JP5365166B2 - Oral composition containing lactic acid bacteria - Google Patents
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Description
本発明は、新規乳酸菌及びこれを含有する口腔用組成物、ならびに口腔内バイオフィルム形成抑制剤、ポルフィロモナス・ジンジバリス及び／又はフゾバクテリウム・ヌクレアタムの生育阻害剤、う蝕予防剤、歯周病予防・治療剤及び口臭改善・予防剤に関するものである。 The present invention relates to a novel lactic acid bacterium and an oral composition containing the same, an oral biofilm formation inhibitor, a Porphyromonas gingivalis and / or Fusobacterium nucleatum growth inhibitor, a caries preventive agent, and a periodontal disease preventive agent. • It relates to therapeutic agents and agents that improve and prevent bad breath.
う蝕、歯周病、口臭等の口腔内の疾患又は不快症状の主要な原因は細菌であり、その原因菌としては、う蝕ではストレプトコッカス・ミュータンスをはじめとするミュータンスレンサ球菌、歯周病や口臭ではグラム陰性嫌気性桿菌、特に歯周病では、ポルフィロモナス・ジンジバリス、口臭ではフゾバクテリウム・ヌクレアタム等が着目されている。これらの菌の生育や、バイオフィルムとして固着することを抑制することが口腔疾患予防策として有用であり、従来、その手段として殺菌剤、抗菌剤等が用いられている。 Bacteria are the main causes of oral diseases such as caries, periodontal disease, bad breath, and unpleasant symptoms, and the causative bacteria include mutans streptococci such as Streptococcus mutans and periodontium in caries. Gram-negative anaerobic bacilli for diseases and halitosis, especially Porphyromonas gingivalis for periodontal disease, Fusobacterium nucleatum, etc. for halitosis. Inhibiting the growth of these bacteria and sticking as a biofilm is useful as a preventive measure for oral diseases. Conventionally, bactericides, antibacterial agents, and the like have been used as the means.
薬品等を用いず、善玉菌で悪玉菌を排除して健康を整えるプロバイオティクスの考え方は腸内で古くから用いられている。腸内プロバイオティクス技術において、善玉菌として用いられている菌は乳酸菌であり、主に乳酸を産生して他の細菌の生育を抑制するものである。このプロバイオティクスの技術が、口腔内でも試されるようになってきている。 The idea of probiotics that eliminates bad bacteria with good bacteria and improves health without using chemicals has long been used in the intestines. In intestinal probiotic technology, bacteria used as good bacteria are lactic acid bacteria, which mainly produce lactic acid and suppress the growth of other bacteria. This probiotic technology is also being tested in the oral cavity.
例えば、ストレプトコッカス・サリバリウスを用いるう蝕抑制技術（特許文献１：特開平０５−００４９２７号公報）、ラクトバチルス・ロイテリを用い、ミュータンス菌の増殖を抑制するう蝕予防技術（特許文献２：特開２００３−２９９４８０号公報）、ラクトバチルスとストレプトコッカスとを併用する口腔内疾患予防／治療用発酵乳（特許文献３：特開２００６−２６２８９３号公報）が提案されている。 For example, a caries prevention technique using Streptococcus salivarius (Patent Document 1: Japanese Patent Laid-Open No. 05-004927) and a caries prevention technique using Lactobacillus reuteri to suppress the growth of mutans bacteria (Patent Document 2: Special) No. 2003-299480), fermented milk for prevention / treatment of oral diseases using both Lactobacillus and Streptococcus (Patent Document 3: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-262893) has been proposed.
