JP5371429B2 - 機能的な血管の完全性及び細胞生存を改善し、脳の虚血における又は虚血エピソード後のアポトーシスを減少するための組成物及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、血管完全性の増進及び脳の虚血又は虚血エピソードに付随する細胞損傷に対する保護についての哺乳類の栄養及びその効果に関する。特に、本発明は、血管の完全性を改善し、細胞生存を促進し、それによって例えば脳虚血の事象における脳及び／又は他の臓器の虚血性損傷を減少するために、通常食の一部として投与される、一酸化窒素を放出する化合物、長鎖多価不飽和脂肪酸及び場合によって抗酸化物質、抗炎症剤、成長因子及びビタミンＢ類を含むその他の成分の組み合わせを利用する。

特許、公開出願、技術論文及び学術論文を含む様々な出版物が本明細書を通して引用されている。これらの引用された出版物のそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み込まれる。

低酸素性虚血性脳損傷は、脳への血流の一時的又は永続的な減少或いは停止による脳への減少した酸素の供給の結果として起こる。脳の虚血は、その後の脳組織のアポトーシス及び壊死を伴って梗塞を引き起こす卒中をもたらす。心血管の虚血と同様に、脳虚血は、様々な要因、例えば、血塊、血栓症、塞栓症、動脈硬化プラークによる閉塞、又は血管中のその他の障害などによって引き起こされ得る。高コレステロール血症、高血圧症、糖尿病、及び肥満症は、要因のなかでも特に、虚血性脳卒中に対する危険要因として確認されている。虚血性脳卒中は、世界的に人間の主要な死因であり、伴侶動物を含む他の動物にも襲う。

虚血性損傷は、また、脳の老化及び認知症を大いに助長することが知られている。認知症は高齢世代に影響を及ぼす主要な疾患である。認知症の発生率は、６０〜６４歳の年齢の人々における約０．３〜１％で、５歳毎に患者数は倍増して、９５歳を超える人々においては５０％まで増加する（ＭｃＤｏｗｅｌｌ，Ｉ．，Ａｇｉｎｇ（Ｍｉｌａｎｏ）１３：（２００１）１４３−１６２）。西洋人の中ではアルツハイマー病（ＡＤ）が、認知症の主要な形態と考えられ、一方東洋人の中では血管性認知症が優勢型のようである（Ｆｒａｔｉｇｌｉｏｎｉ，Ｌ．ら、Ｄｒｕｇｓ Ａｇｉｎｇ（１９９９）１５：３６５−３７５；Ｏｔｔ，Ａ．ら、Ｔｈｅ Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ Ｓｔｕｄｙ，ＢＭＪ（１９９５）３１０：９７０−９７３）。増大する証拠は、血管性認知症とアルツハイマー病とが認知症の人々の中にしばしば共存することを示している。例えば、Ｋａｌａｒｉａ（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ（２０００）２１：３２１−３３０）は、ＡＤの患者の約９０％が脳血管の病変を有しており、ＶＤの約３０％がＡＤ症状を有したことを報告した。認知症になった高齢者における脳血管障害とＡＤの共存は、Ｓｎｏｗｄｏｎら（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ｓｏｃ．（１９９７）２７７：８１３−８１７）によって確認された。さらに、ＡＤの病理学的診断の顕著な特徴（アミロイド沈着、及び神経原線維変化）が認知症になっていない高齢者に存在することが究明された（Ｓｎｏｗｄｏｎら、１９９７，上記参照）。これらのデータは、アミロイド沈着、及び神経原線維変化はＡＤ患者において認知症を引き起こすには十分でなく、脳の虚血性損傷の、脳老化、ＶＤ及びＡＤの発生及び進行への重要な寄与が明らかであることを示唆している（Ｋｏｒｃｚｙｎ，Ａ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．（２００５）２３０：３−６）。それ故、ヒト及び動物において虚血によって引き起こされる脳の損傷及び神経細胞のアポトーシスを防止することにより、脳の老化を遅らせ、認知機能障害の危険性を低減し、認知症の進行を遅らせることができる。

虚血は、どの組織においても起こり得るが、脳、心臓又は腎臓の損傷と最も一般的に関連する。上記のように脳における虚血は、急性損傷、例えば卒中、又は認知症及びそれと関係する状態などの慢性的な機能障害を引き起こし得る。心臓においては、虚血性エピソードは心不全をもたらす可能性があり、同様に腎臓における虚血性事象からは腎不全がもたらされ得る。

脳又はその他の何らかの組織の虚血性発作又はエピソードにおいて、生化学反応が血管系で起こり、それが、浮腫、出血性形質転換、及び影響を受けた組織例えば神経における更なる危険につながり得る。そのようなことから、血管系の治療及び保護は、急性虚血性発作における新たな治療法を開発するための研究をする可能性への道として識別されてきた。その上、血管保護は虚血エピソードの結果として起こる組織の損傷を減少する意味あいを有する。

血管内皮は、抗接着性、抗血栓性表面を維持することによって、血管緊張の調節、炎症、及び恒常性を含む様々な制御機能を果たすことが見出されている。（Ｂｏａｋ，Ｌ．ら、Ｃｕｒ．Ｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２００４）２：４５−５２）。血管の恒常性とは、一つには、血管平滑筋の強力な弛緩薬であるフリーラジカルの一酸化窒素（ＮＯ）を含む様々な因子によって媒介される血管平滑筋の収縮及び弛緩の機能である。

ＮＯは、３つの異なる一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、すなわち、主として神経組織にとどまり、神経伝達のためにＮＯを発生する神経型ＮＯＳ、主としてマクロファージ中に見出され、炎症誘発性メディエーターに反応することができる誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）、及び内皮細胞、例えば血管内皮中に見出されるものなどによって産生される内皮型ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）によって産生される。（Ｍｉｃｈｅｌ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９７）１００：２Ｉ４６−２１５２，Ｍｏｎｃａｄａ，Ｓ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．（１９９１）４３：１０９−１４２，及びＮａｔｈａｎ，Ｃ．（１９９２）ＦＡＳＥＢ Ｊ ６：３０５１−３０６４）。ｅＮＯＳにより放出されるＮＯは、血管拡張、平滑筋増殖、動脈圧の調節において大きな役割を果たし、血小板及び白血球の接着及び凝集の阻害による抗凝固及び抗炎症作用を有する。（Ｇｅｗａｌｔｉｇ，Ｍ．Ｔ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．（２００２）５５：２５０−２６０，Ｄｅ Ｇｒａａｆ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９２）８５：２２８４−２２９０，Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（１９９９）８４：１４１６−１４２１，Ｆｕｒｃｈｇｏｔｔ，Ｒ．Ｆ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ（１９８９）３：２００７−２０１８，Ｇａｂｏｕｒｙ，Ｊ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ．Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９３）２６５：Ｈ８６２−Ｈ８６７，及びＫｕｂｅｓ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：４６５１−４６５５）。長引く虚血の間のＮＯ生成の減少は、内皮損傷と関連していた（Ｌａｕｄｅ，Ｌ，ら、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．（２００１）３４：１−７）。

