JP5360663B2

JP5360663B2 - Cultured adipocytes

Info

Publication number: JP5360663B2
Application number: JP2010147429A
Authority: JP
Inventors: 真理船木
Original assignee: University of Tokushima
Current assignee: University of Tokushima
Priority date: 2010-06-29
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2030-06-29
Also published as: JP2012010600A

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an enlarged fat cell necessary for clarifying the pathology of diabetes and for screening a therapeutic agent; to provide a method for producing the same; and to utilize the enlarged fat cell. <P>SOLUTION: The enlarged fat cell maintaining insulin sensitivity can be newly produced by using a gel coated with collagen and fibronectin and having a hardness of 150 to 350 Pa as a cell-supporting substrate, adding a saturated fatty acid and culturing a fat cell. The employment of the enlarged fat cell has enabled the pathologic clarification of diabetes and the new screening method for a diabetes therapeutic agent. <P>COPYRIGHT: (C)2012,JPO&INPIT

Description

本発明は、肥大化した新たな脂肪細胞とその作製方法、その肥大化脂肪細胞を使用した糖尿病治療薬のスクリーニング方法に関するものである。 The present invention relates to a new enlarged fat cell, a production method thereof, and a screening method for a therapeutic agent for diabetes using the enlarged fat cell.

糖尿病においては、糖尿病発症の主要な原因の一つが、過食・運動不足による脂肪細胞の肥大化であると見なされている（非特許文献４）。脂肪細胞は種々のアディポカインを血中に分泌して全身のインスリン感受性に影響を与える役割を果しており、肥満で肥大化した脂肪細胞はインスリン抵抗性のトリガー（引き金）になっている。即ち、アディポネクチンなどのインスリン感受性を亢進させるアディポカイン分泌が減少し、単球走化活性化因子（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ−１、ＭＣＰ−１)などのインスリン抵抗性を増大させるアディポカイン分泌が増加していることが知られている。後者は脂肪組織に炎症細胞を遊走させ、脂肪組織を慢性炎症の状態にする。慢性炎症は、脂肪細胞からのインスリン抵抗性を増大させるアディポカイン分泌をさらに増加させる。また脂肪組織の慢性炎症は、細胞内に蓄積された中性脂肪の分解とその分解産物である遊離脂肪酸の血液中への放出を促進する。脂肪組織由来のインスリン抵抗性を増悪させるアディポカインおよび遊離脂肪酸は、肝臓や骨格筋などのインスリン標的臓器に働きかけ、これらの臓器におけるインスリン作用を阻害してインスリン抵抗性を発生させ、糖尿病発症に寄与することがよく知られている。 In diabetes, one of the main causes of diabetes is considered to be fat cell hypertrophy due to overeating and lack of exercise (Non-patent Document 4). Adipocytes secrete various adipokines into the blood and influence the sensitivity of insulin throughout the body, and fat cells that have become obese and enlarged have triggered insulin resistance. That is, adipokine secretion that enhances insulin sensitivity such as adiponectin is decreased, and adipokine secretion that increases insulin resistance such as monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1 is increased. It has been known. The latter migrates inflammatory cells into the adipose tissue, leaving the adipose tissue in a state of chronic inflammation. Chronic inflammation further increases adipokine secretion, which increases insulin resistance from adipocytes. Chronic inflammation of adipose tissue promotes the breakdown of neutral fat accumulated in cells and the release of free fatty acids, which are the breakdown products, into the blood. Adipokines and free fatty acids that exacerbate insulin resistance derived from adipose tissue work on insulin target organs such as liver and skeletal muscle, inhibit insulin action in these organs, generate insulin resistance, and contribute to the development of diabetes It is well known.

糖尿病治療薬の開発のためには、インスリン抵抗性のトリガーとなる肥満型脂肪細胞の機能異常のメカニズム解明と、各種の肥満型脂肪細胞のモデル細胞を用いた薬剤のスクリーニング方法の開発が不可欠である。しかし、生体からの初代培養脂肪細胞では、培養中に速やかに形態変化を起こし、その性質が失われてしまうことが観察されている。従って、糖尿病研究を進めるためにも、適切な脂肪細胞の培養方法と肥満型のモデル脂肪細胞の確立が望まれていた。 In order to develop antidiabetic drugs, it is essential to elucidate the mechanism of abnormal function of obese adipocytes that trigger insulin resistance and to develop drug screening methods using various obese adipocyte model cells. is there. However, it has been observed that primary cultured adipocytes from living bodies rapidly undergo morphological changes during culture and lose their properties. Therefore, in order to advance diabetes research, it has been desired to establish an appropriate adipocyte culture method and obese model adipocyte.

一方、細胞培養の分野では、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の研究伸展に伴い、再生医療を始めとする組織工学の研究が大きく進んできた（非特許文献１）。そこでは、単なる細胞培養でなく、ヒトの組織を培養で形成させるには、細胞を支える枠組みである、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と呼ばれる高分子群が重要な役割を果たしていることが明らかになってきた。細胞は、しかるべき場所や組織に存在している細胞外マトリックスを認識し、それに接着することで、細胞が本来持つ機能を発現したり、成分の異なった細胞外マトリックスの空間配置が、細胞の組織形成や機能形成を促していることが知られている。また、細胞の置かれた物理的環境の違いによって、培養された細胞の組織形態や機能が異なってくることも知られている（特許文献１，２）。
特に、細胞が周囲の細胞外マトリックスを手繰り寄せる時に、周囲の細胞外マトリックスの力学的強度を認識して、細胞の移動の方向や形態を変化させることが知られている。例えば、骨髄由来間葉系幹細胞を培養すると、骨髄同様の弾性を持つゲル上では増殖・分化が一時停止して細胞が休眠すること等が報告されている(非特許文献２)。 On the other hand, in the field of cell culture, research on tissue engineering including regenerative medicine has greatly advanced along with research and development of ES cells and iPS cells (Non-patent Document 1). It was revealed that a group of macromolecules called extracellular matrix (ECM), which is a framework that supports cells, plays an important role in forming human tissues in culture, not just cell culture. I came. The cell recognizes the extracellular matrix present in the appropriate place or tissue and adheres to it, thereby expressing the function inherent in the cell, or the spatial arrangement of the extracellular matrix with different components It is known to promote organization formation and function formation. It is also known that the tissue morphology and function of cultured cells differ depending on the physical environment in which the cells are placed (Patent Documents 1 and 2).
In particular, it is known that when cells move around the surrounding extracellular matrix, the mechanical strength of the surrounding extracellular matrix is recognized to change the direction and form of cell movement. For example, it has been reported that when bone marrow-derived mesenchymal stem cells are cultured, proliferation / differentiation is temporarily stopped on a gel having elasticity similar to that of bone marrow, and the cells are dormant (Non-patent Document 2).

脂肪細胞のモデル細胞として、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞が良く使われるが、この脂肪細胞をソフトゲル上で培養すると、インスリン応答性が増大し長期間保存されることが報告されている（非特許文献３）。このように、細胞外基質の種類と細胞支持基盤の硬度を臓器に近づけることにより、生体組織に近い培養細胞が得られることが分かってきた。また、小型脂肪細胞を肥大化した脂肪細胞に分化誘導するために、飽和天然油脂、不飽和天然油脂を使用することが報告されている（特許文献３）。この肥大脂肪細胞はPAI-1（プラスミノーゲン
アクチベイターインヒイビター１）（血栓）、TNF（腫瘍壊死因子）-α（インシュリン抵抗性）、レジスチン（インシュリン抵抗性）、FFA（遊離脂肪酸）（高脂血症）等を生成し、代謝障害を招来すると報告されている。
以上のように、目的に応じた培養脂肪細胞を得るためには、細胞支持基盤の硬さと分化誘導剤を適切に選択する必要があることが明らかとなってきた。しかし、現在においても、適切な肥満型のモデル細胞やそれを用いた糖尿病治療剤のスクリーニング方法についてはまだ充分なものはではなかった。 3T3-L1 adipocytes are often used as model cells for adipocytes, but it has been reported that when these adipocytes are cultured on a soft gel, insulin responsiveness is increased and preserved for a long time (non-patent document). 3). Thus, it has been found that cultured cells close to living tissue can be obtained by bringing the type of extracellular matrix and the hardness of the cell support base closer to the organ. In addition, it has been reported that saturated natural fats and oils and unsaturated natural fats and oils are used to induce differentiation of small fat cells into enlarged fat cells (Patent Document 3). These hypertrophic adipocytes are PAI-1 (plasminogen activator inhibitor 1) (thrombosis), TNF (tumor necrosis factor) -α (insulin resistance), resistin (insulin resistance), FFA (free fatty acid) (high fat) It has been reported to cause metabolic disorders.
As described above, in order to obtain cultured adipocytes according to the purpose, it has become clear that it is necessary to appropriately select the hardness of the cell support base and the differentiation inducer. However, even at present, there is not yet a sufficient method for screening an appropriate obese model cell and a therapeutic agent for diabetes using the same.

