentration in the culture medium was measured and found to be 375 mg / L.
この10本の三角フラスコから回収した培養液約1Lを遠心分離により菌体と上清に分けた。その上清に活性炭5gを加えて1時間攪拌した後、ろ紙を使用して活性炭を除去した。そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトC‐20(H+型)500mlを充
填したカラムに通過させて(S)−3−モルホリンカルボン酸を吸着させ、更に2Lの脱イオン交換水を通過させてカラムを洗浄した後、2%アンモニア水2.5Lで溶出した。(S)−3−モルホリンカルボン酸を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水250mlを加えて固形物を溶解した。その溶解液をデュオライトC‐20(NH4 +型)250mlを充填したカラムに通過させ、更に2Lの脱イオン交換水でカラムを洗浄して(S)−3−モルホリンカルボン酸を回収した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水80mlを加えて固形物を溶解した。その溶解液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトA‐368S 80mlを充填したカラムに通過させ
、その後800mlの脱イオン交換水でカラムを洗浄して(S)−3−モルホリンカルボン酸を回収した。
About 1 L of the culture solution collected from these 10 Erlenmeyer flasks was separated into cells and supernatant by centrifugation. After adding 5 g of activated carbon to the supernatant and stirring for 1 hour, the activated carbon was removed using filter paper. The filtrate was passed through a column packed with 500 ml of strongly acidic cation exchange resin Duolite C-20 (H + type) to adsorb (S) -3-morpholinecarboxylic acid, and 2 L of deionized water was added. The column was washed by passage and then eluted with 2.5 L of 2% aqueous ammonia. The eluate containing (S) -3-morpholinecarboxylic acid was concentrated under reduced pressure to dryness, and then 250 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. The solution was passed through a column packed with 250 ml of Duolite C-20 (NH 4 + type), and the column was washed with 2 L of deionized water to recover (S) -3-morpholinecarboxylic acid. The passing liquid and the collected liquid were concentrated under reduced pressure to dryness, and then 80 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. The solution was passed through a column packed with 80 ml of weakly basic anion exchange resin Duolite A-368S, and then the column was washed with 800 ml of deionized water to recover (S) -3-morpholinecarboxylic acid. .
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮し、メタノールを加えて結晶化させた。結
晶をろ別して回収し、乾燥させたところ152mgの白色結晶が得られた。
この結晶のNMR分析における1H-NMRと13C-NMRのケミカルシフト値が、非特許
文献2記載の(S)−3−モルホリンカルボン酸のそれと一致した。
1H-NMR
d (ppm):3.98(1H,dd)、3.77(1H,dt)、3.51‐3.68(3H
,m)、3.17(1H,dt)、3.01(1H,ddd)
13C-NMR
d (ppm):171.3、66.8、64.0、57.7、42.9
また、光学純度を測定するためにHPLC分析を行ったが(R)−3−モルホリンカルボン酸のピークは検出されず、得られた結晶は(S)−3−モルホリンカルボン酸のみであった。
The passing liquid and the recovered liquid obtained as described above were concentrated under reduced pressure, and methanol was added for crystallization. The crystals were collected by filtration and dried to obtain 152 mg of white crystals.
The chemical shift values of 1 H-NMR and 13 C-NMR in the NMR analysis of this crystal coincided with those of (S) -3-morpholinecarboxylic acid described in Non-Patent Document 2.
1 H-NMR
d (ppm): 3.98 (1H, dd), 3.77 (1H, dt), 3.51-3.68 (3H
, M), 3.17 (1H, dt), 3.01 (1H, ddd)
13 C-NMR
d (ppm): 171.3, 66.8, 64.0, 57.7, 42.9
Moreover, although HPLC analysis was performed in order to measure optical purity, the peak of (R) -3-morpholine carboxylic acid was not detected, and the obtained crystal was only (S) -3-morpholine carboxylic acid.
[実施例2]
高濃度L‐リジン塩酸塩耐性変異株パラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株の調製
SCD液体培地(日本製薬製)にパラコッカス・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)株を一白金耳植菌し、27℃の往復振とう機で18時間培養した。その培養液1mlを0.85%食塩水で10倍に希釈し直径9cmの滅菌シャーレに分注した後、この菌体懸濁液に東芝製GL-15殺菌灯を使用して紫外線を90秒間照射した。
[Example 2]
Preparation of high-concentration L-lysine hydrochloride resistant mutant Paracoccus sp. AB10302 (Paracoccus sp. AB10302) Succeeded inoculated with one platinum ear Paracoccus sp. The cells were cultured for 18 hours on a reciprocating shaker at 27 ° C. 1 ml of the culture broth was diluted 10-fold with 0.85% saline and dispensed into a sterile petri dish with a diameter of 9 cm, and then this cell suspension was irradiated with ultraviolet rays for 90 seconds using a Toshiba GL-15 germicidal lamp. Irradiated.
L‐リジン一塩酸塩 55g/L、酵母エキス 0.1g/L、塩化ナトリウム 1g/
L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム 1g/L、 塩化マンガン4水和物 80μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フ
ラスコに入れたフラスコを1本作成し、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、更に
、そのフラスコに紫外線を照射した菌体懸濁液10mlを接種して、27℃、回転数180rpmのロータリーシェーカーで7日間好気培養した。
L-lysine monohydrochloride 55 g / L, yeast extract 0.1 g / L, sodium chloride 1 g / L
L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, manganese chloride tetrahydrate One flask was prepared by putting 100 ml of 80 μg / L, pH 8.0 medium in a baffled 500 ml Erlenmeyer flask and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask. Further, 10 ml of the bacterial cell suspension irradiated with ultraviolet rays was inoculated into the flask, and a rotary shaker at 27 ° C. and 180 rpm. And aerobic culture for 7 days.
L‐リジン一塩酸塩濃度が50g/Lになるよう調整したソイビーン・カゼイン・ダイジェスト寒天培地(日本製薬製)を直径9cmの滅菌シャーレに分注して寒天培地を作成し、ロータリーシェーカーで培養した培養液を塗沫して27℃で培養を行った。寒天上に生育してきたコロニーを分離・選抜して、パラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株を調製した。 A soybean casein digest agar medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) adjusted so that the concentration of L-lysine monohydrochloride is 50 g / L was dispensed into a 9 cm diameter sterilized petri dish to prepare an agar medium and cultured on a rotary shaker The culture solution was smeared and cultured at 27 ° C. Colonies that grew on the agar were isolated and selected to prepare a Paracoccus sp. AB10302 strain.
