JP5374278B2 - Method for evaluating the oxidation ability of nanomaterials to biomolecules - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method capable of evaluating quickly and highly accurately oxidation ability of a nano material to a biomolecule. <P>SOLUTION: This method for evaluating oxidation ability of the nano material to the biomolecule includes steps for: (a) preparing a sample by mixing the nano material with biomolecules; (b) measuring a plurality of emission quantities by performing in different light conditions and/or measuring conditions, operations wherein the sample prepared in step (a) is left as it is in the dark, exposed under a prescribed light condition, and then left as it is in the dark, and emission from the sample is measured; (c) calculating an evaluation value based on the plurality of emission quantities measured in step (b); and (d) evaluating the oxidation ability of a nano material to the biomolecule based on the evaluation value calculated in step (c). <P>COPYRIGHT: (C)2011,JPO&amp;INPIT

Description

本発明は、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法に関する。   The present invention relates to a method for evaluating the ability of nanomaterials to oxidize biomolecules.

近年、ナノ材料を使った多くの商品が市場に出されており、その安全性が問題となっている。ナノ材料の多くは酸化作用を持つと報告されている（例えば非特許文献１を参照）。また、Ｃ６０フラーレンが引き起こす細胞毒性は、脂質の過酸化が原因の１つであるとの報告がある（例えば、非特許文献２を参照）。また、脂質が酸化されると微弱な発光が生じることが報告されている（例えば、非特許文献３を参照）。 In recent years, many products using nanomaterials have been put on the market, and their safety has become a problem. Many nanomaterials have been reported to have an oxidizing action (see, for example, Non-Patent Document 1). Moreover, it has been reported that the cytotoxicity caused by C 60 fullerene is one of the causes of lipid peroxidation (see, for example, Non-Patent Document 2). In addition, it has been reported that weak lipids are generated when lipids are oxidized (see, for example, Non-Patent Document 3).

国際公開第２００５／０６２０２７号パンフレットInternational Publication No. 2005/062027 Pamphlet

Ｓｔｅｒｎ ＳＴ ａｎｄ ＭｃＮｅｉｌ ＳＥ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ．，２００８，１０１（１），４−２１．Stern ST and McNeil SE. , Toxicol Sci. 2008, 101 (1), 4-21. Ｓａｙｅｓ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００５，２６（３６），７５８７−９５．Says CM, et al. , Biomaterials, 2005, 26 (36), 7587-95. 萩原昌司、他、日本食品科学工学会誌、２００３、５０（７）、３０３−３０９．Masashi Sugawara, et al., Journal of Japan Society for Food Science and Technology, 2003, 50 (7), 303-309.

ナノ材料の安全性が問題とされているにもかかわらず、ナノ材料の安全性を評価する方法は確立されていない。そこで、本発明は、ナノ材料の安全性を評価する方法、より具体的には、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を高精度で迅速に評価する方法を提供することを目的とする。   Despite the safety of nanomaterials, a method for evaluating the safety of nanomaterials has not been established. Therefore, an object of the present invention is to provide a method for evaluating the safety of nanomaterials, more specifically, a method for rapidly and accurately evaluating the oxidizing ability of nanomaterials against biomolecules.

本発明は、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法であって、（ａ）ナノ材料と生体分子とを混合して試料を調製するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で調製した試料を、暗中放置し、所定の光条件下に曝した後に暗中放置し、試料の発光を測定することを、異なる光条件及び／又は測定条件で行い、複数の発光量を測定するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された複数の発光量に基づいて評価値を算出するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）で算出した評価値に基づいてナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価するステップと、を含む方法を提供する。
この方法により、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を高精度で迅速に評価することが可能になる。生体分子に対する酸化能が高いナノ材料は、生体に対する毒性が高いと考えられる。 The present invention is a method for evaluating the ability of nanomaterials to oxidize biomolecules, comprising: (a) preparing a sample by mixing nanomaterials and biomolecules; and (b) preparing in step (a). The sample is left in the dark, exposed to a predetermined light condition and then left in the dark, and measuring the light emission of the sample is performed under different light conditions and / or measurement conditions, and measuring a plurality of light emission amounts; (C) a step of calculating an evaluation value based on the plurality of light emission amounts measured in step (b); and (d) an ability of oxidizing nanomaterials to biomolecules based on the evaluation value calculated in step (c). And a step of evaluating.
This method makes it possible to evaluate the oxidation ability of nanomaterials for biomolecules with high accuracy and speed. Nanomaterials that have a high oxidizing ability for biomolecules are considered to be highly toxic to living bodies.

１つの態様において、上記のステップ（ｂ）で測定する発光量は、試料を暗中放置し、試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ及び試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌであってもよい。   In one embodiment, the amount of luminescence measured in the above step (b) is as follows: the sample is left in the dark, the luminescence amount D under the first condition for measuring the luminescence amount of the sample and the sample is left in the dark, and the light is It may be the light emission amount L under the second condition in which the sample is left in the dark after irradiation and the light emission amount of the sample is measured.

１つの態様において、上記のステップ（ｂ）で測定する発光量は、試料を暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ及び試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌであってもよい。   In one embodiment, the amount of luminescence measured in the above step (b) is the amount of luminescence D and the sample in the dark under the first condition in which the sample is left in the dark and the amount of luminescence of the sample in the predetermined wavelength range is measured. It may be the light emission amount L under the second condition in which the sample is left standing in the dark after being irradiated with light, and the light emission amount of the sample in the same wavelength region as that under the first condition is measured.

１つの態様において、上記のステップ（ｂ）で測定する発光量は、試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｌ１及び試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下とは異なる波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌ２であってもよい。 In one embodiment, the amount of luminescence measured in the above step (b) is the first condition in which the sample is left in the dark, irradiated in the light and then left in the dark, and the amount of luminescence of the sample in a predetermined wavelength region is measured. The light emission amount L 1 and the sample are left in the dark, and after being irradiated with light, the sample is left in the dark, and the light emission amount L under the second condition for measuring the light emission amount of the sample in a wavelength region different from the first condition is measured. 2 may be sufficient.

１つの態様において、上記のステップ（ｂ）で測定する発光量は、試料を暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ１、試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌ１、試料を暗中放置し、第一の条件下とは異なる波長域の試料の発光量を測定する第３の条件下での発光量Ｄ２及び試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第３の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第４の条件下での発光量Ｌ２であってもよい。 In one embodiment, the amount of luminescence measured in the above step (b) is the amount of luminescence D 1 under the first condition in which the sample is allowed to stand in the dark and the amount of luminescence of the sample in a predetermined wavelength region is measured. Leaving the sample in the dark, leaving it in the dark after irradiating light, measuring the amount of luminescence of the sample in the same wavelength range as the first condition, the light emission amount L 1 under the second condition, leaving the sample in the dark, and left light emission amount D 2 and the dark samples of the third condition of measuring the light emission quantity of the sample in different wavelength ranges from the one condition, and left dark after irradiation of light, and a third condition of The light emission amount L 2 under the fourth condition for measuring the light emission amount of the sample in the same wavelength region may be used.

上記のナノ材料は、炭素系ナノ材料であることが好ましい。より具体的には、ナノ材料は、フラーレン又はその誘導体、カーボンナノチューブ又はその誘導体及び多環芳香族炭化水素からなる群から選択される化合物であることが好ましい。本発明の方法により、これらのナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価することができる。   The nanomaterial is preferably a carbon-based nanomaterial. More specifically, the nanomaterial is preferably a compound selected from the group consisting of fullerenes or derivatives thereof, carbon nanotubes or derivatives thereof, and polycyclic aromatic hydrocarbons. The ability of these nanomaterials to oxidize biomolecules can be evaluated by the method of the present invention.

上記の生体分子は、脂質、核酸及びタンパク質からなる群から選択される化合物であることが好ましい。   The biomolecule is preferably a compound selected from the group consisting of lipids, nucleic acids, and proteins.

本発明により、未だに確立されていない、ナノ材料の安全性を評価する方法、より具体的には、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を高精度で迅速に評価する方法が提供される。   The present invention provides a method for evaluating the safety of nanomaterials, which has not yet been established, and more specifically, a method for quickly and accurately evaluating the oxidizing ability of nanomaterials for biomolecules.

（ａ）及び（ｂ）は、本発明の態様を説明する図である。(A) And (b) is a figure explaining the aspect of this invention. （ａ）及び（ｂ）は、本発明の態様を説明する図である。(A) And (b) is a figure explaining the aspect of this invention. （ａ）及び（ｂ）は、本発明の態様を説明する図である。(A) And (b) is a figure explaining the aspect of this invention. （ａ）〜（ｃ）は、本発明の態様を説明する図である。(A)-(c) is a figure explaining the aspect of this invention. 比較例の結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of a comparative example. 実施例１の結果を示すグラフである。3 is a graph showing the results of Example 1. 実施例２の結果を示すグラフである。10 is a graph showing the results of Example 2. 実施例３の結果を示すグラフである。10 is a graph showing the results of Example 3. 実施例４の結果を示すグラフである。（ａ）〜（ｈ）は、それぞれ、フィルター無し、３９８ｎｍ、４４７ｎｍ、４９８．５ｎｍ、５３８．５ｎｍ、５７７．５ｎｍ、６２８ｎｍ及び６８０．５ｎｍのバンドパスフィルターを用いた結果を示す。It is a graph which shows the result of Example 4. (A)-(h) shows the result using a filter without a band pass filter of 398 nm, 447 nm, 498.5 nm, 538.5 nm, 577.5 nm, 628 nm, and 680.5 nm, respectively. 実施例４の結果を示すグラフである。It is a graph which shows the result of Example 4.