一方、ショ糖はヒトが最も一般的に摂取している甘味料であり、細菌による酸産生の基質となる上に虫歯原因菌であるミュータンス連鎖球菌の粘着性多糖生産の特異的な基質ともなるため、他の糖類と比較してう蝕の原因になるリスクが高いと認知されている。上記菌種をはじめ、乳酸菌の多くの菌種はショ糖発酵性を有しているため、これらの菌自体がショ糖を栄養源として乳酸を産生する性状を有する。従って、これらショ糖発酵性を有した乳酸菌のヒト口腔内への投与は、たとえ虫歯原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス菌を抑制したとしても、投与菌自身の産生する乳酸により歯牙を脱灰するう蝕の原因になるリスクを有する。また、乳酸菌は環境周囲を酸性とするものの、う蝕の原因であるストレプトコッカス・ミュータンスは、自身も乳酸を産生し耐酸性も比較的強い菌として知られているため、抵抗を示す傾向にある。よって、乳酸菌の投与は腸管内プロバイオティクスでは他の細菌の排除に有用となるが、口腔内ではう蝕原因菌の排除を必ずしも期待できないばかりか、う蝕リスクを増大させる可能性を持つ。 On the other hand, sucrose is the sweetener most commonly ingested by humans. It is a substrate for acid production by bacteria and a specific substrate for the production of sticky polysaccharides by mutans streptococci, the causative agent for caries. Therefore, it is recognized that there is a high risk of causing caries compared to other saccharides. Many bacterial species of lactic acid bacteria including the above-mentioned bacterial species have sucrose fermentability, so these bacteria themselves have the property of producing lactic acid using sucrose as a nutrient source. Therefore, administration of these sucrose-fermenting lactic acid bacteria into the human oral cavity decalcifies the teeth with the lactic acid produced by the administered bacteria, even if it suppresses the bacteria that cause dental caries, Streptococcus mutans. Has a risk of causing caries. In addition, although lactic acid bacteria acidify the environment, Streptococcus mutans, the cause of caries, is known to be a bacterium that produces lactic acid and is relatively strong in acid resistance, and thus tends to exhibit resistance. . Therefore, the administration of lactic acid bacteria is useful for eliminating other bacteria in intestinal probiotics, but not only can the expectation of elimination of caries-causing bacteria in the oral cavity but also has the potential to increase the risk of dental caries.
これに対して、上記従来技術はいずれも病原菌の排除等の主効果のみに着目しており、投与した菌が産生する酸によって生ずるう蝕発生リスクについては言及されていない。本発明者らは、上記点に着目し、ショ糖発酵性が低く、乳酸を発生しにくいため、う蝕発生リスクが通常乳酸菌より低いと共に、う蝕原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス菌の生育やこの菌によるバイオフィルム形成を抑制し、さらに歯周病や口臭の原因となるポルフィロモナス・ジンジバリスやフゾバクテリウム・ヌクレアタム等の生育阻害作用を有し、う蝕、歯周病、口臭の口腔内の三大トラブルを同時に抑制可能であるものを提供することを目的とする。 On the other hand, all the above prior arts focus only on the main effects such as elimination of pathogenic bacteria, and no mention is made of the caries risk caused by the acid produced by the administered bacteria. The present inventors pay attention to the above points, and since sucrose fermentation is low and lactic acid is hardly generated, the risk of caries generation is lower than that of normal lactic acid bacteria, and the growth of Streptococcus mutans bacteria that are caries-causing bacteria. It suppresses the formation of biofilm by these bacteria and has growth inhibitory effects such as Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum which cause periodontal disease and bad breath. It aims at providing what can suppress three major troubles at the same time.
本発明者らは、上記目的を達成するため、ショ糖非資化性で、乳酸を発生しにくいと共に、ストレプトコッカス・ミュータンスに起因するバイオフィルム形成を抑制する作用、ポルフィロモナス・ジンジバリスやフゾバクテリウム・ヌクレアタム等の生育阻害作用を有する乳酸菌株の探索を行い、ヒト口腔内及び漬物よりそれら性質を持つ細菌株を単離することに成功した。 In order to achieve the above object, the inventors of the present invention are sucrose non-assimilable, hardly generate lactic acid, and suppress biofilm formation caused by Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium・ We searched for lactic acid strains having growth inhibitory action such as Nucleatum, and succeeded in isolating bacterial strains with these properties from human oral cavity and pickles.
従って、本発明は下記乳酸菌及びこれを含有する口腔用組成物を提供する。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス ＦＥＲＭ Ｐ−２１４３６株（（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センター 受託番号）、ラクトバチルス・ラムノーサス ＦＥＲＭ Ｐ−２１４３７株（（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センター 受託番号）、ラクトバチルス・ラムノーサス ＦＥＲＭ Ｐ−２１４３８株（（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センター 受託番号）、及びラクトバチルス・カルバタス ＮＩＴＥ Ｐ−５６８株（（独）製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター 受託番号）から選ばれる乳酸菌。
さらに、本発明は、上記乳酸菌からなる口腔内バイオフィルム形成抑制剤、ポルフィロモナス・ジンジバリス及び／又はフゾバクテリウム・ヌクレアタムの生育阻害剤、う蝕予防剤、歯周病予防・治療剤及び口臭改善・予防剤を提供するもので、上記乳酸菌の用途を限定したものである。
Accordingly, the present invention provides the following lactic acid bacteria and oral compositions containing the same.
