JP5354542B2 - P. falciparum vaccine candidate molecule - Google Patents
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Description
本発明は、マラリアに対するワクチンに関する。詳細には、本発明は、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ遺伝子のマラリアワクチンとしての使用に関する。 The present invention relates to a vaccine against malaria. Specifically, the present invention relates to the use of the malaria parasite GPI8P transamidase gene as a malaria vaccine.
マラリアは熱帯、亜熱帯地域の７０ヶ国以上に分布している原虫感染症である。全世界で年間３〜５億人、累計で約８億人の患者がマラリアに感染し、１００〜１５０万人がマラリアで死亡すると報告されている。
マラリアの病原体は単細胞生物であるマラリア原虫で、ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．）によって媒介される。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）の四種が存在する。特に熱帯熱マラリア原虫によるマラリアは症状が重い。
マラリアワクチンとして最も高い防御効果が確認されているのは、感染型マラリア原虫であるスポロゾイトを放射線照射により不活化したワクチンである。しかし、生産に高度の施設がいるため、開発途上地域においては普及に不向きである。そのため、強力且つ調製が簡易な新たなワクチンの開発が期待されている。しかし、ヒトマラリアは基本的には霊長類にしか感染しないため、ワクチンの有効性の確認は、サル・ヒトを用いた実験か、マウスマラリア原虫をマウスに感染させる模擬的実験によってしか行うことができない。従って、ヒトマラリアに対する新たなワクチンの開発は困難を極めている。
上記ワクチンと同等の効果を有するワクチンタンパクを精製し、サブユニットワクチン（ペプチド製剤）として生産するのがより実用的であると考えられている。これまで、いくつかのマラリアワクチン候補分子が発見され、一部は臨床治験が開始されているが、有効性が確認されたとの報告はなされていない。
また、生ワクチンと比較して、生産性や保存等の取り扱いが非常に簡便なワクチンとしてＤＮＡワクチンが知られている。ＤＮＡワクチンは容易に製造することが可能であるので、変異が早いウイルスに対して、速やかに改良型ワクチンを提供することが可能である。しかしながら、熱帯熱マラリアに対して有効なＤＮＡワクチンは未だ開発されていない。
一方、マラリア原虫のゲノム配列の解析により、ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ遺伝子のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列が明らかとなっている（非特許文献１）。しかし、該遺伝子のマラリアワクチンとしての使用については報告がない。
The pathogen of malaria is a unicellular organism, Plasmodium protozoa, which is mediated by Anopheles spp. There are four types of P. falciparum, P. falciparum (P. vivax), P. falciparum (P. malariae), and oval malaria protozoa (P. ovale). Malaria caused by Plasmodium falciparum is particularly severe.
The highest protective effect of the malaria vaccine has been confirmed is a vaccine obtained by inactivating sporozoite, an infectious malaria parasite, by irradiation. However, because there are sophisticated facilities for production, it is not suitable for popularization in developing regions. Therefore, development of a new vaccine that is powerful and easy to prepare is expected. However, human malaria basically infects only primates, so the effectiveness of the vaccine can only be confirmed by experiments using monkeys or by simulating experiments that infect mice with mouse malaria parasites. Can not. Therefore, development of a new vaccine against human malaria is extremely difficult.
It is considered more practical to purify a vaccine protein having the same effect as the above vaccine and produce it as a subunit vaccine (peptide preparation). So far, several malaria vaccine candidate molecules have been discovered, and some clinical trials have been started, but no report has been made that their effectiveness has been confirmed.
In addition, DNA vaccines are known as vaccines that are very easy to handle, such as productivity and storage, compared to live vaccines. Since a DNA vaccine can be easily produced, it is possible to provide an improved vaccine quickly against a virus with a quick mutation. However, an effective DNA vaccine against P. falciparum has not been developed yet.
On the other hand, the amino acid sequence and nucleotide sequence of the GPI8P transamidase gene have been revealed by analysis of the genome sequence of malaria parasite (Non-patent Document 1). However, there is no report on the use of this gene as a malaria vaccine.
本発明の目的は、強力且つ調製が簡易な新たなマラリアワクチンを提供することである。 The object of the present invention is to provide a new malaria vaccine which is powerful and easy to prepare.
本発明者らは、マラリア、特にヒトへの感染性を有する熱帯熱マラリアに対して有効なワクチンを開発すべく、強力なワクチン活性を有する候補分子を探索した。
熱帯熱マラリアは霊長類以外の哺乳動物（例えばマウス）へは感染しないため、動物実験により熱帯熱マラリアに対するワクチンの効果を直接確認することは困難である。そこで本発明者らは、マラリアゲノムの情報から熱帯熱マラリアの遺伝子と相同性が高いマウスマラリア（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）の細胞表面タンパク（ＧＰＩアンカータンパク）をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで９つ選択し、これらのｃＤＮＡを調製した後に、市販の発現ベクターに組み込み、ＤＮＡワクチンとしてマウスに投与した。ＤＮＡワクチンの投与は圧縮空気を用いた皮下注射により行い、プライムブースター後、マラリア原虫をマウスに感染させ、防御効果を観察した。その結果、ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分ペプチドをコードする発現ベクターの投与により、マラリア原虫の感染が強力に抑制された。該ワクチン投与群ではマラリア原虫に対する血中抗体が確認されたことから、この感染防除効果は、生体内において発現されたＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分ペプチドに対する特異的免疫反応が誘導されたことによるものと考えられた。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
即ち、本発明は以下に関する。
［１］以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質を含むマラリアワクチン：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
［２］該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、［１］のワクチン。
［３］該物質が（３）の発現ベクターである、［１］のワクチン。
［４］マラリア感染に対する予防接種に使用するための、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
［５］該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、［４］記載の物質。
［６］（３）の発現ベクターである、［４］記載の物質。
［７］哺乳動物に、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質の有効量を投与することを含む、該哺乳動物におけるマラリア感染の予防方法：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
［８］該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、［７］の方法。
［９］該物質が（３）の発現ベクターである、［７］の方法。
［１０］マラリアワクチンを製造するための、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質の使用：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
［１１］該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、［１０］の使用。
［１２］該物質が（３）の発現ベクターである、［１０］の使用。The present inventors searched for candidate molecules having potent vaccine activity in order to develop an effective vaccine against malaria, in particular, P. falciparum having infectivity to humans.