ＮＯＳ酵素は、Ｌ−アルギニンを酸化してシトルリンとし、副生成物としてのＮＯの形成をもたらす。従って、Ｌ−アルギニンなどのＮＯ前駆物質の補給によって血管の健康状態を改善することができ、血管疾患状態の回復を促進することができることが示唆されている。実際、アルギニンの食事補給は、血管拡張作用の修復を誘発し、高コレステロール血症の動物モデル及びヒトの患者における冠循環を改善し、同時に冠動脈疾患の患者における全体的な内皮機能を増強することが示されている。（Ｂｏａｋ，Ｌ．ら、２００４）。さらに、Ｌ−アルギニンの補給は、ＮＯ濃度を増し、ヒトの患者における遊離のＯ_２ラジカルが介在する心筋損傷を弱めることも示されている。（Ｋｉｚｉｌｔｅｐｅ，Ｕ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（２００４）９７：９３−１００）。より最近の研究は、アルギニンの補給が、ラットの腸内の誘発された腸の虚血再灌流に続く内皮の修復を促進することを示している。（Ｓｕｋｈｏｔｎｉｋ，Ｉ．ら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．Ｉｎｔ．（２００５）３：１９１−１９６）。従って、Ｌ−アルギニンなどのＮＯ前駆物質の投与は、内皮細胞、特に血管内皮細胞に対しての活性化及び保護についての意味あいを有する。

脂肪酸もまた、内皮細胞活性化を調節することが実証されている。長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）の投与は、血管内皮細胞へのリンパ球接着を阻害することが見出された。（Ｋｈａｌｆｏｕｎ，Ｂ．ら、 ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（１９９６）６２：１６４９−１６５７）。その後の研究により、ＬＣＰＵＦＡの投与は、刺激に反応する接着分子及びサイトカインの内皮細胞の発現を減少することが見出されており、ＬＣＰＵＦＡがアテローム産生抑制特性及び抗炎症特性を有することを示唆している。（Ｄｅ Ｃａｔｅｒｉｎａ，Ｒ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．（２０００）７１（ｓｕｐｐｌ）２１３Ｓ−２２３Ｓ）。ＬＣＰＵＦＡ、特にｎ−３脂肪酸の規則正しい消費が、心臓血管系を保護し、動脈硬化プラークの形成を減少し、心臓血管疾患による、特に心筋梗塞に続く死亡の危険を低減することがますます増える証拠により示されている。（Ｃａｌｄｅｒ，Ｐ．Ｃ．Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ）．２００４ １０７：１−１１）。それにひきかえ、脳の血管系及び組織に対する食物中のＬＣＰＵＦＡの、特に脳における虚血エピソードに関する効果の研究は少ない状態が続いている。

酸化的ストレス及び損傷が老化作用に関与することは知られて久しい。酸化的ストレスは、また、アルツハイマー病及び一定の形の認知症を含む多数の神経変性疾患の発症において役割を果たすものとして立証されている（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ａ．，Ｄｅｍｅｎｔｉａ ＆ Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（１９９９），Ｖｏｌ．１０，Ｓｕｐｐ．１）。それ故に、老化作用を遅らすため及び酸化的ストレスの退行性作用に対する保護のために抗酸化物質による補給が採用されている。同様に、ビタミンＢ類の葉酸、ビタミンＢ−６、及びビタミンＢ−１２は、脳の健康及び機能性に対して重要である。これらビタミンの状態は、高齢者においてはしばしば不適切であり、これらの不適当な点は、最近確認されたアテローム性動脈硬化症について（Ｔｅｍｐｌｅ ＭＥら、Ａｎｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ ２０００；３４：５７−６５．；Ｈａｎｋｅｙ ＧＪら、Ｌａｎｃｅｔ １９９９；３５４．４０７−４１３）及びアルツハイマー病について（Ｃｌａｒｋｅ Ｒら、Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ １９９８ ５５：１４４９−１４５５）の危険因子である高ホモシステイン血症をもたらす可能性がある。これらの不適当な点は、閉塞性血管疾患、卒中、又は血栓症を経る脳又はその他の組織の虚血をもたらし得る。

本発明の一態様は、動物における、例えば脳の血管完全性の増進、及び／又はアポトーシスの減少に有効な量の、１つ又は複数の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）及び１つ又は複数の一酸化窒素放出性化合物（ＮＯＲＣ）を含む組成物を特徴とする。増進された、例えば脳の血管完全性及び／又は細胞生存は、虚血エピソードの事象において組織、例えば脳の虚血性損傷を低減するために役立ち、そのような虚血性事象の最初の発生に対する保護作用を発揮することもできる。

いくつかの実施形態において、該組成物は、ペットフード組成物、栄養補助食品、又はヒトの食用に処方された食品である。様々な実施形態において、ＬＣＰＵＦＡは、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、又はドコサヘキサエン酸の少なくとも１つを含有し、ＮＯＲＣは、Ｌ−アルギニン又はその誘導体の少なくとも１つを含有する。該組成物は付加的な成分を含むことができる。例えば、１つ又は複数の抗酸化物質、ビタミンＢ類、細胞成長因子及び抗炎症剤を含有することができる。

いくつかの実施形態において、該組成物は伴侶動物、例えばイヌ又はネコなどのために処方される。他の実施形態において該組成物は、ヒトの食用に処方される。

本発明の別の態様は、動物における、血管完全性を増進し、且つ／又は虚血によって引き起こされる脳損傷を減少するための方法であって、動物の組織（１つ又は複数）における血管完全性を増進し、且つ／又は動物の脳において虚血エピソードの事象における虚血によって引き起こされる脳損傷を減少するのに有効な量で、１つ又は複数のＬＣＰＵＦＡ及び１つ又は複数のＮＯＲＣを含み、適宜、上記の付加的な成分が補給されている組成物を動物に定期的に投与するステップを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態において、該方法は、伴侶動物、例えばイヌ又はネコなどに適用される。他の実施形態において、該方法はヒトに適用される。

いくつかの実施形態において、該組成物の動物への定期的な投与は、動物の脳で虚血エピソードの事象における脳障害の減少をもたらし、又はそれは動物における脳老化の遅れをもたらす。別の実施形態において、該組成物の動物への定期的投与は、動物に起こっている脳、心臓及び腎臓を含むいずれかの組織内であり得る虚血の部位における細胞アポトーシスの減少をもたらす。