Lactococcus lactis subspecies lactis FERM P-21436 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent deposit number), Lactobacillus rhamnosus FERM P-21437 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) Biological Deposit Center Accession No.), Lactobacillus rhamnosus FERM P-21438 strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center Accession No.), and Lactobacillus carbatus NITE P-568 strain (Germany product evaluation technology) Lactic acid bacteria selected from Fundamental Organization Patent Microorganism Deposit Center (Accession Number).
Furthermore, the present invention is an oral biofilm formation inhibitor comprising the above lactic acid bacteria, a growth inhibitor of Porphyromonas gingivalis and / or Fusobacterium nucleatum, a caries preventive agent, a periodontal disease preventive / therapeutic agent, and a bad breath improvement / A prophylactic agent is provided, and uses of the lactic acid bacteria are limited.
本発明の乳酸菌株は、ショ糖非発酵性で、乳酸を発生しにくいと共に、う蝕原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス菌の生育や口腔内バイオフィルムの形成を抑制し、歯周病や口臭の原因となるポルフィロモナス・ジンジバリスやフゾバクテリウム・ヌクレアタム等の生育阻害作用を有し、う蝕、歯周病、口臭を予防、治療、改善する口腔用組成物に応用できる。 The lactic acid strain of the present invention is non-sucrose fermentable, hardly generates lactic acid, suppresses growth of Streptococcus mutans bacteria that are caries-causing bacteria and formation of oral biofilms, and is effective for periodontal disease and bad breath. It has a growth inhibitory action such as Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum which cause the above, and can be applied to an oral composition for preventing, treating and improving caries, periodontal disease and bad breath.
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の口腔用組成物は、下記乳酸菌株を含有する口腔用組成物である。
（Ａ）ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｌａｃｔｉｓ） ＦＥＲＭ Ｐ−２１４３６株（（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センター 受託番号）
（Ｂ）ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） ＦＥＲＭ Ｐ−２１４３７株（（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センター 受託番号）
（Ｃ）ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ） ＦＥＲＭ Ｐ−２１４３８株（（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センター 受託番号）
（Ｄ）ラクトバチルス・カルバタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ） ＮＩＴＥ Ｐ−５６８株（（独）製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター 受託番号）
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The oral composition of the present invention is an oral composition containing the following lactic acid strain .
(A) Lactococcus lactis subspecies lactis FERM P-21436 strain (patent biological deposit center, AIST)
(B) Lactobacillus rhamnosus FERM P-21437 strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology patent biological deposit center deposit number)
(C) Lactobacillus rhamnosus FERM P-21438 strain (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center accession number)
(D) Lactobacillus curvatus NITE P-568 strain ((Germany) Product Evaluation Technology Fundamental Patent Microorganism Deposit Center Accession Number)
上記（Ａ）〜（Ｄ）の乳酸菌株の菌学的性質を下記に示す。一般的菌学的性質を表１に、主な糖の資化性について表２に示す。菌学的性質及び分類方法はヴァージズ マニュアル オブ システマチック バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（１９８４）を参考とした。糖類資化性を指標とする乳酸菌同定キットＡＰＩ５０ＣＨＬ（シメックス・ビオメリュー（株））を用い、専用解析ソフトＡＰＩ ＷＥＢによって、（Ａ）はラクトコッカス・ラクティス、（Ｂ），（Ｃ）はラクトバチルス・ラムノーサスと同定された。（Ｄ）は、１６ｓＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の相同性から、ラクトバチルス・カルバタスと同定された。 The mycological properties of the lactic acid strains (A) to (D) are shown below. The general bacteriological properties are shown in Table 1, and the main sugar assimilation properties are shown in Table 2. For mycological properties and classification methods, reference was made to Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1984). Lactic acid bacteria identification kit API50CHL (Simex Biomelieu Co., Ltd.) using saccharide assimilation as an index is used, and with dedicated analysis software API WEB, (A) is Lactococcus lactis, (B) and (C) are Lactobacillus Identified as rhamnosus. (D) was identified as Lactobacillus carbatus from the homology of the DNA sequence encoding 16sRNA.