ＷＯ２００９／００５７６９WO2009 / 005769 ＷＯ２００９／００５７７０WO2009 / 005770 特開２００５−３２８８０６JP-A-2005-328806

現代生物科学入門、「７再生医療生物学」第５章（岩波書店、２００９年刊）Introduction to Modern Biological Sciences, Chapter 7 of “7 Regenerative Medicine Biology” (Iwanami Shoten, 2009) ＴｉｓｓｕｅＥｎｇＰａｒｔＡ１５（１）：１４７−１５４（２００９）Tissue Eng Part A 15 (1): 147-154 (2009) Ｊ．Ｍｅｄ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５６，１４２−１４９（２００９）J. et al. Med. Invest. 56, 142-149 (2009) ＪＭｅｄＩｎｖｅｓｔ．５６（３−４），８８−９２，２００９J Med Invest. 56 (3-4), 88-92, 2009 杉原甫、第１２４回日本医学会シンポジウム記録集・肥満の科学、７１−８１頁（２００４年）Sugihara Satoshi, 124th Japan Medical Society Symposium, Obesity Science, 71-81 (2004)

本発明は、飽和脂肪酸の存在下においても、内分泌機能異常を示さない新たな肥大化した脂肪細胞を提供することを目的とする。更にはこれらの脂肪細胞を用いて、インスリン抵抗性のメカニズムを解明すると共に、新たな糖尿病治療薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a new enlarged fat cell that does not exhibit abnormal endocrine function even in the presence of a saturated fatty acid. It is another object of the present invention to elucidate the mechanism of insulin resistance using these adipocytes and provide a method for screening a new therapeutic agent for diabetes.

本発明者は、既に、細胞外基質に接着する細胞は、細胞支持基盤（細胞外基質を介して細胞を保持する基盤）の硬さに応答することを見出している（特許文献１，２）。更に、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、正常脂肪組織と同じ硬さ（２５０パスカル）を持つゲル（細胞支持基盤）上で培養することにより、インスリンシグナルを増強させ、初代培養脂肪細胞と同様の糖輸送担体発現パターンを示すこと、更にはインスリン依存性4型糖輸送担体の細胞膜移行が増加することを見出した（非特許文献３）。これらのことから、本発明者は、細胞支持基盤の硬さは、体外で培養された脂肪細胞が生体内と同様の細胞機能を発揮するために重要な因子の一つであることを見出している。 The present inventor has already found that cells that adhere to the extracellular matrix respond to the hardness of the cell support base (the base that holds the cell via the extracellular matrix) (Patent Documents 1 and 2). . Furthermore, by culturing 3T3-L1 adipocytes on a gel (cell support base) having the same hardness (250 Pascal) as normal adipose tissue, the insulin signal is enhanced and sugar transport similar to that of primary cultured adipocytes It has been found that the carrier expression pattern is shown, and further, cell membrane translocation of the insulin-dependent type 4 sugar transport carrier is increased (Non-patent Document 3). From these facts, the present inventor has found that the hardness of the cell support base is one of the important factors for adipocytes cultured outside the body to exert the same cell functions as in vivo. Yes.

今回、本発明者は、上述の２５０Ｐａの硬さのゲルの上で、パルミチン酸のような飽和脂肪酸の存在下に、脂肪細胞を培養すると、脂肪細胞が肥大化するに係らず、内分泌機能異常を起こさないこと、即ちインスリン抵抗性が惹起されない（インスリン感受性が維持される）ことを見出した。これまでの知見では、肥大化した脂肪細胞では、アディポネクチンの分泌量が低下し、ＭＣＰ−１等の炎症性のサイトカインの分泌量が増大することが知られている。しかし、本発明者が作製した肥大化した脂肪細胞は、従来の知見とは異なり、肥大化していても細胞の機能（内分泌機能）は正常脂肪細胞と同等であった。
また、本発明者は、図１に示すように脂肪細胞の肥大化で生じる細胞−細胞外基質間の歪が、細胞支持基盤の硬さに依存し、影響しあって、肥大化した脂肪細胞の機能を悪化させる（インスリン抵抗性を増悪させる）ことも見出した。即ち、肥満型の脂肪組織と同様の硬さ（７５０Ｐａ）を持つゲル上で脂肪細胞を培養すると、飽和脂肪酸の有無に係わらずインスリン抵抗性が惹起された肥大化した脂肪細胞が作製できることを見出した。これらの知見から、本発明者は、図２に示されるように、ゲルの硬さと飽和脂肪酸（パルミチン酸の有無）が、肥大化した脂肪細胞の機能に大きく影響することを見出した。本発明者は、以上の知見に基き本発明を完成した。 This time, the present inventor has found that when fat cells are cultured on the above-mentioned gel having a hardness of 250 Pa in the presence of saturated fatty acids such as palmitic acid, the endocrine function abnormality occurs regardless of whether the fat cells are enlarged. That is, insulin resistance is not induced (insulin sensitivity is maintained). According to the knowledge so far, it is known that the adiponectin secretion amount decreases and the secretion amount of inflammatory cytokines such as MCP-1 increases in enlarged adipocytes. However, unlike the conventional knowledge, the enlarged adipocytes prepared by the present inventor had a function of cells (endocrine function) equivalent to that of normal adipocytes even when enlarged.
In addition, as shown in FIG. 1, the present inventor has shown that the strain between the cell and the extracellular matrix caused by fat cell hypertrophy depends on and influences the hardness of the cell support base, and the fat cells are enlarged. It has also been found that it deteriorates the function of insulin (aggravates insulin resistance). That is, it has been found that when adipocytes are cultured on a gel having the same hardness (750 Pa) as obese fat tissue, enlarged adipocytes in which insulin resistance is induced can be produced regardless of the presence or absence of saturated fatty acids. It was. From these findings, the present inventor found that the hardness of the gel and the saturated fatty acid (presence or absence of palmitic acid) greatly affect the function of enlarged fat cells, as shown in FIG. The present inventor completed the present invention based on the above findings.

