JP5354710B2 - Highly active catalase-producing microorganism and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は、高い過酸化水素分解活性を有するカタラーゼ、それを生産する細菌、及びそれらの利用に関する。 The present invention relates to a catalase having a high hydrogen peroxide decomposition activity, a bacterium producing the same, and use thereof.
過酸化水素は、半導体産業界における半導体ウエハーのエッチングや洗浄、繊維の晒しの工程、紙の漂白、脱墨、食品工業における無菌充填関連のプラントの殺菌、洗浄やかずのこの漂白等、公衆浴場におけるレジオネラ菌の殺菌など、各種業界で広く利用されている。しかし使用後の過酸化水素は一般的に廃液中に高濃度で存在し、そのような過酸化水素の残留は、環境浄化に関与する有用生物や微生物の死滅をもたらすなど環境負荷を大きく増大させる点で大きな問題となる。残留した過酸化水素の分解処理法としては、貝殻等を使用した曝気法、オガクズ等を利用した生物処理法などが用いられてきたが、いずれも広大な処理設備を必要としたり、分解速度が遅い等の問題点があり、必ずしも効果的な方法ではなかった。他にも過酸化水素を重亜硫酸ナトリウム等の還元剤と接触させる方法があるが、過酸化水素濃度を分析し当量を添加しなければならないことと、もし過剰に添加した場合においては、還元剤が廃水中に残留してしまう欠点がある。そこで近年では、廃水中の過酸化水素をカタラーゼで酵素的に分解処理する方法も利用されている（例えば、特許文献１）。この酵素法自体は汎用性、操作性、効率の面で優れた方法であるが、通常はコストが高く、必ずしも各種業界で広く使用得るものではなかった。 Hydrogen peroxide is used in public baths such as semiconductor wafer etching and cleaning in the semiconductor industry, fiber bleaching process, paper bleaching and deinking, sterilization of aseptic filling related plants in the food industry, cleaning and washing this It is widely used in various industries such as sterilization of Legionella bacteria. However, the hydrogen peroxide after use is generally present in a high concentration in the waste liquid, and such residual hydrogen peroxide greatly increases the environmental load by causing the killing of useful organisms and microorganisms involved in environmental purification. This is a big problem. Decomposition treatment methods for residual hydrogen peroxide include aeration methods using shells, etc., and biological treatment methods using sawdust, etc., all of which require extensive treatment equipment and have a high decomposition rate. There were problems such as slowness, and it was not always an effective method. There is another method in which hydrogen peroxide is brought into contact with a reducing agent such as sodium bisulfite. However, it is necessary to analyze the concentration of hydrogen peroxide and add an equivalent amount. Has the disadvantage of remaining in the wastewater. Therefore, in recent years, a method of enzymatically decomposing hydrogen peroxide in wastewater with catalase is also used (for example, Patent Document 1). This enzymatic method itself is an excellent method in terms of versatility, operability, and efficiency, but is usually expensive and not necessarily widely usable in various industries.
一方、臨床検査の分野においては、測定対象成分から過酸化水素を生成させ、この過酸化水素を定量することにより測定対象成分の試料中濃度を測定する方法が広く利用されている（例えば、特許文献２）。この方法では、測定対象成分以外の物質から生成される過酸化水素が測定値の誤差要因となるため、測定対象成分以外の物質から生成された過酸化水素を除去するために、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する手法がよく用いられている。またグルコースオキシダーゼを使用して食品中のグルコースを除く際に、その反応の副産物である過酸化水素をカタラーゼを用いて分解することもよく行われている。しかし、カタラーゼはコストが高いことから、やはり使用しにくいという問題があった。 On the other hand, in the field of clinical examination, a method of measuring the concentration of a measurement target component in a sample by generating hydrogen peroxide from the measurement target component and quantifying the hydrogen peroxide is widely used (for example, patents). Reference 2). In this method, hydrogen peroxide generated from a substance other than the measurement target component causes an error in the measured value. Therefore, in order to remove hydrogen peroxide generated from the substance other than the measurement target component, catalase is allowed to act. The method of breaking down into water and oxygen is often used. In addition, when glucose in food is removed using glucose oxidase, hydrogen peroxide which is a byproduct of the reaction is often decomposed using catalase. However, there is a problem that catalase is difficult to use due to its high cost.
現在市販されている微生物由来カタラーゼは、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus (lysodeikticus)）やアスペルギルス・ニガー（Asperigillus niger）等の真菌由来のものが多数を占める（例えば、特許文献３）。ミクロコッカス・ルテウスは、培養に時間がかかること（典型的には約2日）や、菌体が頑丈で菌体内から酵素を取り出す際の菌体破壊に余分なコストがかかることから、低コストでの生産が難しい。また真菌由来カタラーゼについては、菌体の除去が容易でなく、大量スケールで十分な精製が可能な手法も確立されていない。真菌由来カタラーゼは、その多くが酸性に対して耐性があり、完全に精製された標品を得るのが比較的簡単であるのが長所である一方、分子あたりの活性が比較的低く過酸化水素を低濃度まで分解するためにはより多くの酵素を必要とするという欠点もある。臨床検査薬に含まれるカタラーゼのほとんどは、真菌由来カタラーゼではなく、家畜の臓器由来のカタラーゼを使用しているが、動物由来カタラーゼは大量生産が困難であるだけでなく、狂牛病等の影響で原料の調達に支障が生じる場合もある。 Many of the microorganism-derived catalases currently on the market are derived from fungi such as Micrococcus luteus (lysodeikticus) and Asperigillus niger (for example, Patent Document 3). Micrococcus luteus is low in cost because it takes time to cultivate (typically about 2 days), and because the microbial cells are strong and there is an extra cost to destroy the cells when removing the enzyme from the cells. Production is difficult. Moreover, about fungal-derived catalase, the removal of a microbial cell is not easy and the method which can fully refine | purify on a large scale is not established. Many of the fungal catalases are resistant to acidity and have the advantage of being relatively easy to obtain a fully purified preparation, while the activity per molecule is relatively low. There is also a disadvantage that more enzyme is required to decompose the lysate to a low concentration. Most of the catalase included in clinical laboratory drugs is not catalase derived from fungi but catalase derived from livestock organs, but animal-derived catalase is not only difficult to mass-produce, but also has the effects of mad cow disease etc. In some cases, this may interfere with the procurement of raw materials.
いくつかの細菌由来カタラーゼの単離も報告されている（例えば、特許文献４）が、高熱条件や酸性条件下での安定性の低さなどそれぞれ課題を抱えていることから、有用な細菌由来カタラーゼの提供はなおも望まれている。 Isolation of several bacterial catalases has also been reported (for example, Patent Document 4), but has problems such as low stability under high heat conditions and acidic conditions. The provision of catalase is still desirable.
このように、従来のカタラーゼは、菌体に含まれる含有量、培養時間、菌体破壊に掛かるコスト、反応速度、酵素回収・精製に掛かるコスト、広範な反応条件（pHや温度等）下での安定性等に問題があり、これはひいては使用時の反応速度の低さや高コストという形で現れていた。 As described above, conventional catalase can be used under the contents contained in the cells, the culture time, the cost for destroying the cells, the reaction rate, the cost for enzyme recovery and purification, and a wide range of reaction conditions (pH, temperature, etc.). There was a problem with the stability of this, which in turn appeared in the form of low reaction speed and high cost during use.
本発明は、高い過酸化水素分解活性を有するカタラーゼ及びその効率的な生産に適した細菌を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the catalase which has high hydrogen peroxide decomposition activity, and the bacteria suitable for the efficient production.
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ある種のサイクロバクター属菌が高い過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを生産すること、及びその細菌からカタラーゼを容易に回収できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventors have produced that certain Cyclobacter spp. Produce catalase having high hydrogen peroxide decomposition activity, and easily recover catalase from the bacterium. The present inventors have found that this can be done and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下を包含する。
[1] 精製カタラーゼタンパク質1mg当たり200,000〜300,000 Uの過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを生産する、サイクロバクター属菌。
このサイクロバクター属菌の好適な例は、サイクロバクター・エスピーT-3株（受託番号FERM P-21525）又はその変異株である。
[2] 上記[1]のサイクロバクター属菌由来の、前記カタラーゼを含有する細胞抽出液。
[3] 以下の(a)又は(b)のタンパク質であるカタラーゼサブユニットから構成されるカタラーゼ。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質
このカタラーゼは、精製カタラーゼタンパク質1mg当たり200,000〜300,000 Uの過酸化水素分解活性を有することが好ましい。
[4] 以下の(a)〜(d)のいずれかのカタラーゼサブユニットタンパク質をコードするDNA。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号１に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA
[5] 上記[4]のDNAを含む組換えベクター。
[6] 組換え発現ベクターである、上記[5]の組換えベクター。
[7] 上記[4]のDNA、又は上記[6]の組換えベクターを含む形質転換細胞。
[8] 上記[1]のサイクロバクター属菌、上記[2]の細胞抽出液、上記[3]のカタラーゼ、又は上記[7]の形質転換細胞を用いて、過酸化水素を含む液体を処理することを含む、過酸化水素の分解処理方法。
[9] 上記[1]のサイクロバクター属菌又は上記[7]の形質転換細胞を培養し、カタラーゼを生産させることを含む、カタラーゼの製造方法。
That is, the present invention includes the following.
[1] A cyclobacter bacterium that produces catalase having a hydrogen peroxide decomposing activity of 200,000 to 300,000 U per 1 mg of purified catalase protein.
A preferred example of the genus Cyclobacter is Cyclobacter sp. T-3 strain (Accession No. FERM P-21525) or a mutant thereof.
[2] A cell extract containing the catalase derived from Cyclobacter spp. Of [1] above.
[3] A catalase composed of a catalase subunit which is a protein of the following (a) or (b).
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(b) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and constituting a catalase having hydrogen peroxide decomposing activity. Preferably, it has a hydrogen peroxide decomposing activity of 200,000 to 300,000 U per mg of purified catalase protein.
[4] DNA encoding a catalase subunit protein of any one of the following (a) to (d).
(a) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(b) a DNA encoding a protein constituting a catalase having a hydrogen peroxide-decomposing activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
(d) DNA encoding a protein constituting a catalase that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has hydrogen peroxide decomposing activity
[5] A recombinant vector comprising the DNA of [4] above.
[6] The recombinant vector according to [5] above, which is a recombinant expression vector.
[7] A transformed cell comprising the DNA of [4] above or the recombinant vector of [6] above.
[8] A liquid containing hydrogen peroxide is treated with the Cyclobacter spp. Of [1], the cell extract of [2], the catalase of [3], or the transformed cell of [7]. A method for decomposing hydrogen peroxide, comprising:
[9] A method for producing catalase, comprising culturing the Cyclobacter spp. Of [1] above or the transformed cell of [7] above to produce catalase.