本発明において、用語「ナノ材料」とは、ｎｍサイズの物質をいい、生体分子に対する酸化能の評価の対象となる、既知及び未知の様々な物質を包含する。ナノ材料は、例えば、フラーレン及びその誘導体、カーボンナノチューブ及びその誘導体、多環芳香族炭化水素（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ、ＰＡＨ）などの炭素系のナノ材料であることが好ましいが、これらに限定されない。ナノ材料は、単一種であっても、複数種の混合物であってもよい。ナノ材料は炭素系のナノ材料であっても無機物質であってもよく、これらの混合物であってもよい。   In the present invention, the term “nanomaterial” refers to a nanometer-sized substance, and includes various known and unknown substances that are targets for evaluation of oxidative ability to biomolecules. The nanomaterial is preferably a carbon-based nanomaterial such as fullerene and derivatives thereof, carbon nanotube and derivatives thereof, and polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH), but is not limited thereto. The nanomaterial may be a single species or a mixture of a plurality of species. The nanomaterial may be a carbon-based nanomaterial, an inorganic substance, or a mixture thereof.

本発明において、用語「フラーレン」は、炭素原子６０個からなる切頂二十面体（サッカーボール状）構造のＣ６０フラーレンや、炭素数が７０、７４、７６、７８などの高次フラーレン、並びに中空の骨格内にスカンジウム、ランタン、セリウム、チタンなどの金属原子を包み込んだ内包フラーレンを含む。
また、フラーレン誘導体とは、フラーレンを基本骨格として、これに部分的な化学構造の変化を加えて得られる化合物をいう。具体的には、フラーレン骨格に水素原子、水酸基、アミノ基、ハロゲン基、有機基などが単数又は複数付加した化合物や、カリックスアレーンやシクロデキストリンなどのホスト分子とフラーレン分子とからなる包括体などが例示でき、より具体的には、水酸化フラーレンや水素化フラーレンなどが例示できる。なお、「有機基」とは、直鎖構造、分岐構造、環構造のいずれを有していてもよい炭化水素基をいい、水酸基、アミノ基、ハロゲン基などの置換基を有していてもよい。 In the present invention, the term “fullerene” means a C 60 fullerene having a truncated icosahedron (soccer ball-like) structure composed of 60 carbon atoms, a higher-order fullerene having 70, 74, 76, 78 carbon atoms, and the like. It contains endohedral fullerenes in which metal atoms such as scandium, lanthanum, cerium, and titanium are encapsulated in a hollow skeleton.
The fullerene derivative refers to a compound obtained by using fullerene as a basic skeleton and adding a partial chemical structure change thereto. Specifically, there are compounds in which one or more hydrogen atoms, hydroxyl groups, amino groups, halogen groups, organic groups, etc. are added to the fullerene skeleton, and inclusion bodies composed of host molecules such as calixarene and cyclodextrin and fullerene molecules. More specifically, hydroxylated fullerene and hydrogenated fullerene can be exemplified. The “organic group” refers to a hydrocarbon group that may have any of a straight chain structure, a branched structure, and a ring structure, and may have a substituent such as a hydroxyl group, an amino group, or a halogen group. Good.

本発明において、用語「カーボンナノチューブ」はシングルウォールカーボンナノチューブ、マルチウォールカーボンナノチューブ、カーボンナノホーンなどを包含する。
また、カーボンナノチューブ誘導体とは、カーボンナノチューブに部分的な化学構造の変化を加えて得られる化合物をいう。具体的には、カーボンナノチューブに水素原子、水酸基、アミノ基、ハロゲン基、有機基などが単数又は複数付加した化合物などが例示できる。 In the present invention, the term “carbon nanotube” includes single-wall carbon nanotubes, multi-wall carbon nanotubes, carbon nanohorns, and the like.
The carbon nanotube derivative refers to a compound obtained by adding a partial chemical structure change to the carbon nanotube. Specifically, a compound in which one or more hydrogen atoms, hydroxyl groups, amino groups, halogen groups, organic groups and the like are added to carbon nanotubes can be exemplified.

本発明において、用語「生体分子」とは、脂質、核酸及びタンパク質などに例示される生体を構成する分子を意味し、天然分子であっても人工的に合成された分子であってもよい。本発明において、生体分子は脂質であることが好ましい。脂質としては、フォスファチジルコリン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質に例示されるレシチン、パルミチンなどの飽和脂肪酸、オレイン酸などのｎ−９系脂肪酸、リノール酸などのｎ−６系脂肪酸及びリノレン酸などのｎ−３系脂肪酸などの不飽和脂肪酸、ドコサヘキサエン酸やエイコサペンタエン酸などの多価不飽和脂肪酸などが用いられる。   In the present invention, the term “biomolecule” means a molecule constituting a living body exemplified by lipid, nucleic acid, protein and the like, and may be a natural molecule or an artificially synthesized molecule. In the present invention, the biomolecule is preferably a lipid. Examples of lipids include lecithins exemplified by phospholipids such as phosphatidylcholine, phosphatidylserine, and phosphatidylethanolamine, saturated fatty acids such as palmitic acid, n-9 fatty acids such as oleic acid, and n such as linoleic acid. Unsaturated fatty acids such as n-3 fatty acids such as -6 fatty acids and linolenic acid, and polyunsaturated fatty acids such as docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid are used.

本発明は、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法を提供する。
本発明において、「所定の光条件」とは、０秒間、すなわち、光照射なしの条件を含む。
本発明の１つの態様を図１（ａ）に示す。まず、ナノ材料を生体分子と混合して試料を調製する。試料の溶媒としてはナノ材料及び生体材料を溶解、分散あるいは懸濁できるものであれば特に限定されないが、トルエン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、クロロホルム、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、メチルセロソルブ及び水などが好ましく用いられる。溶媒は単一の物質であっても２種以上の混合物であってもよい。より好ましくは、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム及びメタノールを、それぞれ容量比０〜５０：２５〜５５：１５〜３５：１〜５：１〜５で混合した溶媒が用いられる。試料中のナノ材料の濃度は０．０１〜２ｍＭであることが好ましく、生体分子の濃度は１ｍＭ〜４Ｍであることが好ましい。 The present invention provides a method for evaluating the oxidation ability of nanomaterials to biomolecules.
In the present invention, the “predetermined light condition” includes a condition for 0 second, that is, no light irradiation.
One embodiment of the present invention is shown in FIG. First, a sample is prepared by mixing nanomaterials with biomolecules. The solvent of the sample is not particularly limited as long as it can dissolve, disperse or suspend nanomaterials and biomaterials, but toluene, dimethylformamide (DMF), 2-propanol, chloroform, methanol, ethanol, dimethyl sulfoxide, tetrahydrofuran, Methyl cellosolve and water are preferably used. The solvent may be a single substance or a mixture of two or more. More preferably, a solvent in which 2-propanol, toluene, DMF, chloroform and methanol are mixed at a volume ratio of 0 to 50:25 to 55:15 to 35: 1 to 5: 1 to 5, respectively. The concentration of the nanomaterial in the sample is preferably 0.01 to 2 mM, and the concentration of the biomolecule is preferably 1 mM to 4M.

試料を調製した後、暗中放置する。これは、試料の光環境の違いによる差を低減させる目的で実施する。暗中放置する時間は５秒〜２４時間であることが好ましく、１〜３０分であることがより好ましい。このような時間、暗中放置すれば、試料の光環境の違いによる差を低減することができる。続いて、試料から放出される発光（遅延発光）を測定し、発光量Ｄを測定する。遅延発光とは、光照射により生じる発光の一種であり、遅延蛍光とも呼ばれる。通常の蛍光がマイクロ秒からピコ秒という非常に短い時間で減衰するのに対し、遅延発光は数秒〜数十秒にわたってゆっくりと減衰する。
試料からの発光は、光電子増倍管、超高感度カメラ、フォトダイオードなどを用いて測定することができるが、光電子増倍管を用いることが高感度である点で好ましい。
試料からの発光の測定時間は、０．１秒〜３０分であることが好ましく、５〜３０秒であることがより好ましく、例えば２５秒間測定するとよい。より正確な測定を行うために、測定の間、試料をマグネティックスターラーなどで攪拌して、試料溶液から析出物が生じた場合、試料分散液、あるいは、試料懸濁液の懸濁状態を維持することが好ましい。 After preparing the sample, leave it in the dark. This is performed for the purpose of reducing the difference due to the difference in the light environment of the sample. The time for standing in the dark is preferably 5 seconds to 24 hours, more preferably 1 to 30 minutes. If the sample is left in the dark for such a time, the difference due to the difference in the light environment of the sample can be reduced. Subsequently, the light emission (delayed light emission) emitted from the sample is measured, and the light emission amount D is measured. Delayed light emission is a kind of light emission caused by light irradiation, and is also called delayed fluorescence. Normal fluorescence decays in a very short time, from microseconds to picoseconds, whereas delayed emission decays slowly over seconds to tens of seconds.
Light emission from the sample can be measured using a photomultiplier tube, an ultra-high sensitivity camera, a photodiode, or the like, but the use of a photomultiplier tube is preferable in terms of high sensitivity.
The measurement time of light emission from the sample is preferably 0.1 second to 30 minutes, more preferably 5 to 30 seconds, for example, 25 seconds. In order to perform more accurate measurement, the sample is stirred with a magnetic stirrer or the like during the measurement, and when precipitates are generated from the sample solution, the suspension state of the sample dispersion or sample suspension is maintained. It is preferable.