Since falciparum malaria does not infect mammals other than primates (eg, mice), it is difficult to directly confirm the effect of the vaccine against falciparum malaria by animal experiments. Therefore, the present inventors selected nine cell surface proteins (GPI anchor proteins) of mouse malaria (P. yoelii) having high homology with the gene of P. falciparum from the information of malaria genome in silico, and these cDNAs. Was prepared and then incorporated into a commercially available expression vector and administered to mice as a DNA vaccine. The DNA vaccine was administered by subcutaneous injection using compressed air. After the prime booster, mice were infected with malaria parasites, and the protective effect was observed. As a result, malaria parasite infection was strongly suppressed by administration of an expression vector encoding a partial peptide of GPI8P transamidase. Since anti-blood antibodies against malaria parasites were confirmed in the vaccine administration group, this infection control effect is considered to be due to the induction of a specific immune response against the partial peptide of GPI8P transamidase expressed in vivo. It was.
Based on the above findings, the present invention has been completed.
That is, the present invention relates to the following.
[1] Malaria vaccine containing any substance selected from the following (1) to (3):
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase;
(2) a polypeptide comprising a partial amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase, wherein the partial amino acid sequence has a length of 6 amino acids or more and has immunogenicity; and (3) ( An expression vector capable of expressing the polypeptide of 1) or (2).
[2] The vaccine of [1], wherein the partial amino acid sequence is contained within the region of amino acids 17-240 of the amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase.
[3] The vaccine of [1], wherein the substance is the expression vector of (3).
[4] Any substance selected from the following (1) to (3) for use in vaccination against malaria infection:
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase;
(2) a polypeptide comprising a partial amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase, wherein the partial amino acid sequence has a length of 6 amino acids or more and has immunogenicity; and (3) ( An expression vector capable of expressing the polypeptide of 1) or (2).
[5] The substance according to [4], wherein the partial amino acid sequence is contained in the region of amino acids 17-240 of the amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase.
[6] The substance according to [4], which is the expression vector according to (3).
[7] A method for preventing malaria infection in a mammal, comprising administering to the mammal an effective amount of any substance selected from the following (1) to (3):
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase;
(2) a polypeptide comprising a partial amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase, wherein the partial amino acid sequence has a length of 6 amino acids or more and has immunogenicity; and (3) ( An expression vector capable of expressing the polypeptide of 1) or (2).
[8] The method according to [7], wherein the partial amino acid sequence is included in the region of amino acids 17-240 of the amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase.
[9] The method of [7], wherein the substance is the expression vector of (3).
[10] Use of any substance selected from the following (1) to (3) for producing a malaria vaccine:
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase;
(2) a polypeptide comprising a partial amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase, wherein the partial amino acid sequence has a length of 6 amino acids or more and has immunogenicity; and (3) ( An expression vector capable of expressing the polypeptide of 1) or (2).
[11] The use of [10], wherein the partial amino acid sequence is contained within the region of amino acids 17-240 of the amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase.
[12] Use of [10], wherein the substance is the expression vector of (3).
本発明により、強力且つ調製が簡易な新たなマラリアワクチンが提供される。特に、ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分ペプチドを発現し得る発現ベクターは、マラリアに対するＤＮＡワクチンとして顕著な効果を示すことから、従来のサブユニットワクチンよりもより安価で安定なマラリアワクチンとして有用である。 The present invention provides a new malaria vaccine that is powerful and easy to prepare. In particular, since an expression vector capable of expressing a partial peptide of GPI8P transamidase has a remarkable effect as a DNA vaccine against malaria, it is useful as a cheaper and more stable malaria vaccine than conventional subunit vaccines.