本発明に係るサイクロバクター属菌は高い過酸化水素分解活性を示す。本発明に係るサイクロバクター属菌からは、高い過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを、容易に回収することができる。本発明に係るサイクロバクター属菌等を用いた過酸化水素の分解処理方法は、過酸化水素を効率良く分解することができる。 The genus Cyclobacter according to the present invention exhibits high hydrogen peroxide decomposition activity. Catalase having high hydrogen peroxide decomposition activity can be easily recovered from the genus Cyclobacter according to the present invention. The method for decomposing hydrogen peroxide using Cyclobacter spp. According to the present invention can efficiently decompose hydrogen peroxide.
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明に係るサイクロバクター属菌
本発明は、高い過酸化水素分解活性を示すサイクロバクター属（Psychrobacter）の細菌（サイクロバクター属菌）に関する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a Psychrobacter bacterium (Cyclobacter genus) exhibiting high hydrogen peroxide decomposition activity.
本発明では、そのようなサイクロバクター属菌を、過酸化水素を含有する条件下で培養し、その増殖の有無を指標として（過酸化水素耐性試験）、さらにはその菌体自体又は細胞抽出液を過酸化水素溶液に添加して過酸化水素分解活性を測定し、その測定値を指標として（カタラーゼ活性測定）、選択することができる。 In the present invention, such a Cyclobacter spp. Is cultured under conditions containing hydrogen peroxide, and the presence or absence of its growth is used as an index (hydrogen peroxide tolerance test). Can be added to a hydrogen peroxide solution to measure hydrogen peroxide decomposition activity, and the measured value can be selected as an index (catalase activity measurement).
過酸化水素耐性は、例えば菌の培養物に一定濃度の過酸化水素を添加し、一定時間後の生菌数をカウントし、生菌数が増加したか否かを判定することにより試験することができる。過酸化水素分解活性の測定は、通常行われているカタラーゼ活性測定法に従って行うことができる。例えば、菌体を破壊し遠心分離により未破壊の菌体を取り除いた細胞抽出液を、適当な緩衝液を混合した過酸化水素水溶液と混合して反応させ、分光光度計により過酸化水素濃度の減少を測定することにより、その細胞抽出液が有する過酸化水素を分解する活性を調べることができる。各種菌株由来の細胞抽出液中の単位タンパク質当たりの過酸化水素分解活性を互いに比較することにより、より過酸化水素分解活性の高い細菌株を得ることができる。さらに一定数の細菌中からの細胞抽出液中の全活性量によって選択し、所望の細菌株を得ることができる。 Test for hydrogen peroxide resistance by, for example, adding a certain concentration of hydrogen peroxide to a culture of bacteria, counting the number of viable bacteria after a certain time, and determining whether the number of viable bacteria has increased. Can do. The hydrogen peroxide decomposition activity can be measured in accordance with a catalase activity measurement method that is usually performed. For example, a cell extract obtained by destroying cells and removing undestructed cells by centrifugation is mixed with a hydrogen peroxide solution mixed with an appropriate buffer and reacted, and the concentration of hydrogen peroxide is measured using a spectrophotometer. By measuring the decrease, the activity of decomposing hydrogen peroxide contained in the cell extract can be examined. By comparing the hydrogen peroxide decomposing activities per unit protein in cell extracts derived from various strains, bacterial strains with higher hydrogen peroxide decomposing activity can be obtained. Furthermore, the desired bacterial strain can be obtained by selecting according to the total amount of activity in the cell extract from a certain number of bacteria.
本発明に係るサイクロバクター属菌は、その細胞抽出液中の菌体タンパク質1 mg当たりの過酸化水素分解活性が5000 Uを超えるものが好ましく、さらには10000 Uを超えるもの、特に20000 Uを超えるものがより好ましい。 The Cyclobacter genus according to the present invention preferably has a hydrogen peroxide decomposition activity of more than 5000 U per 1 mg of cell protein in the cell extract, more than 10,000 U, particularly more than 20000 U. Those are more preferred.
好適な態様では、本発明に係るサイクロバクター属菌は、カタラーゼタンパク質（特にその精製タンパク質）1mg当たり200,000〜300,000 Uの過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを生産するサイクロバクター属菌である。 In a preferred embodiment, the genus Cyclobacter according to the present invention is a bacterium belonging to the genus Cyclobacter that produces catalase having a hydrogen peroxide decomposing activity of 200,000 to 300,000 U per 1 mg of catalase protein (particularly purified protein thereof).
本発明において、過酸化水素分解活性は、20℃にて1分間に過酸化水素を1μmol 分解する活性を1単位（1U: ユニット）として表す。本発明では、カタラーゼの「過酸化水素分解活性」と、「カタラーゼ活性」とは同じ意味で用いる。 In the present invention, the hydrogen peroxide decomposition activity is expressed as 1 unit (1 U: unit) that decomposes 1 μmol of hydrogen peroxide in 1 minute at 20 ° C. In the present invention, “hydrogen peroxide decomposition activity” and “catalase activity” of catalase are used interchangeably.
本発明に係るサイクロバクター属菌の特に好ましい例として、サイクロバクター属に属する新菌種であるサイクロバクター・エスピー（Psychrobacter sp.）T-3株、及びその変異株が挙げられる。本発明においてサイクロバクター・エスピーT-3株の「変異株」とは、サイクロバクター・エスピーT-3株の細菌細胞を継代培養等により増殖させ維持した菌株であって、自然突然変異若しくは人為的突然変異により、又は遺伝子導入等の改変により、遺伝的な変異が生じた菌株をいう。具体的には、本発明に係るサイクロバクター・エスピーT-3株の変異株は、精製カタラーゼタンパク質1mg当たり200,000〜300,000 Uの過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを生産する能力（生産能）を保持することが好ましい。 As a particularly preferred example of the genus Cyclobacter according to the present invention, there can be mentioned Psychrobacter sp. T-3 strain, which is a new bacterial species belonging to the genus Cyclobacter, and mutants thereof. In the present invention, the “mutant strain” of the Cyclobacter sp. T-3 strain is a strain obtained by growing and maintaining the bacterial cells of the Cyclobacter sp. T-3 strain by subculture or the like. It refers to a strain in which a genetic variation has occurred due to genetic mutation or modification such as gene transfer. Specifically, the mutant of Cyclobacter sp. T-3 strain according to the present invention has the ability to produce a catalase having a hydrogen peroxide decomposing activity of 200,000 to 300,000 U per mg of purified catalase protein (production ability). It is preferable to do.
本発明に係るサイクロバクター属菌はまた、生育速度が比較的速いものが好ましい。 Cyclobacter spp. According to the present invention are also preferably those having a relatively high growth rate.
サイクロバクター・エスピーT-3株は、本発明者らが北海道留萌市の食品加工工場排水より分離した菌株であり、上記のように過酸化水素を含む培地での生育能及び細胞抽出液（細胞抽出液）の過酸化水素分解活性を指標として、過酸化水素耐性を有しかつ高い過酸化水素分解活性を有するものとして選択した。その菌学的性質は下記の通りである。 Cyclobacter sp. T-3 strain is a strain isolated by the present inventors from the wastewater from a food processing factory in Rumoi City, Hokkaido. As described above, the growth ability and cell extract (cells) in a medium containing hydrogen peroxide The extract was selected as having hydrogen peroxide resistance and high hydrogen peroxide decomposition activity using the hydrogen peroxide decomposition activity of the extract) as an index. Its mycological properties are as follows.
（１）形態学的特性
グラム染色：陰性
芽胞：無し
運動性：無し
菌形：桿菌
(1) Morphological characteristics Gram staining: Negative Spore: None Motility: None Bacterial shape: Neisseria gonorrhoeae
（２）培地における生育特性
色調：白
形：円形
表面：平滑
(2) Growth characteristics in medium Color: White Shape: Circular Surface: Smooth
（３）化学分類学的特性
主要なイソプレノイドキノン：ユビキノン-8 (Q-8)
DNAのG+C含量（mol％）：44.6％
(3) Chemical taxonomic characteristics Major isoprenoid quinone: Ubiquinone-8 (Q-8)
G + C content of DNA (mol%): 44.6%
（４）生理・生化学的特性
オキシダーゼ試験：陽性
カタラーゼ試験：陽性
尿素分解：弱陽性
ONPG試験：陰性
硫化水素産生：陽性
メチルレッド試験：陽性
VP試験：陰性
インドール試験：陰性
フェニルアラニンのデアミナーゼ試験：陰性
硝酸塩の還元：弱陽性
Na+要求性：陰性
デンプン分解：陰性
ゼラチン分解：陰性
カゼイン分解：陰性
アルギン酸分解：陰性
エスクリン分解：陰性
Tween 20の分解：陽性
Tween 40の分解：陽性
Tween 60の分解：陽性
Tween 80の分解：陽性
(4) Physiological and biochemical characteristics Oxidase test: positive Catalase test: positive Urea degradation: weak positive
ONPG test: negative Hydrogen sulfide production: positive Methyl red test: positive
VP test: negative Indole test: negative Phenylalanine deaminase test: negative Nitrate reduction: weak positive
Na + requirement: negative starch degradation: negative gelatin degradation: negative casein degradation: negative alginic acid degradation: negative esculin degradation: negative
Tween 20 degradation: positive
Tween 40 degradation: positive
Tween 60 degradation: positive
Tween 80 degradation: positive
（５）各温度における生育
-1℃：＋
4℃：＋
30℃：＋
40℃：−
(5) Growth at each temperature
-1 ℃: +
4 ° C: +
30 ° C: +
40 ° C:-
（６）酸生成
以下の基質から酸を産生する：
L-アラビノース、D-マンノース、メリビオース、ガラクトース、ラムノース、ラクトース、セロビオース
以下の基質から酸を産生しない：
フルクトース、マルトース、シュークロース、ラフィノース、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、グリセロール。
(6) Acid production Acids are produced from the following substrates:
L-arabinose, D-mannose, melibiose, galactose, rhamnose, lactose, cellobiose Does not produce acid from the following substrates:
Fructose, maltose, sucrose, raffinose, inositol, mannitol, sorbitol, trehalose, glycerol.
本発明のサイクロバクター・エスピーT-3株は、これらの菌学的性質、及び16S rRNA遺伝子配列に基づく系統学解析で得られた系統樹（図１）に基づいて、サイクロバクター属に属する新菌種として分類された。サイクロバクター・エスピー（Psychrobacter sp.）T-3株は、2008年3月7日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-21525として寄託されている。 The Cyclobacter sp. T-3 strain of the present invention is a new strain belonging to the genus Cyclobacter based on these mycological properties and the phylogenetic tree obtained by phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequence (FIG. 1). Classified as a bacterial species. The Psychrobacter sp. T-3 strain was established on March 7, 2008 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, Central 6th) ) As deposit number FERM P-21525.