続いて、試料を暗中放置する。この態様においては、試料に光が照射されていないため、この暗中放置は実施しなくてもよい。次に、試料を光条件に曝す。光条件は、特に限定されないが、例えば、白色ＬＥＤによる、光量子束密度２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を１〜６０秒間、例えば、５秒間照射する条件であってよい。あるいは、特定の波長域の光を照射してもよい。特定の波長域の光を測定するには、例えばバンドパスフィルターを用いることができる。 Subsequently, the sample is left in the dark. In this embodiment, since the sample is not irradiated with light, this dark standing may not be performed. The sample is then exposed to light conditions. The light conditions are not particularly limited. For example, the light conditions may be a condition of irradiating light with a photon flux density of 2000 μmol / m 2 / second by a white LED for 1 to 60 seconds, for example, 5 seconds. Or you may irradiate the light of a specific wavelength range. In order to measure light in a specific wavelength range, for example, a band pass filter can be used.

続いて、試料を暗中放置する。これは、試料の容器に由来する自家蛍光などの、試料以外から生じる発光を低減させる目的で実施する。暗中放置する時間は０．１〜１０秒であることが好ましく、１〜５秒であることがより好ましい。１０秒を超えると、試料から放出される発光が減衰してしまう場合があり、０．１秒未満であると、試料以外から生じる発光が十分に低減されない場合がある。
次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌを測定する。ここで、発光の測定条件は上記の発光量Ｄの測定条件と同一であることが好ましい。 Subsequently, the sample is left in the dark. This is performed for the purpose of reducing luminescence generated from other than the sample, such as autofluorescence derived from the sample container. The time for standing in the dark is preferably 0.1 to 10 seconds, and more preferably 1 to 5 seconds. If it exceeds 10 seconds, light emission emitted from the sample may be attenuated, and if it is less than 0.1 second, light emission generated from other than the sample may not be sufficiently reduced.
Next, the luminescence emitted from the sample is measured, and the luminescence amount L is measured. Here, the light emission measurement conditions are preferably the same as the light emission amount D measurement conditions.

次に、測定された発光量Ｄ及びＬに基づいて評価値を算出する。この場合の評価値（以下、場合により評価値Ｒという。）は次式（１）により算出されることが好ましいがこれに限定されない。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ／発光量Ｄ…（１） Next, an evaluation value is calculated based on the measured light emission amounts D and L. The evaluation value in this case (hereinafter referred to as evaluation value R in some cases) is preferably calculated by the following equation (1), but is not limited thereto.
(Evaluation value R) = Light emission amount L / Light emission amount D (1)

１つの態様において、本発明の方法は図１（ｂ）に示すように実施されてもよい。すなわち、調製した試料を２つに分け、その一方で発光量Ｄの測定を行い、もう一方で発光量Ｌの測定を行ってもよい。これにより、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価するのに要する時間を短縮することができる。   In one embodiment, the method of the present invention may be performed as shown in FIG. That is, the prepared sample may be divided into two, and the light emission amount D may be measured on the one hand and the light emission amount L may be measured on the other hand. Thereby, the time required for evaluating the oxidation ability of the nanomaterial to the biomolecule can be shortened.

本発明の別の態様を図２（ａ）に示す。試料を調製した後、暗中放置する。続いて、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｄを測定する。ここで、試料からの発光を分光し、第１の波長域の発光のみを測定する。分光には例えばバンドパスフィルターが好ましく用いられる。
ここで、第１の波長域は、５３８．５〜６８０．５ｎｍであることが好ましい。実施例に示すように、このような波長域の発光量に基づいて評価値を算出することにより、従来法による評価とよく一致する、ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価を行うことができる。
続いて、試料を暗中放置する。この態様においては、試料に光が照射されていないため、この暗中放置は実施しなくてもよい。 Another embodiment of the present invention is shown in FIG. After preparing the sample, leave it in the dark. Subsequently, the luminescence emitted from the sample is measured, and the luminescence amount D is measured. Here, the light emitted from the sample is dispersed, and only the light in the first wavelength range is measured. For spectroscopy, for example, a band pass filter is preferably used.
Here, the first wavelength region is preferably 538.5 to 680.5 nm. As shown in the examples, by calculating the evaluation value based on the light emission amount in such a wavelength region, it is possible to evaluate the oxidizing ability of the nanomaterial for the biomolecule, which is well consistent with the evaluation by the conventional method. .
Subsequently, the sample is left in the dark. In this embodiment, since the sample is not irradiated with light, this dark standing may not be performed.

次に、試料を光条件に曝し、続いて、暗中放置する。次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌを測定する。ここで、試料からの発光を分光し、上記、発光量Ｄを測定した時と同一の第１の波長域の発光のみを測定する。
次に、測定された発光量Ｄ及びＬに基づいて評価値を算出する。この場合の評価値は、次式（１）により算出することが好ましいがこれに限定されない。特定の波長域の発光量を測定することにより、評価値の精度を高めることができる。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ／発光量Ｄ…（１） The sample is then exposed to light conditions and then left in the dark. Next, the luminescence emitted from the sample is measured, and the luminescence amount L is measured. Here, the light emission from the sample is dispersed, and only the light emission in the same first wavelength region as that when the light emission amount D is measured is measured.
Next, an evaluation value is calculated based on the measured light emission amounts D and L. The evaluation value in this case is preferably calculated by the following equation (1), but is not limited to this. By measuring the light emission amount in a specific wavelength region, the accuracy of the evaluation value can be increased.
(Evaluation value R) = Light emission amount L / Light emission amount D (1)

１つの態様において、本発明の方法は図２（ｂ）に示すように実施されてもよい。すなわち、調製した試料を２つに分け、その一方で発光量Ｄの測定を行い、もう一方で発光量Ｌの測定を行ってもよい。   In one embodiment, the method of the present invention may be implemented as shown in FIG. That is, the prepared sample may be divided into two, and the light emission amount D may be measured on the one hand and the light emission amount L may be measured on the other hand.

本発明の更に別の態様を図３（ａ）に示す。試料を調製した後、暗中放置する。続いて、試料を光条件に曝し、暗中放置する。次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌ１を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、第１の波長域の発光のみを測定する。
次に、試料を暗中放置する。続いて、試料を光条件に曝し、暗中放置する。次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌ２を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、上記、発光量Ｌ１を測定した時とは異なる第２の波長域の発光のみを測定する。
ここで、第１の波長域は、中心波長４９８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍであることが好ましく、第２の波長域は、中心波長５３８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍであることが好ましい。実施例に示すように、このような波長域の発光量に基づいて評価値を算出することにより、従来法による評価とよく一致する、ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価を行うことができる。
次に、測定された発光量Ｌ１及びＬ２に基づいて評価値を算出する。この場合の評価値は、次式（２）により算出することが好ましいがこれに限定されない。特定の波長域の発光量を測定することにより、評価値の精度を更に高めることができる。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ１／発光量Ｌ２…（２） Yet another embodiment of the present invention is shown in FIG. After preparing the sample, leave it in the dark. Subsequently, the sample is exposed to light conditions and left in the dark. Then, by measuring the luminescence emitted from the sample, measuring the luminescence amount L 1. Here, the light emitted from the sample is dispersed, and only the light in the first wavelength range is measured.
The sample is then left in the dark. Subsequently, the sample is exposed to light conditions and left in the dark. Then, by measuring the luminescence emitted from the sample, measuring the luminescence amount L 2. Here, the spectral emission from the sample, the, measuring only emission of a different second wavelength range and when measuring the light emission amount L 1.
Here, the first wavelength range is preferably a center wavelength of 498.5 nm and a half width of 5 nm, and the second wavelength range is preferably a center wavelength of 538.5 nm and a half width of 5 nm. As shown in the examples, by calculating the evaluation value based on the light emission amount in such a wavelength region, it is possible to evaluate the oxidizing ability of the nanomaterial for the biomolecule, which is well consistent with the evaluation by the conventional method. .
Then, to calculate the evaluation value based on the measured emission amount L 1 and L 2. The evaluation value in this case is preferably calculated by the following equation (2), but is not limited to this. By measuring the light emission amount in a specific wavelength region, the accuracy of the evaluation value can be further increased.
(Evaluation value R) = Light emission amount L 1 / Light emission amount L 2 (2)

１つの態様において、本発明の方法は図３（ｂ）に示すように実施されてもよい。すなわち、調製した試料を２つに分け、その一方で発光量Ｌ１の測定を行い、もう一方で発光量Ｌ２の測定を行ってもよい。図３（ａ）に示す態様では、Ｌ１の測定前に照射した光により試料が変化し、Ｌ２の測定に影響を及ぼす場合があるため、図３（ｂ）に示すように試料を２つに分けて発光量を測定することがより好ましい場合がある。 In one embodiment, the method of the present invention may be implemented as shown in FIG. That is, the prepared sample may be divided into two, and the light emission amount L 1 may be measured on the one hand and the light emission amount L 2 may be measured on the other hand. In the embodiment shown in FIG. 3A, since the sample may be changed by the light irradiated before the measurement of L 1 and may affect the measurement of L 2 , the sample is set to 2 as shown in FIG. It may be more preferable to measure the amount of luminescence separately.