本発明の（Ａ）〜（Ｄ）の乳酸菌株は、後述する実施例で示されたように、下記特徴的な性質（１）〜（４）を有する。このことから、新規の菌株であることが判明した。
（１）ヒトが通常摂取しておりう蝕リスクも高いとされるショ糖からの酸産生能が低く、歯の脱灰ｐＨといわれているｐＨ５．５未満までｐＨを下げない。
（２）ストレプトコッカス・ミュータンスを起因とするバイオフィルム形成を抑制する。
（３）ポルフィロモナス・ジンジバリス生育阻害作用を有する。
（４）フゾバクテリウム・ヌクレアタム生育阻害作用を有する。
なお、本発明においては、「ショ糖非発酵性」とは、後述する試験例２で培養後のｐＨが５．５以上を示すものをいい、「バイオフィルム形成の抑制」とは、後述する試験例１でバイオフィルム形成率を６０％以下に抑制するものをいい、「ポルフィロモナス・ジンジバリス及びフゾクテリウム・ヌクレアタム生育阻害作用を有する」とは、後述する試験例３で阻止円が４ｍｍ以上のものをいう。
The lactic acid bacteria strains (A) to (D) of the present invention have the following characteristic properties (1) to (4) as shown in Examples described later. This proved to be a novel strain.
(1) The ability to produce acid from sucrose, which is usually ingested by humans and has a high caries risk, is low, and the pH is not lowered to less than pH 5.5, which is said to be the demineralized pH of the teeth.
(2) Suppress biofilm formation caused by Streptococcus mutans.
(3) It has an inhibitory effect on growth of Porphyromonas gingivalis.
(4) It has an inhibitory effect on Fusobacterium nucleatum growth.
In the present invention, “sucrose non-fermentative” means that the pH after cultivation is 5.5 or more in Test Example 2 described later, and “suppression of biofilm formation” is described later. In Test Example 1, the biofilm formation rate is suppressed to 60% or less, and “having an effect of inhibiting growth of Porphyromonas gingivalis and Fuzocterium nucleatum” has a blocking circle of 4 mm or more in Test Example 3 described later. Say things.
本発明の（Ａ）〜（Ｄ）の乳酸菌株は、乳酸菌の培養の常法に従って任意の条件で培養し、培養物から遠心分離等の分離手段によって集菌したものを、生理食塩水や滅菌水等で洗浄し使用することができる。う蝕予防剤、歯周病予防・治療剤及び口臭改善・予防剤等の製剤化の形態についても特に制限はなく、所望により凍結乾燥粉末、噴霧乾燥粉末、液体への懸濁等、使用目的に応じて適宜決定すればよい。 The lactic acid strains (A) to (D) of the present invention are cultured under arbitrary conditions in accordance with a conventional method for culturing lactic acid bacteria, and collected from the culture by a separation means such as centrifugation, and are subjected to physiological saline or sterilization. It can be washed with water and used. There are no particular restrictions on the formulation of caries preventive agent, periodontal disease preventive / therapeutic agent, and bad breath odor improving / preventive agent, and if desired, freeze-dried powder, spray-dried powder, suspension in liquid, etc. What is necessary is just to determine suitably according to.
本発明の（Ａ）〜（Ｄ）の乳酸菌株は、口腔内への適用可能な剤型として、歯磨（練り歯磨、粉歯磨、液状歯磨）、洗口剤、口中清涼剤、義歯洗浄剤、うがい用錠剤、歯肉マッサージクリーム、トローチ、ガム、ヨーグルト、ドリンク、発酵品等の形態で口腔用組成物に配合が可能であり、組成物全量に対して、０．００１〜７５質量％となるように配合又は含有することにより、優れたう蝕予防、歯周病予防・治療、口臭改善・防止効果を示す。また、発酵品そのものを口腔用組成物として用いることも可能であり、この場合にはスタータとして用いることもできる。なお、口腔用組成物には、その剤型に通常配合する任意成分を１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて、適量配合することができ、通常の方法で調製することができる。 The lactic acid strains of (A) to (D) of the present invention include toothpaste (toothpaste, powder dentifrice, liquid dentifrice), mouthwash, mouth freshener, denture cleanser, as a dosage form applicable to the oral cavity. It can be blended into the oral composition in the form of gargle tablets, gum massage creams, troches, gums, yogurts, drinks, fermented products, etc., so that it will be 0.001 to 75% by mass with respect to the total amount of the composition Incorporating into or containing, it exhibits excellent caries prevention, periodontal disease prevention / treatment, and halitosis improvement / prevention effects. In addition, the fermented product itself can be used as an oral composition, and in this case, it can also be used as a starter. In addition, the oral composition can be blended in an appropriate amount by combining one component alone or two or more of optional components that are usually blended in the dosage form, and can be prepared by a usual method.
任意成分としては、口腔用組成物の種類に応じた適宣な成分が用いられる。例えば、研磨剤、界面活性剤、粘結剤、粘稠剤、甘味料、防腐剤、香料、着色剤、ｐＨ調整剤、賦形剤、各種薬効成分等が挙げられる。 As the optional component, a proper component corresponding to the type of oral composition is used. Examples thereof include abrasives, surfactants, binders, thickeners, sweeteners, preservatives, fragrances, colorants, pH adjusters, excipients, and various medicinal ingredients.