本発明のサイクロバクター・エスピーT-3株を培養するのに適した液体培地の例は以下の通りである。 Examples of the liquid medium suitable for culturing the Cyclobacter sp. T-3 strain of the present invention are as follows.
PYS-3培地（液体培地組成）
カゼインペプトン 8 g
酵母エキス 3 g
塩化ナトリウム 5 g
コハク酸ナトリウム 5 g
蒸留水 1 L
（pH 7.0）
PYS-3 medium (liquid medium composition)
Casein peptone 8 g
Yeast extract 3 g
Sodium chloride 5 g
Sodium succinate 5 g
Distilled water 1 L
(PH 7.0)
２．本発明に係るサイクロバクター属菌の生産するカタラーゼ
本発明のサイクロバクター属菌（特に好ましくは、サイクロバクター・エスピーT-3株）は、カタラーゼを生産し、通常はそれを菌体内に蓄積する。本発明のサイクロバクター属菌を培養し、その培養物に超音波処理やフレンチプレス等の物理的処理又は化学的処理を施すことにより培養物中の菌体を破壊して破砕液とし、さらに必要に応じて、その破砕液から未破壊の菌体を遠心分離等により取り除くことにより、細胞抽出液を調製することができる。細胞抽出液は、無細胞抽出液とも呼ばれる。本発明に係るサイクロバクター属菌から調製した細胞抽出液（サイクロバクター属菌由来の細胞抽出液）は、比活性（ここでは、菌体タンパク質1mg当たりの過酸化水素分解活性）及び総カタラーゼ活性値が非常に高い。サイクロバクター属菌由来の細胞抽出液には、好ましくは、このサイクロバクター属菌が生産した高活性のカタラーゼ（サイクロバクター属菌由来カタラーゼ）が大量に含まれる。本発明はこのようなカタラーゼにも関する。
2. Catalase produced by Cyclobacter according to the present invention The Cyclobacter genus of the present invention (particularly preferably, Cyclobacter sp. T-3 strain) produces catalase and usually accumulates it in the microbial cells. Cyclobacter spp. Of the present invention are cultured, and the culture is subjected to physical treatment or chemical treatment such as ultrasonic treatment or French press to break down the cells in the culture to obtain a crushed liquid, and further required Accordingly, a cell extract can be prepared by removing unbroken cells from the disrupted solution by centrifugation or the like. The cell extract is also called a cell-free extract. The cell extract prepared from the Cyclobacter spp. According to the present invention (the cell extract derived from Cyclobacter spp.) Has a specific activity (here, hydrogen peroxide decomposition activity per 1 mg of cell protein) and total catalase activity value Is very expensive. Preferably, the cell extract derived from the genus Cyclobacter contains a large amount of highly active catalase (cyclobacter genus-derived catalase) produced by the genus Cyclobacter. The present invention also relates to such catalase.
サイクロバクター・エスピーT-3株由来の上記カタラーゼは、カタラーゼサブユニット４個を含んでおり、そのサブユニットのそれぞれは配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質である。しかし本発明に係るカタラーゼは、配列番号２のアミノ酸配列にマイナーな変異が導入されたサブユニットタンパク質から構成されるものであってもよい。具体的には、本発明に係るサイクロバクター属菌由来のカタラーゼは、その個々のサブユニットが以下のサブユニットタンパク質であるものであってよい：
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質。
The catalase derived from Cyclobacter sp. T-3 strain contains 4 catalase subunits, each of which is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. However, the catalase according to the present invention may be composed of a subunit protein in which a minor mutation is introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Specifically, the catalase derived from the genus Cyclobacter according to the present invention may be one whose individual subunits are the following subunit proteins:
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(b) consisting of an amino acid sequence in which one or several (preferably 2 to 10, more preferably 2 to 6) amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; A protein constituting catalase having hydrogen peroxide decomposing activity.
本発明において、「過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成する」タンパク質とは、そのタンパク質がサブユニットとして（好ましくは４量体へと）反応（会合）してカタラーゼを形成したときに、そのカタラーゼが過酸化水素分解活性を発揮することができるようなタンパク質をいう。 In the present invention, a protein that constitutes a catalase having hydrogen peroxide decomposing activity is a protein that reacts (associates) as a subunit (preferably into a tetramer) to form catalase. A protein that catalase can exhibit hydrogen peroxide decomposing activity.
本発明に係る上記カタラーゼは、一般的なカタラーゼと同様に好ましくは４個のサブユニットから構成される。サブユニット１個の分子量は典型的には約60 kDaである。このカタラーゼはそれらサブユニットに加えて他の成分、例えばプロトヘム（ヘムbとも呼ばれる）等を含みうるが、そのようなカタラーゼも本発明に係るカタラーゼに包含する。 The catalase according to the present invention is preferably composed of four subunits as in the case of general catalase. The molecular weight of one subunit is typically about 60 kDa. This catalase may contain other components in addition to these subunits, such as protoheme (also referred to as heme b), and such catalase is also included in the catalase according to the present invention.
本発明に係る上記カタラーゼは、精製カタラーゼタンパク質1mg当たり200,000〜300,000 U、より好ましくは220,000〜270,000 Uという、高い比活性（カタラーゼタンパク質1mg当たりの過酸化水素分解活性）を有する。本発明において「精製カタラーゼタンパク質」とは、典型的には、電気泳動的に均一なバンドが示される程度以上まで精製されたカタラーゼタンパク質を意味する。本発明に係るカタラーゼの至適温度は、典型的には5℃〜70℃、好ましくは10℃〜60℃である。本発明に係るカタラーゼの至適pHは、通常はpH3〜11、好ましくはpH5〜10である。またこの本発明に係るカタラーゼが特に安定なpH範囲は、通常はpH7.0〜9.0、より好ましくはpH7.5〜8.5、特に好ましくはpH8.0である。さらに、この本発明に係るカタラーゼがより安定な温度範囲は、通常は10℃〜45℃、より好ましくは20℃〜45℃である。
The catalase according to the present invention has a high specific activity (hydrogen peroxide decomposing activity per 1 mg of catalase protein) of 200,000 to 300,000 U, more preferably 220,000 to 270,000 U per 1 mg of purified catalase protein. In the present invention, the “purified catalase protein” typically means a catalase protein that has been purified to such an extent that an electrophoretically uniform band is exhibited. The optimum temperature of the catalase according to the present invention is typically 5 ° C to 70 ° C, preferably 10 ° C to 60 ° C. The optimum pH of the catalase according to the present invention is usually
なお上述のサイクロバクター・エスピーT-3株の変異株は、このようなサイクロバクター属菌由来カタラーゼを生産する能力を保持しているものであることが好ましい。 The above-mentioned mutant of Cyclobacter sp. Strain T-3 preferably has the ability to produce such a Cyclobacter genus-derived catalase.
上記のような本発明に係るサイクロバクター属菌由来のカタラーゼは、サイクロバクター属菌を培養し、その培養物に物理的処理（超音波処理やフレンチプレス等）又は化学的処理（例えばリゾチーム等の酵素処理）を施すことにより培養物中の菌体を破壊して破砕液とし、さらに必要に応じてその破砕液から未破壊の菌体や、菌体の破壊断片の一部などを取り除くことにより、細胞抽出液を調製し、その細胞抽出液から、常法により精製することができる。用途によっては、未破壊の菌体等を取り除く前の破砕液をそのまま細胞抽出液として使用することもできる。 The catalase derived from the genus Cyclobacter according to the present invention as described above is obtained by culturing a bacterium belonging to the genus Cyclobacter, and subjecting the culture to physical treatment (sonication, French press, etc.) or chemical treatment (eg, lysozyme etc. By destroying the cells in the culture to give a crushed liquid, and removing the unbroken cells or some of the broken fragments of the cells from the crushed liquid as necessary. A cell extract can be prepared and purified from the cell extract by a conventional method. Depending on the application, the crushed liquid before removing unbroken cells and the like can be used as it is as a cell extract.
本発明に係るサイクロバクター属菌は、容易に菌体を破壊することができる。本発明のカタラーゼは、細胞抽出液から、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いて単離精製することができる。細胞抽出液からのカタラーゼの特に好適な精製方法としては、例えば、細胞抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、溶出させたカタラーゼ画分をさらに疎水性相互作用クロマトグラフフィーにかける方法が挙げられる。本発明は、このようなサイクロバクター属菌からのカタラーゼの製造方法も提供する。この方法では、ゲル濾過を使用しない少ない精製ステップを細胞抽出液に適用できることから、低コストかつ安定的に本発明に係るカタラーゼの精製酵素を供給することができる。また、ゲル濾過は負荷量が制限されること（例えば通常の実験室の系では2 ml程度）から、本発明においてゲル濾過を使用せずにカタラーゼを精製できることは、大容量のサンプルを処理する上で有利である。 The bacterium belonging to the genus Cyclobacter according to the present invention can easily destroy cells. The catalase of the present invention is a general biochemical method used for protein isolation and purification from cell extracts, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination. Can be used for isolation and purification. As a particularly preferred purification method of catalase from the cell extract, for example, a method in which the cell extract is subjected to anion exchange chromatography and the eluted catalase fraction is further subjected to hydrophobic interaction chromatography. The present invention also provides a method for producing catalase from such a genus Cyclobacter. In this method, since the few purification steps which do not use gel filtration can be applied to the cell extract, the catalase purified enzyme according to the present invention can be supplied stably at low cost. In addition, since gel filtration has a limited load (for example, about 2 ml in a normal laboratory system), the ability to purify catalase without using gel filtration in the present invention processes a large volume of sample. This is advantageous.
あるいは本発明に係るサイクロバクター属菌由来のカタラーゼは、上記のようなカタラーゼサブユニットタンパク質をコードするDNA（カタラーゼ遺伝子）を組換え発現させることによって製造することもできる。 Alternatively, the catalase derived from the genus Cyclobacter according to the present invention can be produced by recombinantly expressing a DNA (catalase gene) encoding the catalase subunit protein as described above.
本発明のカタラーゼ遺伝子は、典型的には以下のようなDNAである。 The catalase gene of the present invention is typically the following DNA.
以下の(a)〜(d)のいずれかのカタラーゼサブユニットタンパク質をコードするDNA：
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（好ましくは2〜10個、より好ましくは2〜6個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号１に示される塩基配列からなるDNA
(d) 配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA。
DNA encoding a catalase subunit protein of any of the following (a) to (d):
(a) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(b) consisting of an amino acid sequence in which one or several (preferably 2 to 10, more preferably 2 to 6) amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; DNA encoding a protein that constitutes catalase having hydrogen peroxide-degrading activity
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
(d) DNA encoding a protein constituting a catalase that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has a hydrogen peroxide decomposing activity.