（Ｉ）マラリアワクチン
本発明は、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質を含むマラリアワクチン（以下、本発明のワクチンという場合がある）を提供するものである：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
本明細書中、マラリアの種類は特に限定されない。原虫の種類によってマラリアは、熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、四日熱マラリア、卵形マラリア、マウスマラリア等に分類され、いずれの種類のマラリアも本発明の範囲内に含まれる。マラリアは、好ましくは熱帯熱マラリア又はマウスマラリアである。
本明細書中、マラリア原虫の種類は特に限定されない。マラリア原虫の種類としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、マウスマラリア原虫（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）等を挙げることができる。それぞれの種類のマラリア原虫の感染により、対応する種類のマラリアが発症する。
マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼは公知の遺伝子であり、そのヌクレオチド配列やアミノ酸配列も公知である。熱帯熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列としては配列番号２で表されるアミノ酸配列を挙げることができ、例えば配列番号１で表されるヌクレオチド配列にコードされる。また、熱帯熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列には、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列も含まれる。マラリア原虫の遺伝子を構成するヌクレオチド配列は、自然突然変異により変異することが知られている。このような自然突然変異により生じた配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドも、熱帯熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに含まれる。該アミノ酸配列としては、例えば、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）上記（１）〜（４）の変異が組み合わせれたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）であって、天然に存在するアミノ酸配列が含まれる。
また、マウスマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列としては配列番号４で表されるアミノ酸配列を挙げることができ、例えば配列番号３で表されるヌクレオチド配列にコードされる。また、マウスマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列には、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列も含まれる。マラリア原虫の遺伝子を構成するヌクレオチド配列は、自然突然変異により変異することが知られている。このような自然突然変異により生じた配列番号４とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドも、マウスマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに含まれる。該アミノ酸配列としては、例えば、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）上記（１）〜（４）の変異が組み合わせれたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）であって、天然に存在するアミノ酸配列が含まれる。
他の種類のマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼオルソログのヌクレオチド配列やアミノ酸配列も、本明細書中の配列表に開示された上記ヌクレオチド配列やアミノ酸配列の情報や、公知の配列データベースを利用して、適切なプライマーやプローブを設計し、ＲＴ−ＰＣＲやプラークハイブリダイゼーション等の通常の遺伝子工学的手法を用いて容易に決定することが出来る。
マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの遺伝子配列はマラリア原虫の種類により異なっているため、標的とするマラリアの種類に応じて、ワクチンに用いるＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの由来を変更することが好ましい。即ち、熱帯熱マラリアに対するワクチンを製造する場合には、熱帯熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼが好適に用いられる。三日熱マラリアに対するワクチンを製造する場合には、三日熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼが好適に用いられる。四日熱マラリアに対するワクチンを製造する場合には、四日熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼが好適に用いられる。卵形マラリアに対するワクチンを製造する場合には、卵形マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼが好適に用いられる。マウスマラリアに対するワクチンを製造する場合には、マウスマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼが好適に用いられる。
上記（２）のポリペプチドに含まれるマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列は、免疫原性を有することが必要である。「アミノ酸配列が免疫原性を有する」とは、該アミノ酸配列からなるポリペプチドを哺乳動物に投与することにより、該ポリペプチドに対する特異的免疫反応（特異的抗体の産生、特異的Ｔ細胞の増殖等）が該哺乳動物内に誘導され得ることを意味する。
上記（２）のポリペプチドに含まれるマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列の長さは、通常６アミノ酸以上、好ましくは１０アミノ酸以上であり、ワクチン接種を受けた哺乳動物の体内にマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ（又はマラリア原虫自体）に対する特異的免疫反応を誘導できる限り、その長さは限定されない。誘導される免疫反応の抗原特異性を高くするため、部分アミノ酸配列の長さは長い方が好ましく、該部分アミノ酸配列の長さは、例えば５０アミノ酸以上、好ましくは１００アミノ酸以上、より好ましくは２００アミノ酸以上である。
上記（２）のポリペプチドに含まれる部分アミノ酸配列は、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのどの部分に由来するものであってもよいが、好ましくは、該部分配列は、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれるものである。該領域内の部分アミノ酸配列を用いることにより、より強力な感染防御効果を得ることが出来る。
上記（１）又は（２）のポリペプチドは、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列又はその部分配列に加え、１または２個以上（例えば１〜５００個、好ましくは１〜１００個程度、より好ましくは１〜１５個程度）の付加的なアミノ酸を含んでいてもよい。このようなアミノ酸付加は、ポリペプチドがマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに対する特異的免疫反応を誘導する限り許容される。付加されるアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えばポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグを挙げることが出来る。タグとしては、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ等）、イムノグロブリンＦｃタグ等を例示することが出来る。アミノ酸配列が付加される位置は、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列又はその部分配列のＮ末端及び／又はＣ末端である。
上記（３）の発現ベクターにおいては、上述の（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）が、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターの下流に機能的に連結されている。即ち、（３）の発現ベクターは、プロモーターの制御下で、転写産物として（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る。（３）の発現ベクターを哺乳動物に投与することにより、該哺乳動物の体内において（１）又は（２）のポリペプチドが産生され、該哺乳動物に（１）又は（２）のポリペプチドに対する特異的免疫反応が誘導される。
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター等が用いられる。
上記（３）の発現ベクターは、好ましくは上述の（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。
本発明において発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクター等を挙げることが出来る。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等が挙げられる。製造及び取り扱いの容易性や経済性を考慮すると、プラスミドベクターが好ましく用いられる。
本発明のワクチンは、上記（１）若しくは（２）のポリペプチド又は（３）の発現ベクターに加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含む医薬組成物として提供され得る。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