[実施例3]
パラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株を利用した、培養変換による(S)−3−モルホリンカルボン酸の製造
パラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株を用いる以外は実施例1と同様に実施した。培養液中の(S)−3−モルホリンカルボン酸の生産量は501mg/Lであった。
[Example 3]
Production of (S) -3-morpholinecarboxylic acid by culture conversion using Paracoccus sp. AB10302 (Paracoccus sp. AB10302) strain In the same manner as in Example 1, except that Paracoccus sp. AB10302 (Paracoccus sp. AB10302) strain is used. Carried out. The production amount of (S) -3-morpholinecarboxylic acid in the culture solution was 501 mg / L.
[実施例4]
パラコッカス基準株を利用した、培養変換による(S)−3−モルホリンカルボン酸の製造
表2に示したパラコッカス属に属する種々の基準株を用いる以外は実施例1と同様に実施した。各菌株の培養液中の(S)−3−モルホリンカルボン酸の生産量は表2に示すようであった。
[Example 4]
Production of (S) -3-morpholinecarboxylic acid by culture conversion using Paracoccus reference strain The same procedure as in Example 1 was carried out except that various reference strains belonging to the genus Paracoccus shown in Table 2 were used. The production amount of (S) -3-morpholine carboxylic acid in the culture solution of each strain was as shown in Table 2.
パラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株を利用した、菌体反応による(S)−3−モルホリンカルボン酸の製造
6−アミノヘキサン酸7.2g/L、酵母エキス2g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム1g/L、塩化マンガン4水和物
80μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラスコ
に入れ、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、その培地中にパラコッカス・エスピ
ー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株をスラントから一白金耳接種し、27℃で回転数180rpmのロータリーシェーカーで24時間好気培養して前培養液を作成した。
Production of (S) -3-morpholinecarboxylic acid by bacterial cell reaction using Paracoccus sp. AB10302 strain (Paracoccus sp. AB10302) 6-aminohexanoic acid 7.2 g / L, yeast extract 2 g / L, sodium chloride 1 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, manganese chloride tetrahydrate
100 ml of 80 μg / L, pH 8.0 medium was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask with baffle and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask, and a platinum loop of Paracoccus sp. AB10302 strain was inoculated into the medium from the slant. A preculture was prepared by aerobic culture for 24 hours on a rotary shaker at 180 rpm.
次に、65L容ジャファーメンターに6−アミノヘキサン酸7.2g/L、酵母エキス8g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム 1g/L、塩化マンガン4水和物 80μg/L、pH8.0の培地を30L加え、121℃で25分間蒸気滅菌した。植菌直前に別滅菌したグルコース溶液(300g/L
)をジャファーメンターに2L添加し、更に前培養液300mlを植菌して27℃、攪拌回転数180rpm、通気量1vvmで38時間培養を行った。
Next, a 65-liter Jafermenter was charged with 7.2 g / L of 6-aminohexanoic acid, 8 g / L of yeast extract, 1 g / L of sodium chloride, 2 g / L of potassium dihydrogen phosphate, 1 g / L of dipotassium hydrogen phosphate, and chloride. Manganese tetrahydrate 30 L of a medium with 80 μg / L and pH 8.0 was added and steam sterilized at 121 ° C. for 25 minutes. Separately sterilized glucose solution immediately before inoculation (300 g / L
2) was added to the jaffer mentor, and 300 ml of the preculture solution was inoculated, and cultured for 38 hours at 27 ° C., a stirring rotational speed of 180 rpm, and an aeration rate of 1 vvm.
培養液から遠心分離機で菌体を回収し、ろ過滅菌した基質溶液(L−4−オキサリジン一塩酸塩30g/L、グルコース 22.5g/LとなるようpH6.98の300mM
リン酸バッファーで溶解)3Lをその回収した菌体に加えて懸濁し、5L容ミニジャーファーメンターに菌体懸濁液を加えた。反応温度27℃、攪拌回転数450rpm、通気量0.5vvmで25時間菌体反応を行った。反応終了後の反応液中の(S)−3−モルホリンカルボン酸濃度を測定したところ、13.8g/Lであった。
Bacterial cells were collected from the culture broth with a centrifugal separator and sterilized by filtration (L-4-oxalidine monohydrochloride 30 g / L, glucose 22.5 g / L, 300 mM, pH 6.98, 300 mM).
3 L was dissolved in the collected bacterial cells and suspended, and the bacterial cell suspension was added to a 5 L minijar fermenter. The cell reaction was carried out at a reaction temperature of 27 ° C., a stirring speed of 450 rpm, and an aeration rate of 0.5 vvm for 25 hours. It was 13.8 g / L when the (S) -3-morpholine carboxylic acid density | concentration in the reaction liquid after completion | finish of reaction was measured.
この反応液から遠心分離により菌体を除去し、その上清に活性炭24gを加えて1時間攪拌した後、ろ紙を使用して活性炭を除去した。そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトC‐20(H+型)2Lを充填したカラムに通過させて(S)−3−モルホリン
カルボン酸を吸着させ、更に5Lの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、2%アンモニア水で溶出した。(S)−3−モルホリンカルボン酸を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水1Lを加えて固形物を溶解した。その溶解液をデュオライトC‐20(NH4 +型)1Lを充填したカラムに通過させ、更に2Lの脱イオン交換水でカラム
を洗浄して(S)−3−モルホリンカルボン酸を回収した。
Bacteria were removed from the reaction solution by centrifugation, 24 g of activated carbon was added to the supernatant and stirred for 1 hour, and then the activated carbon was removed using filter paper. The filtrate was passed through a column packed with 2 L of strongly acidic cation exchange resin Duolite C-20 (H + type) to adsorb (S) -3-morpholinecarboxylic acid, and further with 5 L of deionized water. The column was washed and eluted with 2% aqueous ammonia. The eluate containing (S) -3-morpholinecarboxylic acid was concentrated under reduced pressure to dryness, and then 1 L of deionized exchange water was added to dissolve the solid matter. The solution was passed through a column packed with 1 L of Duolite C-20 (NH 4 + type), and the column was washed with 2 L of deionized water to recover (S) -3-morpholinecarboxylic acid.