この「過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成する」タンパク質の意味は上記と同様である。 The meaning of the protein constituting “catalase having hydrogen peroxide decomposing activity” is the same as described above.
ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的な核酸ハイブリッドが形成される条件をいう。典型的には、ナトリウム塩濃度50〜750mM、より好ましくは300〜750mM、反応温度50℃〜70℃、より好ましくは55〜65℃、ホルムアミド濃度20〜50％、より好ましくは35〜45％でハイブリダイゼーション反応を行い、さらにハイブリダイゼーション後の洗浄を、ナトリウム塩濃度50〜600mM、より好ましくは300〜600mM、温度55〜70℃、より好ましくは60〜65℃で行う条件を、本発明における「ストリンジェントな条件」と呼ぶ。 Here, stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific nucleic acid hybrid is formed. Typically, the sodium salt concentration is 50 to 750 mM, more preferably 300 to 750 mM, the reaction temperature is 50 ° C. to 70 ° C., more preferably 55 to 65 ° C., and the formamide concentration is 20 to 50%, more preferably 35 to 45%. The conditions under which a hybridization reaction is performed and washing after hybridization is performed at a sodium salt concentration of 50 to 600 mM, more preferably 300 to 600 mM, a temperature of 55 to 70 ° C., more preferably 60 to 65 ° C. It is called “stringent conditions”.
なお、この配列番号１に示される塩基配列からなるDNAは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、サイクロバクター・エスピーT-3株由来のカタラーゼ遺伝子である。 The DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a catalase gene derived from Cyclobacter sp. T-3 strain that encodes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
本発明のカタラーゼ遺伝子は、実施例のようにサイクロバクター・エスピーT-3株の細菌細胞から単離することができるが、それ以外のサイクロバクター属菌から単離してもよい。 The catalase gene of the present invention can be isolated from Cyclobacter sp. Strain T-3 bacterial cells as in Examples, but may be isolated from other Cyclobacter species.
本発明のカタラーゼ遺伝子は、本発明のカタラーゼ遺伝子配列又はカタラーゼのアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号１の塩基配列、配列番号２のアミノ酸配列）に基づいて、常法により単離することができる。例えば、サイクロバクター属菌から常法により調製された全mRNA、全RNAからRT-PCRにより得られたcDNA、cDNAライブラリー等の核酸を鋳型とし、本発明のカタラーゼ又はカタラーゼ遺伝子の配列に基づいて設計されるプライマーセット（例えば、それぞれ配列番号４及び５の塩基配列からなるプライマーのセット、又はそれぞれ配列番号６及び７の塩基配列からなるプライマーのセット）を用いたPCR法によって、本発明のカタラーゼ遺伝子を含むDNA増幅断片を取得することができる。得られたDNA増幅断片は、常法により抽出・精製することが好ましい。あるいは、本発明のカタラーゼ遺伝子（例えば、配列番号１の塩基配列からなるDNA）又はその一部を用いてプローブを作製し、それをサイクロバクター属菌から常法により調製された全mRNA、全RNAからRT-PCRにより得られたcDNA、cDNAライブラリー等の核酸に対してハイブリダイズさせることにより、本発明のカタラーゼ遺伝子をクローンとして取得することもできる。本発明のカタラーゼ遺伝子はまた、化学合成法を利用して合成してもよい。 The catalase gene of the present invention can be isolated by a conventional method based on the catalase gene sequence of the present invention or the amino acid sequence of catalase (for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, respectively). . For example, based on the catalase or catalase gene sequence of the present invention, using as a template total mRNA prepared from Cyclobacter spp. By conventional methods, cDNA obtained by RT-PCR from total RNA, cDNA library, etc. The catalase of the present invention is obtained by a PCR method using a designed primer set (for example, a set of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 4 and 5, or a set of primers consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 6 and 7, respectively). A DNA amplified fragment containing the gene can be obtained. The obtained DNA amplified fragment is preferably extracted and purified by a conventional method. Alternatively, a probe is prepared using the catalase gene of the present invention (for example, DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) or a part thereof, and is prepared from total mRNA or total RNA prepared from Cyclobacter bacteria by a conventional method. Thus, the catalase gene of the present invention can also be obtained as a clone by hybridizing with a nucleic acid such as cDNA or cDNA library obtained by RT-PCR. The catalase gene of the present invention may also be synthesized using chemical synthesis methods.
また本発明に係るカタラーゼ遺伝子は、天然源から得られたカタラーゼ遺伝子又は合成カタラーゼ遺伝子を、部位特異的突然変異誘発法等の変異導入法を用いて改変することにより作製してもよい。遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。これらの変異導入は、例えば市販の部位特異的突然変異誘発キット（例えばMutan(R)-K、Mutan(R)-Super Express Km、PrimeSTAR(R) Mutagenesis Basal Kit（いずれもTAKARA BIO INC.社製））などを用いて当業者であれば容易に行うことができる。 In addition, the catalase gene according to the present invention may be prepared by modifying a catalase gene obtained from a natural source or a synthetic catalase gene using a mutation introducing method such as site-directed mutagenesis. In order to introduce a mutation into a gene, a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method, or a method equivalent thereto can be employed. These mutagenesis can be performed by, for example, commercially available site-directed mutagenesis kits (for example, Mutan (R) -K, Mutan (R) -Super Express Km, PrimeSTAR (R) Mutagenesis Basal Kit (both manufactured by TAKARA BIO INC. ) )) And the like can be easily performed by those skilled in the art.
なお、得られたカタラーゼ遺伝子のDNA増幅断片については、塩基配列決定によりその配列を確認することが好ましい。塩基配列決定はマキサム-ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばABI社製DNAシークエンサー）を用いて行えばよい。 In addition, it is preferable to confirm the sequence of the obtained DNA amplified fragment of the catalase gene by determining the base sequence. The nucleotide sequence can be determined by a known method such as a Maxam-Gilbert chemical modification method or a dideoxynucleotide chain termination method, but it may be usually performed using an automatic nucleotide sequencer (eg, DNA sequencer manufactured by ABI).
本発明は、上記のようなサイクロバクター属菌由来カタラーゼ遺伝子にも関する。 The present invention also relates to a catalase gene derived from the genus Cyclobacter as described above.
本発明では、本発明に係るサイクロバクター属菌由来カタラーゼ遺伝子（当該カタラーゼのサブユニットタンパク質をコードするDNA）をベクター中にクローニングして組換えベクターを作製することも好ましい。 In the present invention, it is also preferable to prepare a recombinant vector by cloning the catalase gene derived from the genus Cyclobacter according to the present invention (DNA encoding the subunit protein of the catalase) into the vector.
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。例えばプラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばpET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript、pET100/D-TOPO等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13、YCp50、pPICZαA等）などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等）などが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。ベクター中に本発明のカタラーゼ遺伝子を組み込むには、例えば、その遺伝子を含むDNA断片を適当な制限酵素で切断し、ベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトにインフレームで挿入し連結すればよい。 The recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating the gene of the present invention to an appropriate vector. The vector for inserting the gene of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and examples thereof include plasmid DNA, phage DNA and the like. For example, plasmid DNA includes plasmids derived from E. coli (eg, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, pET100 / D-TOPO, etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.) ), Yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YCp50, pPICZαA, etc.) and the like, and phage DNAs include λ phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, λZAPII, etc.). Furthermore, animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect virus vectors such as baculovirus can also be used. In order to incorporate the catalase gene of the present invention into a vector, for example, a DNA fragment containing the gene may be cleaved with an appropriate restriction enzyme and inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of the vector DNA in-frame and linked. .
本発明のカタラーゼ遺伝子を含む組換えベクターは、本発明の遺伝子を宿主細胞内で発現させるため、組換え発現ベクターとして作製することも好ましい。この組換え発現ベクターを作製するためには、ベクターのうち発現ベクターを選択して用いればよい。発現ベクターには、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必要な各種エレメントが含まれることが好ましい。また発現ベクターにはプロモーターを制御する遺伝子がさらに含まれてもよい。プロモーターは、その発現ベクターを導入すべき宿主細胞中でその制御下の遺伝子の発現を誘導できる任意のものであってよい。例えば細菌中で発現させるのであれば、T7プロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等が使用でき、酵母中で発現させるのであれば、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター、MFα1プロモーター等が使用でき、糸状菌中で発現させるのであれば、アミラーゼプロモーター、trpCプロモーター等が使用でき、動物細胞中で発現させるのであれば、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター等が使用でき、植物で発現させるのであれば、CaMV35Sプロモーター、ユビキチンプロモーター等が利用できる。 The recombinant vector containing the catalase gene of the present invention is also preferably produced as a recombinant expression vector in order to express the gene of the present invention in a host cell. In order to produce this recombinant expression vector, an expression vector may be selected from the vectors. The expression vector preferably contains various elements necessary for expression in the host organism such as a promoter, terminator, and ribosome binding site. The expression vector may further contain a gene that controls the promoter. The promoter may be any that can induce the expression of the gene under its control in the host cell into which the expression vector is to be introduced. For example, if expressed in bacteria, T7 promoter, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc. can be used, and if expressed in yeast, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter, MFα1 promoter, etc. If it is expressed in filamentous fungi, amylase promoter, trpC promoter, etc. can be used, and if expressed in animal cells, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc. can be used and expressed in plants In this case, CaMV35S promoter, ubiquitin promoter and the like can be used.
本発明で使用する発現ベクターには、ベクターが細胞内に保持されていることを示す選択マーカーやベクター内に簡単に正しい向きで遺伝子を挿入するためのポリリンカー、エンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、分泌シグナル配列、精製用のヒスチジンタグ配列等の有用な配列が必要に応じて含まれていてもよい。選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT遺伝子）等が挙げられる。本発明のカタラーゼを細胞中で高レベルに発現させる目的では、本発明のカタラーゼ遺伝子を過剰発現プロモーターの下流に連結した状態で組換え発現ベクターに組み込んでもよい。 The expression vector used in the present invention includes a selection marker indicating that the vector is retained in the cell, a polylinker for easily inserting a gene into the vector in the correct orientation, a cis element such as an enhancer, and a splicing signal. In addition, useful sequences such as a poly A addition signal, a secretion signal sequence, and a histidine tag sequence for purification may be included as necessary. Examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, a chloramphenicol resistance gene (CAT gene), and the like. For the purpose of expressing the catalase of the present invention at a high level in cells, the catalase gene of the present invention may be incorporated into a recombinant expression vector in a state of being linked downstream of the overexpression promoter.