本発明のその他の特徴及び利点は、以下の図面、詳細な説明及び実施例を参照することにより明らかとなろう。

（定義）
本発明の方法及びその他の態様に関する様々な用語が明細書及び特許請求の範囲を通して使用される。かかる用語は、他に指摘がない限り、当技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられ得る。その他の特別に定義される用語は、本明細書において与えられる定義と合致するように解釈すべきである。

以下の略語が明細書及び実施例の中で使用され得る：ＡＡ、アラキドン酸；ＡＬＡ、α−リノレン酸；ＡＮＯＶＡ、分散分析；ＤＨＡ、ドコサヘキサエン酸；ＤＭ、乾燥物質；ＤＰＡ、ドコサペンタエン酸；ＥＰＡ、エイコサペンタエン酸；ＬＡ、リノール酸；ＬＣＰＵＦＡ、長鎖多価不飽和脂肪酸；ＮＯＲＣ、一酸化窒素放出性化合物；Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−アルギニン。

本明細書の文脈の中で、用語「約」は、場合によってプラス又はマイナス２０％、より好ましくは場合によってプラス又はマイナス１０％、さらにより好ましくは場合によってプラスマイナス５％、最も好ましくは場合によってプラス又はマイナス２％を意味する。

「有効な量」は、特定の生物学的結果を得るために有効な本明細書に記載の化合物、材料、又は組成物の量を表す。かかる結果としては、以下に限定されないが、血管完全性の増進又は虚血性脳損傷の減少が挙げられる。かかる効果的な活性は、例えば、本発明の組成物を動物に投与することによって得ることができる。

用語「血管完全性」は、健全な血管の緊張と構造、健全な血管増殖、健全な収縮と拡張、低減した透過性、低減した増殖、低減した炎症、低減した細胞接着及び／又は血小板粘着、正常な血圧及び血流の維持などを無制限に含む動物における血管の健康全般を指す。「増進された血管完全性」とは、動物における血管の健康全般の当技術分野における適切な何らかの手段により測定された何らかの改善を指す。

本明細書で使用される「長鎖多価不飽和脂肪酸」又は「ＬＣＰＵＦＡ」は、少なくとも２０個の炭素原子及び少なくとも２個の二重結合を有する任意のモノカルボン酸を指す。ＬＣＰＵＦＡの非限定的な例としては、アラキドン酸などのｎ−６脂肪酸、及びエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸などのｎ−３脂肪酸が挙げられる。

本明細書で使用される「一酸化窒素放出性化合物」又は「ＮＯＲＣ」は、動物の中で遊離の一酸化窒素の放出を引き起こす何らかの化合物を指す。そのような化合物の好ましい例としては、Ｌ−アルギニン及びその類似物又はアルギニンα−ケトグルタル酸などのＬ−アルギニンの誘導体、ＧＥＡ３１７５、ニトロプルシドナトリウム、三硝酸グリセリン、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ペニシラミン、ニトログリセリン、Ｓ−ＮＯ−グルタチオン、ＮＯ−共役非ステロイド系抗炎症薬、例えば、ＮＯ−ナプロキセン、ＮＯ−アスピリン、ＮＯ−イブプロフェン、ＮＯ−ジクロフェナック、ＮＯ−フルルビプロフェン及びＮＯ−ケトプロフェンなど、ＮＯ放出性化合物−７、ＮＯ放出性化合物−５、ＮＯ放出性化合物−１２、ＮＯ放出性化合物−１８、ジアゼニウムジオレート類及びその誘導体、ジエチルアミンＮＯＮＯａｔｅ、或いは動物の中で遊離の一酸化窒素の放出を引き起こす任意の有機又は無機化合物、生体分子、又はその類似物、同族体、複合体、又はそれらの誘導体が挙げられる。

「虚血」は、血管系の何らかの狭窄又は障害物により引き起こされる任意の身体の器官、組織、又は一部への血液供給の何らかの減少若しくは停止を指す。「虚血エピソード」は、任意の一時的又は永続的期間の虚血を指す。

「血管系」は、動物の体内の血管の任意のネットワークを指し、前記血管は動脈、静脈及び毛細血管を含むがこれらに限定されるものではない。

「血管内皮細胞」又は「血管内皮」は、血管の内面を覆って管腔内の循環血液と残りの血管壁の間に界面を形成する薄くて平らな細胞の層を有する細胞を指す。

本発明は、任意の動物、好ましくは哺乳類、より好ましくは伴侶動物類、最も好ましくはヒトと関連する。「伴侶動物」は、任意の家畜であり、非限定で、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、フェレット、ハムスター、マウス、スナネズミ、ウマ、乳牛、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタなどが挙げられる。

本明細書で使用される用語「ペットフード」又は「ペットフード組成物」とは、動物による、好ましくは伴侶動物による摂取を対象とする組成物を意味する。「完全且つ栄養バランスのとれたペットフード」は、伴侶動物の栄養についての認定された権威者の推薦に基づく適切な量と割合の全ての既知の必要な栄養素を含有し、そのために補助的な栄養源の追加なしで生命を維持し、又は生産を推進するために摂取する食糧の唯一の供給源として役立ち得るペットフードである。栄養バランスのとれたペットフード組成物は、当技術分野では広く知られており、広く使用されている。

本明細書で使用される「栄養補助食品」とは、動物の普通の食事に加えて摂取されることを目的としている製品である。

本明細書で使用される「ヒトの食用に処方された食品」とは、ヒトによる摂取を対象とする任意の組成物である。

（説明）
本発明者らは、イヌにおいて補助的なアルギニンが、用量依存的な形での複数の増殖因子及び抗炎症性タンパク質の発現を増加させることを見出した。ＮＧＦ、ｎＩＧＦ、及びＢＤＮＦを含むそのような増殖因子の多くは、強力な神経細胞保護効果を発揮する。（Ｍａｔｔｓｏｎ，ＭＰら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ．（２００２）２３：６９５−７０５，及びＫｒｕｔｔｇｅｎ，Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５：９６１４−９６１９）。本発明者らはさらなる調査では、イヌにおいてニシンの肉（ＬＣＰＵＦＡが豊富な魚油を含有する）を含む自然源のアルギニンを用いる場合、純粋なＬ−アルギニンを用いた結果と同等またはそれ以上の反応を見出した。本明細書の実施例で詳細に記載したように、卵巣切除ラットのモデルにおける一過性脳虚血の機能的研究により、Ｌ−アルギニン、魚油、抗酸化物質、及びビタミンＢ類の組み合わせを含有する食餌は、アルギニン又は魚油を単独で含有する食餌よりももっと脳の病変及びアポトーシスを顕著に減少させることが示された。それ故に、本発明の様々な態様は、動物の血管完全性を改善し、動物の虚血の事象における虚血性損傷、例えば動物の脳虚血の事象における脳損傷を減少する食品組成物及び方法を提供することによりこれらの発見を利用する。