その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水900mlを加えて固形物を溶解した。強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトA‐113(CH3COO-型)200mlを充填したカラムに通過させ、その後このカラムを脱イオン交換水で洗浄して(S)−3−モルホリンカルボン酸を回収した。 The passing liquid and the collected liquid were concentrated under reduced pressure to dryness, and 900 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. Strongly basic anion exchange resin Duolite A-113 (CH 3 COO - form) was passed through a column packed with 200 ml, and then washing the column with deionized water (S)-3-morpholine carboxylic acid It was collected.
上記により得た通過液と回収液を減圧濃縮し、活性炭による脱色、0.45μmフィルターによるろ過後、ろ液を濃縮しつつメタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ(S)−3−モルホリンカルボン酸の白色結晶が34.5g得られた。 The passing liquid and the collected liquid obtained above were concentrated under reduced pressure, decolorized with activated carbon, and filtered with a 0.45 μm filter, and then the filtrate was concentrated and crystallized with methanol. The crystals were collected by filtration and dried to obtain 34.5 g of white crystals of (S) -3-morpholinecarboxylic acid.
光学純度を測定するためにHPLC分析を行ったが(R)−3−モルホリンカルボン酸のピークは検出されず、得られた結晶は(S)−3−モルホリンカルボン酸のみであった。 In order to measure the optical purity, HPLC analysis was performed, but the peak of (R) -3-morpholinecarboxylic acid was not detected, and the obtained crystal was only (S) -3-morpholinecarboxylic acid.
[実施例6]
パラコッカス・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)株を利用した、培養変換による(S)−ピペコリン酸の製造
L−リジン一塩酸塩10g/L、酵母エキス2g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム1g/L、塩化マンガン4水和物 8
0μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラスコに入れ、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピ
ー AB10292(Paracoccus sp. AB10292)株をスラントから一白金耳接種した。合
計10本の三角フラスコを27℃で3日間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養した。培養液中の(S)−ピペコリン酸濃度を測定したところ、5.8g/Lであった。
[Example 6]
Production of (S) -pipecolic acid by culture conversion using Paracoccus sp. AB10292 (Paracoccus sp. AB10292) strain L-lysine monohydrochloride 10 g / L, yeast extract 2 g / L, sodium chloride 1 g / L, phosphoric acid Potassium dihydrogen 2g / L, Dipotassium hydrogen phosphate 1g / L, Manganese chloride tetrahydrate 8
100 ml of 0 μg / L, pH 8.0 medium was placed in a baffled 500 ml Erlenmeyer flask and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before the inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask, and a strain of Paracoccus sp. AB10292 was inoculated from the slant into the medium. A total of 10 Erlenmeyer flasks were subjected to aerobic culture at 27 ° C. for 3 days on a rotary shaker at 180 rpm. The (S) -pipecolic acid concentration in the culture was measured and found to be 5.8 g / L.
この10本の三角フラスコから回収した培養液約1Lを遠心分離により菌体と上清に分けた。その培養液上清に活性炭5gを加えて1時間攪拌した後、ろ紙を使用して活性炭を除去した。そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトC‐20(H+型)1Lを充
填したカラムに通過させて(S)−ピペコリン酸を吸着させ、更に4Lの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、2%アンモニア水5Lで溶出した。(S)−ピペコリン酸を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水500mlを加えて固形物を溶解した。その溶解液をデュオライトC‐20(NH4 +型)500mlを充填したカラムに通過させ、更に2Lの脱イオン交換水でカラムを洗浄して(S)−ピペコリン酸を回収した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水200mlを加えて固形物を溶解した。その溶解液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトA‐368S 1
00mlを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに 1Lの脱イオン交換水を通
過させて(S)−ピペコリン酸を回収した。
About 1 L of the culture solution collected from these 10 Erlenmeyer flasks was separated into cells and supernatant by centrifugation. After adding 5 g of activated carbon to the culture supernatant and stirring for 1 hour, the activated carbon was removed using filter paper. The filtrate is passed through a column packed with 1 L of strongly acidic cation exchange resin Duolite C-20 (H + type) to adsorb (S) -pipecolic acid, and the column is further washed with 4 L of deionized water. And then eluted with 5 L of 2% aqueous ammonia. The eluate containing (S) -pipecolic acid was concentrated under reduced pressure to dryness, and then 500 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. The solution was passed through a column packed with 500 ml of Duolite C-20 (NH 4 + type), and the column was washed with 2 L of deionized water to recover (S) -pipecolic acid. The passing liquid and the collected liquid were concentrated under reduced pressure to dryness, and 200 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. The solution was used as a weakly basic anion exchange resin Duolite A-368S 1
(S) -pipecolic acid was recovered by passing 1 L of deionized water through this column.
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮し、メタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ3.2gの白色結晶が得られた。
この結晶のHPLC分析による溶出時間及びNMR分析における1H-NMRと13C-NM
Rのケミカルシフト値が、標準品である(S)−ピペコリン酸のそれと一致した。
1HNMRデータ:
d(ppm):1.37−1.59(3H,m)、1.70−1.77(2H,m)、2.08(1H,m)、2.86(1H,m)、3.27(1H,m)、3.43(1H,m)
13CNMRデータ:
d(ppm):175.4、59.8、44.5、27.3、22.6、22.4
また、光学純度を測定するためにHPLC分析を行ったが(R)−ピペコリン酸のピークは検出さず、得られた結晶は(S)−ピペコリン酸のみであった。
The passing liquid and the recovered liquid obtained as described above were concentrated under reduced pressure, and methanol was added for crystallization. The crystals were collected by filtration and dried to obtain 3.2 g of white crystals.
Elution time of this crystal by HPLC analysis and 1 H-NMR and 13 C-NM in NMR analysis
The chemical shift value of R was consistent with that of (S) -pipecolic acid, which is a standard product.
1 HNMR data:
d (ppm): 1.37-1.59 (3H, m), 1.70-1.77 (2H, m), 2.08 (1H, m), 2.86 (1H, m), 3 .27 (1H, m), 3.43 (1H, m)
13 C NMR data:
d (ppm): 175.4, 59.8, 44.5, 27.3, 22.6, 22.4
Moreover, although HPLC analysis was performed in order to measure optical purity, the peak of (R) -pipecolic acid was not detected, and the obtained crystal was only (S) -pipecolic acid.