本発明では、本発明のカタラーゼ遺伝子を宿主に導入して形質転換細胞を作製することもできる。具体的には、本発明のカタラーゼ遺伝子又はその遺伝子を含む組換えベクター（好ましくは組換え発現ベクター）を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換することができる。 In the present invention, the catalase gene of the present invention can be introduced into a host to produce a transformed cell. Specifically, the host cell can be transformed by introducing the catalase gene of the present invention or a recombinant vector containing the gene (preferably a recombinant expression vector) into the host cell.
宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。より具体的には、宿主細胞には、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞（好ましくは培養細胞）が含まれる。 The host cell may be a prokaryotic cell or a eukaryotic cell. More specifically, host cells include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, yeast cells, insect cells, animal cells (for example, mammalian cells), and any cells (preferably cultured cells) such as plant cells. It is.
本発明の遺伝子又はそれを含む組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換するには、一般的に行われている遺伝子導入法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコール（PEG）法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。形質転換細胞の選択は、常法に従って行うことができるが、通常は使用した組換えベクターに組み込まれた選択マーカー又はリポータータンパク質を利用して行うことができる。 In order to transform host cells using the gene of the present invention or a recombinant vector containing the same, gene transfer methods commonly used, for example, calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, particle gun method Polyethylene glycol (PEG) method, Agrobacterium method, protoplast fusion method and the like may be used. Selection of transformed cells can be performed according to a conventional method, but can usually be performed using a selection marker or a reporter protein incorporated in the recombinant vector used.
本発明では、得られた形質転換細胞において、導入した本発明のカタラーゼ遺伝子を発現させてカタラーゼサブユニットタンパク質を産生させ、それにより当該サブユニットが細胞内で組み立てられてカタラーゼとして生産されるようにすることにより、高い過酸化水素分解活性（カタラーゼ活性）を有するカタラーゼを製造することができる。 In the present invention, in the obtained transformed cells, the introduced catalase gene of the present invention is expressed to produce a catalase subunit protein, whereby the subunit is assembled in the cell and produced as catalase. By doing so, a catalase having a high hydrogen peroxide decomposition activity (catalase activity) can be produced.
限定するものではないが、導入したカタラーゼ遺伝子を発現させる際は、通常は、形質転換細胞を培養することが好ましい。形質転換細胞の培養は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行えばよい。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換細胞は、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有する培地中に接種して培養すればよい。培地は、形質転換細胞の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を添加してもよい。 Although not limited, it is usually preferable to culture transformed cells when expressing the introduced catalase gene. The transformed cells may be cultured according to a usual method used for culturing host organisms. For example, transformed cells obtained by using microorganisms such as E. coli and yeast cells as host cells may be inoculated and cultured in a medium containing a carbon source, nitrogen source, inorganic salts and the like that can be assimilated by the host microorganism. The medium may be either a natural medium or a synthetic medium as long as it can efficiently culture transformed cells. If necessary, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium.
誘導性プロモーターを含む組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはイソプロピル-１-チオ-β-D-ガラクトシド（IPTG）等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはインドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主細胞に適した条件下で行われる。 When culturing host cells transformed with a recombinant expression vector containing an inducible promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when culturing a host cell transformed with an expression vector using the Lac promoter, a host cell transformed with isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (IPTG) or the like with an expression vector using the trp promoter is used. When culturing, indoleacrylic acid (IAA) or the like can be added to the medium. The culture conditions are not particularly limited, but are preferably performed under conditions suitable for the host cell used for transformation.
培養後、通常カタラーゼは細胞内に蓄積されるので、その細胞を常法により破壊してカタラーゼを採取することが好ましい。本発明は、このような本発明のカタラーゼ遺伝子を導入した形質転換細胞を用いたカタラーゼの製造方法にも関する。 Since catalase usually accumulates in cells after culturing, it is preferable to collect catalase by destroying the cells by a conventional method. The present invention also relates to a method for producing catalase using such a transformed cell into which the catalase gene of the present invention has been introduced.
産生された本発明のカタラーゼ又はカタラーゼサブユニットタンパク質は、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより単離精製することができる。しかしながら、場合により、遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて採取又は濃縮した培養上清や溶菌液上清、あるいはそれらの上清をさらに硫安分画後に透析にかけるなどして得た溶液を、そのまま粗酵素液として使用してもよい。 The produced catalase or catalase subunit protein of the present invention can be obtained by a general biochemical method used for protein isolation and purification, such as ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. Or it can isolate and purify by using it combining suitably. However, in some cases, the culture supernatant or lysate supernatant collected or concentrated using a centrifugal separator, an ultrafiltration filter or the like, or a solution obtained by dialysis of the supernatant after further ammonium sulfate fractionation, etc. May be used as a crude enzyme solution as it is.
３．本発明に係るカタラーゼを用いた過酸化水素の分解処理方法
本発明に係るサイクロバクター属菌やそれに由来するカタラーゼは、高い過酸化水素分解活性を有することから、過酸化水素を分解する目的で各種用途に用いることができる。
3. Method for Decomposing Hydrogen Peroxide Using Catalase According to the Present Invention Cyclobacter spp. And the catalase derived therefrom according to the present invention have high hydrogen peroxide decomposing activity. Can be used for applications.
特に本発明は、本発明に係るサイクロバクター属菌、その細胞抽出液、その菌由来のカタラーゼ、又はそのカタラーゼ遺伝子を導入した形質転換細胞を用いて、過酸化水素を含む液体を処理することを含む、過酸化水素の分解処理方法を提供する。この方法により、工業廃水等に含まれる過酸化水素を効率よく除去することができる。 In particular, the present invention is to treat a liquid containing hydrogen peroxide using a Cyclobacter genus bacterium according to the present invention, a cell extract thereof, a catalase derived from the bacterium, or a transformed cell into which the catalase gene has been introduced. A hydrogen peroxide decomposition treatment method is provided. By this method, hydrogen peroxide contained in industrial wastewater or the like can be efficiently removed.
この方法で処理に供する過酸化水素を含む液体は、含有する過酸化水素を分解除去する必要がある任意の液体であってよい。過酸化水素を含む液体は、好ましくは過酸化水素を含む水性溶媒（アルコール成分を少量含んでもよい）である。より具体的には、過酸化水素を含む液体としては、限定するものではないが、例えば、半導体ウエハーのエッチングや洗浄、繊維の晒しの工程、紙の漂白、脱墨、無菌充填関連の食品プラントの殺菌、洗浄、かずのこの漂白などの過酸化水素を用いる任意の作業工程を行う工場で生成される過酸化水素含有廃液、それらの工場から排出される排水、過酸化水素を使用する試験又は実験で生じる廃液、公衆浴場におけるレジオネラ菌殺菌処理後の下水、過酸化水素が流入しているか又はその恐れがある下水、河川水、湖水、若しくは海水などが挙げられる。 The liquid containing hydrogen peroxide to be treated by this method may be any liquid that needs to decompose and remove the hydrogen peroxide contained therein. The liquid containing hydrogen peroxide is preferably an aqueous solvent containing hydrogen peroxide (which may contain a small amount of an alcohol component). More specifically, the liquid containing hydrogen peroxide includes, but is not limited to, for example, a food plant for semiconductor wafer etching and cleaning, fiber bleaching, paper bleaching, deinking, and aseptic filling. Hydrogen peroxide-containing waste liquid produced in factories that perform any work process using hydrogen peroxide, such as sterilization, washing, and bleaching of waste, wastewater discharged from those factories, tests or experiments using hydrogen peroxide Sewage generated in the public bath, sewage after sterilization treatment of Legionella in public baths, sewage into which hydrogen peroxide is inflow or at risk, river water, lake water, sea water, and the like.
過酸化水素の分解処理を行うには、本発明に係るサイクロバクター属菌、細胞抽出液、カタラーゼ、及び形質転換細胞からなる群より選択される少なくとも１つを、そのような過酸化水素を含む液体に、任意の方法で接触させればよく、例えば当該過酸化水素を含む液体に直接添加してもよいし、任意の固相（例えば、シリカ、活性炭、ガラス、若しくはプラスチック等の各種材料から製造した、微粒子、支持板、繊維状担体等の担体）などに固定して固相触媒の形態で投入してもよい。サイクロバクター属菌は、培養して得られる培養物の形態で、過酸化水素を含む液体に添加してもよい。さらに、サイクロバクター属菌の菌体又は細胞抽出液を透析膜等の低分子のみ透過させるような袋に収納して、この袋を、過酸化水素含有廃液などの過酸化水素を含む液体中に入れてもよい。この際、本発明に係るサイクロバクター属菌等を添加する、過酸化水素を含む液体の温度やpH等は、カタラーゼの活性が保持される条件範囲に調整することが望ましい。例えば、温度は15〜45℃が望ましく、pHは6〜10が望ましい。 In order to perform the decomposition treatment of hydrogen peroxide, at least one selected from the group consisting of the genus Cyclobacter according to the present invention, cell extract, catalase, and transformed cells, contains such hydrogen peroxide. What is necessary is just to make it contact with a liquid by arbitrary methods, for example, you may add directly to the liquid containing the said hydrogen peroxide, or from arbitrary solid phases (for example, various materials, such as a silica, activated carbon, glass, or a plastics). It may be fixed to the produced fine particles, a support plate, a fibrous carrier or the like) and charged in the form of a solid phase catalyst. Cyclobacter spp. May be added to a liquid containing hydrogen peroxide in the form of a culture obtained by culturing. Furthermore, the cells or cell extract of the genus Cyclobacter are stored in a bag that allows only low molecules such as dialysis membranes to pass through, and this bag is placed in a liquid containing hydrogen peroxide such as a hydrogen peroxide-containing waste liquid. May be put in. At this time, it is desirable to adjust the temperature, pH, etc. of the liquid containing hydrogen peroxide to which the Cyclobacter spp. For example, the temperature is desirably 15 to 45 ° C., and the pH is desirably 6 to 10.
本発明に係るこのような過酸化水素の分解処理方法により、高効率に過酸化水素を酸素と水に分解することで、溶液中の過酸化水素を良好に除去することができる。 By such a method for decomposing hydrogen peroxide according to the present invention, hydrogen peroxide in a solution can be favorably removed by efficiently decomposing hydrogen peroxide into oxygen and water.
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[実施例１] 細菌株の分離
北海道留萌市の食品加工工場から採取した工場排水から、過酸化水素含有培地での生育能および菌体からの細胞抽出液の過酸化水素分解活性を指標に、高い過酸化水素分解活性を有する細菌株を分離した。
[Example 1] Isolation of bacterial strains From plant wastewater collected from a food processing plant in Rumoi City, Hokkaido, based on the ability to grow in a hydrogen peroxide-containing medium and the hydrogen peroxide decomposing activity of cell extracts from bacterial cells, A bacterial strain with high hydrogen peroxide degrading activity was isolated.