発現ベクターの細胞内への導入を促進するために、本発明のワクチンは更に核酸導入用試薬を含むことができる。発現ベクターとしてウイルスベクターを使用する場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、発現ベクターとしてプラスミドベクターを使用する場合には、リポフェクチン、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
ワクチン効果を増強するために、本発明のワクチンは更にアジュバントを含むことが出来る。該アジュバントとしては、鉱油オイル、アルミニウムゲル等を挙げることができる。
本発明のワクチンは、経口又は非経口的に哺乳動物に対して投与することが出来る。ポリペプチドや発現ベクターは、胃の中で分解され得るので、非経口的に投与することが好ましい。経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
医薬組成物中の有効成分の含有量は、通常、医薬組成物全体の約０．１乃至１００重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
本発明のワクチンの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、有効成分が上記（１）又は（２）のポリペプチドの場合は、通常成人１人当たりポリペプチドを、一回当たり１μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ〜１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。有効成分が上記（３）の発現ベクターの場合は、通常成人１人当たり発現ベクターを、一回当たり１μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ〜１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。
本発明のワクチンを哺乳動物へ投与することにより、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに対する特異的免疫応答（特異的抗体産生、特異的Ｔ細胞の増殖等）が誘導され、該哺乳動物がマラリア感染への抵抗性を獲得する。
本発明のワクチンの投与対象である哺乳動物は、通常、標的とするマラリア原虫が感染し得る哺乳動物である。例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫は霊長類（ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等）に感染するので、これらのマラリア原虫の感染予防を目的とする場合には、本発明のワクチンは霊長類に投与される。また、マウスマラリア原虫はげっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）に感染するので、マウスマラリア原虫の感染予防を目的とする場合には、本発明のワクチンはげっ歯類に投与される。
（ＩＩ）併用ワクチン
また、上記（１）又は（２）のポリペプチドと、上記（３）の発現ベクターとを適量配合して、或いは適量併用して使用することにより、好適なマラリアワクチンを提供することができる。即ち、本発明は上記（１）又は（２）のポリペプチド、及び上記（３）の発現ベクターを組み合わせてなる、マラリアワクチンを提供する。
上記ポリペプチドと上記発現ベクターとの併用に際しては、該ポリペプチドと該発現ベクターの投与時期は限定されず、該ポリペプチドと該発現ベクターとを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。該ポリペプチド及び該発現ベクターの投与量は、本発明の併用ワクチンにおいて用いられた際にマラリアの発症を予防し得る範囲で特に限定されず、投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択することが出来る。
上記ポリペプチドと上記発現ベクターの投与形態は、特に限定されず、投与時に、該ポリペプチドと該発現ベクターとが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、該ポリペプチド→該発現ベクターの順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等が挙げられる。以下、これらの投与形態をまとめて、本発明の併用ワクチンと略記する。
本発明の併用ワクチンは、上記（Ｉ）の本発明のワクチンと同様に、医薬上許容される担体と混合して、常套手段に従って製剤化することができる。
上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを同時に製剤化して単一の医薬組成物として使用する場合、本発明の併用ワクチンにおける該ポリペプチドの含有量は、製剤の形態等によって相違するが、通常、医薬組成物全体の約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
また、本発明の併用ワクチンにおける該発現ベクターの含有量は、製剤の形態等によって相違するが、通常、医薬組成物全体の約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
本発明の併用ワクチンにおける上記ポリペプチドと上記発現ベクターとの配合比は、投与対象、投与ルート、疾患等により適宜選択することができる。
本発明の併用ワクチンの投与量は、上記ポリペプチドおよび上記発現ベクターの種類、投与ルート、症状、患者の年令等によっても異なり、適宜選択することが出来るが、通常は、上記（Ｉ）の本発明のワクチンと同様である。
上記ポリペプチド及び上記発現ベクターをそれぞれ別々に製剤化する場合も同様の含有量でよい。
上記ポリペプチドと上記発現ベクターをそれぞれ別々に製剤化して併用投与するに際しては、該ポリペプチドを含有する医薬組成物と該発現ベクターを含有する医薬組成物とを同時期に投与してもよいが、該発現ベクターを含有する医薬組成物を先に投与した後、該ポリペプチドを含有する医薬組成物を投与してもよいし、該ポリペプチドを含有する医薬組成物を先に投与し、その後で該発現ベクターを含有する医薬組成物を投与してもよい。好ましくは、初回のワクチン接種は上記発現ベクターを含有する医薬組成物の投与により行い、２回目以降のワクチン接種は上記ポリペプチドを含有する医薬組成物の投与により行う。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、上記発現ベクターを含有する医薬組成物を先に投与する場合、該発現ベクターを含有する医薬組成物を投与した後、通常２週間〜１２ヶ月以内、好ましくは４週間〜６ヶ月以内に上記ポリペプチドを含有する医薬組成物を投与する方法が挙げられる。上記ポリペプチドを含有する医薬組成物を先に投与する場合、該ポリペプチドを含有する医薬組成物を投与した後、通常２週間〜１２ヶ月以内、好ましくは４週間〜６ヶ月以内に上記発現ベクターを含有する医薬組成物を投与する方法が挙げられる。
本発明の併用ワクチンを哺乳動物へ投与することにより、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに対する特異的免疫応答（特異的抗体産生、特異的Ｔ細胞の増殖等）が強力に誘導され、該哺乳動物がマラリア感染への抵抗性を獲得する。本発明の併用ワクチンの投与対象である哺乳動物の態様は、上記（Ｉ）の本発明のワクチンと同一である。
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。(I) Malaria vaccine The present invention provides a malaria vaccine (hereinafter sometimes referred to as the vaccine of the present invention) containing any substance selected from the following (1) to (3):
(1) a polypeptide comprising the amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase;
(2) a polypeptide comprising a partial amino acid sequence of Plasmodium GPI8P transamidase, wherein the partial amino acid sequence has a length of 6 amino acids or more and has immunogenicity; and (3) ( An expression vector capable of expressing the polypeptide of 1) or (2).
In the present specification, the type of malaria is not particularly limited. Malaria is classified into P. falciparum, S. falciparum malaria, S. vivax malaria, oval malaria, mouse malaria, etc. depending on the type of protozoa, and any type of malaria is included within the scope of the present invention. The malaria is preferably P. falciparum or mouse malaria.
In the present specification, the type of malaria parasite is not particularly limited. The types of malaria parasites include P. falciparum, P. vivax, P. malariae, oval malaria (P. ovale), mouse A malaria parasite (P. yoelii) etc. can be mentioned. Each type of malaria parasite causes the corresponding type of malaria.