本発明の更に別の態様を図４（ａ）に示す。試料を調製した後、暗中放置する。続いて、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｄ１を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、第１の波長域の発光のみを測定する。
続いて、試料を暗中放置する。この態様においては、試料に光が照射されていないため、この暗中放置は実施しなくてもよい。続いて、試料を光条件に曝し、暗中放置する。次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌ１を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、発光量Ｄ１を測定した時と同じ、第１の波長域の発光のみを測定する。 Still another embodiment of the present invention is shown in FIG. After preparing the sample, leave it in the dark. Then, by measuring the luminescence emitted from the sample, measuring the luminescence amount D 1. Here, the light emitted from the sample is dispersed, and only the light in the first wavelength range is measured.
Subsequently, the sample is left in the dark. In this embodiment, since the sample is not irradiated with light, this dark standing may not be performed. Subsequently, the sample is exposed to light conditions and left in the dark. Then, by measuring the luminescence emitted from the sample, measuring the luminescence amount L 1. Here, the spectral emission from the sample, the same as when measuring the light emission amount D 1, to measure the light only of the first wavelength region.

次に、試料を暗中放置する。続いて、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｄ２を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、上記の発光量Ｄ１及びＬ１を測定した時とは異なる、第２の波長域の発光のみを測定する。
続いて、試料を光条件に曝し、暗中放置する。次に、試料から放出される発光を測定し、発光量Ｌ２を測定する。ここで、試料からの発光を分光し、上記、発光量Ｄ２を測定した時と同じ、第２の波長域の発光のみを測定する。
ここで、第１の波長域は、中心波長４９８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍであることが好ましく、第２の波長域は、中心波長５３８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍであることが好ましい。実施例に示すように、このような波長域の発光量に基づいて評価値を算出することにより、従来法による評価とよく一致する、ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価を行うことができる。
次に、測定された発光量Ｄ１、Ｌ１、Ｄ２及びＬ２に基づいて評価値を算出する。この場合の評価値は、次式（３）により算出することが好ましいがこれに限定されない。このような評価値を用いることにより、評価値の精度を更に高めることができる。
（評価値Ｒ）＝（発光量Ｌ１−発光量Ｄ１）／（発光量Ｌ２−発光量Ｄ２）…（３） The sample is then left in the dark. Then, by measuring the luminescence emitted from the sample, measuring the luminescence amount D 2. Here, the light emission from the sample is dispersed, and only the light emission in the second wavelength range, which is different from the time when the above light emission amounts D 1 and L 1 are measured, is measured.
Subsequently, the sample is exposed to light conditions and left in the dark. Then, by measuring the luminescence emitted from the sample, measuring the luminescence amount L 2. Here, the spectral emission from the sample, the same as when measuring the light emission amount D 2, to measure the light only of the second wavelength region.
Here, the first wavelength range is preferably a center wavelength of 498.5 nm and a half width of 5 nm, and the second wavelength range is preferably a center wavelength of 538.5 nm and a half width of 5 nm. As shown in the examples, by calculating the evaluation value based on the light emission amount in such a wavelength region, it is possible to evaluate the oxidizing ability of the nanomaterial for the biomolecule, which is well consistent with the evaluation by the conventional method. .
Next, an evaluation value is calculated based on the measured light emission amounts D 1 , L 1 , D 2 and L 2 . The evaluation value in this case is preferably calculated by the following equation (3), but is not limited to this. By using such an evaluation value, the accuracy of the evaluation value can be further increased.
(Evaluation value R) = (Light emission amount L 1 −Light emission amount D 1 ) / (Light emission amount L 2 −Light emission amount D 2 ) (3)

１つの態様において、本発明の方法は図４（ｂ）に示すように実施されてもよい。すなわち、発光量Ｄ１及びＤ２の測定を先に行い、続いて発光量Ｌ１及びＬ２の測定を行ってもよい。図４（ａ）に示す態様では、Ｌ１の測定前に照射した光により試料が変化し、Ｄ２の測定に影響を及ぼす場合があるが、発光量Ｄ１及びＤ２の測定を先に行うことにより、この影響を低減することができる場合がある。 In one embodiment, the method of the present invention may be implemented as shown in FIG. 4 (b). That is, the light emission amounts D 1 and D 2 may be measured first, and then the light emission amounts L 1 and L 2 may be measured. In the embodiment shown in FIG. 4 (a), the sample is changed by light irradiation before the measurement of L 1, but may affect the measurement of the D 2, before the measurement of the light emission amount D 1 and D 2 Doing so may reduce this effect.

１つの態様において、本発明の方法は図４（ｃ）に示すように実施されてもよい。すなわち、調製した試料を２つに分け、その一方で発光量Ｄ１及びＬ１の測定を行い、もう一方で発光量Ｄ２及びＬ２の測定を行ってもよい。図４（ａ）及び（ｂ）に示す態様では、Ｌ１の測定前に照射した光により試料が変化し、Ｄ２及びＬ２の測定に影響を及ぼす場合があるため、図４（ｃ）に示すように試料を２つに分けて発光量を測定することがより好ましい場合がある。 In one embodiment, the method of the present invention may be performed as shown in FIG. That is, the prepared sample may be divided into two, and the light emission amounts D 1 and L 1 may be measured on the one hand, and the light emission amounts D 2 and L 2 may be measured on the other hand. In the embodiment shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b), the sample may change due to the light irradiated before the measurement of L 1 , which may affect the measurement of D 2 and L 2 . In some cases, it is more preferable to measure the amount of luminescence by dividing the sample into two.

以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。   EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples of the present invention. However, the present invention is not limited to these examples, and various modifications can be made without departing from the technical idea of the present invention. Can be changed.

（比較例）
（従来法によるナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価）
従来法である、ジエチルチオバルビツール酸（ＤＥＴＢＡ）法により、ナノ材料の脂質に対する酸化能を評価した。
ナノ材料として、フラーレン（Ｃ６０、バックミンスターフラーレン、９９．９％、Ｓｔｒａｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．、米国）、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ、ｎ＝約１０、ｎａｎｏ ｓｐｅｃｔｒａ Ｄ１００、フロンティアカーボン株式会社）、及び水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ、ｎ＝約３０、ｎａｎｏ ｓｐｅｃｔｒａ Ａ１００、フロンティアカーボン株式会社）を用いた。生体分子としてレシチン（卵由来、東京化成工業株式会社）を用いた。 (Comparative example)
(Evaluation of oxidation ability of nanomaterials for biomolecules by conventional methods)
The oxidation ability of nanomaterials to lipids was evaluated by a conventional method, diethylthiobarbituric acid (DETBA) method.
As a nanomaterial, fullerene (C 60 , Buckminsterfullerene, 99.9%, Stram Chemical Inc., USA), fullerene hydroxide (C 60 (OH) n , n = about 10, nano spectra D100, Frontier Carbon Co., Ltd. ), And hydrogenated fullerene (C 60 H n , n = about 30, nano spectra A100, Frontier Carbon Co., Ltd.). Lecithin (egg derived, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used as a biomolecule.