即ち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）肥大化した脂肪細胞であって、
ａ）上記脂肪細胞は、飽和脂肪酸に抵抗性を示し、
ｂ）上記脂肪細胞は、肥大化する前の内分泌機能が維持されている
ことを特徴とする、肥大化した脂肪細胞。
（２）肥大化した脂肪細胞が、１００μｍ〜１５０μｍの細胞直径であることを特徴とする、上記（１）記載の肥大化した脂肪細胞。
（３）１５０〜３５０Ｐａの硬さのゲル上で肥大化した脂肪細胞であることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載の肥大化した脂肪細胞。
（４）飽和脂肪酸の存在下で培養し肥大化した脂肪細胞であることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞。
（５）飽和脂肪酸がパルミチン酸である、上記（４）に記載の肥大化した脂肪細胞。
（６）肥大化する前の内分泌機能が維持されていることが、肥大化する前の脂肪細胞のアディポネクチン、ＭＣＰ−１またはＩＬ−１２αの分泌量が、肥大した後も維持されていることである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞。
（７）肥大化する前の内分泌機能が維持されていることが、アディポネクチンに関して肥大化する前の分泌量が維持されることである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞。
（８）アディポネクチンが高分子量アディポネクチンである、上記（７）に記載の肥大化した脂肪細胞。
（９）肥大する前の内分泌機能が維持されることが、肥大化する前の脂肪細胞のＮＦκＢの発現量が維持されることである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞。
（１０）分泌量または発現量が維持されることが、肥大する前の脂肪細胞の分泌量または発現量を１として、±０．５の変動範囲にあることである、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞。
（１１）１５０〜３５０Ｐａの硬さのゲルが、コラーゲンとフィブロネクチンで被覆されていることを特徴とする、上記（３）に記載の肥大化した脂肪細胞。
（１２）ゲルの硬さが２５０Ｐａである、上記（１１）に記載の肥大化した脂肪細胞。
（１３）脂肪細胞が、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞またはヒト脂肪細胞である、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞。 That is, the gist of the present invention is as follows.
(1) enlarged fat cells,
a) the fat cells are resistant to saturated fatty acids;
b) An enlarged fat cell, wherein the adipocyte maintains an endocrine function prior to enlargement.
(2) The enlarged fat cells according to (1) above, wherein the enlarged fat cells have a cell diameter of 100 μm to 150 μm.
(3) The enlarged fat cells according to (1) or (2) above, which are fat cells enlarged on a gel having a hardness of 150 to 350 Pa.
(4) The enlarged fat cell according to any one of (1) to (3) above, wherein the fat cell is cultured and enlarged in the presence of a saturated fatty acid.
(5) The enlarged fat cell according to (4) above, wherein the saturated fatty acid is palmitic acid.
(6) The endocrine function before enlargement is maintained because the adiponectin, MCP-1 or IL-12α secretion amount of adipocytes before enlargement is maintained after enlargement. The enlarged fat cell according to any one of (1) to (5) above.
(7) The enlargement according to any one of (1) to (6) above, wherein the endocrine function before enlargement is maintained that the amount of secretion before enlargement is maintained with respect to adiponectin Fat cells.
(8) The enlarged fat cell according to (7) above, wherein the adiponectin is a high molecular weight adiponectin.
(9) The maintenance of the endocrine function before hypertrophy is that the expression level of NFκB in the adipocytes before hypertrophy is maintained, according to any one of (1) to (5) above Enlarged fat cells.
(10) The above-mentioned (1) to (1) is that the secretion amount or expression level is maintained within a variation range of ± 0.5, where 1 is the secretion amount or expression level of adipocytes before hypertrophy. The enlarged fat cell according to any one of 9).
(11) The enlarged fat cell according to (3) above, wherein a gel having a hardness of 150 to 350 Pa is coated with collagen and fibronectin.
(12) The enlarged fat cells according to (11) above, wherein the gel has a hardness of 250 Pa.
(13) The enlarged fat cell according to any one of the above (1) to (12), wherein the fat cell is a 3T3-L1 fat cell or a human fat cell.

（１４）肥大化する前の内分泌機能を維持した肥大化した脂肪細胞を作製する方法であって、
ａ）１５０〜３５０Ｐａの硬さのゲルをコラーゲンとフィブロネクチンで被覆し、
ｂ）被覆されたゲルに脂肪細胞を担持させ、
ｃ）飽和脂肪酸存在下で培養する
ことにより、肥大化する前の内分泌機能を維持した肥大化した脂肪細胞の作製方法。
（１５）肥大化した脂肪細胞が、１００μｍ〜１５０μｍの細胞直径であることを特徴とする、上記（１４）記載の肥大化した脂肪細胞の作製方法。
（１６）肥大化する前の内分泌機能を維持することが、肥大化する前のアディポネクチン、ＭＣＰ−１またはＩＬ−１２αの分泌量が維持されていることである、上記（１４）または(１５)に記載の肥大化した脂肪細胞の作製方法。
（１７）肥大化する前の内分泌機能を維持することが、肥大化する前のアディポネクチンの分泌量が維持されていることである、上記（１４）〜(１６)のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞の作製方法。
（１８）肥大化する前の内分泌機能を維持することが、肥大する前の脂肪細胞のアディポサイトカインの分泌量または発現量を１として、±０．５の変動範囲にあることである、上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞。
（１９）脂肪細胞が、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞またはヒト脂肪細胞である、上記（１４）〜
（１８）のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞の作製方法。
（２０）飽和脂肪酸がパルミチン酸である、上記（１４）〜（１９）のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞の作製方法。
（２１）ゲルの硬さが２５０Ｐａである、上記（１４）〜（２０）のいずれかに記載の肥大化した脂肪細胞の作製方法。 (14) A method for producing enlarged fat cells that maintain the endocrine function before enlargement,
a) A gel having a hardness of 150 to 350 Pa is coated with collagen and fibronectin,
b) loading the fat cells on the coated gel;
c) A method for producing enlarged fat cells by maintaining the endocrine function before enlargement by culturing in the presence of saturated fatty acids.
(15) The method for producing enlarged fat cells according to (14) above, wherein the enlarged fat cells have a cell diameter of 100 μm to 150 μm.
(16) The above (14) or (15), wherein maintaining the endocrine function before enlargement is maintaining the secretion amount of adiponectin, MCP-1 or IL-12α before enlargement 2. A method for producing enlarged fat cells according to 1.
(17) The enlargement according to any one of the above (14) to (16), wherein maintaining the endocrine function before enlargement is maintaining the secretion amount of adiponectin before enlargement Of producing adipocytes.
(18) Maintaining the endocrine function before enlargement is within a variation range of ± 0.5, where 1 is the secretion amount or expression level of adipocytokine of adipocytes before enlargement (1) The enlarged fat cells according to any one of 14) to (17).
(19) The above (14) to (14), wherein the adipocytes are 3T3-L1 adipocytes or human adipocytes
(18) The method for producing an enlarged fat cell according to any one of (18).
(20) The method for producing enlarged fat cells according to any one of (14) to (19), wherein the saturated fatty acid is palmitic acid.
(21) The method for producing enlarged fat cells according to any one of (14) to (20), wherein the gel has a hardness of 250 Pa.

（２２）６５０〜８５０Ｐａの硬さのゲルをコラーゲンとフィブロネクチンで被覆し、被覆されたゲルに脂肪細胞を担持させて培養し、インスリン抵抗性を惹起した脂肪細胞を用いて、薬剤共存下で培養することにより、脂肪細胞のアディポサイトカインの発現変動を評価することによる、糖尿病治療剤の評価方法。
（２３）アディポサイトカインが、アディポネクチン、ＭＣＰ−１またはIL-12αである、上記（２２）記載の糖尿病治療剤の評価方法。
（２４）薬剤と共に飽和脂肪酸が添加されている、上記（２２）または（２３）に記載の糖尿病治療剤の評価方法。
（２５）飽和脂肪酸がパルミチン酸である、上記（２２）〜（２４）のいずれかに記載の糖尿病治療剤の評価方法。 (22) A gel having a hardness of 650 to 850 Pa is coated with collagen and fibronectin, and the coated gel is cultured with adipocytes supported, and cultured in the presence of a drug using fat cells that have induced insulin resistance. A method for evaluating a therapeutic agent for diabetes, by evaluating changes in the expression of adipocytokines in adipocytes.
(23) The method for evaluating a therapeutic agent for diabetes according to the above (22), wherein the adipocytokine is adiponectin, MCP-1 or IL-12α.
(24) The method for evaluating a therapeutic agent for diabetes according to (22) or (23), wherein a saturated fatty acid is added together with the drug.
(25) The method for evaluating a therapeutic agent for diabetes according to any one of (22) to (24), wherein the saturated fatty acid is palmitic acid.

本発明の脂肪細胞は、肥大化しているものの、内分泌機能は肥大化する前の脂肪細胞と同じ程度に維持されていると言う特徴をもった脂肪細胞である。本発明の脂肪細胞は、飽和脂肪酸の存在下でもインスリン感受性亢進因子（アディポネクチン等）を持続的に分泌できることから、糖尿病の病態生理の解明のターゲット細胞として重要であり、本発明の脂肪細胞を用いて解明された病態生理のメカニズムから、新たな糖尿病治療薬のスクリーニングの試剤として有用である。 Although the fat cells of the present invention are enlarged, the endocrine function is an adipocyte characterized by being maintained at the same level as the fat cells before enlargement. The adipocytes of the present invention are important as target cells for elucidating the pathophysiology of diabetes because they can secrete insulin sensitivity-enhancing factors (such as adiponectin) continuously even in the presence of saturated fatty acids. Therefore, it is useful as a screening agent for screening new therapeutic drugs for diabetes.