本発明の乳酸菌は、ショ糖非発酵性で、乳酸を発生しにくいと共に、う蝕原因菌であるストレプトコッカス・ミュータンス菌の生育や口腔内バイオフィルムの形成を抑制し、歯周病や口臭の原因となるポルフィロモナス・ジンジバリスやフゾバクテリウム・ヌクレアタム等の生育阻害作用を有することから、口腔内バイオフィルム形成抑制剤、ポルフィロモナス・ジンジバリス及び／又はフゾバクテリウム・ヌクレアタムの生育阻害剤として用いることができ、う蝕予防剤、歯周病予防・治療剤及び口臭改善・予防剤としても用いることができる。 The lactic acid bacterium of the present invention is non-sucrose fermentable, hardly generates lactic acid, suppresses the growth of Streptococcus mutans, which is a caries-causing bacterium, and the formation of oral biofilm, and prevents periodontal disease and bad breath. Since it has growth inhibitory effects such as Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum, it can be used as an oral biofilm formation inhibitor, Porphyromonas gingivalis and / or Fusobacterium nucleatum growth inhibitor. It can also be used as a caries preventive agent, periodontal disease preventive / therapeutic agent and halitosis improving / preventive agent.
以下、実験例、試験例、実施例及び比較例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、下記の例において特に明記のない場合は、組成の「％」は容量％、比率は容量比を示す。 EXAMPLES Hereinafter, although an experiment example, a test example, an Example, and a comparative example are shown and this invention is demonstrated concretely, this invention is not restrict | limited to the following Example. In the following examples, unless otherwise specified, “%” in the composition represents volume%, and the ratio represents the volume ratio.
［実験例１］
ヒト口腔からの菌株分離
７名の被験者の口腔を滅菌綿棒（日本綿棒社製）でスワブし、これらをラクトバシライＭＲＳ寒天平板（日本ベクトンディッキンソン）に塗沫し、３７℃、２日間、嫌気条件（以後、嫌気条件は以下と共通；窒素：炭酸ガス：水素＝８０：１０：１０）及び好気条件で培養を行った。発生したコロニーを観察し、同一被験者の中でコロニー形態が異なるものを選定し、それぞれのコロニーを白金耳で釣菌し、再度ラクトバシライＭＲＳ平板に塗沫して分離培養を行った。これを単一コロニー形態となるまで繰り返して菌株を単離した。結果として７４菌を分離した。
[Experiment 1]
Isolation of strains from human oral cavity The oral cavity of 7 subjects was swabbed with a sterile cotton swab (manufactured by Nippon Cotton Swab Co., Ltd.), and these were smeared on a Lactobacili MRS agar plate (Nippon Becton Dickinson), and anaerobic conditions ( Thereafter, the anaerobic conditions were the same as the following: nitrogen: carbon dioxide gas: hydrogen = 80: 10: 10) and aerobic conditions. The generated colonies were observed, and those with different colony morphology were selected from the same subjects, and each colony was fished with a platinum loop, and smeared again on a Lactobacillus MRS plate and subjected to separation culture. This was repeated until a single colony form was obtained to isolate the strain. As a result, 74 bacteria were isolated.
［実験例２］
漬物からの菌株分離
家庭の漬物より、漬物周囲の固着物及び液体を採取し、ラクトバシライＭＲＳ寒天平板（日本ベクトンディッキンソン）に塗沫し、３７℃、２日間、嫌気条件及び好気条件で培養を行った。漬物としてはいわゆる野沢菜漬け、粕漬け、沢庵を用いた。発生したコロニーを観察し、同一検体の中でコロニー形態が異なるものを選定し、それぞれのコロニーを白金耳で釣菌し、再度ラクトバシライＭＲＳ平板に塗沫して分離培養を行った。これを単一コロニー形態となるまで繰り返して菌株を単離した。結果として７９菌を分離した。
[Experiment 2]
Isolation of strains from pickles Collected sticky materials and liquid around pickles from home pickles, smeared on Lactobacili MRS agar plate (Nippon Becton Dickinson), cultured at 37 ° C for 2 days under anaerobic and aerobic conditions went. As the pickles, the so-called Nozawana pickles, pickled pickles, and swabs were used. The generated colonies were observed, and those with different colony morphology were selected from the same specimens. Each colony was fished with a platinum loop, and smeared again on a Lactobacillus MRS plate for separation culture. This was repeated until a single colony form was obtained to isolate the strain. As a result, 79 bacteria were isolated.