ナノ材料及びレシチンを、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム、メタノール又はそれらから選ばれる混合溶媒を用いて溶解し、最終的な容量比が２−プロパノール：トルエン：ＤＭＦ：クロロホルム：メタノール＝２７：１８：１２：２：１の混合溶媒中、ナノ材料０．２ｍＭ及びレシチン０．５（ｗ／ｖ）％になるように調製し、試料１０ｍＬを作製した。
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ ３．０）に、ジエチルチオバルビツール酸（ＤＥＴＢＡ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ、和光純薬工業株式会社）及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、１０ｍＭ ＤＥＴＢＡ、１ｍＭ ＢＨＴ、及び１．４％ＳＤＳとなるように溶解して、ＤＥＴＢＡ溶液を調製した。
２４℃にて３時間暗中放置した試料、及び２４℃にて蛍光灯による２００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を照射する光条件下に３時間放置した試料各１００μＬに、ＤＥＴＢＡ溶液を９００μＬずつ添加し、９５℃で１５分間過熱した。冷却後、各試料に酢酸エチルを１ｍＬずつ添加し、室温にて１００００ ｒｐｍで１０分間遠心分離し、酢酸エチル層を分離した。酢酸エチル層中のＤＥＴＢＡと過酸化脂質の反応物（ＤＥＴＢＡ反応物質）の濃度をＨＰＬＣ法により測定した。具体的には、各試料の酢酸エチル層の５３２ｎｍの吸収スペクトルを測定した。 The nanomaterial and lecithin are dissolved using 2-propanol, toluene, DMF, chloroform, methanol or a mixed solvent selected from them, and the final volume ratio is 2-propanol: toluene: DMF: chloroform: methanol = 27: In a mixed solvent of 18: 12: 2: 1, the nanomaterial was prepared to be 0.2 mM and lecithin 0.5 (w / v)% to prepare 10 mL of a sample.
In 100 mM phosphate buffer (pH 3.0), diethylthiobarbituric acid (DETBA), dibutylhydroxytoluene (BHT, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and sodium dodecyl sulfate (SDS) were added to 10 mM DETBA, 1 mM BHT, A DETBA solution was prepared by dissolving to 1.4% SDS.
900 μL of the DETBA solution was added to 100 μL each of the sample left in the dark at 24 ° C. for 3 hours and the sample left at 24 ° C. for 3 hours under the light condition of irradiating light of 200 μmol / m 2 / sec. And heated at 95 ° C. for 15 minutes. After cooling, 1 mL of ethyl acetate was added to each sample and centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes at room temperature to separate the ethyl acetate layer. The concentration of the reaction product (DETBA reactant) of DETBA and lipid peroxide in the ethyl acetate layer was measured by the HPLC method. Specifically, the absorption spectrum at 532 nm of the ethyl acetate layer of each sample was measured.

図５に結果を示す。図では、各試料中の過酸化脂質の濃度を、主要な脂質過酸化分解生成物の一つであるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に換算した値で示す。Ｃ６０、Ｃ６０（ＯＨ）ｎ及びＣ６０Ｈｎは、光照射によりレシチンを基質として脂質過酸化物を生成し、その生成量は、Ｃ６０ ＞ Ｃ６０（ＯＨ）ｎ ＞ Ｃ６０Ｈｎであった。一方、暗中放置した試料では、脂質過酸化物量にほとんど変化が見られなかった。 The results are shown in FIG. In the figure, the concentration of lipid peroxide in each sample is shown as a value converted to malondialdehyde (MDA), which is one of the major lipid peroxidative decomposition products. C 60 , C 60 (OH) n and C 60 H n generate lipid peroxides using lecithin as a substrate by light irradiation, and the amount of C 60 > C 60 (OH) n > C 60 H n is generated. Met. On the other hand, in the sample left in the dark, there was almost no change in the amount of lipid peroxide.

（実施例１）
（ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価）
比較例と同様に、ナノ材料として、フラーレン（Ｃ６０）、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）、及び水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ）を用いた。生体分子としてレシチンを用いた。
ナノ材料及びレシチンを、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム、メタノール又はそれらから選ばれる混合溶媒を用いて溶解し、最終的な容量比が２−プロパノール：トルエン：ＤＭＦ：クロロホルム：メタノール＝２７：１８：１２：２：１の混合溶媒中、ナノ材料０．２ｍＭ及びレシチン０．５（ｗ／ｖ）％になるように調製し、試料１０ｍＬを作製した。試料溶液から析出物が生じた場合でも懸濁状態を維持するため、計測の間、試料をマグネティックスターラーで撹拌した。 Example 1
(Evaluation of oxidation ability of nanomaterials for biomolecules)
As in the comparative example, fullerene (C 60 ), fullerene hydroxide (C 60 (OH) n ), and hydrogenated fullerene (C 60 H n ) were used as nanomaterials. Lecithin was used as a biomolecule.
The nanomaterial and lecithin are dissolved using 2-propanol, toluene, DMF, chloroform, methanol or a mixed solvent selected from them, and the final volume ratio is 2-propanol: toluene: DMF: chloroform: methanol = 27: In a mixed solvent of 18: 12: 2: 1, the nanomaterial was prepared to be 0.2 mM and lecithin 0.5 (w / v)% to prepare 10 mL of a sample. The sample was stirred with a magnetic stirrer during measurement in order to maintain a suspended state even when precipitates were generated from the sample solution.

（発光量Ｄの測定）
試料を２０分間暗中放置した後、０秒間（光照射なし）の光条件を実施した。続いて５秒間暗中放置した。次に、光電子増倍管（バイアルカリタイプ・Ｒ７５１８ＨＡ、浜松ホトニクス株式会社）を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、波長３５０ｎｍ〜８００ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｄとして記録した。 (Measurement of light emission amount D)
The sample was allowed to stand in the dark for 20 minutes and then subjected to light conditions for 0 seconds (no light irradiation). Subsequently, it was left in the dark for 5 seconds. Next, light emission (delayed light emission) of the sample was measured using a photomultiplier tube (bialkali type R7518HA, Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Specifically, light emission with a wavelength of 350 nm to 800 nm was measured at 100 millisecond intervals for 25 seconds. The total of the measured light values was recorded as the light emission amount D.

（発光量Ｌの測定）
発光量Ｄの測定に引き続いて、発光量Ｌの測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、発光量Ｄの測定と同様に試料の発光を測定した。波長３５０ｎｍ〜８００ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測し、光の測定値の総和を発光量Ｌとして記録した。 (Measurement of luminescence L)
Subsequent to the measurement of the light emission amount D, the light emission amount L was measured. The sample was left in the dark for 20 minutes, and then left under the light condition of irradiating with 2000 μmol / m 2 / second of light from the white LED for 5 seconds. Next, it was left in the dark for 5 seconds. Subsequently, the light emission of the sample was measured in the same manner as the measurement of the light emission amount D. Light emission with a wavelength of 350 nm to 800 nm was measured at 100 millisecond intervals for 25 seconds, and the total of the measured light values was recorded as the light emission amount L.

（評価値Ｒの算出）
上記の発光量Ｄ及び発光量Ｌを使用し、下記式（１）により評価値Ｒを算出した。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ／発光量Ｄ…（１）
図６に結果を示す。Ｃ６０、Ｃ６０（ＯＨ）ｎ及びＣ６０Ｈｎは、レシチンを基質として光照射により遅延発光を放出し、その放出量は、Ｃ６０ ＞ Ｃ６０（ＯＨ）ｎ ＞ Ｃ６０Ｈｎであった。この結果は、従来法による脂質過酸化物の生成量の測定結果とよく一致した。また、従来法よりもはるかに簡便、迅速にナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価することができた。 (Calculation of evaluation value R)
The evaluation value R was calculated by the following formula (1) using the light emission amount D and the light emission amount L.
(Evaluation value R) = Light emission amount L / Light emission amount D (1)
The results are shown in FIG. C 60 , C 60 (OH) n and C 60 H n release delayed luminescence by light irradiation using lecithin as a substrate, and the release amount is C 60 > C 60 (OH) n > C 60 H n. It was. This result was in good agreement with the measurement result of the amount of lipid peroxide produced by the conventional method. In addition, the ability of nanomaterials to oxidize biomolecules could be evaluated much more easily and quickly than conventional methods.

（実施例２）
（ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価）
実施例１と同様に、ナノ材料として、フラーレン（Ｃ６０）、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）、及び水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ）を用いた。生体分子としてレシチンを用いた。
ナノ材料及びレシチンを、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム、メタノール又はそれらから選ばれる混合溶媒を用いて溶解し、最終的な容量比が２−プロパノール：トルエン：ＤＭＦ：クロロホルム：メタノール＝２７：１８：１２：２：１の混合溶媒中、ナノ材料０．２ｍＭ及びレシチン０．５（ｗ／ｖ）％になるように調製し、試料１０ｍＬを作製した。試料溶液から析出物が生じた場合でも懸濁状態を維持するため、計測の間、試料をマグネティックスターラーで撹拌した。 (Example 2)
(Evaluation of oxidation ability of nanomaterials for biomolecules)
As in Example 1, fullerene (C 60 ), fullerene hydroxide (C 60 (OH) n ), and hydrogenated fullerene (C 60 H n ) were used as nanomaterials. Lecithin was used as a biomolecule.
The nanomaterial and lecithin are dissolved using 2-propanol, toluene, DMF, chloroform, methanol or a mixed solvent selected from them, and the final volume ratio is 2-propanol: toluene: DMF: chloroform: methanol = 27: In a mixed solvent of 18: 12: 2: 1, the nanomaterial was prepared to be 0.2 mM and lecithin 0.5 (w / v)% to prepare 10 mL of a sample. The sample was stirred with a magnetic stirrer during measurement in order to maintain a suspended state even when precipitates were generated from the sample solution.