飽和脂肪酸によるインスリン抵抗性の誘導メカニズムの概念図である。It is a conceptual diagram of the induction mechanism of insulin resistance by a saturated fatty acid. 本発明の脂肪細胞の培養において、使用するゲルの硬さの相違による、脂肪細胞のアディポサイトカイン等の分泌と発現が変化する様子を図示した概略図である。即ち、パルミチン酸の添加、無添加の影響を表わした、以下の図４〜図１２の結果をまとめて図示した概略図である。FIG. 3 is a schematic diagram illustrating how secretion and expression of adipocytokines and the like of adipocytes are changed due to differences in hardness of gels used in the cultivation of adipocytes of the present invention. That is, FIG. 13 is a schematic view illustrating the effects of the addition and non-addition of palmitic acid together with the results of FIGS. 肥満モデルマウス（Ｚｕｃｋｅｒマウス）における、痩せ型マウスの脂肪組織の硬さと肥満型マウスの脂肪組織の硬さを測定した結果を表わした図である。It is a figure showing the result of having measured the hardness of the fat tissue of a lean type mouse | mouth, and the hardness of the fat tissue of an obese type mouse | mouth in an obesity model mouse (Zucker mouse). パルミチン酸存在下で３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞を培養した際に、ゲルの硬さの相違によって生じる、脂肪細胞内に蓄積されるトリグリセリド（ＴＧ）量の変化を表わした図である。It is a figure showing the change of the amount of triglycerides (TG) accumulate | stored in a fat cell which arises by the difference in the hardness of a gel, when 3T3-LI adipocyte is cultured in presence of a palmitic acid. パルミチン酸存在下で３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞を培養した際に、ゲルの硬さの相違によって生じる、肥大化した脂肪細胞のサイズの変化を表わした図である。It is a figure showing the change of the size of the enlarged fat cell which arises by the difference in the hardness of a gel, when 3T3-LI fat cells are cultured in presence of palmitic acid. パルミチン酸存在下で３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞を培養した際に、ゲルの硬さの相違によって生じる、脂肪細胞内の炎症関連因子（ＩκＢα、ｐ６５）の変化を表わした電気泳動の図（写真）である。An electrophoretic diagram (photograph) showing changes in inflammation-related factors (IκBα, p65) in fat cells caused by differences in gel hardness when 3T3-LI adipocytes are cultured in the presence of palmitic acid. is there. パルミチン酸存在下で３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞を培養した際に、ゲルの硬さの相違によって生じる、脂肪細胞内の遺伝子発現の変化を整理した表である。７５０／２５０とは、パルミチン酸の存在しない中でのゲルの硬さの相違（７５０Ｐａ／２５０Ｐａ）による遺伝子の変動比である。２５０Ｐａ／２５０とは、同じ硬さのゲル（２５０Ｐａ）を使用し、パルミチン酸の有無で生じる遺伝子の変動比である。７５０Ｐａ／７５０の意味も上記と同様である。It is the table | surface which arranged the change of the gene expression in an adipocyte which arises by the difference in the hardness of a gel when 3T3-LI adipocyte was cultured in presence of a palmitic acid. 750/250 is a variation ratio of genes due to a difference in gel hardness (750 Pa / 250 Pa) in the absence of palmitic acid. 250 Pa / 250 is a variation ratio of genes generated by the presence or absence of palmitic acid using a gel (250 Pa) having the same hardness. The meaning of 750 Pa / 750 is the same as above. パルミチン酸存在下で３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞を培養した際に、ゲルの硬さの相違によって生じる、脂肪細胞内の遺伝子発現の変化を整理した表である。７５０／２５０等の表記は、図７と同じ内容を意味する。It is the table | surface which arranged the change of the gene expression in an adipocyte which arises by the difference in the hardness of a gel when 3T3-LI adipocyte was cultured in presence of a palmitic acid. The notation such as 750/250 means the same contents as FIG. パルミチン酸存在下で３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞を培養した際に、ゲルの硬さの相違によって生じる、３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞からの全アディポネクチン分泌量の変化を表わした図である。併せて、パルミチン酸が添加されていない場合のアディポネクチン分泌量の変化も併記されている。全アディポネクチンの分泌量は、ゲルの硬さに影響されることが示されている。It is a figure showing the change of the total adiponectin secretion amount from 3T3-LI fat cells which arises by the difference in the hardness of a gel when 3T3-LI fat cells are cultured in presence of palmitic acid. In addition, changes in adiponectin secretion when no palmitic acid is added are also shown. It has been shown that the amount of total adiponectin secretion is affected by the hardness of the gel. パルミチン酸を添加せずに３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞を培養した際に、ゲルの硬さの相違によって生じる、３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞からの高分子量アディポネクチン分泌量の変化を表わした図である。It is a figure showing the change of the high molecular weight adiponectin secretion amount from 3T3-LI fat cells which arises by the difference in the hardness of a gel, when 3T3-LI fat cells are cultured without adding palmitic acid. パルミチン酸の添加、無添加の両方の場合、３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞を培養した際に、ゲルの硬さの相違によって生じる、脂肪細胞からの高分子量アディポネクチン分泌量の変化を表わした図である。It is a figure showing the change of the high molecular weight adiponectin secretion amount from an adipocyte which arises by the difference in the hardness of a gel, when 3T3-LI adipocyte is culture | cultivated in both the addition of palmitic acid, and non-addition. パルミチン酸の添加、無添加の両方の場合、３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞を培養した際に、ゲルの硬さの相違によって生じる、脂肪細胞からのＭＣＰ−１分泌量の変化を表わした図である。ＭＣＰ−１の分泌量は、アディポネクチンの場合と異なり、パルミチン酸の添加の影響を大きく受けることを表わしている。It is a figure showing the change of the amount of MCP-1 secretion from a fat cell which arises by the difference in the hardness of a gel, when a 3T3-LI fat cell is culture | cultivated in both the addition of palmitic acid, and non-addition. Unlike the case of adiponectin, the amount of MCP-1 secretion is greatly influenced by the addition of palmitic acid. 図４〜図１２の結果をまとめた図２を簡略化し、炎症性アディポカインの発現が増強される要因を表わした図である。まず、脂肪組織の線維化などの際に見られる細胞支持基盤の硬さの増加が影響し、炎症性アディポカインであるＭＣＰ−1の分泌やＮＦκＢの発現が増大することを表わしている。更にパルミチン酸が添加されることで（(＋)ＰＡ）、細胞が肥大する際に生じる細胞−細胞外基質間の歪み（ｓｔｒｅｓｓ）とトール・ライク・リセプター（ＴＬＲ）関与の影響が出て、ＭＣＰ−1やＮＦκＢ等の炎症性アディポカインの発現が増強されることを表わしている。It is the figure which simplified the FIG. 2 which put together the result of FIGS. 4-12, and represented the factor by which the expression of inflammatory adipokine is enhanced. First, it shows that the increase in the hardness of the cell support base observed during fibrosis of adipose tissue affects the secretion of inflammatory adipokine MCP-1 and the expression of NFκB. Furthermore, by adding palmitic acid ((+) PA), the influence of cell-to-extracellular matrix stress (trest) and toll-like receptor (TLR) involvement that occur when cells enlarge, This indicates that the expression of inflammatory adipokines such as MCP-1 and NFκB is enhanced. 図１３の結果を、脂肪細胞内のシグナル情報の伝達メカニズムで整理して表わした概念図である。It is the conceptual diagram which arranged and represented the result of FIG. 13 with the transmission mechanism of the signal information in an adipocyte.