[実施例7]
パラコッカス・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)株を利用した、DL−リジン一塩酸からの培養変換による(S)−ピペコリン酸の製造
DL−リジン一塩酸塩3g/L、酵母エキス2g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム 1g/L、塩化マンガン4水和物 80μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラスコに入れ、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピ
ー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)株をスラントから一白金耳接種した。その三角フラスコを27℃で3日間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養した。培養液中の(S)−ピペコリン酸濃度を測定したところ、0.76g/Lであった。
[Example 7]
Production of (S) -pipecolic acid by culture conversion from DL-lysine monohydrochloride using Paracoccus sp. AB10292 (Paracoccus sp. AB10292) strain DL-lysine monohydrochloride 3 g / L, yeast extract 2 g / L, chloride Sodium 1g / L, Potassium dihydrogen phosphate 2g / L, Dipotassium hydrogen phosphate 1g / L, Manganese chloride tetrahydrate 100 ml of 80 μg / L, pH 8.0 medium was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask with baffle and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before the inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask, and a strain of Paracoccus sp. AB10292 (Paracoccus sp. AB10292) was inoculated from the slant into the medium. The Erlenmeyer flask was subjected to aerobic culture at 27 ° C. for 3 days on a rotary shaker at 180 rpm. When the (S) -pipecolic acid concentration in the culture was measured, it was 0.76 g / L.
[実施例8]
パラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株を利用した、培養変換による(S)−ピペコリン酸の製造
L−リジン一塩酸塩5g/L、酵母エキス2g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム1g/L、塩化マンガン4水和物 80
μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラスコに入れ、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株をスラントから一白金耳接種した。27℃
で24時間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養して前培養液を作成した。
[Example 8]
Production of (S) -pipecolic acid by culture conversion using Paracoccus sp. AB10302 (Paracoccus sp. AB10302) strain L-lysine monohydrochloride 5 g / L, yeast extract 2 g / L, sodium chloride 1 g / L, phosphoric acid Potassium dihydrogen 2g / L, Dipotassium hydrogen phosphate 1g / L, Manganese chloride tetrahydrate 80
100 ml of a medium of μg / L, pH 8.0 was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask with baffle and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before the inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask, and a Paracoccus sp. AB10302 strain was inoculated from the slant into the medium. 27 ° C
And aerobic culture on a rotary shaker at 180 rpm for 24 hours to prepare a preculture solution.
L−リジン一塩酸塩65g/L、酵母エキス5.5g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム1g/L、塩化マンガン4水和物80μg/L、炭酸カルシウム2g/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラスコに入れ、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前にそのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(375g/L)を16ml添加し、更にそ
の培地中に前培養液を5ml接種した。27℃で12日間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養し、培養液中の(S)-ピペコリン酸濃度を測定したところ3
8.4g/Lであった。
L-lysine monohydrochloride 65 g / L, yeast extract 5.5 g / L, sodium chloride 1 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, manganese chloride tetrahydrate 80 μg / L 100 ml of L, calcium carbonate 2 g / L, pH 8.0 medium was placed in a baffled 500 ml Erlenmeyer flask and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Just before inoculation, 16 ml of a separately sterilized glucose solution (375 g / L) was added to the flask, and 5 ml of the preculture was inoculated into the medium. The aerobic culture was carried out at 27 ° C. for 12 days on a rotary shaker with a rotation speed of 180 rpm, and the concentration of (S) -pipecolic acid in the culture medium was measured.
It was 8.4 g / L.
[実施例9]
パラコッカス属基準株を利用した、培養変換による(S)−ピペコリン酸の製造
L−リジン一塩酸塩3g/L、酵母エキス2g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム1g/L、塩化マンガン4水和物80μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラスコに入れ、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前にそのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、更にその培地中に表3に示したパラコッカ
ス属に属する種々の菌株をスラントから一白金耳接種した。その後、27℃で3日間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養した。各菌株培養液中の(S)−ピペコリン酸生産量は表3に示すようであった。
[Example 9]
Production of (S) -pipecolic acid by culture conversion using Paracoccus standard strain L-lysine monohydrochloride 3 g / L, yeast extract 2 g / L, sodium chloride 1 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, 100 ml of a medium of dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, manganese chloride tetrahydrate 80 μg / L, pH 8.0 was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask equipped with a baffle, and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask, and various strains belonging to the genus Paracoccus shown in Table 3 were inoculated from the slant into the platinum medium. Thereafter, the cells were aerobically cultured on a rotary shaker at 180 rpm for 3 days at 27 ° C. Table 3 shows the amount of (S) -pipecolic acid produced in each strain culture solution.
パラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株を利用した、菌体反応による(S)−ピペコリン酸の製造
6−アミノヘキサン酸7.2g/L、酵母エキス2g/L、塩化ナトリウム 1g/L
、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム1g/L、塩化マンガン4水和物 80μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラス
コに入れたフラスコを10本作成し、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、その培
地中にパラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株をスラントから一白金耳接種して、27℃で2日間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養した。
Production of (S) -pipecolic acid by bacterial cell reaction using Paracoccus sp. AB10302 strain (Paracoccus sp. AB10302) 6-aminohexanoic acid 7.2 g / L, yeast extract 2 g / L, sodium chloride 1 g / L
, Potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, manganese chloride tetrahydrate Ten flasks were prepared by putting 100 ml of 80 μg / L, pH 8.0 medium in a baffled 500 ml Erlenmeyer flask and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask, and a platinum loop of Paracoccus sp. AB10302 strain was inoculated from the slant into the medium. The aerobic culture was performed on a rotary shaker with a rotation speed of 180 rpm for one day.
次に、培養液を集めて約1Lとし、8000rpmで20分間遠心分離を行って上清を除去した。その沈殿した菌体に50mMリン酸バッファー(pH6.98)を200ml加えてよく撹拌し、再び8000rpmで20分間遠心分離を行って上清を除去して菌体反応用の菌体を得た。 Next, the culture solution was collected to about 1 L, and centrifuged at 8000 rpm for 20 minutes to remove the supernatant. To the precipitated cells, 200 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 6.98) was added and stirred well, and centrifuged again at 8000 rpm for 20 minutes to remove the supernatant to obtain cells for cell reaction.