（発光量Ｌ１の測定）
試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、中心波長５３８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌ１として記録した。 (Measurement of luminescence L 1 )
The sample was left in the dark for 20 minutes, and then left under the light condition of irradiating with 2000 μmol / m 2 / second of light from the white LED for 5 seconds. Next, it was left in the dark for 5 seconds. Subsequently, the light emission (delayed light emission) of the sample was measured using a photomultiplier tube. Specifically, emission with a center wavelength of 538.5 nm and a half width of 5 nm was measured at 100 millisecond intervals for 25 seconds. Were recorded sum of the measured values of the light as the light emission amount L 1.

（発光量Ｌ２の測定）
発光量Ｌ１の測定に引き続いて、発光量Ｌ２の測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を照射する光条件下に５秒間放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、発光量Ｌ１の測定と同様に試料の発光を測定した。中心波長４９８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌ２として記録した。 (Measurement of luminescence L 2 )
Following measurement of the emission amount L 1, it was measured emission amount L 2. The sample was allowed to stand for 20 minutes in the dark, and then left for 5 seconds under the light condition of irradiating light of 2000 μmol / m 2 / second with a white LED. Next, it was left in the dark for 5 seconds. Then, luminescence was measured sample similar to the measurement of the emission amount L 1. Light emission with a center wavelength of 498.5 nm and a half-value width of 5 nm was measured at 100 millisecond intervals for 25 seconds. Were recorded sum of the measured values of the light as the light emission amount L 2.

（評価値Ｒの算出）
上記の発光量Ｌ１及び発光量Ｌ２を使用し、下記式（２）により評価値Ｒを算出した。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ１／発光量Ｌ２…（２）
図７に結果を示す。Ｃ６０、Ｃ６０（ＯＨ）ｎ及びＣ６０Ｈｎは、レシチンを基質として光照射により遅延発光を放出し、その放出量は、Ｃ６０ ＞ Ｃ６０（ＯＨ）ｎ ＞ Ｃ６０Ｈｎであった。この結果は、従来法による脂質過酸化物の生成量の測定結果とよく一致した。 (Calculation of evaluation value R)
Using the above light emission amount L 1 and the light emission amount L 2, and calculates an evaluation value R by the following equation (2).
(Evaluation value R) = Light emission amount L 1 / Light emission amount L 2 (2)
The results are shown in FIG. C 60 , C 60 (OH) n and C 60 H n release delayed luminescence by light irradiation using lecithin as a substrate, and the release amount is C 60 > C 60 (OH) n > C 60 H n. It was. This result was in good agreement with the measurement result of the amount of lipid peroxide produced by the conventional method.

（実施例３）
（ナノ材料の生体分子に対する酸化能の評価）
実施例１と同様に、ナノ材料として、フラーレン（Ｃ６０）、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）、及び水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ）を用いた。生体分子としてレシチンを用いた。
ナノ材料及びレシチンを、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム、メタノール又はそれらから選ばれる混合溶媒を用いて溶解し、最終的な容量比が２−プロパノール：トルエン：ＤＭＦ：クロロホルム：メタノール＝２７：１８：１２：２：１の混合溶媒中、ナノ材料０．２ｍＭ及びレシチン０．５（ｗ／ｖ）％になるように調製し、試料１０ｍＬを作製した。試料溶液から析出物が生じた場合でも懸濁状態を維持するため、計測の間、試料をマグネティックスターラーで撹拌した。 (Example 3)
(Evaluation of oxidation ability of nanomaterials for biomolecules)
As in Example 1, fullerene (C 60 ), fullerene hydroxide (C 60 (OH) n ), and hydrogenated fullerene (C 60 H n ) were used as nanomaterials. Lecithin was used as a biomolecule.
The nanomaterial and lecithin are dissolved using 2-propanol, toluene, DMF, chloroform, methanol or a mixed solvent selected from them, and the final volume ratio is 2-propanol: toluene: DMF: chloroform: methanol = 27: In a mixed solvent of 18: 12: 2: 1, the nanomaterial was prepared to be 0.2 mM and lecithin 0.5 (w / v)% to prepare 10 mL of a sample. The sample was stirred with a magnetic stirrer during measurement in order to maintain a suspended state even when precipitates were generated from the sample solution.

（発光量Ｄ１の測定）
試料を２０分間暗中放置した後、０秒間（光照射なし）の光条件を実施した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、中心波長５３８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｄ１として記録した。 (Measurement of light emission amount D 1)
The sample was allowed to stand in the dark for 20 minutes and then subjected to light conditions for 0 seconds (no light irradiation). Next, it was left in the dark for 5 seconds. Subsequently, the light emission (delayed light emission) of the sample was measured using a photomultiplier tube. Specifically, emission with a center wavelength of 538.5 nm and a half width of 5 nm was measured at 100 millisecond intervals for 25 seconds. Were recorded sum of the measured values of the light as the light emission amount D 1.

（発光量Ｄ２の測定）
発光量Ｄ１の測定に引き続いて、発光量Ｄ２の測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、０秒間（光照射なし）の光条件を実施した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、中心波長４９８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｄ２として記録した。 (Measurement of light emission amount D 2)
Following the measurement of the light emission amount D 1, it was measured light emission amount D 2. The sample was allowed to stand in the dark for 20 minutes and then subjected to light conditions for 0 seconds (no light irradiation). Next, it was left in the dark for 5 seconds. Subsequently, the light emission (delayed light emission) of the sample was measured using a photomultiplier tube. Specifically, emission with a center wavelength of 498.5 nm and a half-value width of 5 nm was measured at 100 millisecond intervals for 25 seconds. Were recorded sum of the measured values of the light as the light emission amount D 2.

（発光量Ｌ１の測定）
発光量Ｄ２の測定に引き続いて、発光量Ｌ１の測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、中心波長５３８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌ１として記録した。 (Measurement of luminescence L 1 )
Following the measurement of the light emission amount D 2, it was measured emission amount L 1. The sample was left in the dark for 20 minutes, and then left under the light condition of irradiating with 2000 μmol / m 2 / second of light from the white LED for 5 seconds. Next, it was left in the dark for 5 seconds. Subsequently, the light emission (delayed light emission) of the sample was measured using a photomultiplier tube. Specifically, emission with a center wavelength of 538.5 nm and a half width of 5 nm was measured at 100 millisecond intervals for 25 seconds. Were recorded sum of the measured values of the light as the light emission amount L 1.

（発光量Ｌ２の測定）
発光量Ｌ１の測定に引き続いて、発光量Ｌ２の測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、中心波長４９８．５ｎｍ、半値幅５ｎｍの発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌ２として記録した。 (Measurement of luminescence L 2 )
Following measurement of the emission amount L 1, it was measured emission amount L 2. The sample was left in the dark for 20 minutes, and then left under the light condition of irradiating with 2000 μmol / m 2 / second of light from the white LED for 5 seconds. Next, it was left in the dark for 5 seconds. Subsequently, the light emission (delayed light emission) of the sample was measured using a photomultiplier tube. Specifically, emission with a center wavelength of 498.5 nm and a half-value width of 5 nm was measured at 100 millisecond intervals for 25 seconds. Were recorded sum of the measured values of the light as the light emission amount L 2.

（評価値Ｒの算出）
上記の発光量Ｄ１、Ｌ１、Ｄ２及びＬ２を使用し、下記式（６）により評価値Ｒを算出した。
（評価値Ｒ）＝（発光量Ｌ１−発光量Ｄ１）／（発光量Ｌ２−発光量Ｄ２）…（３）
図８に結果を示す。Ｃ６０、Ｃ６０（ＯＨ）ｎ及びＣ６０Ｈｎは、レシチンを基質として光照射により遅延発光を放出し、その放出量は、Ｃ６０ ＞ Ｃ６０（ＯＨ）ｎ ＞ Ｃ６０Ｈｎであった。この結果は、従来法による脂質過酸化物の生成量の測定結果とよく一致した。 (Calculation of evaluation value R)
The evaluation value R was calculated by the following formula (6) using the light emission amounts D 1 , L 1 , D 2 and L 2 described above.
(Evaluation value R) = (Light emission amount L 1 −Light emission amount D 1 ) / (Light emission amount L 2 −Light emission amount D 2 ) (3)
The results are shown in FIG. C 60 , C 60 (OH) n and C 60 H n release delayed luminescence by light irradiation using lecithin as a substrate, and the release amount is C 60 > C 60 (OH) n > C 60 H n. It was. This result was in good agreement with the measurement result of the amount of lipid peroxide produced by the conventional method.