The malaria parasite GPI8P transamidase is a known gene, and its nucleotide sequence and amino acid sequence are also known. The amino acid sequence of the GPI8P transamidase of Plasmodium falciparum can include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and is encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, for example. Further, the amino acid sequence of P. falciparum GPI8P transamidase is an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, Existing amino acid sequences are also included. It is known that the nucleotide sequence constituting the malaria parasite gene is mutated by natural mutation. A polypeptide having an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2 generated by such a natural mutation is also included in the GPI8P transamidase of P. falciparum. Examples of the amino acid sequence include (1) one or more (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to number (2 to 5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. ) Amino acid sequence deleted in the amino acid sequence; (2) one or more (preferably 1-30, more preferably 1-10, more preferably 1-number) of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 2 to 5) amino acid sequence added, (3) one or more (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1) to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. An amino acid sequence in which ~ (2-5) amino acids are inserted, (4) one or more (preferably 1-30, more preferably 1-10) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, More preferably ~ (Several (2-5)) amino acid sequences substituted with other amino acids, or (5) an amino acid sequence in which the mutations of (1) to (4) above are combined (in this case, The total sum is preferably 1-30, more preferably 1-10, still more preferably 1-number (2-5)), and naturally occurring amino acid sequences are included.
Further, the amino acid sequence of mouse malaria parasite GPI8P transamidase can include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and is encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, for example. In addition, the amino acid sequence of the mouse malaria parasite GPI8P transamidase is an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and exist in nature. The amino acid sequence to be included is also included. It is known that the nucleotide sequence constituting the malaria parasite gene is mutated by natural mutation. A polypeptide having an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 4 generated by such a natural mutation is also included in the GPI8P transamidase of mouse malaria parasite. Examples of the amino acid sequence include (1) one or more (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to number (2 to 5) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. ) Amino acid sequence deleted in the amino acid sequence, (2) one or more (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to number (s) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 2 to 5) amino acid sequence added, (3) one or more (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1) to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. Amino acid sequence inserted with ˜ several (2-5) amino acids, (4) one or more (preferably 1-30, more preferably 1-10) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, More preferably ~ (Several (2-5)) amino acid sequences substituted with other amino acids, or (5) an amino acid sequence in which the mutations of (1) to (4) above are combined (in this case, The total sum is preferably 1-30, more preferably 1-10, still more preferably 1-number (2-5)), and naturally occurring amino acid sequences are included.
The nucleotide sequence and amino acid sequence of the GPI8P transamidase ortholog of other types of malaria parasites are also appropriately determined using the nucleotide sequence and amino acid sequence information disclosed in the sequence listing in the present specification and known sequence databases. Simple primers and probes can be designed and determined easily using ordinary genetic engineering techniques such as RT-PCR and plaque hybridization.
Since the gene sequence of the malaria parasite GPI8P transamidase varies depending on the type of malaria parasite, it is preferable to change the origin of the GPI8P transamidase used in the vaccine according to the type of malaria targeted. That is, when producing a vaccine against P. falciparum, P. falciparum GPI8P transamidase is preferably used. When producing a vaccine against Plasmodium falciparum malaria parasite, GPI8P transamidase of Plasmodium falciparum is preferably used. When producing a vaccine against Plasmodium falciparum malaria parasite GPI8P transamidase is preferably used. When producing a vaccine against egg-shaped malaria, the egg-shaped malaria parasite GPI8P transamidase is preferably used. In the case of producing a vaccine against mouse malaria, GPI8P transamidase of mouse malaria parasite is preferably used.
The partial amino acid sequence of the Plasmodium GPI8P transamidase contained in the polypeptide of (2) above needs to have immunogenicity. “Amino acid sequence has immunogenicity” means that a specific immune reaction (production of specific antibody, proliferation of specific T cells) is induced by administering a polypeptide comprising the amino acid sequence to a mammal. Etc.) can be induced in the mammal.
The length of the partial amino acid sequence of the malaria parasite GPI8P transamidase contained in the polypeptide of (2) above is usually 6 amino acids or more, preferably 10 amino acids or more, and the malaria parasite GPI8P is contained in the vaccinated mammal. The length is not limited as long as a specific immune response against transamidase (or Plasmodium itself) can be induced. In order to increase the antigen specificity of the induced immune response, the partial amino acid sequence is preferably long, and the partial amino acid sequence has a length of, for example, 50 amino acids or more, preferably 100 amino acids or more, and more preferably 200 amino acids. More than amino acids.
The partial amino acid sequence contained in the polypeptide of (2) may be derived from any part of the malaria parasite GPI8P transamidase, but preferably the partial sequence is the amino acid sequence of the malaria parasite GPI8P transamidase. In the region of amino acids 17-240. By using a partial amino acid sequence within the region, a stronger protective effect against infection can be obtained.
In addition to the amino acid sequence of malaria parasite GPI8P transamidase or a partial sequence thereof, the polypeptide of (1) or (2) is one or more (for example, about 1 to 500, preferably about 1 to 100, more preferably May contain about 1 to 15 additional amino acids. Such amino acid addition is tolerated as long as the polypeptide induces a specific immune response against the malaria parasite GPI8P transamidase. The amino acid sequence to be added is not particularly limited, and examples thereof include a tag for facilitating detection and purification of the polypeptide. As tags, Flag tag, histidine tag, c-Myc tag, HA tag, AU1 tag, GST tag, MBP tag, fluorescent protein tag (for example, GFP, YFP, RFP, CFP, BFP, etc.), immunoglobulin Fc tag, etc. It can be illustrated. The position where the amino acid sequence is added is the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequence of the malaria parasite GPI8P transamidase or a partial sequence thereof.