［試験例１］
バイオフィルム形成抑制効果
上記実験例１及び２で単離した１５３菌株を、ラクトバシライＭＲＳブロス（日本ベクトンディッキンソン）で、ストレプトコッカス・ミュータンス ＡＴＣＣ２５１７５株をトッド・ヒューイット・ブロス（日本ベクトンディッキンソン）を用いて、それぞれ一日３７℃で嫌気培養した。なお、分離菌のうち好気下で分離したものも全て嫌気条件下で生育したため、全菌株を嫌気培養とした。１％のショ糖（和光純薬）を添加したトッド・ヒューイット・ブロス２ｍＬを分注した試験管に対して、乳酸菌株（菌数約１０9／ｍＬ）及びストレプトコッカス・ミュータンスの培養液（菌数約１０9／ｍＬ）を各２０μＬ添加して、３７℃・１日嫌気条件で共培養した。
培養後、試験管を生理食塩水３ｍＬで２回、非付着物を洗浄除去してから３ｍＬの生理食塩水を試験管に添加し、試験管に付着したバイオフィルムを超音波ホモジナイザー（ブランソン社製 Ｄ４０）で分散した。得られた分散液の波長５５０ｎｍの濁度により、バイオフィルム形成量を計測した。対照としてはストレプトコッカス・ミュータンス単独で培養したものを用いた。
バイオフィルム形成率（％）を、（共培養のバイオフィルム形成量）／（ストレプトコッカス・ミュータンス単独培養のバイオフィルム形成量）×１００とした。単離菌の中にストレプトコッカス・ミュータンスのバイオフィルム形成量を減少させる菌株の存在が認められ、バイオフィルム形成率を６０％以下に抑制する菌株は１５３株中２７株であった。
[Test Example 1]
Biofilm formation inhibitory effect The 153 strain isolated in the above Experimental Examples 1 and 2 is Lactobacillus MRS broth (Nippon Becton Dickinson), Streptococcus mutans ATCC25175 strain is used with Todd Hewitt Bros (Nippon Becton Dickinson), Each was anaerobically cultured at 37 ° C. each day. Since all of the isolates isolated under aerobic conditions grew under anaerobic conditions, all strains were anaerobically cultured. A test tube into which 2 mL of Todd Hewitt broth supplemented with 1% sucrose (Wako Pure Chemical Industries) was dispensed with a lactic acid bacterial strain (approximately 10 9 / mL) and Streptococcus mutans broth (About 10 9 / mL) was added, and the cells were co-cultured at 37 ° C. for 1 day under anaerobic conditions.
After culturing, the test tube was washed twice with 3 mL of physiological saline, and non-adherent substances were washed away, 3 mL of physiological saline was added to the test tube, and the biofilm attached to the test tube was subjected to ultrasonic homogenizer (Branson) D40). The amount of biofilm formed was measured from the turbidity of the obtained dispersion at a wavelength of 550 nm. As a control, one cultured with Streptococcus mutans alone was used.
The biofilm formation rate (%) was defined as (biofilm formation amount of co-culture) / (biofilm formation amount of Streptococcus mutans alone culture) × 100. Among the isolates, the presence of strains that reduce the amount of Streptococcus mutans biofilm formation was observed, and 27 strains out of 153 strains suppressed the biofilm formation rate to 60% or less.