（実施例４）
（遅延発光の分光解析）
実施例１と同様に、ナノ材料として、フラーレン（Ｃ６０）、水酸化フラーレン（Ｃ６０（ＯＨ）ｎ）、及び水素化フラーレン（Ｃ６０Ｈｎ）を用いた。生体分子としてレシチンを用いた。
ナノ材料及びレシチンを、２−プロパノール、トルエン、ＤＭＦ、クロロホルム、メタノール又はそれらから選ばれる混合溶媒を用いて溶解し、最終的な容量比が２−プロパノール：トルエン：ＤＭＦ：クロロホルム：メタノール＝２７：１８：１２：２：１の混合溶媒中、ナノ材料０．２ｍＭ及びレシチン０．５（ｗ／ｖ）％になるように調製し、試料１０ｍＬを作製した。試料溶液から析出物が生じた場合でも懸濁状態を維持するため、計測の間、試料をマグネティックスターラーで撹拌した。
光電子増倍管を用いた試料の発光（遅延発光）の測定において、試料の発光の全量（フィルター無し）、波長３９８、４４７、４９８．５、５３８．５、５７７．５、６２８、及び６８０．５ｎｍのバンドパスフィルターを透過した光を測定した。各バンドパスフィルター透過光の測定値は、バンドパスフィルターの光の透過率及び光電子増倍管の分光感度を考慮して補正した。 Example 4
(Spectroscopic analysis of delayed luminescence)
As in Example 1, fullerene (C 60 ), fullerene hydroxide (C 60 (OH) n ), and hydrogenated fullerene (C 60 H n ) were used as nanomaterials. Lecithin was used as a biomolecule.
The nanomaterial and lecithin are dissolved using 2-propanol, toluene, DMF, chloroform, methanol or a mixed solvent selected from them, and the final volume ratio is 2-propanol: toluene: DMF: chloroform: methanol = 27: In a mixed solvent of 18: 12: 2: 1, the nanomaterial was prepared to be 0.2 mM and lecithin 0.5 (w / v)% to prepare 10 mL of a sample. The sample was stirred with a magnetic stirrer during measurement in order to maintain a suspended state even when precipitates were generated from the sample solution.
In measurement of light emission (delayed light emission) of a sample using a photomultiplier tube, the total amount of light emission of the sample (no filter), wavelengths 398, 447, 498.5, 538.5, 577.5, 628, and 680. The light transmitted through a 5 nm band pass filter was measured. The measured values of the light transmitted through each bandpass filter were corrected in consideration of the light transmittance of the bandpass filter and the spectral sensitivity of the photomultiplier tube.

（発光量Ｄの測定）
試料を２０分間暗中放置した後、０秒間（光照射なし）の光条件を実施した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、フィルター無しの状態で試料の発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｄとして記録した。 (Measurement of light emission amount D)
The sample was allowed to stand in the dark for 20 minutes and then subjected to light conditions for 0 seconds (no light irradiation). Next, it was left in the dark for 5 seconds. Subsequently, the light emission (delayed light emission) of the sample was measured using a photomultiplier tube. Specifically, the light emission of the sample was measured at 100 millisecond intervals for 25 seconds without a filter. The total of the measured light values was recorded as the light emission amount D.

（発光量Ｌの測定）
発光量Ｄの測定に引き続いて、発光量Ｌの測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、フィルター無しの状態で試料の発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌとして記録した。 (Measurement of luminescence L)
Subsequent to the measurement of the light emission amount D, the light emission amount L was measured. The sample was left in the dark for 20 minutes, and then left under the light condition of irradiating with 2000 μmol / m 2 / second of light from the white LED for 5 seconds. Next, it was left in the dark for 5 seconds. Subsequently, the light emission (delayed light emission) of the sample was measured using a photomultiplier tube. Specifically, the light emission of the sample was measured at 100 millisecond intervals for 25 seconds without a filter. The total of the measured light values was recorded as the light emission amount L.

（発光量Ｄ３９８の測定）
試料を２０分間暗中放置した後、０秒間（光照射なし）の光条件を実施した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、波長３９８ｎｍのバンドパスフィルターを透過した試料の発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｄ３９８として記録した。ここで、Ｄ３９８は、波長３９８ｎｍのバンドパスフィルターを用いて測定した発光量Ｄを表す。 (Measurement of light emission amount D 398 )
The sample was allowed to stand in the dark for 20 minutes and then subjected to light conditions for 0 seconds (no light irradiation). Next, it was left in the dark for 5 seconds. Subsequently, the light emission (delayed light emission) of the sample was measured using a photomultiplier tube. Specifically, the light emission of the sample transmitted through the bandpass filter having a wavelength of 398 nm was measured for 25 seconds at 100 millisecond intervals. The total of the measured light values was recorded as the amount of emitted light D 398 . Here, D 398 represents the light emission amount D measured using a bandpass filter having a wavelength of 398 nm.

（発光量Ｌ３９８の測定）
発光量Ｄ３９８の測定に引き続いて、発光量Ｌ３９８の測定を行った。試料を２０分間暗中放置した後、白色ＬＥＤによる２０００μｍｏｌ／ｍ２／秒の光を５秒間照射する光条件下に放置した。次に５秒間暗中放置した。続いて、光電子増倍管を用いて試料の発光（遅延発光）を測定した。具体的には、波長３９８ｎｍのバンドパスフィルターを透過した試料の発光を１００ミリ秒間隔で２５秒間計測した。光の測定値の総和を発光量Ｌ３９８として記録した。ここで、Ｌ３９８は、波長３９８ｎｍのバンドパスフィルターを用いて測定した発光量Ｌを表す。 (Measurement of luminescence L 398 )
Subsequent to the measurement of the light emission amount D 398 , the light emission amount L 398 was measured. The sample was left in the dark for 20 minutes, and then left under the light condition of irradiating with 2000 μmol / m 2 / second of light from the white LED for 5 seconds. Next, it was left in the dark for 5 seconds. Subsequently, the light emission (delayed light emission) of the sample was measured using a photomultiplier tube. Specifically, the light emission of the sample transmitted through the bandpass filter having a wavelength of 398 nm was measured for 25 seconds at 100 millisecond intervals. The total of the measured light values was recorded as the amount of emitted light L 398 . Here, L 398 represents the light emission amount L measured using a bandpass filter having a wavelength of 398 nm.

（発光量Ｄ４４７、Ｄ４９８．５、Ｄ５３８．５、Ｄ５７７．５、Ｄ６２８及びＤ６８０．５、並びに発光量Ｌ４４７、Ｌ４９８．５、Ｌ５３８．５、Ｌ５７７．５、Ｌ６２８及びＬ６８０．５の測定）
バンドパスフィルターを波長４４７、４９８．５、５３８．５、５７７．５、６２８、及び６８０．５ｎｍのものに変更した以外は、発光量Ｄ３９８及びＬ３９８の測定と同様にして、それぞれ発光量Ｄ４４７、Ｄ４９８．５、Ｄ５３８．５、Ｄ５７７．５、Ｄ６２８及びＤ６８０．５、並びに発光量Ｌ４４７、Ｌ４９８．５、Ｌ５３８．５、Ｌ５７７．５、Ｌ６２８及びＬ６８０．５を測定した。 (Light emission amount D 447 , D 498.5 , D 538.5 , D 577.5 , D 628 and D 680.5 , and light emission amount L 447 , L 498.5 , L 538.5 , L 577.5 , Measurement of L 628 and L 680.5 )
Except for changing the band-pass filter to ones with wavelengths of 447, 498.5, 538.5, 577.5, 628, and 680.5 nm, the light emission amount was the same as the measurement of the light emission amount D 398 and L 398. D 447 , D 498.5 , D 538.5 , D 577.5 , D 628 and D 680.5 , and light emission amounts L 447 , L 498.5 , L 538.5 , L 577.5 , L 628 and L 680.5 was measured.

（評価値Ｒの算出）
上記の各発光量Ｄ及びＬを使用し、下記式（１）により評価値Ｒを算出した。
（評価値Ｒ）＝発光量Ｌ／発光量Ｄ…（１）
表１及び図９に各測定波長における評価値Ｒの結果を示す。波長５３８．５〜６８０．５ｎｍのバンドパスフィルターを用いた場合の評価値Ｒにおいて、Ｃ６０、Ｃ６０（ＯＨ）ｎ及びＣ６０Ｈｎが、レシチンを基質として光照射により放出した遅延発光の放出量は、Ｃ６０ ＞ Ｃ６０（ＯＨ）ｎ ＞ Ｃ６０Ｈｎであった。この結果は、従来法による脂質過酸化物の生成量の測定結果とよく一致した。一方、フィルター無し並びに波長３９８〜４９８．５ｎｍ及び７３０ｎｍのバンドパスフィルターを用いた場合の評価値Ｒの結果では、試料の遅延発光の放出量がＣ６０ ＞ Ｃ６０（ＯＨ）ｎ ＞ Ｃ６０Ｈｎとはならず、従来法による脂質過酸化物の生成量の測定結果とは一致しなかった。 (Calculation of evaluation value R)
The evaluation value R was calculated by the following formula (1) using the respective light emission amounts D and L.
(Evaluation value R) = Light emission amount L / Light emission amount D (1)
Table 1 and FIG. 9 show the results of the evaluation value R at each measurement wavelength. In the evaluation value R when using a bandpass filter with a wavelength of 538.5 to 680.5 nm, C 60 , C 60 (OH) n and C 60 H n are delayed emission emitted by light irradiation using lecithin as a substrate. emissions was C 60> C 60 (OH) n> C 60 H n. This result was in good agreement with the measurement result of the amount of lipid peroxide produced by the conventional method. On the other hand, in the result of the evaluation value R when no filter is used and bandpass filters with wavelengths of 398 to 498.5 nm and 730 nm are used, the amount of delayed emission of the sample is C 60 > C 60 (OH) n > C 60 H. n was not consistent with the measurement result of the amount of lipid peroxide produced by the conventional method.