具体的には、まず、採取した水試料を過酸化水素の濃度が10 mMになる様に調整したPYS-2寒天平板培地（カゼインペプトン8 g、酵母エキス3 g、塩化ナトリウム5 g、寒天15 g; pH 7.5）に塗抹して27℃で一週間培養後、出現したコロニーについて、再分離を行い分離株を得た。得られた分離株について100 mlのPYSG培地（PYS-2培地に0.5%グルタミン酸ナトリウムを添加した培地）に接種し、140 rpm、27℃で対数増殖期後期まで振盪培養した後、15,000 × gの遠心分離によって集菌した。フレンチプレス（1,8000 Ib/in2)によって菌体を破壊後、15,000 × gの遠心分離によって未破壊の菌体を取り除き、細胞抽出液を得た。酵素活性による細胞抽出液中の過酸化水素の減少について、分光学的に240 nmの吸光値の経時的変化をモニターし、各細胞抽出液のカタラーゼ活性の活性値を計算した。活性の単位としては、1分間に過酸化水素を1μmol分解する活性を1 U（ユニット）とした。測定の結果に基づき、細胞抽出液のタンパク質1 mg当りのカタラーゼ活性が20,000 U以上の菌株を選抜し、T-3株を得た。 Specifically, first, PYS-2 agar plate medium (8 g of casein peptone, 3 g of yeast extract, 5 g of sodium chloride, agar 15) was prepared by adjusting the collected water sample so that the concentration of hydrogen peroxide was 10 mM. g; pH 7.5) was smeared and cultured at 27 ° C. for one week, and the colonies that appeared were re-separated to obtain isolates. The obtained isolate was inoculated into 100 ml of PYSG medium (PYS-2 medium supplemented with 0.5% sodium glutamate), cultured at 140 rpm at 27 ° C. until the late logarithmic growth phase, and then 15,000 × g Bacteria were collected by centrifugation. After disrupting the cells with a French press (1,8000 Ib / in 2 ), the undestructed cells were removed by centrifugation at 15,000 × g to obtain a cell extract. The decrease in hydrogen peroxide in the cell extract due to enzyme activity was monitored spectroscopically for changes in absorbance at 240 nm, and the activity value of catalase activity in each cell extract was calculated. As an activity unit, 1 U (unit) was defined as an activity for decomposing 1 μmol of hydrogen peroxide per minute. Based on the measurement results, a strain having a catalase activity of 20,000 U or more per 1 mg of protein in the cell extract was selected to obtain a T-3 strain.
[実施例２] 分離菌株の分類
実施例１で分離した細菌株（T-3株）は、常法に従って分析したところ、上述の菌学的性質を有していた。
[Example 2] Classification of isolates The bacterial strain (T-3 strain) isolated in Example 1 was analyzed according to a conventional method, and had the above-mentioned mycological properties.
このT-3株の帰属分類群の同定は、以下のようにして行った。まず分離した菌株（T-3株）をPYS-2寒天斜面培地で27℃で1〜2日間培養し、光学顕微鏡及び電子顕微鏡で観察したところ、グラム染色陰性の桿菌であり芽胞及び運動性は無いことが判明した。また、得られた生理学的、生化学的性状検査結果は、Berger's manual of systematic Bacteriology, second edition（Brenner DJ, Krieg NR, Staley, JT, Garrity GM (2005)Bergey's manual of systematic Bacteriology, 2nd edn. Springer, New York, NY, USA）に記載されているサイクロバクター属細菌の性質と一致していた。 Identification of the taxonomic group of this T-3 strain was performed as follows. First, the isolated strain (T-3 strain) was cultured on a PYS-2 agar slant medium at 27 ° C for 1-2 days, and observed with an optical microscope and an electron microscope. It turned out not to exist. In addition, the obtained physiological and biochemical property test results are shown in Berger's manual of systematic Bacteriology, second edition (Brenner DJ, Krieg NR, Staley, JT, Garrity GM (2005) Bergey's manual of systematic Bacteriology, 2nd edn. , New York, NY, USA).
続いて、分離した菌株について、16S rRNA遺伝子配列に基づく分子系統学的解析を行った。培養したT-3株菌から常法によりDNAを抽出し、それを鋳型として16S rRNA遺伝子に特異的なプライマーを用いてPCRにより16S rRNA遺伝子断片を増幅し、次いでその塩基配列を自動シークエンサーを用いて解析した。得られた16S rRNA遺伝子断片の塩基配列について、配列データベースでのBLAST（ブラスト）サーチによる相同性検索を行い、細菌由来16S rRNAの類似配列を調べた。ヒットした類似配列とT-3株菌の16S rRNA遺伝子配列とのアラインメントをとり、近隣結合法により系統樹を作成したところ、この菌がサイクロバクター属に属することが示された（図１）。この結果、T-3株は、サイクロバクター属（Psychrobacter）に属する菌株であると考えられた。さらに16S rRNA遺伝子配列に基づく系統学上の近縁株サイクロバクター・ニビマリス（Psychrobacter nivimaris）DSM 16093T、サイクロバクター・プロテオリティカス（Psychrobacter proteolyticus）DSM 13887T及びサイクロバクター・アキマリス（Psychrobacter aquimaris）DSM 16329Tに対してDNA-DNA相同性を調べたところ、それぞれ40%、38%及び32%でいずれも同種と考えられる値である70%未満であったことからT-3株はいずれの菌株とも同一種でないことが示された。 Subsequently, the isolated strain was subjected to molecular phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequence. DNA is extracted from the cultured T-3 strain by a conventional method, and a 16S rRNA gene fragment is amplified by PCR using a primer specific for the 16S rRNA gene as a template, and then the base sequence is used with an automatic sequencer. And analyzed. The base sequence of the obtained 16S rRNA gene fragment was subjected to homology search by BLAST search in a sequence database, and similar sequences of bacteria-derived 16S rRNA were examined. An alignment between the hit similar sequence and the 16S rRNA gene sequence of the T-3 strain was made, and a phylogenetic tree was created by the neighborhood joining method, and it was shown that this bacterium belongs to the genus Cyclobacter (FIG. 1). As a result, the T-3 strain was considered to be a strain belonging to the genus Psychrobacter. In addition, phylogenetic related strains Psychrobacter nivimaris DSM 16093 T , Psychrobacter proteolyticus DSM 13887 T and Psychrobacter aquimaris DSM 16329 based on 16S rRNA gene sequence When DNA-DNA homology was examined for T , it was 40%, 38%, and 32%, respectively, and all were less than 70%, which is considered to be the same species. It was shown not to be the same species.
以上の結果から、実施例１で分離した菌株（T-3株）は、サイクロバクター属（Psychrobacter）の新菌種に属するものとして同定された。本発明者らは、この分離した菌株を、サイクロバクター・エスピー（Psychrobacter sp.）T-3株と名付けた。サイクロバクター・エスピーT-3株は、2008年3月7日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、受託番号FERM P-21525として寄託されている。 From the above results, the strain (T-3 strain) isolated in Example 1 was identified as belonging to a new strain of the genus Psychrobacter. The present inventors named this isolated strain as a Psychrobacter sp. T-3 strain. Cyclobacter SP T-3 shares were registered on March 7, 2008 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki, Japan). Deposited as FERM P-21525.
[実施例３] 細胞抽出液を用いた過酸化水素分解試験
サイクロバクター・エスピーT-3株、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、アエロモナス・ハイドロフィーラ（Aeromonas hydrophila）、アルカリゲネス・フェーカリス（Alcaligenes faecalis）、シュードモナス・フローレッセンス（Pseudomonas fluorescence）、大腸菌（Escherichia coli）、腸炎ビブリオ菌（Vibrio parahemolyticus）を、それぞれ対数期後期から定常期まで同じスケ−ルで培養し、遠心分離（10,000×g、15分）で集菌した。集菌後、加圧型細胞破壊装置（フレンチプレス）で菌体を破壊し、得られた菌体破壊液をさらに遠心分離（10,000×g、15分）することにより未破壊の菌体を取り除いた液を細胞抽出液とした。一方、30 mMの過酸化水素液を50 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）中で調製し、この1 mlを1 cm 光透過の石英セルに入れ、反応基質として用いた。
[Example 3] Hydrogen peroxide decomposition test using cell extract Cyclobacter sp. T-3 strain, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila Incubate Alcaligenes faecalis, Pseudomonas fluorescence, Escherichia coli, Vibrio parahemolyticus on the same scale from late log phase to stationary phase, respectively, and centrifuge Bacteria were collected by separation (10,000 × g, 15 minutes). After collecting the cells, the cells were destroyed with a pressurized cell disruption device (French press), and the resulting cell destruction solution was further centrifuged (10,000 × g, 15 minutes) to remove undestructed cells. The solution was used as a cell extract. On the other hand, a 30 mM hydrogen peroxide solution was prepared in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and 1 ml thereof was placed in a 1 cm light-transmitting quartz cell and used as a reaction substrate.
過酸化水素の分解反応は、上記で調製した過酸化水素液を入れた石英セルに、上記の細胞抽出液 数μlを粗酵素液としてマイクロシリンジで投入することによって開始させた。この反応は20℃で行った。反応混合液中の過酸化水素濃度の減少を分光光度計で240 nmでの吸光度を経時的にモニターし、減少の初速度を見積もることにより、各細胞抽出液の活性値を計算した。活性の単位としては、1分間に過酸化水素を1μmol分解する活性を1 U（ユニット）とした。 The decomposition reaction of hydrogen peroxide was started by introducing several μl of the cell extract as a crude enzyme solution into a quartz cell containing the hydrogen peroxide solution prepared above with a microsyringe. This reaction was carried out at 20 ° C. The activity value of each cell extract was calculated by monitoring the decrease in the hydrogen peroxide concentration in the reaction mixture over time by measuring the absorbance at 240 nm with a spectrophotometer and estimating the initial rate of decrease. As an activity unit, 1 U (unit) was defined as an activity for decomposing 1 μmol of hydrogen peroxide per minute.
その結果、各細胞抽出液の菌体タンパク質（粗タンパク質）1mg当たりの活性値は以下の通りであった。 As a result, the activity value per 1 mg of bacterial cell protein (crude protein) in each cell extract was as follows.