−本発明の第１態様―
本発明の第１の態様は肥大した脂肪細胞に関するものである。
本発明の「肥大した脂肪細胞」とは、中性脂肪の貯蔵を行なって肥大化した成熟脂肪細胞のことを言う。非特許文献５の記載によれば、肥大した脂肪細胞の細胞直径は、１００μｍ以上であり、最大でも１３０〜１４０μｍである。一方、通常の脂肪細胞（ＢＭＩ２０〜２２の普通体重者）の細胞直径は、７０〜９０μｍであった。このように、通常の脂肪細胞と肥大化した脂肪細胞では、細胞直径が顕著に異なっている。また、形態的にも、肥大化した脂肪細胞では、細胞が多面体の形状を取るが、通常の脂肪細胞では、脂肪細胞は球形で細胞相互間に隙間があり、例えばぶどう型の形状を示している。本発明においても、肥大化した脂肪細胞の細胞直径として、１００〜１５０μｍを挙げることができる。好ましくは１００〜１４０μｍを挙げることができ、更に好ましくは、１００〜１３０μｍを挙げることができる。
本発明の「脂肪細胞」とは、例えばマウス線維芽細胞由来の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞、Ｚｕｃｋｅｒ肥満マウス脂肪細胞、ヒト脂肪細胞のことを挙げることができる。
本発明の「飽和脂肪酸」とは、飽和高級脂肪酸のことを言い、例えば、パルミチン酸、ラウリン酸等の炭素数１２以上の飽和脂肪酸を挙げることができる。好ましいものとしては、パルミチン酸を挙げることができる。
本発明の「飽和脂肪酸に抵抗性を示す」とは、脂肪細胞が存在する環境（培養条件等）の中に、飽和脂肪酸が存在しても、脂肪細胞の内分泌機能が余り変化しないことを言う。即ち、飽和脂肪酸が存在し、脂肪細胞が肥大化しても、肥大化する前の内分泌機能が維持されることを言う。 -First aspect of the present invention-
The first aspect of the present invention relates to enlarged fat cells.
The “hypertrophic adipocytes” of the present invention refers to mature adipocytes that are enlarged by storing neutral fat. According to the description in Non-Patent Document 5, the cell diameter of the enlarged fat cells is 100 μm or more, and is 130 to 140 μm at the maximum. On the other hand, the cell diameter of normal fat cells (normal body weight of BMI 20-22) was 70-90 μm. Thus, the cell diameter is significantly different between normal fat cells and enlarged fat cells. In addition, morphologically, fat cells that are enlarged have a polyhedral shape, but in normal fat cells, the fat cells are spherical and have gaps between them, such as a grape shape. Yes. Also in this invention, 100-150 micrometers can be mentioned as a cell diameter of the enlarged fat cell. Preferably 100-140 micrometers can be mentioned, More preferably, 100-130 micrometers can be mentioned.
Examples of the “adipocytes” in the present invention include mouse fibroblast-derived 3T3-L1 adipocytes, Zucker obese mouse adipocytes, and human adipocytes.
The “saturated fatty acid” in the present invention means a saturated higher fatty acid, and examples thereof include saturated fatty acids having 12 or more carbon atoms such as palmitic acid and lauric acid. Preferable examples include palmitic acid.
“Resistant to saturated fatty acid” in the present invention means that the endocrine function of adipocytes does not change much even in the presence of saturated fatty acids in the environment where adipocytes exist (culture conditions, etc.). . In other words, even when saturated fatty acids are present and fat cells are enlarged, the endocrine function before enlargement is maintained.

本発明の「肥大化する前の内分泌機能が維持されている」とは、脂肪細胞においてアディポネクチン、レプチンなどのインスリン感受性を亢進させるアディポカインの分泌が、肥大化する前の脂肪細胞と同じ程度に維持されており、単球走化活性因子（ＭＣＰ−１）、ＩＬ−１２α、ＴＮＦ−α、ＰＡＩ−１、レジスチンなどのインスリン抵抗性を増大させるアディポカインの分泌が、肥大化する前の脂肪細胞のように低く抑制されていることを言う。
また、別の表現をすれば、「肥大化する前の内分泌機能が維持されている」とは、肥大する前の脂肪細胞のアディポサイトカインの分泌量または発現量を１として、±０．５の変動範囲にあることを表わすものである。即ち、本発明の「肥大化する前のアディポネクチン、ＭＣＰ−１またはＩＬ−１２αの分泌量が、肥大した後も維持されている」とは、図７と図８の「２５０ＰＡ／２５０」の項目に示されるように、アディポネクチンの場合、パルミチン酸の存在下の方が、１．３倍分泌が高くなっている。ＭＣＰ−１では０．６倍に分泌が抑制され、ＩＬ−１２αでは１．１倍と分泌がほぼ変わらない状態であった。
それ故、「内分泌機能が維持されている」好ましい範囲とは、例えばアディポネクチンなどのインスリン感受性を亢進させるアディポカインの場合には、分泌量がほぼ同じか、あるいは３割ほど増加減少する範囲のものを言う。また、ＭＣＰ−１やＩＬ−１２αなどのインスリン抵抗性を増大させるアディポカインの場合には、分泌量がほぼ同じか、低下しているものを言う。なお、図７と図８の「２５０ＰＡ／２５０」とは、ゲルの硬さが２５０Ｐａのものを用いて、パルミチン酸が存在する場合、しない場合での分泌量の変動比較を行なった結果を表わしている。
なお、一般に、肥大した脂肪細胞からは、上記のインスリン抵抗性を増大させるアディポカインや遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が多量に産生されることが知られている。このうちＴＮＦ−α、レジスチン、ＦＦＡは、骨格筋や肝臓でインスリンの情報伝達を障害し，インスリン抵抗性を惹起することが知られている。
本発明の「ゲル」とは、細胞培養における細胞支持基盤である細胞外マトリックスのことを言い、２次元培養系または３次元培養系に使用される公知の培養基材を使用することができる。例えば特許文献１や２、非特許文献２に記載の方法で作製されたポリアクリル酸アミドゲル、市販のチオール化ヒアルロン酸ゲル（www.glycosan.comを参照）等の樹脂、例えばポリアミド・ナノファイバー、多孔質のポリビニルフォーマル（ＰＶＦ）樹脂等を挙げることができる。なお、ゲルの硬さは、公知の方法で測定することができ、例えば特許文献１や２、非特許文献２に記載の測定方法でゲルの硬さを評価することができる。 In the present invention, “the endocrine function before enlargement is maintained” means that the secretion of adipokine that enhances insulin sensitivity such as adiponectin and leptin in fat cells is maintained at the same level as that of fat cells before enlargement. The secretion of adipokines that increase insulin resistance, such as monocyte chemotactic factor (MCP-1), IL-12α, TNF-α, PAI-1, resistin, etc. Say that it is suppressed so low.
In other words, "the endocrine function before enlargement is maintained" means that the adipocyte cytokine adipocytokine secretion or expression level before enlargement is 1, ± 0.5 It represents that it is in the fluctuation range. That is, “the secretion amount of adiponectin, MCP-1 or IL-12α before enlargement is maintained even after enlargement” in the present invention is “item 250 PA / 250” in FIGS. 7 and 8. As shown in the figure, in the case of adiponectin, secretion in the presence of palmitic acid is 1.3 times higher. In MCP-1, secretion was suppressed 0.6 times, and in IL-12α, secretion was almost unchanged at 1.1 times.
Therefore, the preferable range in which the endocrine function is maintained is, for example, in the case of adipokines that increase insulin sensitivity, such as adiponectin, the range in which the secretion amount is almost the same or increases or decreases by about 30%. say. In addition, in the case of adipokines that increase insulin resistance such as MCP-1 and IL-12α, the secretion amount is almost the same or decreased. “250PA / 250” in FIG. 7 and FIG. 8 represents the result of comparison of fluctuations in secretion amount in the presence and absence of palmitic acid using gel having a hardness of 250 Pa. ing.
In general, it has been known that adipokines and free fatty acids (FFA) that increase the above-mentioned insulin resistance are produced in large quantities from enlarged adipocytes. Among these, TNF-α, resistin, and FFA are known to impair insulin signal transmission in skeletal muscles and liver and to induce insulin resistance.
The “gel” of the present invention refers to an extracellular matrix that is a cell support base in cell culture, and a known culture substrate used in a two-dimensional culture system or a three-dimensional culture system can be used. For example, a resin such as a polyacrylic acid amide gel or a commercially available thiolated hyaluronic acid gel (see www.glycosan.com) prepared by the methods described in Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 2, such as polyamide nanofibers, Examples thereof include a porous polyvinyl formal (PVF) resin. In addition, the hardness of a gel can be measured by a well-known method, for example, the hardness of a gel can be evaluated by the measuring method of patent documents 1 and 2, and nonpatent literature 2.