この食品組成物は、以下に限定されないが、脳老化（脳卒中及び一過性脳虚血発作）及び関連する損傷、虚血性心事象、誘発性虚血及び再灌流手術（術前及び術後投与）、糖尿病誘発性末梢性虚血、を含む様々な虚血性状況において、及び閉経後の女性における卒中及び心疾患の危険を減少するための閉経後のエストロゲン治療の代替物として効果的であることが期待される。

様々な実施形態において、本発明の組成物及び方法は、虚血発生後の機能的血管完全性、アポトーシスの低減及び細胞生存の促進に対して複数要素によるアプローチを適用する。これらの要素としては、（１）血管完全性及び機能を増進すること、（２）細胞修復を促進すること、（３）抗炎症効果を改善すること、（４）細胞代謝を最適化すること、及び（５）酸化的ストレスを削減することが挙げられる。

（組成物）
本発明の一態様は、動物の血管完全性の増進に有効な量の１つ又は複数の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）及び１つ又は複数の一酸化窒素放出性化合物（ＮＯＲＣ）を含む組成物を特徴とする。ＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣは、その組成物中に１成分又は１添加物として存在させることができる。組成物の好ましい実施形態において、ＬＣＰＵＦＡは、少なくとも１つのｎ−３脂肪酸、例えばＡＬＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡなどを含み、ＮＯＲＣは、少なくとも１つのＬ−Ａｒｇ及びその誘導体を含む。この組成物は、この組成物が投与される動物の血漿を、ＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣが豊富なものにする。

本発明の組成物は、上で要点を述べたように、虚血した場合の血管完全性を推進すること及び細胞生存を促進することへの複数要素のアプローチを提供するための多数の追加的成分を含むことができる。これらには，抗酸化物質、ビタミンＢ類、増殖因子及び抗炎症剤が含まれる。

１つの好ましい実施形態において、本発明の組成物はペットフード組成物である。これらは、トリート（例えばビスケット）又はその他の栄養補助食品と同様に、必要な栄養所要量を供給することを意図した食品を有利に含む。場合によって、ペットフード組成物は、乾燥した組成物（例えばキブル）、やや湿った組成物、湿潤組成物、又はそれらの任意の混合物であり得る。

別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ヒトの食用に処方された食品である。これらは、その他のヒトの栄養補助食品と同様に、ヒトにとっての必要な栄養所要量を供給することを意図した食品及び栄養素を有利に含む。詳細な実施形態においては、ヒトの食用に処方された食品は、完全であり、栄養的にバランスがとれている。

別の好ましい実施形態において、その組成物は、栄養補助食品、例えば、グレイビー、飲料水、飲料、液体濃縮物、ヨーグルト、粉末、顆粒、ペースト、懸濁液、咀嚼物、ひと口分の食物（ｍｏｒｓｅｌ）、トリート、スナック、ペレット、ピル、カプセル、錠剤、又は任意のその他の供給形態などである。その栄養補助食品は、特定の動物、例えば伴侶動物又はヒトの食用に特別に処方することができる。１つの詳細な実施形態において、この栄養補助食品は、高濃度のＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣを含むことができ、その結果、この栄養補助食品は動物への少量の投与が可能であり、又は別法では動物に投与する前に希釈することができる。この栄養補助食品は、動物に投与する前に水と混合することが必要かもしれない。

該組成物は、冷凍することができる。ＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣは、組成物の他の成分と必要な有利な量を提供するために予めブレンドすることができ、ペットフード組成物、ヒトの食用に処方された栄養補助食品又は食品を被覆することができ、又はその組成物を動物に提供する前に、例えば粉末又は配合物を用いてそれに添加することができる。

本発明の組成物は、その組成物が投与された動物の血管完全性を増進するのに有効な量のＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣを含む。ペットフード及びヒトの食用に処方された食品については、組成物の百分率としてのＬＣＰＵＦＡの量は、乾燥物質基準で組成物の約０．１％〜約１３％の範囲であるが、それより大きい百分率を供給することができる。様々な実施形態において、その量は、乾燥物質を基準とする組成物の、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５．０％、又はそれ以上、例えば６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、又はそれ以上であり、組成物の百分率としてのＮＯＲＣの量は、乾燥物質を基準とする組成物の約０．１％〜約１２％の範囲であるが、それより大きい百分率で供給することができる。様々な実施形態において、その量は、乾燥物質を基準とする組成物の、約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４．０％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５．０％、又はそれ以上、例えば、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、又はそれ以上である。特定の実施形態においては、２〜２．５％のＬＣＰＵＦＡ及び２〜２．５％の純粋なＬ−アルギニンが使用される。栄養補助食品は、錠剤、カプセル、液体濃縮物、又は他の類似の剤形、又は水中に希釈するなど投与前に希釈して、ペットフードに吹き付けるか振りかける形での動物への投与、及び他の類似の投与の様式を可能にするように、数倍高い濃度のＬＣＰＵＦＡ又はＮＯＲＣを含有するように処方することができる。

別法の実施形態において、組成物中のＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣの量は、動物の血清中のＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣの特定濃度を達成するために必要な量の関数である。血清中のＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣの特定濃度は、当業者には理解されようが、上で特定したＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣの推奨量を与えた動物の血清濃度を測定することによって計算することができる。

それぞれのＬＣＰＵＦＡの供給源は、合成又は天然の任意の適当な供給源であり得る。ＬＣＰＵＦＡの好ましい供給源としては、非限定で、ホウレンソウなどの淡緑黄色及び濃緑色野菜、スピルリナなどの藻及び藍藻、アマニ、カノーラ、ダイズ、クルミ、カボチャ、ベニバナ、ゴマ、小麦麦芽、ヒマワリ、トウモロコシ、及びタイマなどの植物種子及び植物油、並びに、魚、特にサケ、マグロ、サバ、ニシン、スズキ、シマスズキ、サメ、オヒョウ、ナマズ、イワシ、エビ、及びハマグリなどの冷水魚、及びそれらの抽出油が挙げられ、或いはＬＣＰＵＦＡは、当該技術における任意の適切な手段によって新たに合成することができる。

各ＮＯＲＣの供給源は、合成又は天然の任意の適当な供給源であり得る。アルギニンの好ましい供給源としては、非限定で、動物及び植物のタンパク質が挙げられる。アルギニン含量の特に豊富な植物の非限定的な例としては、ダイズ、ルピナス、及びイナゴマメなどのマメ科植物、コムギ及びコメなどの穀物、並びにブドウなどの果物が挙げられる。カカオ及びラッカセイなどの種子及び木の実もまたアルギニン含量が豊富である。アルギニン含量が特に豊富な動物タンパク質の非限定的な例としては、家禽及び魚加工品が挙げられる。ＮＯＲＣは、当該技術における任意の適切な手段によって新たに合成することができ、又は商業的供給源によって提供され得る。