サイクロバクター・エスピーT-3株 23,000 U／mgタンパク質
ミクロコッカス・ルテウス 12,341 U／mg タンパク質
黄色ブドウ球菌 1,425 U／mg タンパク質
アエロモナス・ハイドロフィーラ 622 U／mg タンパク質
アルカリゲネス・フェーカリス 540 U／mg タンパク質
シュードモナス・フローレッセンス 290 U／mg タンパク質
大腸菌 44 U／mg タンパク質
腸炎ビブリオ菌 15 U／mg タンパク質
Cyclobacter sp. T-3 strain 23,000 U / mg protein Micrococcus luteus 12,341 U / mg protein Staphylococcus aureus 1,425 U / mg protein Aeromonas hydrophila 622 U / mg protein Alcaligenes faecalis 540 U / mg protein Pseudomonas flow Less 290 U / mg protein E. coli 44 U / mg protein Vibrio parahaemolyticus 15 U / mg protein
この結果から、サイクロバクター・エスピーT-3株菌が、他の菌と比べて格段に高いカタラーゼ活性を示すことが判明した。なおこの段階では菌体タンパク質中に夾雑タンパク質が多く含まれるため、各細胞抽出液の活性値はより低い値として算出されていると思われる。 From this result, it was found that Cyclobacter sp. T-3 strain exhibits a significantly higher catalase activity than other bacteria. At this stage, the bacterial protein contains a lot of contaminating proteins, so the activity value of each cell extract seems to be calculated as a lower value.
なお市販のカタラーゼの生産菌であるミクロコッカス・ルテウス等の真菌は、菌体が頑丈で破壊しにくく、菌体内酵素を抽出するのにかなり手間が掛かる。またミクロコッカス・ルテウスの生育速度は遅く、カタラーゼ生産の効率は良くない。これに対し、サイクロバクター・エスピーT-3株菌は破壊しやすく、菌体内のカタラーゼを容易に取得することができただけでなく、生育速度が速いためカタラーゼ生産効率に非常に優れていた。 In addition, fungi such as Micrococcus luteus, which are commercially available catalase producing bacteria, are strong and difficult to destroy, and it takes considerable time to extract the intracellular enzyme. Also, the growth rate of Micrococcus luteus is slow and the efficiency of catalase production is not good. On the other hand, Cyclobacter sp. Strain T-3 strain was easy to destroy and could not only easily acquire catalase in the cells, but also had a very high growth rate and was very excellent in catalase production efficiency.
[実施例４] サイクロバクター・エスピーT-3株由来のカタラーゼの特性解析１
サイクロバクター・エスピーT-3株を培養培地（上記のPYS-3培地）中、27℃で24時間培養した。得られた2リットルの培養物を遠心分離（10,000×g、15分）により菌体を回収し、加圧型細胞破壊装置（フレンチプレス）で菌体を破壊し、得られた菌体破壊液をさらに遠心分離（10,000×g、15分）することにより未破壊の菌体を取り除いて得られた無細胞抽出液を細胞抽出液とした。得られた細胞抽出液を陰イオン交換クロマトグラフィー（DEAE-Toyopaerl、東ソー）にかけ、溶出させたカタラーゼ画分を次に疎水性相互作用クロマトグラフィー（Phenyl Sepharose、GEヘルスケアーサイエンス）にかけて精製を行った。
[Example 4] Characteristic analysis 1 of catalase derived from Cyclobacter sp. Strain T-3
Cyclobacter sp. Strain T-3 was cultured in a culture medium (PYS-3 medium described above) at 27 ° C. for 24 hours. The resulting 2-liter culture is centrifuged (10,000 × g, 15 minutes) to recover the cells, and the cells are destroyed with a pressurized cell disrupter (French press). Furthermore, a cell-free extract obtained by removing unbroken cells by centrifugation (10,000 × g, 15 minutes) was used as a cell extract. The obtained cell extract was subjected to anion exchange chromatography (DEAE-Toyopaerl, Tosoh), and the eluted catalase fraction was then purified by hydrophobic interaction chromatography (Phenyl Sepharose, GE Healthcare Science). .
このようにして精製した画分については、電気泳動により、均一な精製標品が得られたことが確認された。このカタラーゼ精製標品のサブユニット１個の推定分子量は約60 kDaであった。 For the fraction purified in this way, it was confirmed by electrophoresis that a uniform purified sample was obtained. The estimated molecular weight of one subunit of the purified catalase preparation was about 60 kDa.
次に、得られたサイクロバクター・エスピーT-3株由来のカタラーゼについて、(1) 比活性、(2) 活性の温度依存性、及び(3) 活性のpH依存性の検討を行った。なお対照としては、市販の牛肝臓カタラーゼと、ミクロコッカス・ルテウス由来のカタラーゼを使用した。カタラーゼ活性は、過酸化水素分解活性として以下の通り測定した。まず30 mMの過酸化水素液を50 mMリン酸緩衝液（pH 7.0）中で調製し、この1 mlを1 cm 光透過の石英セルに入れ、反応基質として用いた。過酸化水素の分解反応は20℃で行い、上記で調製した過酸化水素液を入れた石英セルに、上記の細胞抽出液 数μlを酵素液としてマイクロシリンジで投入することによって開始させた。実施例１と同様に、分光光度計を用いて240 nmでの吸光度（吸光値）を測定することにより反応液中の過酸化水素量を算出し、その経時的変化をモニターした。上記と同様に、活性の単位は、1分間に過酸化水素を1μmol分解する活性を1 U（ユニット）とした。 Next, the obtained catalase derived from Cyclobacter sp. Strain T-3 was examined for (1) specific activity, (2) temperature dependence of activity, and (3) pH dependence of activity. As controls, commercially available cattle liver catalase and catalase derived from Micrococcus luteus were used. Catalase activity was measured as hydrogen peroxide decomposition activity as follows. First, 30 mM hydrogen peroxide solution was prepared in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and 1 ml of this solution was placed in a 1 cm light-transmitting quartz cell and used as a reaction substrate. The decomposition reaction of hydrogen peroxide was carried out at 20 ° C., and the reaction was started by introducing several μl of the above cell extract as an enzyme solution into a quartz cell containing the hydrogen peroxide solution prepared above with a microsyringe. Similarly to Example 1, the amount of hydrogen peroxide in the reaction solution was calculated by measuring the absorbance (absorption value) at 240 nm using a spectrophotometer, and the change with time was monitored. Similarly to the above, the activity unit was defined as 1 U (unit), which is an activity for decomposing 1 μmol of hydrogen peroxide per minute.
この測定により、サイクロバクター・エスピーT-3株由来のカタラーゼ精製標品の比活性（精製カタラーゼ1mg当たりの過酸化水素分解活性）は、222,000 U／mgタンパク質であることが示された。 From this measurement, it was shown that the specific activity of the purified catalase derived from Cyclobacter sp. Strain T-3 (hydrogen peroxide decomposing activity per 1 mg of purified catalase) was 222,000 U / mg protein.
次に、上記で得たカタラーゼ精製標品の数μlを、10 mMトリス-塩酸緩衝液（pH 8.0）に溶解した30 mMの過酸化水素液に混合して、反応温度10〜85℃の範囲内の各種温度で過酸化水素分解活性を測定した。活性値が約222,000 U／mg精製カタラーゼタンパク質であった反応温度を、カタラーゼの至適温度とした。その結果、サイクロバクター・エスピーT-3株は10〜55℃で至適温度を示した。一方、市販の牛肝臓カタラーゼとミクロコッカス・ルテウス由来のカタラーゼは、10〜60℃で至適温度を示した。 Next, several μl of the catalase purified sample obtained above is mixed with 30 mM hydrogen peroxide solution dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and the reaction temperature is in the range of 10 to 85 ° C. The hydrogen peroxide decomposition activity was measured at various temperatures. The reaction temperature at which the activity value was about 222,000 U / mg purified catalase protein was determined as the optimum temperature for catalase. As a result, Cyclobacter sp. T-3 strain showed an optimum temperature at 10 to 55 ° C. On the other hand, commercially available cattle liver catalase and catalase derived from Micrococcus luteus showed optimum temperatures at 10 to 60 ° C.
さらに、上記で得たカタラーゼ精製標品数μlを、上記と同様の反応液（pH3〜10の範囲内の各種pH値に調整したもの）に添加し、過酸化水素分解活性を測定した。活性値が約222,000 U／mg精製カタラーゼタンパク質であった反応条件のpHを、カタラーゼの至適pHとした。その結果、サイクロバクター・エスピーT-3株由来の精製カタラーゼはpH 5〜10で至適pHを示し、pH 4及びpH 3においてもそれぞれ至適pH時の活性の50％および20％の活性を示した。一方、市販の牛肝臓カタラーゼとミクロコッカス・ルテウス由来のカタラーゼは、pH 6〜8で至適pHを示した。しかしその牛肝臓カタラーゼとミクロコッカス・ルテウス由来のカタラーゼはいずれもpH 4では至適pH時の活性の45％以下の活性しか示さず、pH 3では全く活性が見られなかった。
Furthermore, several μl of the catalase purified sample obtained above was added to the same reaction solution (adjusted to various pH values within the range of
このように、サイクロバクター・エスピーT-3株由来のカタラーゼは、高いカタラーゼ活性を有し、かつ幅広いpH範囲で作用することが示された。 Thus, it was shown that the catalase derived from Cyclobacter sp. T-3 strain has high catalase activity and acts in a wide pH range.
[実施例５] サイクロバクター・エスピーT-3株由来のカタラーゼの特性解析２
サイクロバクター・エスピーT-3株は実施例４と同様の条件で培養した。得られた20リットルの培養物を遠心分離（10,000×g、15分）して80gの菌体を回収し、これをさらに加圧型細胞破壊装置（フレンチプレス）にかけて菌体を破壊し、得られた菌体破壊液をさらに遠心分離（10,000×g、15分）して未破壊の菌体を取り除いて細胞抽出液とした。この細胞抽出液を陰イオン交換樹脂（DEAE-Toyopearl）に一度かけたところ、カタラーゼ8.8 gを含む、167,000 U／mgタンパク質の過酸化水素分解活性を示す粗酵素標品を回収することができた。カタラーゼのこの活性は、牛肝臓カタラーゼの精製標品の約2倍に相当していた。この結果は、サイクロバクター・エスピーT-3株の細胞抽出物由来の酵素精製物が、非常に高いカタラーゼ含量及びカタラーゼ活性を有することを示していた。
[Example 5] Characteristic analysis 2 of catalase derived from Cyclobacter sp. Strain T-3
Cyclobacter sp. T-3 strain was cultured under the same conditions as in Example 4. The obtained 20-liter culture was centrifuged (10,000 × g, 15 minutes) to recover 80 g of cells, which was further subjected to a pressure cell disrupter (French press) to destroy the cells. The microbial cell disruption solution was further centrifuged (10,000 × g, 15 minutes) to remove undestructed microbial cells to obtain a cell extract. When this cell extract was applied to an anion exchange resin (DEAE-Toyopearl) once, a crude enzyme preparation showing a hydrogen peroxide-degrading activity of 167,000 U / mg protein containing 8.8 g of catalase could be recovered. . This activity of catalase was equivalent to approximately twice that of a purified sample of cattle liver catalase. This result showed that the enzyme purified product derived from the cell extract of Cyclobacter sp. Strain T-3 had a very high catalase content and catalase activity.