本発明の「脂肪細胞を担持させ（る）」とは、２次元培養系または３次元培養系の被覆されたゲル（細胞支持基盤）に脂肪細胞を播種するか、包埋させることを言う。
本発明の「１５０〜３５０Ｐａの硬さのゲル」とは、ＢＭＩが２０〜２２の普通体重者の脂肪組織と同じ硬さを持つゲル（細胞外マトリックス）のことである。なお、脂肪組織の硬さは、通常の脂肪組織と肥満の脂肪組織の間には差があるが、同じ通常脂肪組織においては、ヒトと実験動物(ラット)の間には大差がない状況である。例えば実施例１に示されるように、通常の脂肪組織では、脂肪組織の硬さが約２５０Ｐａであり、肥満型の肥大化した脂肪細胞では約７５０Ｐａであった。
本発明の「コラーゲン」とは、例えばＩ〜VI型のコラーゲンを挙げることができる。好ましいものとしては、Ｉ型コラーゲン又は６型コラーゲンを挙げることができる。
本発明の「ゲルをコラーゲンとフィブロネクチンで被覆する」とは、特許文献１や２、非特許文献２に記載のように、例えばポリアクリルアミドゲルの表面にコラーゲンとフィブロネクチンを結合させることを言う。 In the present invention, “loading a fat cell” refers to seeding or embedding a fat cell on a coated gel (cell support base) of a two-dimensional culture system or a three-dimensional culture system.
The “gel having a hardness of 150 to 350 Pa” of the present invention is a gel (extracellular matrix) having the same hardness as that of an adipose tissue of a normal weight person having a BMI of 20 to 22. It should be noted that the hardness of adipose tissue is different between normal adipose tissue and obese adipose tissue, but in the same normal adipose tissue there is no significant difference between humans and experimental animals (rats). is there. For example, as shown in Example 1, in a normal adipose tissue, the hardness of the adipose tissue was about 250 Pa, and in an obese-type enlarged fat cell, it was about 750 Pa.
Examples of the “collagen” of the present invention include I-VI type collagen. Preferable examples include type I collagen and type 6 collagen.
“Coating a gel with collagen and fibronectin” in the present invention refers to binding collagen and fibronectin to the surface of a polyacrylamide gel, for example, as described in Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 2.

−本発明の第２態様―
本発明の第２の態様は本発明の肥大化した脂肪細胞（特にインスリン抵抗性を持つもの）を用いる、糖尿病治療剤の評価方法に関するものである。
本発明の「６５０〜８５０Ｐａの硬さのゲル」とは、ヒト又はラットの肥満した脂肪細胞組織の硬さのことを言う。前述するように、肥満した脂肪組織の硬さは、特許文献１や２、非特許文献２に記載の測定方法で評価することができる。例えば実施例１で示すように、肥満した脂肪細胞の硬さは、約７５０Ｐａである。
本発明の「アディポサイトカインの発現変動」とは、培養系中に添加されている薬効成分の影響を受けて、肥満型脂肪細胞が分泌するアディポサイトカインの種類と分泌量が変化することを言う。アディポサイトカインの発現変動は、汎用のサイトカインの定量方法を用いて行なうことができる。
なお、本発明の第１態様と共通する用語は、同じ意味を表わす。 -Second aspect of the present invention-
The second aspect of the present invention relates to a method for evaluating a therapeutic agent for diabetes using the enlarged fat cells of the present invention (particularly those having insulin resistance).
The “gel having a hardness of 650 to 850 Pa” in the present invention refers to the hardness of obese adipocyte tissue of a human or rat. As described above, the hardness of obese adipose tissue can be evaluated by the measurement methods described in Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 2. For example, as shown in Example 1, the hardness of obese adipocytes is about 750 Pa.
The “variation in the expression of adipocytokines” in the present invention means that the type and amount of adipocytokines secreted by obese adipocytes change under the influence of medicinal ingredients added in the culture system. Variation in the expression of adipocytokine can be performed using a general-purpose cytokine quantification method.
Terms common to the first aspect of the present invention have the same meaning.

次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is further demonstrated, this invention is not limited to these.

(実施例１)ツッカー肥満ラットの脂肪細胞組織の硬さの評価
ａ）方法
ツッカー（Ｚｕｃｋｅｒ）非肥満ラットと肥満ラットからそれぞれ脂肪組織を採取し、特許文献１や２の方法で、採取した脂肪組織の硬さを評価した。
ｂ）結果
図３に示されるように、非肥満ラットの脂肪細胞組織の硬さは平均約２５０Ｐａであり、肥満ラットの脂肪組織の硬さは平均約７５０Ｐａであることが明らかとなった。
(Example 1) Evaluation of hardness of fat cell tissue of Zucker obese rat a) Method Adipose tissue was collected from Zucker non-obese rat and obese rat, respectively, and the fat collected by the methods of Patent Documents 1 and 2 Tissue hardness was evaluated.
b) Results As shown in FIG. 3, it was revealed that the adipose tissue hardness of non-obese rats averaged about 250 Pa, and the adipose tissue hardness of obese rats averaged about 750 Pa.

（実施例２）培養系の相違（ゲルの硬さの相違）による３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でのトリグリセリド蓄積効果の変化
ａ）ポリアクリルアミドゲル（ソフトゲル）の作製
非特許文献２と３の方法に順じて作成される。例えば、２５０Ｐａソフトゲル用としては、ガラス製カバースリップの表面で、３．０％アクリル酸アミドと０．２％ビスアクリル酸アミドの溶液に、０．１ｍｇ／ｍｌラット尾部コラーゲン１型と０．０２ｍｇ／ｍｌヒト・フィブロネクチンを混合して、Ｎ−コハク酸イミドを用いてゲル表面を架橋する。このガラス製カバースリップをラット尾部コラーゲン１型とヒト・フィブリノーゲンの溶液で１時間浸漬し、表面を細胞外マトリックス・リガンドで被覆した。
ｂ）細胞培養
Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，２４，７５６７−７５７７（２００４）の方法に準じて行なわれる。例えば、３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞が１０％ＣＳが添加されたＤＭＥＭ培地で２日間培養され、コンフルエントにする。培養細胞をソフトゲルに撒き、４８時間培養する。培養培地は、ＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭＩＢＭＸ、１μＭデキサメタゾン、１．７μＭインスリンを含んでいる。その後、培養細胞を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で７−９日間培養する。その間、培地は毎日交換した。
ｃ）結果
４００ｍＭパルミチン酸を含有する培地と含有しない培地を用いて、２４時間の培養を行い、結果を比較した。図４に示されるように、細胞支持基盤(ゲル)の弾性が２５０Ｐａの場合に、脂肪細胞のトリグリセライド蓄積量が顕著に高いことを見出した。
なお、培養脂肪細胞の形態的にも、細胞のサイズが肥大している様子が伺える。図５に示されるようにパルミチン酸の添加を中止しても、脂肪細胞のサイズが増加して行くことが見出された。
以上の培養細胞の挙動は、糖尿病初期の白色脂肪細胞の挙動とほとんど同じものである。それ故、ゲルの硬さが２５０Ｐａの細胞支持基盤で培養された３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞は、糖尿病初期の白色脂肪細胞のモデルとして使用できることが見出された。
(Example 2) Change in triglyceride accumulation effect in 3T3-L1 adipocytes due to difference in culture system (difference in gel hardness) a) Preparation of polyacrylamide gel (soft gel) Created sequentially. For example, for 250 Pa soft gel, 0.1 mg / ml rat tail collagen type 1 and 0. 0% in a solution of 3.0% acrylic amide and 0.2% bisacrylic amide on the surface of a glass coverslip. 02 mg / ml human fibronectin is mixed and the gel surface is cross-linked using N-succinimide. This glass coverslip was immersed in a rat tail collagen type 1 and human fibrinogen solution for 1 hour, and the surface was coated with an extracellular matrix ligand.
b) Cell culture Mol. Cell Biol. 24, 7567-7777 (2004). For example, 3T3-L1 fibroblasts are cultured in DMEM medium supplemented with 10% CS for 2 days to confluence. The cultured cells are plated on a soft gel and cultured for 48 hours. The culture medium contains 10% FBS, 0.5 m MIBMX, 1 μM dexamethasone, 1.7 μM insulin in DMEM medium. Thereafter, the cultured cells are cultured for 7-9 days in DMEM medium containing 10% FBS. Meanwhile, the medium was changed every day.
c) Results Culture was performed for 24 hours using a medium containing 400 mM palmitic acid and a medium containing no 400 mM palmitic acid, and the results were compared. As shown in FIG. 4, when the elasticity of the cell support base (gel) was 250 Pa, it was found that the amount of triglyceride accumulated in adipocytes was remarkably high.
In addition, it can be seen that the size of the cultured fat cells is enlarged. As shown in FIG. 5, it was found that the adipocyte size increased even when the addition of palmitic acid was stopped.
The behavior of the above cultured cells is almost the same as that of white adipocytes in early diabetes. Therefore, it was found that 3T3-L1 adipocytes cultured on a cell support base with a gel hardness of 250 Pa can be used as a model for white adipocytes in early diabetes.