［試験例２］
ショ糖非発酵性（ショ糖からの酸産性能）
試験例１において、バイオフィルム形成率を６０％以下に抑制した２７菌株について、ショ糖を基質とした酸産生能（ショ糖資化性）を検討した。各菌株をラクトバシライＭＲＳブロス（日本ベクトンディッキンソン）を用いて、一日３７℃で嫌気培養した。培養液（菌数約１０9／ｍＬ）４０μＬを、１％のショ糖（和光純薬）を添加したハートインフュージョンブロス（日本ベクトンディッキンソン）４ｍＬに添加して、３７℃・１日嫌気条件で培養した。
培養後のｐＨをｐＨメータ（堀場製作所：型番ＰＨ Ｆ−２１）で測定した。培養液のｐＨが５．５以上を示す菌は４株であった。
３株は主に糖類資化性を指標とする乳酸菌同定キットＡＰＩ５０ＣＨＬ（シメックス・ビオメリュー（株））を用い、専用解析ソフトＡＰＩ ＷＥＢによって同定し、１株がラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズラクティス、２株がラクトバチルス・ラムノーサスと同定され、（独）産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス ＦＥＲＭ Ｐ−２１４３６株（受託番号）、ラクトバチルス・ラムノーサス ＦＥＲＭ Ｐ−２１４３７株（受託番号）、ラクトバチルス・ラムノーサス ＦＥＲＭ Ｐ−２１４３８株（受託番号））、また１株は、「株式会社テクノスルガラボ」への委託分析により、１６ｓＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の相同性から、ラクトバチルス・カルバタスと同定され、（独）製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した（ラクトバチルス・カルバタス ＮＩＴＥ Ｐ−５６８株（受託番号））。
[Test Example 2]
Non-fermentable sucrose (acid production performance from sucrose)
In Test Example 1, acid production ability (sucrose utilization) using sucrose as a substrate was examined for 27 strains whose biofilm formation rate was suppressed to 60% or less. Each strain was anaerobically cultured at 37 ° C. a day using Lactobacillus MRS broth (Nippon Becton Dickinson). 40 μL of the culture solution (the number of bacteria: about 10 9 / mL) is added to 4 mL of Heart Infusion Broth (Nippon Becton Dickinson) supplemented with 1% sucrose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) under anaerobic conditions at 37 ° C./day. Cultured.
The pH after the culture was measured with a pH meter (Horiba, Ltd .: model number PH F-21). There were 4 strains whose pH of the culture broth was 5.5 or more.
Three strains are identified by lactic acid bacteria identification kit API50CHL (Simex Biomelieu Co., Ltd.) mainly using saccharide assimilation index, and are identified by dedicated analysis software API WEB. One strain is Lactococcus lactis subspecies lactis, 2 The strain was identified as Lactobacillus rhamnosus and deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (Lactococcus lactis subspecies lactis FERM P-21436 strain (accession number), Lactobacillus rhamnosus FERM) P-21437 strain (Accession number), Lactobacillus rhamnosus FERM P-21438 strain (Accession number)), and one strain were homologous to the DNA sequence encoding 16sRNA by consignment analysis to "Techno Surgarabo Inc." From the nature, Lactobacillus -It was identified as Carbatus and deposited at the (Japan) Product Evaluation Technology Base Organization Patent Microorganism Depositary Center (Lactobacillus carbatus NITE P-568 (accession number)).
［試験例３］
歯周病原因菌（ポルフィロモナス・ジンジバリス）及び口臭原因菌（フゾバクテリウム・ヌクレアタム）に対する生育阻害
試験例３で得られた４菌株の単離菌をラクトバシライＭＲＳ寒天平板（日本ベクトンディッキンソン）に穿刺し、３７℃・１日嫌気条件で培養した。
別にポルフィロモナス・ジンジバリス ＡＴＣＣ３３２７７株及びフゾバクテリウム・ヌクレアタム ＡＴＣＣ１０９５７株を、ヘミン（和光純薬、５００μｇ／ｍＬ）、メナジオン（和光純薬、１００μｇ／ｍＬ）を添加したトッド・ヒューイット・ブロス（日本ベクトンディッキンソン）で培養した。
上記同様にヘミン、メナジオンを添加したトッド・ヒューイット・ブロスに０．９％の寒天（細菌培養用：和光純薬）を添加してオートクレーブ後４７℃で保温したもの５ｍＬに、上記ポルフィロモナス・ジンジバリス又はフゾバクテリウム・ヌクレアタムの培養液０．５ｍＬを添加して泡立たないように速やかに攪拌して、単離菌を穿刺培養した平板に重層した。さらに３７℃・嫌気条件で１日培養した後に、単離菌を穿刺した周囲の重層菌の生育阻止円の有無を観察した。その結果、４菌株ともポルフィロモナス・ジンジバリス及びフゾバクテリウム・ヌクレアタムに対して阻止円形成が認められ、歯周病や口臭菌に対する生育阻害効果を有することが確認された。
[Test Example 3]
Growth inhibition against periodontal disease-causing bacteria (Porphyromonas gingivalis) and halitosis-causing bacteria (Fusobacterium nucleatum) The 4 isolated strains obtained in Test Example 3 were punctured on Lactobacili MRS agar plates (Nippon Becton Dickinson) The cells were cultured under anaerobic conditions at 37 ° C for 1 day.
Separately, Porphyromonas gingivalis ATCC33277 and Fusobacterium nucleatum ATCC10957 were added to hemin (Wako Pure Chemical, 500 μg / mL) and menadione (Wako Pure Chemical, 100 μg / mL). Todd Hewitt Bros (Nippon Becton Dickinson) In culture.