Figure 0005374278
Figure 0005374278

図１０に、上記の測定結果に基づいて、各測定波長における発光量Ｌから発光量Ｄを差し引いた値（Ｌ−Ｄ）をプロットしたグラフを示す。上述したように、各バンドパスフィルター透過光の測定値は、バンドパスフィルターの光の透過率及び光電子増倍管の分光感度を考慮して補正されている。その結果、各試料の発光は、４９８．５ｎｍ付近と５３８．５ｎｍ付近にピークを持つ２つの発光成分を含むことが明らかとなった。これらの発光成分は、それぞれ、ナノ材料が生体分子（レシチン）を酸化する際の発光、及びナノ材料が脂質過酸化物を還元する際の発光であると考えられる。   FIG. 10 shows a graph in which a value (LD) obtained by subtracting the light emission amount D from the light emission amount L at each measurement wavelength is plotted based on the above measurement results. As described above, the measured value of each bandpass filter transmitted light is corrected in consideration of the light transmittance of the bandpass filter and the spectral sensitivity of the photomultiplier tube. As a result, it has been clarified that the light emission of each sample includes two light emitting components having peaks near 498.5 nm and 538.5 nm. These luminescent components are considered to be luminescence when the nanomaterial oxidizes a biomolecule (lecithin) and luminescence when the nanomaterial reduces lipid peroxide, respectively.

本発明により、未だに確立されていない、ナノ材料の安全性を評価する方法、より具体的には、ナノ材料の生体分子に対する酸化能を高精度で迅速に評価する方法が提供される。   The present invention provides a method for evaluating the safety of nanomaterials, which has not yet been established, and more specifically, a method for quickly and accurately evaluating the oxidizing ability of nanomaterials for biomolecules.

Claims (7)

ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法であって、
（ａ）ナノ材料と生体分子とを混合して試料を調製するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で調製した試料を、暗中放置し、所定の光条件下に曝した後に暗中放置し、試料の発光を測定することを、異なる光条件及び／又は測定条件で行い、複数の発光量を測定するステップであって、
測定する発光量は、
試料を暗中放置し、試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ及び
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌであるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された複数の発光量に基づいて評価値を算出するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で算出した評価値に基づいてナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価するステップと、
を含む、方法。 A method for evaluating the oxidation ability of nanomaterials to biomolecules,
(A) preparing a sample by mixing nanomaterials and biomolecules;
(B) The sample prepared in step (a) is left in the dark, exposed to a predetermined light condition, then left in the dark, and the light emission of the sample is measured under different light conditions and / or measurement conditions, Measuring a plurality of light emission amounts ,
The amount of luminescence to be measured is
The sample is left in the dark, and the amount of luminescence D under the first condition for measuring the amount of luminescence of the sample and
Leaving the sample in the dark, leaving it in the dark after irradiating with light, and measuring the amount of light emitted from the sample, the step being a light emission amount L under a second condition ;
(C) calculating an evaluation value based on the plurality of light emission amounts measured in step (b);
(D) a step of evaluating the ability of the nanomaterial to oxidize biomolecules based on the evaluation value calculated in step (c);
Including a method. ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法であって、
（ａ）ナノ材料と生体分子とを混合して試料を調製するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で調製した試料を、暗中放置し、所定の光条件下に曝した後に暗中放置し、試料の発光を測定することを、異なる光条件及び／又は測定条件で行い、複数の発光量を測定するステップであって、
測定する発光量は、
試料を暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ及び
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌであるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された複数の発光量に基づいて評価値を算出するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で算出した評価値に基づいてナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価するステップと、
を含む、方法。 A method for evaluating the oxidation ability of nanomaterials to biomolecules,
(A) preparing a sample by mixing nanomaterials and biomolecules;
(B) The sample prepared in step (a) is left in the dark, exposed to a predetermined light condition, then left in the dark, and the light emission of the sample is measured under different light conditions and / or measurement conditions, Measuring a plurality of light emission amounts ,
The amount of luminescence to be measured is
The sample is allowed to stand in the dark, and the light emission amount D under the first condition for measuring the light emission amount of the sample in the predetermined wavelength range and
Leaving the sample in the dark, leaving it in the dark after irradiating with light, and measuring the amount of luminescence of the sample in the same wavelength region as in the first condition, the step being a luminescence amount L under a second condition ;
(C) calculating an evaluation value based on the plurality of light emission amounts measured in step (b);
(D) a step of evaluating the ability of the nanomaterial to oxidize biomolecules based on the evaluation value calculated in step (c);
Including a method. ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法であって、
（ａ）ナノ材料と生体分子とを混合して試料を調製するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で調製した試料を、暗中放置し、所定の光条件下に曝した後に暗中放置し、試料の発光を測定することを、異なる光条件及び／又は測定条件で行い、複数の発光量を測定するステップであって、
測定する発光量は、
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｌ １ 及び
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下とは異なる波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌ ２ であるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された複数の発光量に基づいて評価値を算出するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で算出した評価値に基づいてナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価するステップと、
を含む、方法。 A method for evaluating the oxidation ability of nanomaterials to biomolecules,
(A) preparing a sample by mixing nanomaterials and biomolecules;
(B) The sample prepared in step (a) is left in the dark, exposed to a predetermined light condition, then left in the dark, and the light emission of the sample is measured under different light conditions and / or measurement conditions, Measuring a plurality of light emission amounts ,
The amount of luminescence to be measured is
The sample is left in the dark, irradiated with light, then left in the dark, and the light emission amount L 1 under the first condition for measuring the light emission amount of the sample in a predetermined wavelength range and
A step of the sample was left in the dark, and left dark after irradiation of light, the first condition is a emission amount L 2 in the second condition of measuring the light emission quantity of the sample of different wavelength ranges,
(C) calculating an evaluation value based on the plurality of light emission amounts measured in step (b);
(D) a step of evaluating the ability of the nanomaterial to oxidize biomolecules based on the evaluation value calculated in step (c);
Including a method. ナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価する方法であって、
（ａ）ナノ材料と生体分子とを混合して試料を調製するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で調製した試料を、暗中放置し、所定の光条件下に曝した後に暗中放置し、試料の発光を測定することを、異なる光条件及び／又は測定条件で行い、複数の発光量を測定するステップであって、
測定する発光量は、
試料を暗中放置し、所定の波長域の試料の発光量を測定する第１の条件下での発光量Ｄ １ 、
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第１の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第２の条件下での発光量Ｌ １ 、
試料を暗中放置し、第一の条件下とは異なる波長域の試料の発光量を測定する第３の条件下での発光量Ｄ ２ 及び
試料を暗中放置し、光を照射した後に暗中放置し、第３の条件下と同一の波長域の試料の発光量を測定する第４の条件下での発光量Ｌ ２ であるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定された複数の発光量に基づいて評価値を算出するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で算出した評価値に基づいてナノ材料の生体分子に対する酸化能を評価するステップと、
を含む、方法。 A method for evaluating the oxidation ability of nanomaterials to biomolecules,
(A) preparing a sample by mixing nanomaterials and biomolecules;
(B) The sample prepared in step (a) is left in the dark, exposed to a predetermined light condition, then left in the dark, and the light emission of the sample is measured under different light conditions and / or measurement conditions, Measuring a plurality of light emission amounts ,
The amount of luminescence to be measured is
The sample is allowed to stand in the dark, and the light emission amount D 1 under the first condition for measuring the light emission amount of the sample in the predetermined wavelength range ,
The sample is left in the dark, left in the dark after being irradiated with light, and the light emission amount L 1 under the second condition for measuring the light emission amount of the sample in the same wavelength region as the first condition ,
The sample is allowed to stand in the dark, and the amount of luminescence D 2 under the third condition for measuring the amount of luminescence of the sample in a wavelength region different from that of the first condition and
Leaving the sample in the dark, leaving it in the dark after irradiating with light, and measuring the amount of light emitted from the sample in the same wavelength range as the third condition , the step being the light emission amount L 2 under the fourth condition ;
(C) calculating an evaluation value based on the plurality of light emission amounts measured in step (b);
(D) a step of evaluating the ability of the nanomaterial to oxidize biomolecules based on the evaluation value calculated in step (c);
Including a method. ナノ材料は炭素系ナノ材料である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 Nanomaterials are carbon-based nanomaterials, the method according to any one of claims 1-4. ナノ材料はフラーレン又はその誘導体、カーボンナノチューブ又はその誘導体及び多環芳香族炭化水素からなる群から選択される化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 4 , wherein the nanomaterial is a compound selected from the group consisting of fullerenes or derivatives thereof, carbon nanotubes or derivatives thereof and polycyclic aromatic hydrocarbons. 生体分子は脂質、核酸及びタンパク質からなる群から選択される化合物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 6 , wherein the biomolecule is a compound selected from the group consisting of lipids, nucleic acids and proteins.
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