(実施例３)パルミチン酸の添加培養により惹起される、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞での炎症性応答に対する細胞支持基盤の硬さの効果
ａ）方法
特許文献１と２、非特許文献２と３の方法に準じて、各種の硬さを持つポリアクリル酸アミドゲル上での培養系を作製し、効果を評価した。培地にパルミチン酸またはＬＰＳの添加、無添加のものを作製して培養し、１００Ｐａ、２５０Ｐａ、７５０Ｐａ、５×１０^４の硬さのゲル、ガラスを細胞外マトリックスとして用いて、それぞれの硬さがどのように影響するかを検討した。ＩκＢα、ｐ６５の発現評価に関しては、文献の方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９，Ｎｏ．４０，４１２９４−４１３０１（２００４））に準じて行なった。
ｂ）結果
図６で示されるように、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞に対するパルミチン酸またはＬＰＳの効果は、細胞支持基盤が硬いほど、影響が出る傾向が見られた。逆に、硬さが少なくなるほど、パルミチン酸またはＬＰＳの影響が弱くなり、例えば２５０Ｐａのゲルでは、パルミチン酸が添加されていても、炎症性応答が起こりにくくなっていた。即ち、ＮＦκＢのシグナル伝達にあまり影響を与えないことが分かった。
(Example 3) Effect of hardness of cell support base on inflammatory response in 3T3-L1 adipocytes caused by addition culture of palmitic acid a) Method Patent Documents 1 and 2, Non-Patent Documents 2 and 3 According to the method, a culture system on polyacrylic acid amide gel having various hardnesses was prepared, and the effect was evaluated. A medium with or without palmitic acid or LPS was prepared and cultured, and the hardness of each of the gels and glasses of 100 Pa, 250 Pa, 750 Pa, 5 × 10 ⁴ was used as the extracellular matrix. We examined how it affected. The expression evaluation of IκBα and p65 was performed according to a literature method (J. Biol. Chem., 279, No. 40, 41294-41301 (2004)).
b) Results As shown in FIG. 6, the effect of palmitic acid or LPS on 3T3-L1 adipocytes tended to be affected as the cell support base was harder. Conversely, as the hardness decreases, the influence of palmitic acid or LPS becomes weaker. For example, in a 250 Pa gel, an inflammatory response is less likely to occur even when palmitic acid is added. That is, it was found that the signal transduction of NFκB is not significantly affected.

(実施例４)パルミチン酸の添加培養により惹起される、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における発現遺伝子に対する細胞支持基盤の硬さの効果
ａ）方法
実施例３の培養系の内、２５０Ｐａと７５０Ｐａの培養系で得られた脂肪細胞を用いて、それぞれの細胞内の発現遺伝子をマイクロアレイ方法により検討評価した。
それぞれの細胞からの遺伝子の単離操作等は、実施例３の方法に準じて行った。また、マイクロアレイによる、発現遺伝子の変動確認は、公知の汎用手段で行なった。
ｂ）結果
図７と図８で示されるように、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における、パルミチン酸の添加の有無による効果は、ゲル（細胞外マトリックス基盤）の硬さが２５０Ｐａと７５０Ｐａで変化すると、遺伝子発現が影響を受けることが示された。なお、「７５０／２５０」の項目は、パルミチン酸が存在しない場合におけるゲル硬さの影響を示している。７５０Ｐａで培養された３Ｔ３−Ｌ１細胞と２５０Ｐａで培養された３Ｔ３−Ｌ１細胞を比較すると、７５０Ｐａの場合に、ＭＣＰ−１とＩＬ−１２αの発現量が２．５倍増加していることが分かった。「２５０Ｐａ／２５０」の項目は、２５０Ｐａの硬さのゲルを使用し、パルミチン酸の存在の有無で、どのように遺伝子発現が変動するかを見たものである。また、「７５０Ｐａ／７５０」の項目も、上記と同様に、７５０Ｐａの硬さのゲルを使用し、パルミチン酸の存在の有無で、どのように遺伝子発現が変動するかを見たものである。
これらの遺伝子発現の変動をまとめると、図７に示されるように、ゲルの硬さが硬くなると、幾つかのアディポカインに関して炎症性の応答が認められるようになった。即ち、パルミチン酸の添加の有無に関わらず、７５０Ｐａの方がＭＣＰ−１とＩＬ−１２αの分泌量が高いことが示された。
図８に示されるように、ゲルの硬さが硬くなると、パルミチン酸の添加により、コラーゲンレセプターの発現が減少したが、フィブロネクチン（ＦＮ）リセプターの発現は増大した。 (Example 4) Effect of hardness of cell support base on gene expressed in 3T3-L1 adipocytes induced by addition culture of palmitic acid a) Method Among culture systems of Example 3, 250 Pa and 750 Pa culture systems Using the adipocytes obtained in the above, the expressed genes in each cell were examined and evaluated by the microarray method.
The operation of isolating genes from each cell was performed according to the method of Example 3. In addition, the variation of the expressed gene by microarray was confirmed by a known general-purpose means.
b) Results As shown in FIG. 7 and FIG. 8, the effect of the addition or absence of palmitic acid in 3T3-L1 adipocytes is that the gel (extracellular matrix base) hardness changes between 250 Pa and 750 Pa. Expression was shown to be affected. The item “750/250” indicates the influence of gel hardness when palmitic acid is not present. When comparing 3T3-L1 cells cultured at 750 Pa and 3T3-L1 cells cultured at 250 Pa, it was found that the expression levels of MCP-1 and IL-12α were increased 2.5-fold at 750 Pa. It was. The item “250 Pa / 250” shows how gene expression varies depending on the presence or absence of palmitic acid using a gel with a hardness of 250 Pa. The item “750 Pa / 750” also shows how gene expression varies depending on the presence or absence of palmitic acid using a gel having a hardness of 750 Pa, as described above.
Summarizing these variations in gene expression, as shown in FIG. 7, when the hardness of the gel was increased, an inflammatory response was observed for some adipokines. That is, it was shown that the secretion amount of MCP-1 and IL-12α was higher at 750 Pa regardless of whether palmitic acid was added.
As shown in FIG. 8, when the gel hardness was increased, the expression of the collagen receptor was decreased by the addition of palmitic acid, but the expression of the fibronectin (FN) receptor was increased.

(実施例５)パルミチン酸の添加培養により惹起される、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞から分泌されるアディポネクチンの分泌量に対する細胞支持基盤の硬さの効果
ａ）方法
実施例３の方法により、１００Ｐａ、２５０Ｐａ、７５０Ｐａ、５×１０^４の硬さのゲルおよびガラスを細胞支持基盤とする培養系を作製し、３Ｔ３−Ｌ１培養脂肪細胞にもたらす、パルミチン酸の添加の有無とゲルの硬さの影響を評価した。
アディポネクチンの分泌量は市販のＥＬＩＺＡキット（大塚製薬製、積水工業製）により、培地に分泌された全アディポネクチン量と高分子量アディポネクチン量を測定した。
ｂ）結果
図９に示されるように、培養脂肪細胞の全アディポネクチンの分泌量は、細胞外マトリックスの硬さを横軸に取ると、２５０Ｐａと７５０Ｐａの範囲でピークを示すベル型の曲線を示した。しかし、アディポネクチンの分泌量は、細胞支持基盤の硬さに依存し、パルミチン酸の添加の有無には余り依存しないことが示された。
更に、分泌されたアディポネクチンの中に存在する、高分子量アディポネクチンの量を測定したところ、図１０に示されるように、２５０Ｐａと７５０Ｐａの範囲でピークを示すベル型の曲線を示した。しかし、２５０Ｐａの硬さを持つ細胞外マトリックス基盤で培養された脂肪細胞が、最も多く高分子量アディポネクチンを分泌していることが示された。
また、パルミチン酸の添加の有無で、高分子量アディポネクチンの分泌量にどのような影響が出るかを検討した。その結果、図１１に示されるように、パルミチン酸の添加の有無は、高分子量アディポネクチンの分泌にあまり影響を与えないことが分かった。 (Example 5) Effect of hardness of cell support base on secretion amount of adiponectin secreted from 3T3-L1 adipocytes caused by addition culture of palmitic acid a) Method According to the method of Example 3, 100 Pa, 250 Pa , 750 Pa, 5 × 10 ⁴ hardness gel and glass culture system based on cell support, and evaluation of the effect of gel addition and the presence of palmitic acid on 3T3-L1 cultured adipocytes did.
The amount of adiponectin secreted was determined by measuring the total amount of adiponectin and the amount of high molecular weight adiponectin secreted into the medium using a commercially available ELIZA kit (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Sekisui Kogyo Co., Ltd.).
b) Results As shown in FIG. 9, the secretion amount of total adiponectin in cultured adipocytes shows a bell-shaped curve showing peaks in the range of 250 Pa and 750 Pa when the hardness of the extracellular matrix is taken on the horizontal axis. It was. However, it was shown that the amount of adiponectin secreted depends on the hardness of the cell support base and not so much on the presence or absence of palmitic acid.
Furthermore, when the amount of high molecular weight adiponectin present in the secreted adiponectin was measured, as shown in FIG. 10, a bell-shaped curve showing peaks in the range of 250 Pa and 750 Pa was shown. However, it was shown that adipocytes cultured on an extracellular matrix base having a hardness of 250 Pa secreted the most high molecular weight adiponectin.
In addition, the effect of the addition of palmitic acid on the secretion amount of high molecular weight adiponectin was examined. As a result, as shown in FIG. 11, it was found that the presence or absence of palmitic acid did not significantly affect the secretion of high molecular weight adiponectin.