次いで、このサイクロバクター・エスピーT-3株由来のカタラーゼを、実施例４と同様にして、各種pHにて60℃で15分間インキュベートし、残存活性を測定した。その結果、本酵素が最も安定なpHは8.0であることが示された。 Subsequently, the catalase derived from the Cyclobacter sp. T-3 strain was incubated at 60 ° C. for 15 minutes at various pHs in the same manner as in Example 4 to measure the residual activity. As a result, it was shown that the most stable pH of this enzyme is 8.0.
そこでこのカタラーゼを、実施例４と同様にして、反応pH8.0にて各種温度で15分間インキュベートし、残存活性を測定したところ、本酵素は45℃まで安定（45℃での残存活性：100％）であることが示された。60℃においては約50％の残存活性を示した。 Thus, this catalase was incubated at various temperatures for 15 minutes at a reaction pH of 8.0 in the same manner as in Example 4 and the residual activity was measured. As a result, the enzyme was stable up to 45 ° C. (residual activity at 45 ° C .: 100 %). The residual activity was about 50% at 60 ° C.
[実施例６] 実施例４で得たサイクロバクター・エスピーT-3株由来のカタラーゼの精製標品を用いて、タンパク質自動シークエンサー(Applied Biosystems, model 491 Protein Sequencer）を用いてエドマン分解法により、このカタラーゼのN末端アミノ酸配列を決定した(N末端配列：SNDMNDKKXPYDMTPLXMXN（配列番号３）)。得られたN末端アミノ酸配列と細菌由来カタラーゼの共通アミノ酸配列から、カタラーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーを作成した（フォワードプライマー：5'- AAYGAYAGAAYGAYAARAA -3'（配列番号４）、リバースプライマー：5'- TGNGCRTCNGCRTARTTRAA -3'（配列番号５））。次いで、これらのプライマーを用いたPCR反応により、1 kbpの増幅断片を得た。PCR反応液は、Ex Taq（5 units/μl） 1μl; 10 × Ex Taqバッファー; dNTP Mixture（各2.5 mM）8μl; 鋳型DNA 100 ng; フォワードプライマー（100 pmol/μl）1μl; リバースプライマー（100 pmol/μl）1μlを混合し、滅菌水を添加して総量を100μlとして用いた。PCRサイクルは、ステップ1として94℃で1分；ステップ2として94℃で30秒；ステップ3として44℃で30秒；ステップ4として72℃で1分（1分/1 kbp）の後、ステップ2に戻ってステップ2〜4を全部で30サイクル行い、さらにステップ5として4℃で休止、の条件で行った。
[Example 6] Using the purified catalase sample derived from Cyclobacter sp. Strain T-3 obtained in Example 4, using an automated protein sequencer (Applied Biosystems, model 491 Protein Sequencer), The N-terminal amino acid sequence of this catalase was determined (N-terminal sequence: SNDMNDKKXPYDMTPLXMXN (SEQ ID NO: 3)). Primers for amplifying the catalase gene were prepared from the obtained N-terminal amino acid sequence and the common amino acid sequence of bacterial catalase (forward primer: 5'-AAYGAYAGAAYGAYAARAA-3 '(SEQ ID NO: 4), reverse primer: 5' -TGNGCRTCNGCRTARTTRAA-3 '(SEQ ID NO: 5)). Next, an amplified fragment of 1 kbp was obtained by PCR reaction using these primers. PCR reaction solution: Ex Taq (5 units / μl) 1 μl; 10 × Ex Taq buffer; dNTP Mixture (2.5 mM each) 8 μl; Template DNA 100 ng; Forward primer (100 pmol / μl) 1 μl; Reverse primer (100 pmol) 1 μl) was mixed, and sterilized water was added to make a total volume of 100 μl. PCR cycle is 1 minute at 94 ° C. as step 1; 30 seconds at 94 ° C. as step 2; 30 seconds at 44 ° C. as
このようにして取得した増幅産物について塩基配列を決定し、その内部配列に基づいて同カタラーゼ遺伝子全長を含む領域を増幅可能なプライマー対を設計した（5'-GTATATTGAGTAATGTCATT-3'（配列番号６）、及び5'-GTCGGTAATAATACGCCGG-3'（配列番号７））。それらの合成プライマーおよびTaKaRa PCR in vitro Cloning Kit（TAKARA）を使用して同カタラーゼ遺伝子全長を含む断片を増幅し、同カタラーゼ遺伝子全長の遺伝子配列を決定した。TaKaRa PCR in vitro Cloning Kitによる遺伝子の増幅は、付属したマニュアルに従い行った。 The nucleotide sequence of the amplification product thus obtained was determined, and a primer pair capable of amplifying a region containing the full length of the catalase gene was designed based on the internal sequence (5'-GTATATTGAGTAATGTCATT-3 '(SEQ ID NO: 6) And 5′-GTCGGTAATAATACGCCGG-3 ′ (SEQ ID NO: 7)). Using these synthetic primers and TaKaRa PCR in vitro Cloning Kit (TAKARA), a fragment containing the full-length catalase gene was amplified, and the gene sequence of the full-length catalase gene was determined. Amplification of the gene using TaKaRa PCR in vitro Cloning Kit was performed according to the attached manual.
こうして単離されたカタラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームの配列（1533bp）を配列番号１に示した。また配列番号１に示される塩基配列によってコードされるカタラーゼのアミノ酸配列（510アミノ酸残基）を配列番号２に示した。配列番号２のアミノ酸配列のN末端配列は、上記でエドマン分解法により決定したN末端アミノ酸配列と完全に一致していたことから、上記のカタラーゼの精製標品が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有することが示された。 The isolated open reading frame sequence (1533 bp) of the catalase gene thus isolated is shown in SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence (510 amino acid residues) of catalase encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2. Since the N-terminal sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was completely identical to the N-terminal amino acid sequence determined by the Edman degradation method described above, the purified product of catalase described above was represented by SEQ ID NO: 2. It was shown to have
本発明に係るサイクロバクター・エスピーT-3株菌は、産業上頻用されているミクロコッカス・ルテウスよりも格段に破壊しやすいため菌体内のカタラーゼを容易に取得でき、また生育速度も速いことから、高効率でのカタラーゼ生産に有利に使用することができる。サイクロバクター・エスピーT-3株菌を用いて、典型的には僅か2ステップ（陰イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー）で、カタラーゼ精製標品を回収することができる。 Cyclobacter sp. T-3 strain according to the present invention is much easier to destroy than Micrococcus luteus, which is frequently used in the industry, so that catalase in the bacterial body can be easily obtained and the growth rate is fast. It can be advantageously used for catalase production with high efficiency. Using the Cyclobacter sp. T-3 strain, the catalase purified preparation can be recovered, typically in just two steps (anion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography).
サイクロバクター・エスピーT-3株菌由来の本発明に係るカタラーゼは、従来のカタラーゼと比べて顕著に高いカタラーゼ活性（過酸化水素分解活性）を示すことから、例えば過酸化水素を大量に含む工業廃水の処理などに好適に使用することができる。本発明に係るカタラーゼはまた、市販の牛肝臓カタラーゼやミクロコッカス・ルテウス由来のカタラーゼ等の従来のカタラーゼよりもかなり広いpH作用範囲を有することから、より広範囲な用途に用いることができる。 The catalase according to the present invention derived from Cyclobacter sp. T-3 strain exhibits a significantly higher catalase activity (hydrogen peroxide decomposition activity) than conventional catalase. It can be suitably used for the treatment of wastewater. The catalase according to the present invention also has a considerably wider pH range than conventional catalases such as commercially available cattle liver catalase and micrococcus luteus-derived catalase, and therefore can be used for a wider range of applications.
本発明に係るサイクロバクター・エスピーT-3株菌又はそれに由来するカタラーゼを用いた過酸化水素の分解処理方法は、T-3株菌やそのカタラーゼの上記のような優れた性質を利用して、高効率かつ簡便に（例えば、過酸化水素含有廃水から）過酸化水素を除去するために使用することができる。 The method for decomposing hydrogen peroxide using the Cyclobacter sp. T-3 strain or the catalase derived therefrom according to the present invention utilizes the superior properties of the T-3 strain and its catalase as described above. It can be used to remove hydrogen peroxide with high efficiency and convenience (for example, from wastewater containing hydrogen peroxide).
さらに本発明に係るカタラーゼの製造方法は、従来のカタラーゼ生産に見られる様々な問題、例えば(a) 菌体に含まれている含有量の低さ、(2) 長い培養時間、(3) 菌体破壊に掛かるコストの高さ（菌体の破壊しにくさ）、(4) 遅い反応速度、(5) 酵素回収や精製に要するコストの高さ、(6) 広範な反応条件での安定性の低さ等を改善し、低コストで効率良くカタラーゼを生産するために用いることができる。この製造方法によれば、真菌類由来のカタラーゼよりも高活性なカタラーゼを容易に調製することができる。この製造方法によれば、例えば臨床検査用などの精製カタラーゼについても、精製ステップが簡便になるため活性が高い酵素を効率良く供給することができる。 Furthermore, the method for producing catalase according to the present invention has various problems found in conventional catalase production, such as (a) low content contained in the cells, (2) long culture time, (3) bacteria High cost to destroy the body (hardness to destroy the cells), (4) Slow reaction rate, (5) High cost for enzyme recovery and purification, (6) Stability under a wide range of reaction conditions It can be used to improve catalysis, etc., and to produce catalase efficiently at low cost. According to this production method, a catalase having a higher activity than a fungal-derived catalase can be easily prepared. According to this production method, for example, a purified catalase for clinical testing can be efficiently supplied with a highly active enzyme because the purification step is simplified.
配列番号４〜７の配列はプライマーである。 The sequences of SEQ ID NOs: 4 to 7 are primers.
Claims (10)
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質 The catalase comprised from the catalase subunit which is a protein of the following (a) or (b).
(a) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(b) a protein comprising a catalase having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having hydrogen peroxide decomposing activity
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、過酸化水素分解活性を有するカタラーゼを構成するタンパク質をコードするDNA
(c) 配列番号１に示される塩基配列からなるDNA DNA encoding the catalase subunit protein of any of the following (a) to (c) .
(a) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(b) a DNA encoding a protein constituting a catalase having a hydrogen peroxide-decomposing activity, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
(c) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
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