本発明の組成物は、補助物質、例えばミネラル、ビタミン、塩、香辛料、着色料、及び保存料などを適宜含むことができる。補助的なミネラルの非限定的な例としては、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、鉄、塩化物、ホウ素、銅、亜鉛、マグネシウム、マンガン、ヨウ素、セレンなどが挙げられる。補助的ビタミンの非限定的な例としては、ビタミンＡ、様々なビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、及びビタミンＫが挙げられる。さらなる補助栄養食品として、例えば、ナイアシン、パントテン酸、イヌリン、葉酸、ビオチン、アミノ酸類なども挙げることができる。

本発明の組成物は、血管の健康状態を増進又は維持し、或いは血管の完全性又は細胞生存をさらに促進する１つ又は複数の補助物質を適宜含むことができる。そのような物質としては、当業者には理解されるように、非限定で、ビンポセチン、コエンザイムＱ_１０、ホスファチジルセリン、アセチル−Ｌ−カルニチン、アルファリポ酸類、ビルベリー（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ ｍｙｒｔｉｌｉｓ）などの抽出物、又はトコフェロール、トコトリエノール、α−カロテン及びβ−カロテンなどのカロテノイド類、リコピン、ルテイン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン並びにフラバノール、フラバノン、フラボン、フラバン−３−オール（カテキン）、アントシアニン、及びイソフラボン（イソフラボノイド）などのフラボノイド類などの抗酸化物質、並びに抗炎症剤及び成長因子（特に細胞生存を促進するために適用できる）の１つ又は複数が挙げられる。

様々な実施形態において、本発明のペットフード又は栄養補助食品組成物は、乾燥物質基準で組成物重量の約１５％〜約５０％の粗タンパク質を含むことができる。その粗タンパク質材料は、ダイズ、綿実、及びラッカセイなどの植物性タンパク質、又はカゼイン、アルブミン、及び食肉タンパク質などの動物性タンパク質を含むことができる。本件で有用な食肉タンパク質の非限定的な例としては、豚肉、子羊の肉、馬肉、鶏肉、魚、及びそれらの混合物が挙げられる。

該組成物は、乾燥物質基準で組成物重量の約５％〜約４０％の脂肪をさらに含むことができる。該組成物は、炭水化物の源をさらに含むことができる。該組成物は、乾燥物質基準で組成物重量の約１５％〜約６０％の炭水化物を含むことができる。かかる炭水化物の非限定的な例としては、穀物又は穀類、例えばコメ、トウモロコシ、ソルガム、ムラサキウマゴヤシ、オオムギ、ダイズ、カノーラ、カラスムギ、コムギ、及びそれらの混合物が挙げられる。該組成物は、また、その他の材料、例えば乾燥ホエー及びその他の乳製品副産物を場合によって含むことができる。

該組成物は、また、少なくとも１つの繊維源を含むことができる。当業者には知られているように、様々な水溶性繊維又は不溶性繊維を活用することができる。その繊維源は、ビートパルプ（砂糖大根からの）、アラビアゴム、タルハゴム（ｇｕｍ ｔａｌｈａ）、オオバコ種子、米ぬか、イナゴマメガム、シトラスパルプ、ペクチン、短鎖オリゴフルクトースに追加されるフルクトオリゴ糖、マンナンオリゴフルクトース、ダイズ繊維、ルピナスの種子からの繊維、アラビノガラクタン、ガラクトオリゴ糖、アラビノキシラン、又はそれらの混合物であり得る。別法では、その繊維源は発酵性繊維であることができる。発酵性繊維は、伴侶動物の免疫システムに利点を提供することが既に記載されている。腸内のプロバイオティック微生物の増殖を促進するプレバイオティック組成物を提供する当業者には周知の発酵性繊維又はその他の組成物もまた、動物の免疫システムに対する本発明により提供される利点の促進を助けるために組成物中に組み込むことができる。さらに、プロバイオティック微生物、例えば乳酸菌又はビフィドバクテリウム種属などを組成物に加えることができる。

詳細な実施形態において、該組成物は、完全且つ栄養バランスのとれたペットフードである。これに関連して、該ペットフードは、ペットフードの処方及び製造に関わる当業者には認識される、湿潤食品、乾燥食品、又は水分量が中間的な食品であり得る。「湿潤食品」は、一般的には缶又はホイルの袋に入れて販売されており、一般的には約７０％〜約９０％の水分量を有するペットフードを表す。「乾燥食品」は、湿潤食品と類似の組成のものであるが、一般的には約５％〜約１５％の範囲の限定された水分量を有しており、そのために例えば小さなビスケットのようなキブルとして与えられる。組成物及び栄養補助食品は、成長した動物用、又は年上の若しくは若い動物用に、例えば「子犬チャウ（ｃｈｏｗ）」、「子猫チャウ」、又は「シニア」配合物を特別に処方することができる。一般に特化した配合物は、発育又は年齢の異なる段階の動物に対して適切なエネルギー及び栄養所要量を含む。

本発明のいくつかの態様は、完全且つバランスのとれた食品（例えば、米国学術研究会議、１９８５年、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｄｏｇｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、又はアメリカ飼料検査官協会の１９９６年機関紙に記載されている）と組み合わせて使用することが好ましい。即ち、本発明のいくつかの態様によるＬＣＰＵＦＡ、又はＤＨＡを含む組成物は、高品質の市販食品と共に使用することが好ましい。本明細書で使用される「高品質の市販食品」とは、例えば上記の米国学術研究会議のイヌに対しての推奨に示されているように８０％以上の重要な栄養素の吸収率を生ずるように製造された食べ物を表す。同様の高い栄養基準が、他の動物に対しても用いられる。

当業者であれば、所与の組成物に加えるべきＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣの適切な量の決め方を理解するであろう。考慮に入れられる要因としては、組成物のタイプ（例えば、ペットフード組成物、栄養補助食品、又はヒトの食用に処方された食品）、異なる動物による特定タイプの組成物の平均消費、及びその組成物が調製される製造条件が挙げられる。好ましくは、組成物に加えるＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣの濃度は、動物のエネルギー及び栄養所要量に基づいて計算する。本発明のいくつかの実施形態によれば、ＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣは、該組成物の製造及び／又は処理の途中の任意の時間に加えることができる。これには、非限定的に、ペットフード組成物、栄養補助食品、又はヒトの食用に処方された食品の配合物の一部、或いはペットフード組成物、栄養補助食品、又はヒトの食用に処方された食品に適用されるコーティングが含まれる。

該組成物は、例えば、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ ＯｘｆｏｒｄのＷａｌｔｈａｍ Ｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｏｇ ａｎｄ Ｃａｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．ＡＴＢ Ｅｄｎｅｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ｂｙ Ａ． Ｒａｉｎｂｉｒｄ、題名「Ａ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｄｉｅｔ」の５７〜７４頁に記載されているような当技術分野における適当な任意の方法によって製造することができる。