In the expression vector of (3) above, the polynucleotide (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the polypeptide of (1) or (2) above has promoter activity in mammalian cells to be administered. Is operably linked downstream of a promoter capable of exhibiting That is, the expression vector (3) can express the polypeptide (1) or (2) as a transcription product under the control of a promoter. By administering the expression vector of (3) to a mammal, the polypeptide of (1) or (2) is produced in the mammal, and the mammal is directed against the polypeptide of (1) or (2). A specific immune response is induced.
The promoter to be used is not particularly limited as long as it can function in mammalian cells to be administered. As the promoter, a pol I promoter, pol II promoter, pol III promoter, or the like can be used. Specifically, SV40-derived early promoter, viral promoter such as cytomegalovirus LTR, mammalian constituent protein gene promoter such as β-actin gene promoter, and the like are used.
The expression vector (3) preferably contains a transcription termination signal, that is, a terminator region downstream of the polynucleotide encoding the polypeptide (1) or (2). Furthermore, a selection marker gene for selecting transformed cells (a gene that imparts resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, and kanamycin, a gene that complements an auxotrophic mutation, and the like) can be further contained.
The type of vector used for the expression vector in the present invention is not particularly limited, and examples of vectors suitable for administration to mammals such as humans include viral vectors and plasmid vectors. Examples of viral vectors include retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and the like. In view of ease of production and handling and economic efficiency, a plasmid vector is preferably used.
The vaccine of the present invention can be provided as a pharmaceutical composition containing any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to the polypeptide of (1) or (2) or the expression vector of (3).
Examples of pharmaceutically acceptable carriers include excipients such as sucrose and starch, binders such as cellulose and methylcellulose, disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose, lubricants such as magnesium stearate and aerosil, citric acid, Fragrances such as menthol, preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite, stabilizers such as citric acid and sodium citrate, suspensions such as methylcellulose and polyvinylpyrrolide, dispersants such as surfactants, water, Although diluents, such as physiological saline, base wax, etc. are mentioned, it is not limited to them.
In order to promote the introduction of the expression vector into the cell, the vaccine of the present invention can further contain a reagent for nucleic acid introduction. When a viral vector is used as an expression vector, retronectin, fibronectin, polybrene or the like can be used as a gene introduction reagent. When a plasmid vector is used as an expression vector, lipofectin, lipofectamine, DOGS (transfectam), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDAB, HDAB, polybrene, poly (ethyleneimine) (PEI), etc. Cationic lipids can be used.
In order to enhance the vaccine effect, the vaccine of the present invention may further contain an adjuvant. Examples of the adjuvant include mineral oil oil and aluminum gel.
The vaccine of the present invention can be administered to mammals orally or parenterally. Since polypeptides and expression vectors can be degraded in the stomach, they are preferably administered parenterally. Preparations suitable for oral administration include liquids, capsules, sachets, tablets, suspensions, emulsions and the like. Formulations suitable for parenteral administration (eg, subcutaneous injection, intramuscular injection, local infusion, intraperitoneal administration, etc.) include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants , Buffer solutions, antibacterial agents, tonicity agents and the like may be included. Aqueous and non-aqueous sterile suspensions are also included, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like. The preparation can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials. Alternatively, the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.
The content of the active ingredient in the pharmaceutical composition is usually about 0.1 to 100% by weight, preferably about 1 to 99% by weight, and more preferably about 10 to 90% by weight of the whole pharmaceutical composition.
The dose of the vaccine of the present invention varies depending on the subject to be administered, the administration method, the dosage form, etc., but when the active ingredient is the polypeptide of (1) or (2) above, usually one polypeptide per adult is used. The dose is in the range of 1 μg to 1000 μg per dose, preferably in the range of 20 μg to 100 μg, usually 2 to 3 times over 4 weeks to 18 months. When the active ingredient is the expression vector of (3) above, the expression vector per adult is usually in the range of 1 μg to 1000 μg, preferably in the range of 20 μg to 100 μg, usually for 4 weeks to 18 months, Administer 2 to 3 times.
By administering the vaccine of the present invention to a mammal, a specific immune response (specific antibody production, specific T cell proliferation, etc.) to the malaria parasite GPI8P transamidase is induced, and the mammal is resistant to malaria infection. Gain sex.
The mammal to which the vaccine of the present invention is administered is usually a mammal that can be infected with the target malaria parasite. For example, Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum, Plasmodium falciparum and oval malaria parasites infect primates (humans, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, chimpanzees, etc.). For the purpose of preventing infection, the vaccine of the present invention is administered to primates. Since mouse malaria parasites infect rodents (mouse, rat, hamster, guinea pig, etc.), the vaccine of the present invention is administered to rodents for the purpose of preventing infection of mouse malaria parasites. .
(II) Concomitant vaccine In addition, a suitable malaria vaccine is provided by using an appropriate amount of the above-mentioned polypeptide of (1) or (2) and the expression vector of (3) above or in combination. can do. That is, this invention provides the malaria vaccine which combines the polypeptide of said (1) or (2), and the expression vector of said (3).
In the combined use of the polypeptide and the expression vector, the administration time of the polypeptide and the expression vector is not limited, and the polypeptide and the expression vector may be administered simultaneously to the administration subject. Alternatively, administration may be performed with a time difference. The dosage of the polypeptide and the expression vector is not particularly limited as long as it can prevent the development of malaria when used in the combination vaccine of the present invention, and is appropriately selected depending on the administration subject, administration route, disease, combination, etc. I can do it.