In the same manner as above, Tod Hewitt broth to which hemin and menadione were added, 0.9% agar (for bacterial culture: Wako Pure Chemical Industries) was added and kept at 47 ° C. after autoclaving to 5 mL of the above Porphyromonas A culture solution of gingivalis or Fusobacterium nucleatum was added in an amount of 0.5 mL, and the mixture was rapidly stirred so as not to foam, and the isolated bacteria were layered on a puncture-cultured plate. Further, after culturing for one day at 37 ° C. under anaerobic conditions, the presence or absence of a growth inhibition circle of the surrounding stratified bacteria punctured with the isolated bacteria was observed. As a result, all four strains were found to have inhibition circle formation against Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum, and confirmed to have growth inhibitory effects against periodontal disease and bad breath bacteria.
［実施例及び比較例］
上記試験例２で得られた４菌株及びこれらの菌と同種に属する公知の菌株について、上記試験例１〜３を行った。結果を下記に基づき表３に示す。
バイオフィルム形成抑制効果については、バイオフィルム形成率が３０％未満に減少したものを「◎」、３０％以上６０％以下を「○」、６０％超８０％以下を「△」、８０％超を「×」とした。
ショ糖非発酵性については、培養液ｐＨ５．５未満を「×」、５．５以上６．２未満を「○」、６．２以上を「◎」とした。
ポルフィロモナス・ジンジバリス及びフゾバクテリウム・ヌクレアタムの生育阻害は、明確な阻止円が認められないものを「×」、阻止円の直径が４ｍｍ未満を「△」、４ｍｍ以上７ｍｍ未満を「○」、７ｍｍ以上を「◎」とした。
[Examples and Comparative Examples]
With respect to the 4 strains obtained in Test Example 2 and known strains belonging to the same species as these bacteria, Test Examples 1 to 3 were performed. The results are shown in Table 3 based on the following.
Regarding the biofilm formation inhibitory effect, “◎” indicates that the biofilm formation rate has decreased to less than 30%, “◯” indicates 30% or more and 60% or less, “△” indicates more than 60% and 80% or less, and exceeds 80%. Was marked “x”.
Regarding sucrose non-fermentability, the culture solution pH of less than 5.5 was designated as “x”, 5.5 or more and less than 6.2 as “◯”, and 6.2 or more as “◎”.
The growth inhibition of Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum is “x” when no clear circle is recognized, “△” when the circle diameter is less than 4 mm, “◯” when 4 mm or more but less than 7 mm, 7 mm The above was designated as “◎”.
以上のように、ショ糖非発酵性、う蝕予防有効性の指標であるストレプトコッカス・ミュータンスを起因とするバイオフィルム形成の抑制、歯周病予防・治療の指標である、ポルフィロモナス・ジンジバリス、及び口臭改善・予防の指標である、フゾバクテリウム・ヌクレアタムの生育阻害の３項目において、本発明の４菌株は良好な結果を得たのに対し、比較例（同種に分類される公知菌）では、全項目で良好な性状を示す菌は認められなかった。なお、本実験の比較例では実施例と近縁の菌種を用いたため多くの菌のショ糖非発酵性の項が○又は◎となっているが、ラクトバチルス属又はラクトコッカス属に分類される一般的乳酸菌において、ショ糖発酵性を有する菌は少なくない。 As described above, suppression of biofilm formation caused by Streptococcus mutans, which is an indicator of sucrose non-fermentative and caries prevention effectiveness, and Porphyromonas gingivalis, an indicator of periodontal disease prevention and treatment In the three items of growth inhibition of Fusobacterium nucleatum, which is an index for improving and preventing bad breath, the four strains of the present invention obtained good results, while in the comparative example (known bacteria classified as the same species) No bacteria showing good properties were observed in all items. In addition, in the comparative example of this experiment, the sucrose non-fermentable term of many bacteria is ○ or ◎ because the bacterial species closely related to the example is used, but it is classified as Lactobacillus genus or Lactococcus genus. In general lactic acid bacteria, many bacteria have sucrose fermentability.
なお、上記乳酸菌ラクトバチルス・カルバタス ＮＩＴＥ Ｐ−５６８株を湿重量で２質量％配合した洗口剤（液）を調製して一日二回、１週間使用したところ、口臭の自覚症状改善が確認された。 In addition, the above-mentioned lactic acid bacteria Lactobacillus carbatus NITE P-568 strain containing 2% by mass of wet weight was used to prepare a mouthwash (liquid) that was used twice a day for one week. It was done.
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