その菌体に、ろ過滅菌した基質溶液(L−リジン一塩酸塩 30g/L、グルコース 22.5g/LになるようpH6.98の300mMリン酸バッファーで溶解)を100ml加えて懸濁し、500ml容三角フラスコにその菌体懸濁液を加えた。27℃、回転数180rpmのロータリーシェーカーで27時間菌体反応を行った後、反応液中の(S)−ピペコリン酸濃度を測定したところ、16.2g/Lであった。 100 ml of a substrate solution (L-lysine monohydrochloride 30 g / L, dissolved in 300 mM phosphate buffer having a pH of 6.98 so that glucose is 22.5 g / L) was added to the cells and suspended. The bacterial cell suspension was added to an Erlenmeyer flask. After the bacterial cell reaction was carried out for 27 hours with a rotary shaker at 27 ° C. and 180 rpm, the (S) -pipecolic acid concentration in the reaction solution was measured and found to be 16.2 g / L.
[実施例11]
パラコッカス・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)株を利用した、培養変換によるtrans−5−ヒドロキシ-(S)-ピペコリン酸及びcis−5−ヒドロキシ-(S)-ピペコリン酸の製造
5−ヒドロキシ−DL−リシン塩酸塩3.3g/L(和光純薬製)、酵母エキス2g/L
、塩化ナトリウム 1g/L、リン酸2水素カリウム0.29g/L、リン酸水素2ナトリウム12水和物 6.86g/L、塩化マンガン4水和物 80μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラスコに入れ、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L
)を8ml添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)株をスラントから一白金耳接種した。この三角フラスコ3本を27℃で3日間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養した。
[Example 11]
Production of trans-5-hydroxy- (S) -pipecolic acid and cis-5-hydroxy- (S) -pipecolic acid by culture conversion using Paracoccus sp. Strain AB10292 (Paracoccus sp. AB10292) 5-hydroxy-DL -Lysine hydrochloride 3.3 g / L (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), yeast extract 2 g / L
Sodium chloride 1 g / L, potassium dihydrogen phosphate 0.29 g / L, disodium hydrogen phosphate 12 hydrate 6.86 g / L, manganese chloride tetrahydrate 100 ml of 80 μg / L, pH 8.0 medium was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask with baffle and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before inoculation, the flask was separately sterilized with a glucose solution (250 g / L
8 ml) was added, and a platinum ear was inoculated from the slant with a strain of Paracoccus sp. AB10292 (Paracoccus sp. AB10292). The three Erlenmeyer flasks were aerobically cultured on a rotary shaker at 180 rpm for 3 days at 27 ° C.
培養液上清をTLCで分析したところ、5−ヒドロキシ−DL−リシン塩酸塩とは明らかに異なるRf値を示す青紫色のニンヒドリン発色物質が2物質認められた(展開溶媒 アセトニトリル:メタノール:水=3:1:1、Rf値=0.308、0.356、メルク社製TLCプレート;シリカゲル60F254)。 When the culture supernatant was analyzed by TLC, two blue-violet ninhydrin coloring substances showing Rf values clearly different from 5-hydroxy-DL-lysine hydrochloride were observed (developing solvent acetonitrile: methanol: water = 3: 1: 1, Rf value = 0.308,0.356, Merck TLC plates: silica gel 60F 254).
この三角フラスコから回収した培養液約300mLを遠心分離により菌体と上清に分けた。その遠心上清を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトC‐20(H+型)100ml
を充填したカラムに通過させてニンヒドリン発色物質を吸着させ、更に500mLの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、2%アンモニア水500mLで溶出した。溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水50mlを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトC‐20(NH4 +型)50mlを充填したカラムに通過させ、更に250mLの脱イオン交換水でカラムを洗浄してニンヒドリン発色物質を回収した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水50mlを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトA‐113(CH3COO-型) 10mlを充填したカラムに通過させ、更に50mlの脱イ
オン交換水でカラムを洗浄してニンヒドリン発色物質を回収した。
About 300 mL of the culture solution collected from the Erlenmeyer flask was separated into cells and supernatant by centrifugation. 100 ml of the centrifugal supernatant was strongly acidic cation exchange resin Duolite C-20 (H + type)
The ninhydrin color-developing substance was adsorbed by passing through a column filled with, and the column was further washed with 500 mL of deionized water, and then eluted with 500 mL of 2% aqueous ammonia. The eluate was concentrated under reduced pressure to dryness, and then 50 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. The solution was passed through a column packed with 50 ml of strongly acidic cation exchange resin Duolite C-20 (NH 4 + type), and the column was further washed with 250 mL of deionized water to recover the ninhydrin coloring material. The passing liquid and the collected liquid were concentrated under reduced pressure to dryness, and 50 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. Its solution strongly basic anion exchange resin Duolite A-113 (CH 3 COO - type) 10 ml was passed through a column packed with further washing the column with deionized water 50ml recovered ninhydrin coloring material did.
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水1mlを加えて固形物を溶解した。活性炭素(顆粒状・和光純薬製)70mlを充填したカラムを用いて溶解液のカラムクロマトグラフィーを行い、ニンヒドリン発色する2物質を回収した。 The passing liquid and the collected liquid obtained above were concentrated under reduced pressure to dryness, and then 1 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. Column chromatography of the dissolved solution was performed using a column packed with 70 ml of activated carbon (granular, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to recover two substances that develop ninhydrin color.
上記により得た回収液を減圧下濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水0.5mlを加えて固形物を溶解した。強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオン UBK530(Ca2+型
)200mlを充填したカラムを用いて溶解液のカラムクロマトグラフィーを行い、Rf値=0.356を示す物質を44mg、Rf値=0.308を示す物質を84mg単離した。
The recovered liquid obtained above was concentrated to dryness under reduced pressure, and 0.5 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. Column chromatography of the lysate was performed using a column packed with 200 ml of strongly acidic cation exchange resin Diaion UBK530 (Ca 2+ type), and 44 mg of substance showing Rf value = 0.356, Rf value = 0.308. 84 mg of the substance showing was isolated.
Rf値=0.356を示す物質をNMR分析したところ、その1H-NMRと13C-NM
Rのケミカルシフト値が、非特許文献7に記載されているtrans−5−ヒドロキシ-
(S)-ピペコリン酸のそれと一致した。また、この物質の比旋光度は[α]D=−20.2°(c;1.0、H2O、23℃)であった。
1HNMRデータ:
d(ppm):1.54−1.64(1H,m)、1.68−1.81(1H,m)、2.01−2.10(1H,m)、2.24−2.33(1H,m)、2.78−2.86(1H,m)、3.43(1H,dd)、3.59(1H,dd)、3.94(1H,m)
13CNMRデータ:
d(ppm):173.8、63.2、58.0、47.2、29.8、23.8
The substance having Rf value = 0.356 was analyzed by NMR, and its 1 H-NMR and 13 C-NM were analyzed.