（方法）
本発明の別の態様は、動物における血管完全性を増進し且つ／又は細胞生存を促進するのに有効な量の１つ又は複数のＬＣＰＵＦＡ及び１つ又は複数のＮＯＲＣを含む組成物を動物に投与するステップを含む、動物における血管完全性の増進及び／又は細胞生存の推進のための方法を特徴とする。本発明のさらに別の態様は、動物における例えば動物の脳における虚血エピソードの事象における虚血によって引き起こされる例えば脳に対する損傷を減らすための１つ又は複数のＬＣＰＵＦＡ及び１つ又は複数のＮＯＲＣを含む組成物の有効量を定期的に動物に投与するステップを含む、動物の脳又はその他の組織に虚血によって引き起こされる損傷を減らすための予防の方法を特徴とする。

本発明の上記の２つの態様の詳細な実施形態のいずれにおいても、その組成物は、本明細書で例示されているペットフード組成物、栄養補助食品、又はヒトの食用に処方された食品である。さらに詳細な実施形態において、ＬＣＰＵＦＡは、以下に限定されないが、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡを含む（ｎ−３）ＬＣＰＵＦＡの１つ又は複数であり、ＮＯＲＣは、Ｌ−Ａｒｇ及びその誘導体の１つ又は複数である。動物は、任意の家畜若しくは伴侶動物を含むことができ、又はヒトを含むことができる。いくつかの実施形態において、動物は、イヌ又はネコなどの伴侶動物である。別の実施形態において、動物はヒトである。

該組成物は、様々な投与の代替経路によって動物に投与することができる。そのような経路としては、以下に限定はされないが、経口、経鼻、静脈内、筋肉内、胃内、幽門通過、皮下、直腸などが挙げられる。好ましくは、該組成物は、経口で投与される。本明細書で使用される「経口投与」又は「経口投与する」とは、本明細書に記載の１つ又は複数の本発明の組成物を、動物が摂取すること、又はヒトが動物に食べさせるように指示されること、若しくは食べさせることを意味する。

ヒトが該組成物を食べさせるように指示される場合、そのような指示は、ヒトにその組成物の使用が、言及した利点、例えば、上で詳しく述べた、動物の血管完全性又は動物の細胞生存の促進、脳老化又は虚血エピソードの予防又は遅延、虚血によって引き起こされる例えば脳、心臓又はその他の組織に対する損傷の減少、虚血エピソードの事象における虚血と関連する例えば再灌流手術、糖尿病誘発性の末梢性虚血における障害からの保護及びその他を提供することができること及び／又は提供するであろうことを、ヒトに指示し、且つ／又は知らせるものであり得る。そのような指示は、口頭の指示（例えば、医師、獣医、若しくはその他の医療従事者、又はラジオ若しくはテレビのマスメディア（即ち広告）による口頭の使用説明を介する）、或いは、文書による指示（例えば、医師、獣医、若しくはその他の医療従事者からの文書（例えば処方箋）、指示販売の専門家又は組織からの文書（例えば、マーケッティング用冊子、パンフレット、又はその他の使用説明のための用具を介する）、書き込まれた媒体（例えば、インターネット、電子メール、又はその他のコンピューター関連媒体）、及び／又は該組成物に使われる包装（例えば該組成物を保持する容器上に存在するラベル）による指示を介する）であり得る。

投与は、必要性又は所望に基づいて、例えば、月１回、週１回、毎日、又は１日に複数回とすることができる。同様に、投与は、１日おき、１週間おき又は１カ月おき、２日おき、２週間おき又は２カ月おき、３日おき、３週間おき又は３カ月おきなどとすることができる。投与は１日当り複数回とすることができる。通常の栄養の必要条件に対する栄養補助食品として利用する場合、該組成物は、動物に直接投与してよく、さもなければ、毎日の飼料又は食品に添えるか混合することができる。毎日の飼料又は食品として利用する場合、投与は通常の技量の者には良く知られている。

投与は、また、例えば動物における食事療法の一部として定期的に行うことができる。食事療法は、動物の血管完全性を増進し、又は虚血エピソードの事象における虚血によって引き起こされる脳に対する損傷を減少するための有効量の１つ又は複数のＬＣＰＵＦＡ及び１つ又は複数のＮＯＲＣを含む組成物の動物による定期的な摂取をもたらすことを含み得る。定期的な摂取は、１日又は１週を基準として、１日１回、又は１日当り２回、３回、４回、又はそれ以上とすることができる。同様に、定期的な投与は、１日おき又は１週間おき、２日おき又は２週間おき、３日おき又は３週間おき、４日おき又は４週間おき、５日おき又は５週間おきとすることができ、そのような食事療法においては、投与は１日当り複数回とすることができる。定期的投与の目標は、動物に、本明細書に例示したＬＣＰＵＦＡ及びＮＯＲＣの好ましい１日の投与量を提供することである。

本発明の方法によれば、食事療法の一部としての投与を含めた１つ又は複数のＬＣＰＵＦＡ及び１つ又は複数のＮＯＲＣを含む組成物の投与は、動物の胎児から全生涯を通した範囲の期間に及ぶことができる。

以下の実施例は、本発明をこれまで以上に詳しく説明するために提供する。それらは、説明を意図したものであり本発明を限定するものではない。

実施例１ 卵巣切除ラットモデルにおける一過性脳虚血による脳損傷に対する１７β−エストラジオール、或いはアルギニン若しくは魚油又はその組み合わせによる栄養補助の効果
卵巣切除ラットモデルにおける一過性脳虚血によって引き起こされた脳損傷に対する、１７β−エストラジオール（Ｅ２）による長期間投与による効果と、アルギニン、魚油の形態としてのＬＣＰＵＦＡ、又はそれらの組み合わせをそれぞれ含有する３つの試験食餌による効果とを比較した。

（方法）
動物：メスのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０ｇ、マサチューセッツ州ウィルミントン）を、手術前の３日間１２時間の明暗サイクルの動物施設に慣れさせた。双方の卵巣切除を、食餌給餌を開始する２週間前に実施した。食餌給餌開始の４週間後、麻酔下で一過性中大脳動脈（ｔＭＣＡ）を閉塞した後、ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔（ｉ．ｐ．）内注射を実施した。

食餌及びホルモンの投与：１群当り１４〜１５匹のラットとなるように、５つの処置群に無作為に割り付けた。これらの群は以下のものであった：
群１ 対照食餌（ホワイトダイエット）
群２ 対照食餌＋ＳＩＬＡＳＴＩＣ（登録商標）エストラジオールインプラント１週間（ホワイト＋Ｅ２）
群３ 食餌Ｉ（ピンクダイエット）
群４ 食餌ＩＩ（パープルダイエット）
群５ 食餌ＩＩＩ（グレーダイエット）