The administration mode of the polypeptide and the expression vector is not particularly limited as long as the polypeptide and the expression vector are combined at the time of administration. Examples of such administration forms include, for example, (1) administration of a single preparation obtained by simultaneously preparing the polypeptide and the expression vector, and (2) preparation of the polypeptide and the expression vector separately. Co-administration of the two preparations obtained by the same administration by the same administration route, (3) with a time difference in the same administration route of the two preparations obtained by separately formulating the polypeptide and the expression vector. (4) Simultaneous administration of two types of preparations obtained by separately formulating the polypeptide and the expression vector through different administration routes, (5) Formulating the polypeptide and the expression vector separately Administration of the two types of preparations obtained by combining the two preparations at different time intervals (for example, administration in the order of the polypeptide → the expression vector, or administration in the reverse order). . Hereinafter, these administration forms are collectively abbreviated as the combination vaccine of the present invention.
The combination vaccine of the present invention can be formulated according to conventional means by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier in the same manner as the vaccine of the present invention of (I) above.
When the polypeptide and the expression vector are simultaneously formulated and used as a single pharmaceutical composition, the content of the polypeptide in the combination vaccine of the present invention varies depending on the form of the formulation, etc. About 0.1 to 99.9% by weight of the total composition, preferably about 1 to 99% by weight, more preferably about 10 to 90% by weight.
The content of the expression vector in the combination vaccine of the present invention varies depending on the form of the preparation and the like, but is usually about 0.1 to 99.9% by weight, preferably about 1 to 99% by weight of the whole pharmaceutical composition. %, More preferably about 10 to 90% by weight.
The mixing ratio of the polypeptide and the expression vector in the combination vaccine of the present invention can be appropriately selected depending on the administration subject, administration route, disease and the like.
The dose of the combination vaccine of the present invention varies depending on the type of the polypeptide and the expression vector, administration route, symptom, patient age, etc., and can be appropriately selected. This is the same as the vaccine of the present invention.
The same content may be used when the polypeptide and the expression vector are separately formulated.
When the polypeptide and the expression vector are separately formulated and administered together, the pharmaceutical composition containing the polypeptide and the pharmaceutical composition containing the expression vector may be administered at the same time. The pharmaceutical composition containing the expression vector may be administered first, then the pharmaceutical composition containing the polypeptide may be administered, or the pharmaceutical composition containing the polypeptide may be administered first, and then A pharmaceutical composition containing the expression vector may be administered. Preferably, the first vaccination is performed by administration of a pharmaceutical composition containing the expression vector, and the second and subsequent vaccinations are performed by administration of a pharmaceutical composition containing the polypeptide. When administered at a time difference, the time difference varies depending on the active ingredient to be administered, dosage form, and administration method. For example, when the pharmaceutical composition containing the expression vector is administered first, the pharmaceutical composition containing the expression vector Examples include a method of administering a pharmaceutical composition containing the above polypeptide usually within 2 weeks to 12 months, preferably 4 weeks to 6 months after administration of the product. When the pharmaceutical composition containing the polypeptide is administered first, the expression vector is usually administered within 2 weeks to 12 months, preferably within 4 weeks to 6 months, after administering the pharmaceutical composition containing the polypeptide. The method of administering the pharmaceutical composition containing this is mentioned.
By administering the combination vaccine of the present invention to a mammal, a specific immune response (specific antibody production, specific T cell proliferation, etc.) against the Plasmodium GPI8P transamidase is strongly induced, and the mammal is infected with malaria. To gain resistance to. The aspect of the mammal to which the combination vaccine of the present invention is administered is the same as that of the vaccine of the present invention (I).
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is shown and this invention is demonstrated more concretely, this invention is not limited at all by the Example shown below.
（実施例１）
マラリアゲノムの情報から熱帯熱マラリアの遺伝子と相同性が高いマウスマラリア（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）の細胞表面タンパク（ＧＰＩアンカータンパク）をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで９つ選択し（表１）、これらのｃＤＮＡを調製した後に、市販のｐＶＡＸＤＥＳＴ２００ベクターに組み込み、針なし空気圧式の注射器ｓｈｉｍａｊｅｔを用いて５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下に投与した。投与量は１匹のマウスあたり４μｇであった（４μｇ／１００μｌ）。２週間の間隔をおいて計３回の同様の投与を行った後、１０日後にＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ １７ＸＬ １００万個を腹腔内投与して感染させ、その後の原虫血症と生存数を観察した。
その結果、対照群では約５日間で全てのマウスがマラリア血症で死亡したが、マウスマラリアのＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼをコードする発現ベクターを投与した群（Ｇ１）においては、３回の独立した試験においてそれぞれ５０％、５７％及び１００％のマウスが生存していた（表２、図１及び２）。ＰＹ０５０００をコードする発現ベクターを投与した群（Ｇ２）においても、マウスの生存率が若干上昇したが、その他の遺伝子の発現ベクターを投与しても、生存率に対する効果はほとんど認められなかった。
ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ群（Ｇ１）においては、原虫血症の発症が強力に抑制された（図３及び４）。ＰＹ０５０００群（Ｇ２）においても、原虫血症の発症が若干抑制されたが、その他の遺伝子の発現ベクターを投与しても、原虫血症の発症はほとんど抑制されなかった。
更なる２回の追加実験においても、同一の効果が確認された（図５〜８）。
ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ群（Ｇ１）においては、マラリア原虫（特に血液段階のマラリア原虫）に対する血中抗体が確認されたことから、この感染防除効果は、生体内において発現されたＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに対する特異的免疫反応が誘導されたことによるものと考えられた。
以上より、マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ、又はその部分ペプチドをコードする発現ベクターがマラリアワクチンとして極めて有効であることが確認された。
Nine cell surface proteins (GPI anchor proteins) of mouse malaria (P. yoelii) having high homology to the gene of P. falciparum were selected from in silico genome information in silico (Table 1), and these cDNAs were prepared. Later, it was incorporated into a commercially available pVAXDEST200 vector and administered subcutaneously to 5-week-old female C57BL / 6 mice using a needleless pneumatic syringe shimajet. The dose was 4 μg per mouse (4 μg / 100 μl). After a total of 3 similar administrations at intervals of 2 weeks, 10 days later, 1 million Plasmodium yoelii 17XL were administered by intraperitoneal infection, and the subsequent protozoalemia and the number of survivors were observed.