The chemical shift value of R is trans-5-hydroxy- described in Non-Patent Document 7.
Consistent with that of (S) -pipecolic acid. The specific rotation of this substance was [α] D = -20.2 ° (c; 1.0, H 2 O, 23 ° C.).
1 HNMR data:
d (ppm): 1.54-1.64 (1H, m), 1.68-1.81 (1H, m), 2.01-2.10 (1H, m), 2.24-2. 33 (1H, m), 2.78-2.86 (1H, m), 3.43 (1H, dd), 3.59 (1H, dd), 3.94 (1H, m)
13 C NMR data:
d (ppm): 173.8, 63.2, 58.0, 47.2, 29.8, 23.8
用した基質から考えてcis−5−ヒドロキシ-(S)-ピペコリン酸と考えられる。また、この物質の比旋光度は[α]D=−30.6°(c;2.0、H2O、23℃)であった。1HNMRデータ:
d(ppm):1.77−2.14(4H,m)、3.19(1H,dd)、3.32(1H,dt)、3.63(1H,dd)、4.15−4.19(1H,m)
13CNMRデータ:
d(ppm):173.4、60.8、2、58.0、47.5、27.6、20.5
d (ppm): 1.77-2.14 (4H, m), 3.19 (1H, dd), 3.32 (1H, dt), 3.63 (1H, dd), 4.15-4 19 (1H, m)
13 C NMR data:
d (ppm): 173.4, 60.8, 2, 58.0, 47.5, 27.6, 20.5
パラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株を利用した、菌体反応によるtrans−5−ヒドロキシ-(S)-ピペコリン酸及びcis−5−ヒドロキシ-(S)-ピペコリン酸の製造
6−アミノヘキサン酸 7.2g/L、酵母エキス2g/L、塩化ナトリウム 1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム 1g/L、 塩化マンガン4水和物 80μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラ
スコに入れたフラスコを2本作成し、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、その培
地中にパラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株をスラントから一白金耳接種し、27℃で40時間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養した。
Production of trans-5-hydroxy- (S) -pipecolic acid and cis-5-hydroxy- (S) -pipecolic acid by bacterial cell reaction using Paracoccus sp. AB10302 strain 6-aminohexane 7.2 g / L of acid, 2 g / L of yeast extract, 1 g / L of sodium chloride, 2 g / L of potassium dihydrogen phosphate, 1 g / L of dipotassium hydrogen phosphate, manganese chloride tetrahydrate Two flasks were prepared by putting 100 ml of 80 μg / L, pH 8.0 medium in a baffled 500 ml Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before the inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask, and a Paracoccus sp. AB10302 strain was inoculated into the medium from a slant at 40 ° C. for 40 hours. The aerobic culture was performed on a rotary shaker with a rotation speed of 180 rpm.
次に、培養液から遠心分離機で菌体を回収し、ろ過滅菌した基質溶液(5−ヒドロキシ−DL−リシン塩酸塩20g/L、グルコース 15g/LとなるようpH6.98の3
00mMリン酸バッファーで溶解)20mLをその回収した菌体に加えて懸濁し、100ml容三角フラスコに菌体懸濁液を加えた。その後、反応温度27℃、回転数160rpmのロータリーシェーカーで32時間菌体反応を行った。
Next, the bacterial cells were collected from the culture broth with a centrifuge and filtered to sterilize a substrate solution (5-hydroxy-DL-lysine hydrochloride 20 g / L, glucose 3 g of pH 6.98 to 15 g / L).
(Dissolved in 00 mM phosphate buffer) 20 mL was added to the collected cells and suspended, and the cell suspension was added to a 100 ml Erlenmeyer flask. Thereafter, the cell reaction was carried out for 32 hours using a rotary shaker with a reaction temperature of 27 ° C. and a rotation speed of 160 rpm.
生産を確認するために反応液上清をTLCで分析したところ、Rf値=0.308と0.356にそれぞれ、trans−5−ヒドロキシ-(S)-ピペコリン酸とcis−5−ヒドロキシ-(S)-ピペコリン酸のニンヒドリン発色が認められた(展開溶媒 アセトニトリル:メタノール:水=3:1:1、メルク社製TLCプレート;シリカゲル60F254
)。
When the reaction supernatant was analyzed by TLC to confirm production, trans-5-hydroxy- (S) -pipecolic acid and cis-5-hydroxy- (Rf value = 0.308 and 0.356, respectively. S) -pipecolic acid ninhydrin color was observed (developing solvent acetonitrile: methanol: water = 3: 1: 1, TLC plate manufactured by Merck & Co., Ltd .; silica gel 60F 254
).
[実施例13]
パラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株を利用した、培養変換による(R)−3−チオモルホリンカルボン酸の製造
L−アラニン20mg/L、L−グルタミン酸水素ナトリウム一水和物20mg/L、L−バリン20mg/L、L−イソロイシン20mg/L、L−ロイシン20mg/L、チアミン塩酸塩5mg/L、(+)ビオチン0.1mg/L、シアノコバラミン2.5m
g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム1g/L、硫酸鉄7水和物250μg/L、硫酸銅5水和物250μg/L、塩化カルシウム2.5mg/L、硫酸亜鉛7水和物500μg/L、塩化マンガン4水和物500μg/L、塩化ニッケル6水和物250μg/L、モリブデン酸ナトリウム2水和物250μg/L、ヨウ化カリウム5μg/L、ホウ酸25μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラスコに入れたフラスコを10本作成し、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコにL−4−チアリジン一塩酸塩水溶液(20g/L、pH7.0)10mlを各フラスコにろ過滅菌して添加した。同様に別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を各フラスコに8ml添加し、その培
地中にパラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株をスラントから一白金耳接種し、27℃で90時間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養した。
[Example 13]
Production of (R) -3-thiomorpholinecarboxylic acid by culture conversion using Paracoccus sp. AB10302 (Paracoccus sp. AB10302) strain L-alanine 20 mg / L, L-sodium hydrogen glutamate monohydrate 20 mg / L, L-valine 20 mg / L, L-isoleucine 20 mg / L, L-leucine 20 mg / L, thiamine hydrochloride 5 mg / L, (+) biotin 0.1 mg / L, cyanocobalamin 2.5 m
g / L, sodium chloride 1 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, iron sulfate heptahydrate 250 μg / L, copper sulfate pentahydrate 250 μg / L, calcium chloride 2.5 mg / L, zinc sulfate heptahydrate 500 μg / L, manganese chloride tetrahydrate 500 μg / L, nickel chloride hexahydrate 250 μg / L, sodium molybdate dihydrate 250 μg / L, potassium iodide Ten flasks were prepared by putting 100 ml of 5 μg / L, boric acid 25 μg / L, pH 8.0 medium in a 500 ml Erlenmeyer flask with baffle, and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before inoculation, 10 ml of an L-4-thialysin monohydrochloride aqueous solution (20 g / L, pH 7.0) was added to each flask after filtration sterilization. Similarly, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to each flask, and a platinum loop of Paracoccus sp. AB10302 strain was inoculated from the slant into the medium. Aerobic culture was performed on a rotary shaker at 180 rpm.