対照食餌は、１４０ｇ／ｋｇのカゼイン、１００ｇ／ｋｇのスクロース、５０ｇ／ｋｇの繊維、１５５ｇ／ｋｇのデキストリン、４６６ｇ／ｋｇのコーンスターチ、３５ｇ／ｋｇの標準ソルトミックス、４０ｇ／ｋｇのダイズ油、１０ｇ／ｋｇの標準ビタミンミックス、１．８ｇ／ｋｇのＬ−シスチン及び２．５ｇ／ｋｇの塩化コリンを含有する標準のラット食餌とした。３つの試験食餌（食餌Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）は、全て、（１）４５ｍｇ／ｋｇのニコチン酸、３５ｍｇ／ｋｇのパントテネート、２４ｍｇ／ｋｇのピリドキシン、１５ｍｇ／ｋｇのチアミン、９ｍｇ／ｋｇのリボフラビン、３ｍｇ／ｋｇの葉酸、０．８ｍｇ／ｋｇのビオチン及び０．２２５ｍｇ／ｋｇのビタミンＢ１２を含む付加的なビタミンＢ類、並びに（２）５００ｍｇ／ｋｇのビタミンＥ、１５０ｍｇ／ｋｇのビタミンＣ、１００ｍｇ／ｋｇのアスタキサンチン及び０．４ｍｇ／ｋｇのセレンを含む抗酸化物質カクテルを追加した。食餌Ｉは、さらに２％のアルギニン（２０ｇ／ｋｇ）を含めた。食餌ＩＩは、さらに２％のアルギニンと２％のニシンの魚油（２０ｇ／ｋｇ）を含めた。食餌ＩＩＩは、さらに２％のニシンの魚油を含めた。

食餌は全てラットに４週間にわたって無制限に与えた。食餌の交換は１週間につき１回発生した。また、１週間につき１回、体重及び食餌摂取量を測定した。ｔＭＣＡ閉塞を誘発させる１週間前に、群２のラットには、皮下にインプラントしたＳＩＬＡＳＴＩＣ（登録商標）ペレット中に存在するＥ２を４ｍｇ／ｍｌの投与量で投与した。この処置は、様々な発作から脳を保護するために用いられてきており、生理的に適切なレベルの血清Ｅ２を生ずる（Ｓｉｍｐｋｉｎｓら、１９９７；Ｊｕｎｇら、２００３）。これは陽性対照であったが、それはＥ２処置のこの投与量と時間とがｔＭＣＡ閉塞の作用からの保護をもたらすことが既に示されているためである（Ｓｉｍｐｋｉｎｓら、１９９７；Ｙａｎｇら、２００４ａ；Ｙａｎｇら、２００４ｂ）。

中大脳動脈閉塞及び試料調製：動物に、ケタミン（６０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することによって麻酔をかけた。ｔＭＣＡ閉塞を、前記のもの（Ｓｉｍｐｋｉｎｓら、１９９７）を少し修正して実施した。手短に言えば、左総頸動脈、外頸動脈及び内頸動脈を、正中頸部切開によって露出させた。３．０モノフィラメント縫合糸を内頸動脈内腔に導入し、抵抗を感じるまで静かに進入させた。その外科的処置は、最小限の出血で、２０分以内で行った。縫合糸は、６０分間所定位置に保ち、その後、再灌流が可能となるように引き抜いた。直腸温を測定し、処置中加温パッドにより３６．５℃と３７℃の間に保持した。再灌流の開始後２４時間で、動物を犠牲にし、脳を除去した。その脳を次に金属脳マトリクス（ＡＳＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、ミシガン州ウォレン）を用いて冠状に切り裂いて２ｍｍの切片とし、塩化２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）の生理食塩水２％溶液中に３７℃でインキュベートして染色し、次いで１０％ホルマリン中に入れて固定した。

ＴｄＴ媒介ｄＵＴＰ Ｎｉｃｋ−Ｅｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ：タネル）ＭＣＡ閉塞によるＤＮＡ断片化分析は、幅広く用いられている局所的虚血性脳梗塞モデルである（Ｂｅｄｅｒｓｏｎら、１９８６）。神経細胞の死に対するこのインビボモデルは、多数の神経細胞及びその他の細胞における同期化されたアポトーシスプロセスを急速に誘発することができる（Ｌｉら、１９９７）。アポトーシスに対する一過性虚血の影響は、それ故、ＴＵＮＥＬ法によるＤＮＡ断片化を解析することにより調べた。ＴＵＮＥＬ染色は、修正された製造業者の使用説明書（Ｇａｖｒｉｅｌｉら、１９９２）により実施した。ホルマリン固定した、パラフィン包埋組織切片を、キシレンで脱パラフィン化し、段階的なエタノール処理によって再水和し、ＰＢＳ中の最終洗浄をした。その切片を４％パラホルムアルデヒド中で２０分間にわたって後固定した。次に、切片を洗浄して、ＰＢＳ中１００／μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫにより１５分間処理し、平衡緩衝液により１０分間平衡させ、次いでＴｄＴ酵素及びＦＩＴＣ標識したｄＵＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を含有する緩衝液と共に加湿チャンバー中３７℃でインキュベートした。反応は、室温における２×ＳＳＣ緩衝液中１５分のインキュベーションによって停止させた。その切片に次にＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）を含有する退色防止剤をマウントした。陽性対照の切片は、ＴｄＴ緩衝液中での平衡の前にＤＮアーゼＩ溶液中に室温で１０分間浸漬した。切片は、適切な励起／発光フィルタのペアを備えた蛍光顕微鏡下で観察した。

一部の動物は、プロトコル中に試験から排除した。損傷体積について定量化した動物の数は、１群当り１２〜１５匹の範囲であった。

統計手法：結果をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｃ；カリフォルニア州サンディエゴ）を用いる一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により解析した。群間の差異の有意性は、一元ＡＮＯＶＡに続くテューキーの多重比較検定により確定した。全ての値は、平均＋／−ＳＥＭとして表した。

（結果）
ストロークボリューム：実験条件４つ（エストラジオール、並びに食餌Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）の全てが、梗塞面積を減少した（図１）。エストラジオール処理（群２）は、梗塞体積を６８％減少したが、これは卒中損傷からのエストロゲン保護を示す値である（Ｓｉｍｐｋｉｎｓら、１９９７；Ｆａｎら、２００３；Ｙａｎｇら、２００４ａ；Ｙａｎｇら、２００４ｂ）。同様に、食餌ＩＩは、梗塞体積を６７％と有意に減少した。試験した他の２つの食餌も中程度の梗塞体積の減少を示したが、数値の変動が大きすぎるため統計上有意かどうかの評価までに至らなかった。