As a result, in the control group, all mice died of malariaemia in about 5 days, but in the group (G1) administered with an expression vector encoding GPI8P transamidase of mouse malaria, three independent tests were performed. 50%, 57% and 100% of the mice were alive (Table 2, FIGS. 1 and 2), respectively. In the group (G2) to which the expression vector encoding PY05000 was administered, the survival rate of the mice was slightly increased, but even when the expression vectors of other genes were administered, there was almost no effect on the survival rate.
In the GPI8P transamidase group (G1), the onset of protozoa was strongly suppressed (FIGS. 3 and 4). Also in the PY05000 group (G2), the onset of protozoa was somewhat suppressed, but even when other gene expression vectors were administered, the onset of protozoa was hardly suppressed.
The same effect was confirmed in two additional experiments (FIGS. 5 to 8).
In the GPI8P transamidase group (G1), blood antibodies against malaria parasites (especially blood stage malaria parasites) were confirmed, and this infection control effect was achieved by specific immunity against GPI8P transamidase expressed in vivo. This was thought to be due to the induction of the reaction.
From the above, it was confirmed that an expression vector encoding a malaria parasite GPI8P transamidase or a partial peptide thereof was extremely effective as a malaria vaccine.
本発明により、強力且つ調製が簡易な新たなマラリアワクチンが提供される。特に、ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分ペプチドを発現し得る発現ベクターは、マラリアに対するＤＮＡワクチンとして顕著な効果を示すことから、従来のサブユニットワクチンよりもより安価で安定なマラリアワクチンとして有用である。
本出願は日本で出願された特願２００７−２３９４８８（出願日：２００７年９月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
［配列表］
The present invention provides a new malaria vaccine that is powerful and easy to prepare. In particular, since an expression vector capable of expressing a partial peptide of GPI8P transamidase has a remarkable effect as a DNA vaccine against malaria, it is useful as a cheaper and more stable malaria vaccine than conventional subunit vaccines.
This application is based on Japanese Patent Application No. 2007-239488 filed in Japan (filing date: September 14, 2007), the contents of which are incorporated in full herein.
[Sequence Listing]
Claims (2)
（１ａ）配列番号４で表されるマウスマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１ｂ）配列番号４で表されるマウスマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列、及び当該アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に付加された１〜１５個のアミノ酸からなる付加的アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫原性を有する、ポリペプチド；
（１ｃ）配列番号２で表される熱帯熱マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（１ｄ）配列番号２で表される熱帯熱マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列、及び当該アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に付加された１〜１５個のアミノ酸からなる付加的アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫原性を有する、ポリペプチド；
（２ａ）配列番号６で表されるマウスマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２ｂ）配列番号６で表されるマウスマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列、及び当該部分アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に付加された１〜１５個のアミノ酸からなる付加的アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫原性を有する、ポリペプチド；
（２ｃ）配列番号２で表される熱帯熱マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の１７〜２４０番目の部分アミノ酸配列からなるポリペプチド；
（２ｄ）配列番号２で表される熱帯熱マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の１７〜２４０番目の部分アミノ酸配列、及び当該部分アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に付加された１〜１５個のアミノ酸からなる付加的アミノ酸配列からなるポリペプチドであって、免疫原性を有する、ポリペプチド
；及び
（３）（１ａ）〜（２ｄ）のいずれかのポリペプチドを発現し得る発現ベクター。 Malaria vaccine containing any substance selected from the following (1 a ) to (3):
(1 a) mouse malaria parasite GPI8P represented by SEQ ID NO: 4 consisting of trans amidase amino acid sequence polypeptide;
(1b) consisting of the amino acid sequence of mouse malaria parasite GPI8P transamidase represented by SEQ ID NO: 4 and an additional amino acid sequence consisting of 1 to 15 amino acids added to the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequence A polypeptide having immunogenicity;
(1c) a polypeptide comprising the amino acid sequence of P. falciparum GPI8P transamidase represented by SEQ ID NO: 2;
(1d) From the amino acid sequence of P. falciparum GPI8P transamidase represented by SEQ ID NO: 2 and an additional amino acid sequence consisting of 1 to 15 amino acids added to the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequence A polypeptide having immunogenicity;
(2 a ) a polypeptide comprising a partial amino acid sequence of mouse malaria parasite GPI8P transamidase represented by SEQ ID NO: 6 ;
(2b) a partial amino acid sequence of mouse malaria parasite GPI8P transamidase represented by SEQ ID NO: 6 and an additional amino acid sequence consisting of 1 to 15 amino acids added to the N-terminal and / or C-terminal of the partial amino acid sequence a polypeptide consisting of, having immunogenic, the polypeptide;
(2c) a polypeptide comprising a 17-240th partial amino acid sequence of the amino acid sequence of P. falciparum GPI8P transamidase represented by SEQ ID NO: 2;
(2d) the 17-240th partial amino acid sequence of the amino acid sequence of P. falciparum GPI8P transamidase represented by SEQ ID NO: 2 and 1-15 added to the N-terminal and / or C-terminal of the partial amino acid sequence A polypeptide comprising an additional amino acid sequence comprising one amino acid , the polypeptide having immunogenicity; and the expression capable of expressing any one of (3) (1 a ) to (2 d ) vector.
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