(実施例６)パルミチン酸の添加培養により惹起される、３Ｔ３-Ｌ１脂肪細胞から分泌される単球走化活性因子（ＭＣＰ-１）の分泌量に対する細胞支持基盤の効果
ａ）方法
実施例５の方法と同様にして、ＭＣＰ-１の分泌量に対する、細胞支持基盤の硬さとパルミチン酸の添加の有無による影響を評価した。ＭＣＰ-１の分泌量の評価方法は、公知の文献（大豆たん白質研究、Ｖｏｌ．１，１１６−１２０（２００８））等に準じて行なった。
ｂ）結果
インスリン抵抗性を惹起する因子であると考えられているＭＣＰ-１は、図１２に示されるように、７５０Ｐａの細胞支持基盤で培養された脂肪細胞から最も多く分泌されるが、２５０Ｐａの細胞支持基盤では、あまり分泌されないことが分かった。また、細胞支持基盤の硬さが増大すると、ＭＣＰ−１の分泌量が増大する傾向が見られた。
更に、パルミチン酸の添加の影響を見ると、パルミチン酸を添加した方が、ＭＣＰ-１の分泌がより増大する傾向にあることが分かった。 (Example 6) Effect of cell support base on secretion amount of monocyte chemotactic active factor (MCP-1) secreted from 3T3-L1 adipocytes induced by addition culture of palmitic acid a) Method Example 5 In the same manner as described above, the influence of the hardness of the cell support base and the presence or absence of palmitic acid on the secretion amount of MCP-1 was evaluated. The method for evaluating the secretion amount of MCP-1 was performed according to known literature (soy protein research, Vol. 1, 116-120 (2008)).
b) Results MCP-1 which is considered to be a factor causing insulin resistance is secreted most from adipocytes cultured on a cell support base of 750 Pa, as shown in FIG. It was found that the cell support base of the cell was not secreted very much. Moreover, when the hardness of a cell support base | substrate increased, the tendency for the secretion amount of MCP-1 to increase was seen.
Furthermore, when the influence of the addition of palmitic acid was observed, it was found that the addition of palmitic acid tends to increase the secretion of MCP-1.

以上の図４〜図１２の結果をまとめると、本発明の肥大した脂肪細胞においては、細胞支持基盤の硬さとパルミチン酸の添加の有無に影響され、図２で示されるようなアディポサイトカイン類の分泌変化が生じることが明らかとなった。
更に、図２の内容を簡略化し、炎症性アディポカインの発現が増強される要因分析を行なうと、図１３のように表わすことができる。即ち、細胞支持基盤の硬さに影響されて、ＭＣＰ-１などの炎症性サイトカインの遺伝子発現が増大し、線維形成し易くなる（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）。更にパルミチン酸が添加されることで（(＋)ＰＡ）、細胞が肥大する際に生じる細胞−細胞外基質間の歪み（ｓｔｒｅｓｓ）とトール・ライク・リセプター（ＴＬＲ）関与の影響が出て来るため、ＭＣＰ−1やＮＦκＢ等の炎症性アディポカインの発現が増強される。
これらの結果から、脂肪細胞内においては、図１４に示されるようなシグナル情報伝達が行なわれていることが明らかになった。このように本発明の肥大した脂肪細胞から、インスリン抵抗性の発症メカニズムの一部が確認できた。 Summarizing the results of FIG. 4 to FIG. 12, the adipocytes of the present invention are affected by the hardness of the cell support base and the presence or absence of addition of palmitic acid, and adipocytokines as shown in FIG. It became clear that secretion changes occurred.
Furthermore, when the contents of FIG. 2 are simplified and a factor analysis that enhances the expression of inflammatory adipokines is performed, it can be expressed as shown in FIG. That is, the gene expression of inflammatory cytokines such as MCP-1 increases due to the hardness of the cell support base and facilitates fibrosis (fibrosis). Furthermore, the addition of palmitic acid ((+) PA) affects the effects of cell-to-extracellular matrix stress and toll-like receptor (TLR) involvement when cells grow in size. Therefore, the expression of inflammatory adipokines such as MCP-1 and NFκB is enhanced.
From these results, it became clear that signal information transmission as shown in FIG. 14 is performed in the adipocytes. Thus, from the enlarged fat cells of the present invention, a part of the onset mechanism of insulin resistance could be confirmed.

本発明の肥大した脂肪細胞は、飽和脂肪酸が存在する環境でも、通常の痩せ型の脂肪細胞と同様の内分泌機能を示し、インスリン抵抗性促進因子（ＭＣＰ−１等）の分泌が増加していないことを見出した。更に本発明の肥大化した脂肪細胞を用いたインスリン抵抗性の発症メカニズム研究の中で、発症阻害剤としての糖尿病予防剤あるいは糖尿病進行抑制剤のスクリーニングが可能となった。
また、本発明に基き、３Ｔ３−ＬＩ脂肪細胞から作製された肥満型脂肪細胞をヒト肥満型脂肪細胞のモデル細胞として使用し、糖尿病の病態生理の解明と共に、新たな糖尿病治療薬のスクリーニングが可能となった。 The enlarged fat cells of the present invention show the same endocrine function as normal lean adipocytes even in the presence of saturated fatty acids, and secretion of insulin resistance promoting factors (MCP-1 etc.) is not increased. I found out. Furthermore, in the study of the onset mechanism of insulin resistance using the enlarged fat cells of the present invention, it became possible to screen for diabetes preventive agents or diabetes progression inhibitors as onset inhibitors.
Based on the present invention, obesity type adipocytes prepared from 3T3-LI adipocytes can be used as model cells for human mast type adipocytes, and the pathophysiology of diabetes can be elucidated and new antidiabetic drugs can be screened. It became.

Claims

A fat cell cultured in the presence of a saturated fatty acid on a gel having a hardness of 150 to 350 Pa having the same hardness as that of an adipocyte of a normal weight person having a BMI of 20 to 22, and enlarged to a cell diameter of 100 to 150 μm. There,
a) the fat cells are resistant to saturated fatty acids;
b) The adipokine secretion of the adipocytes is within a variation range of ± 0.5, where 1 is the secretion amount or expression level of adipokine in the adipocytes before hypertrophy .
c) Enlarged adipocytes, characterized in that insulin sensitivity is maintained .

The enlarged fat cell according to claim 1, wherein the saturated fatty acid is palmitic acid.

Adipokines are adiponectin, an MCP-1 or IL-12 alpha, adipocytes bloated according to claim 1 or 2.

The enlarged adipocyte according to claim 3 , wherein the adiponectin is a high molecular weight adiponectin.

The enlarged fat cell according to any one of claims 1 to 4, wherein a gel having a hardness of 150 to 350 Pa is coated with collagen and fibronectin.

The enlarged fat cell according to any one of claims 1 to 5 , wherein the fat cell is a 3T3-L1 fat cell or a human fat cell.