各群は、観測できる損傷のない（われわれの損傷体積の計算において０の値）ラットを有したので、データは、この０の値が群の差異に寄与した程度を判定するためにこれらの値を削除した後で評価した。図２に示されているように、同じ２つの群が、データのこの修正をした対照食餌群より有意に低かった。このようにして、群間の差異は、損傷が観察される動物並びに観察される損傷のない動物の数によって引き出された。エストロゲン処理と食餌の両方の保護作用は、主として実験的脳梗塞において「救助可能」であると考えられる境界域と呼ばれる脳の領域の皮質上で発揮される。これは、今までに実験的脳梗塞において試験したいずれの処置によっても容易に救われていない梗塞のコアと呼ばれる大脳基底核とは対照をなしている。

アポトーシス。実験的虚血に対するアポトーシス反応についてのエストラジオール処理及び３つの試験食餌の結果を判定するために、ＴＵＮＥＬ染色を用いるアポトーシスの評価を実施した。試験を完了した全ての動物におけるＴＵＮＥＬ染色をした３つの脳の領域を評価した。ＴＵＮＥＬは、ＴＴＣ染色（Ｗｅｎら、２００４）を用いる損傷した脳の領域のわれわれの評価に基づいて、大脳皮質のコア、大脳皮質の境界域及び皮質下部のコア内を評価した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は、ＤＡＰＩ核対比染色を用いる領域内の細胞の総数に対して正常なものにした。３つの脳の領域の全てからの切片を数え、各動物についてのそれらの平均の細胞計数を、群の平均を生ずるために使用した。細胞計数は、ＴＴＣ染色によって決定された最大範囲の脳梗塞からの薄片における任意抽出された顕微鏡視野（３２０μｍ正方形断面）中で行った。ＴＵＮＥＬ染色は、対照動物における３つの脳の領域の全てにおいて広範囲に及んだ。５つの処理群の全ての比較を行ったときは、各脳におけるＴＵＮＥＬ染色を、ＴＴＣ染色を用いて見出した結果と相関させて損傷体積を定量化した（図３）。即ち、Ｅ２処理をした動物並びに食餌ＩＩを与えた動物の両方においてＴＵＮＥＬ染色の実質的な減少が存在した。食餌Ｉ及びＩＩＩを与えた動物は、対照と食餌ＩＩの動物との中間であった。ＴＴＣ染色とＴＵＮＥＬ染色との間のこの相関関係は、図４に描かれている。ホルモンと食餌のＴＵＮＥＬ染色に対する効果の特徴づけによって、Ｅ２及び食餌ＩＩによる細胞死からの保護のかなりの部分はアポトーシスの阻害によって仲介されることが示されている。

（結論）
３つの試験食餌は全て、平均の梗塞体積並びにＴＵＮＥＬ陽性細胞計数を減少し、食餌ＩＩは、これらのパラメータを既知の神経保護剤エストラジオールで見られるレベルまで減少した。

本発明は、上で説明し、例示した実施形態には限定されず、添付した特許請求の範囲の範囲内で変更及び修正が可能である。

一過性脳虚血にさらされた全てのラットにおける虚血性損傷体積に対する対照及び試験食餌の効果を示す棒グラフである。対照及び試験食餌の組成は、実施例１に記載されている（対照と比較して^＊ｐ＜０．０１）。 ラットにおいて一過性脳虚血後に現れる虚血性損傷体積に対する対照及び試験食餌の効果を示す棒グラフである。対照及び試験食餌の組成は、実施例１に記載されている（対照と比較して^＊ｐ＜０．０１）。 ラットにおいて脳虚血によって引き起こされたアポトーシスに対する対照及び試験食餌の効果を示す棒グラフである。対照及び試験食餌の組成は、実施例１に記載されている（対照と比較して^＊ｐ＜０．００１）。 一過性脳虚血にさらされたラットにおける虚血性損傷体積（Ｘ軸）とＴＵＮＥＬ染色によって示されたアポトーシス細胞の百分率（Ｙ軸）との間の相関関係を示すグラフである。対照及び試験食餌の組成は、実施例１に記載されている。

Claims (15)

1. 動物における虚血によって引き起こされる脳損傷を、治療、遅延又は予防するための薬剤組成物であって、前記動物は脳における虚血エピソードの１つ又は複数の危険要因を有し、前記組成物は前記動物の脳において虚血エピソードの事象における虚血によって引き起こされる脳損傷を減少するのに有効な量の、
   アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、又はドコサヘキサエン酸の少なくとも１つを含有する１つ又は複数の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）、
   Ｌ−アルギニン、
   １つ又は複数のビタミンＢ類、及び
   アスタキサンチン
   を含む組成物。
2. 前記ＬＣＰＵＦＡが配合物の少なくとも約０．１重量％〜約１３重量％の量であり、Ｌ−アルギニンが配合物の少なくとも約０．１重量％〜約１２重量％の量である、請求項１に記載の組成物。
3. 前記動物が伴侶動物である、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 前記伴侶動物がイヌ又はネコである、請求項３に記載の組成物。
5. 前記動物がヒトである、請求項１又は２に記載の組成物。
6. １日１回定期的に摂取される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記１つ又は複数の危険要因が、高コレステロール血症、高血圧症、糖尿病、又は肥満症の少なくとも１つを含有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 抗酸化物質、成長因子及び抗炎症剤から選択される少なくとも１つ、或いはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 動物の虚血によって引き起こされる脳損傷を減少させるための薬剤又は共に投与される複数の薬剤の製造における、
   アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、又はドコサヘキサエン酸の少なくとも１つを含有する１つ又は複数のＬＣＰＵＦＡ、
   Ｌ−アルギニン、
   １つ又は複数のビタミンＢ類、及び
   アスタキサンチン
   の使用。
10. ヒト以外の動物における虚血によって引き起こされる脳損傷を、治療、遅延又は予防する方法であって、脳における虚血エピソードの１つ又は複数の危険要因を有する動物を特定する工程と、前記動物に、脳において虚血エピソードの事象における虚血によって引き起こされる脳損傷を減少するのに有効な量の、
    アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、又はドコサヘキサエン酸の少なくとも１つを含有する１つ又は複数の長鎖多価不飽和脂肪酸（ＬＣＰＵＦＡ）、
    Ｌ−アルギニン、
    １つ又は複数のビタミンＢ類、及び
    アスタキサンチン
    を含む薬剤組成物を、定期的に投与する工程とを含む方法。
11. 前記ＬＣＰＵＦＡが配合物の少なくとも約０．１重量％〜約１３重量％の量であり、Ｌ−アルギニンが配合物の少なくとも約０．１重量％〜約１２重量％の量である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記動物が伴侶動物である、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 前記伴侶動物がイヌ又はネコである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記定期的投与は１日１回である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記１つ又は複数の危険要因が、高コレステロール血症、高血圧症、糖尿病、又は肥満症の少なくとも１つを含有する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。