次に、培養液から遠心分離機で菌体を除去し、その上清を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトC‐20(H+型)500mlを充填したカラムに通過させて(R)−3−チオ
モルホリンカルボン酸を吸着させ、更に2Lの脱イオン交換水で洗浄した後、2%アンモニア水5Lで溶出した。溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水250mlを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトC‐20(NH4 +型)250mlを充填したカラムに通過させ、更に2Lの脱イオン交換水でカラムを洗浄した。その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水80mlを加えて固形物を溶解した。その溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトA‐116(CH3COO-型)80mlを充填したカラムに通過させ、更に800mlの脱イオン交換水でカラムを洗浄した。
Next, the cells are removed from the culture broth with a centrifugal separator, and the supernatant is passed through a column packed with 500 ml of strongly acidic cation exchange resin Duolite C-20 (H + type) (R) -3. -Thiomorpholine carboxylic acid was adsorbed, further washed with 2 L of deionized water, and eluted with 5 L of 2% aqueous ammonia. The eluate was concentrated under reduced pressure to dryness, and 250 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. The solution was passed through a column packed with 250 ml of strongly acidic cation exchange resin Duolite C-20 (NH 4 + type), and the column was further washed with 2 L of deionized water. The passing liquid and the collected liquid were concentrated under reduced pressure to dryness, and then 80 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. The solution strongly basic anion exchange resin Duolite A-116 a - was passed through a column packed with (CH 3 COO type) 80 ml, the column was washed further with deionized water 800 ml.
上記により得た通過液と回収液を減圧下濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水20mlを加えて固形物を溶解した。その溶液をTLCで分析したところ、Rf値=0.494にニンヒドリン発色物質が認められた(展開溶媒 アセトニトリル:メタノール:水=3:1:1、メルク社製TLCプレート;シリカゲル60F254)。 The passing liquid and the recovered liquid obtained above were concentrated under reduced pressure to dryness, and then 20 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. When the solution was analyzed by TLC, a ninhydrin coloring substance was observed at an Rf value = 0.494 (developing solvent acetonitrile: methanol: water = 3: 1: 1, TLC plate manufactured by Merck; silica gel 60F 254 ).
その溶液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水4mlを加えて固形物を溶解した。弱酸性陽イオン交換樹脂アンバーライト CG−50(NH4 +型)250mlを充填
したカラムを用いてその溶液のカラムクロマトグラフィーを行い、Rf値=0.494を示す物質を含む画分を回収した。その溶液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水20mlを加えて固形物を溶解し、活性炭による脱色、0.45μmフィルターによるろ過後、その溶液を濃縮しつつメタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ白色結晶が84mg得られた。
The solution was concentrated to dryness under reduced pressure, and 4 ml of deionized exchange water was added to dissolve the solid matter. The column chromatography of the solution was performed using a column packed with 250 ml of weakly acidic cation exchange resin Amberlite CG-50 (NH 4 + type), and a fraction containing a substance exhibiting an Rf value = 0.494 was collected. . The solution was concentrated to dryness under reduced pressure, 20 ml of deionized exchange water was added to dissolve the solid matter, decolorized with activated carbon, filtered through a 0.45 μm filter, and then methanol was added to the solution while concentrating the crystals. Made it. The crystals were collected by filtration and dried to obtain 84 mg of white crystals.
このRf値=0.494を示すニンヒドリン発色物質は、1H-NMRと13C-NMRの
分析結果及び生成に使用した基質から考えて(R)-3-チオモルホリンカルボン酸と考えられる。また、この物質の比旋光度は[α]D=−53.2°(c;2.0、H2O、23℃)であった。
1HNMRデータ:
d(ppm):2.74−2.82(1H,m)、2.89−3.13 (3H,m)、3.29(1H,ddd)、3.69(1H,dt)、3.84(1H,dd)
13CNMRデータ:
d(ppm):172.3、59.3、45.3、27.5、23.8
The ninhydrin coloring substance showing this Rf value = 0.494 is considered to be (R) -3-thiomorpholine carboxylic acid in view of the analysis results of 1 H-NMR and 13 C-NMR and the substrate used for production. The specific rotation of this substance was [α] D = −53.2 ° (c; 2.0, H 2 O, 23 ° C.).
1 HNMR data:
d (ppm): 2.74-2.82 (1H, m), 2.89-3.13 (3H, m), 3.29 (1H, ddd), 3.69 (1H, dt), 3 .84 (1H, dd)
13 C NMR data:
d (ppm): 172.3, 59.3, 45.3, 27.5, 23.8
パラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株を利用した、菌体反応による(R)−3−チオモルホリンカルボン酸の製造
6−アミノヘキサン酸7.2g/L、酵母エキス2g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム1g/L、塩化マンガン4水和物
80μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラスコ
に入れたフラスコを4本作成し、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、その培地中
にパラコッカス・エスピー AB10302(Paracoccus sp.AB10302)株をスラントから一白金耳接種し、27℃で44時間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養した。
Production of (R) -3-thiomorpholinecarboxylic acid by cell reaction using Paracoccus sp. AB10302 (Paracoccus sp. AB10302) strain 6-aminohexanoic acid 7.2 g / L, yeast extract 2 g / L, sodium chloride 1 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, manganese chloride tetrahydrate
Four flasks were prepared by putting 100 ml of 80 μg / L, pH 8.0 medium in a baffled 500 ml Erlenmeyer flask and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask, and a Paracoccus sp. AB10302 strain was inoculated into the medium from a slant at 44 ° C for 44 hours. The aerobic culture was performed on a rotary shaker with a rotation speed of 180 rpm.
次に、培養液から遠心分離機で菌体を回収し、基質溶液(L−4−チアリジン一塩酸塩
10g/L、グルコース 7.5g/LとなるようpH6.98の300mMリン酸バッファーで溶解)40mLをその回収した菌体に加えて懸濁し、200ml容三角フラスコに菌体懸濁液を加えた。その後、反応温度27℃、回転数160rpmのロータリーシェーカーで27時間菌体反応を行った。
Next, the cells are collected from the culture broth with a centrifuge and dissolved in a substrate solution (L-4-thalidine monohydrochloride 10 g / L, glucose 7.5 g / L in 300 mM phosphate buffer having a pH of 6.98). 40 mL was added to the collected cells and suspended, and the cell suspension was added to a 200 ml Erlenmeyer flask. Thereafter, the cell reaction was carried out for 27 hours on a rotary shaker with a reaction temperature of 27 ° C. and a rotation speed of 160 rpm.
反応液上清をTLCで分析したところ、L−4−チアリジン一塩酸塩はほとんど消失し、Rf値=0.494に(R)-3-チオモルホリンカルボン酸のニンヒドリン発色が認められた(展開溶媒 アセトニトリル:メタノール:水=3:1:1、メルク社製TLCプレート;シリカゲル60F254)。 When the supernatant of the reaction solution was analyzed by TLC, L-4-thalidine monohydrochloride almost disappeared, and ninhydrin coloration of (R) -3-thiomorpholinecarboxylic acid was observed at an Rf value = 0.494 (development). Solvent acetonitrile: methanol: water = 3: 1: 1, TLC plate manufactured by Merck & Co .; silica gel 60F 254 ).
この反応液から遠心分離により菌体を除去し、そのろ液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトC‐20(H+型)40mlを充填したカラムに通過させて(R)-3-チオモル
ホリンカルボン酸を吸着させ、更に200mlの脱イオン交換水でカラムを洗浄した後、2%アンモニア水で溶出した。ニンヒドリン発色物質を含む溶出液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水40Lを加えて固形物を溶解した。その溶解液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライトC‐20(NH4 +型)20mlを充填したカラムに通過させ、更に100mlの脱イオン交換水でカラムを洗浄して(R)-3-チオモルホリンカルボン酸を回収した。
The cells are removed from the reaction solution by centrifugation, and the filtrate is passed through a column packed with 40 ml of strongly acidic cation exchange resin Duolite C-20 (H + type) to give (R) -3-thiomorpholine. Carboxylic acid was adsorbed, and the column was further washed with 200 ml of deionized exchange water, and then eluted with 2% aqueous ammonia. The eluate containing the ninhydrin coloring substance was concentrated under reduced pressure to dryness, and then 40 L of deionized water was added to dissolve the solid matter. The solution was passed through a column packed with 20 ml of strongly acidic cation exchange resin Duolite C-20 (NH 4 + type), and the column was further washed with 100 ml of deionized exchange water (R) -3-thio. The morpholine carboxylic acid was recovered.
その通過液と回収液を減圧濃縮して乾固させた後、脱イオン交換水10mlを加えて固形物を溶解した。その溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライトA‐113(CH3
COO-型)3mlを充填したカラムに通過させ、更に脱イオン交換水でカラムを洗浄し
て(R)-3-チオモルホリンカルボン酸を回収した。
The passing liquid and the collected liquid were concentrated under reduced pressure to dryness, and 10 ml of deionized water was added to dissolve the solid matter. The solution was added to the strongly basic anion exchange resin Duolite A-113 (CH 3
The (R) -3-thiomorpholine carboxylic acid was recovered by passing through a column packed with 3 ml of (COO − type) and further washing the column with deionized water.
上記により得た通過液と回収液を減圧濃縮し、活性炭による脱色、0.45μmフィルターによるろ過後、溶液を濃縮しつつメタノールを加えて結晶化させた。結晶をろ別して回収し、乾燥させたところ(R)-3-チオモルホリンカルボン酸の白色結晶が70.5mg得られた。この結晶の比旋光度は、[α]D=−53.7°(c;2.0、H2O、23℃)であった。 The passing liquid and the collected liquid obtained above were concentrated under reduced pressure, decolorized with activated carbon, filtered through a 0.45 μm filter, and then crystallized by adding methanol while concentrating the solution. The crystals were collected by filtration and dried to obtain 70.5 mg of white crystals of (R) -3-thiomorpholinecarboxylic acid. The specific rotation of this crystal was [α] D = −53.7 ° (c; 2.0, H 2 O, 23 ° C.).
[比較例1]
D−リジン一塩酸塩3g/L、酵母エキス2g/L、塩化ナトリウム1g/L、リン酸2水素カリウム2g/L、リン酸水素2カリウム1g/L、塩化マンガン4水和物80μg/L、pH8.0の培地100mlをバッフル付き500ml容三角フラスコに入れ、121℃で20分間オートクレーブ滅菌した。植菌直前そのフラスコに別滅菌したグルコース溶液(250g/L)を8ml添加し、更にその培地中にパラコッカス・エスピー AB10292(Paracoccus sp.AB10292)株をスラントから一白金耳接種した。その三角
フラスコを27℃で3日間、回転数180rpmのロータリーシェーカーで好気培養した。培養終了後の培養液中に(S)-ピペコリン酸及び(R)-ピペコリン酸のいずれも検出されなかった。
[Comparative Example 1]
D-lysine monohydrochloride 3 g / L, yeast extract 2 g / L, sodium chloride 1 g / L, potassium dihydrogen phosphate 2 g / L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, manganese chloride tetrahydrate 80 μg / L, 100 ml of pH 8.0 medium was placed in a baffled 500 ml Erlenmeyer flask and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Immediately before the inoculation, 8 ml of a separately sterilized glucose solution (250 g / L) was added to the flask, and a strain of Paracoccus sp. AB10292 (Paracoccus sp. AB10292) was inoculated from the slant into the medium. The Erlenmeyer flask was subjected to aerobic culture at 27 ° C. for 3 days on a rotary shaker at 180 rpm. Neither (S) -pipecolic acid nor (R) -pipecolic acid was detected in the culture broth after completion of the culture.
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