JP5346307B2 - Polyion dendrimers for intracellular introduction of proteins - Google Patents
Polyion dendrimers for intracellular introduction of proteins Download PDFInfo
- Publication number
- JP5346307B2 JP5346307B2 JP2010047133A JP2010047133A JP5346307B2 JP 5346307 B2 JP5346307 B2 JP 5346307B2 JP 2010047133 A JP2010047133 A JP 2010047133A JP 2010047133 A JP2010047133 A JP 2010047133A JP 5346307 B2 JP5346307 B2 JP 5346307B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- group
- protein
- polyion
- dendrimer
- polyion dendrimer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Description
本発明は、表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、コア部としてベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマーに関する。本発明のポリイオンデンドリマーは、共有結合を介さず、分子間相互作用を利用して、単に混合という簡便な操作でタンパク質を細胞内に輸送できる、汎用性の高いタンパク質輸送剤として有用であり、本発明は、さらに本発明のポリイオンデンドリマーを用いたタンパク質輸送剤、及び生体細胞内へのタンパク質の輸送方法に関する。 The present invention has a cationic group selected from the group consisting of a guanidine group, a thiourenium group, and an isothiourenium group as a surface portion, a polyalkyleneoxy group as a branched chain, and a benzophenone group as a core portion. The present invention relates to a polyion dendrimer in which a substituent is bonded. The polyion dendrimer of the present invention is useful as a highly versatile protein transport agent that can transport proteins into cells by simple operation of mixing using intermolecular interaction without using a covalent bond. The invention further relates to a protein transport agent using the polyion dendrimer of the present invention, and a method for transporting the protein into living cells.
タンパク質は、その機能の特異性や生体適合性の高さから新しいタイプの薬剤として注目されている。一般にタンパク質のような高分子化合物は細胞膜透過性が極めて低いという問題があるために、効率的な細胞内導入を可能にするキャリアの使用が必要不可欠である。
タンパク質の細胞内取り込みを実現するアプローチの一つとして、アルギニンを多数含有する細胞内輸送ペプチドを連結させる方法が知られている (非特許文献１参照) 。しかしながら、この方法ではペプチドを共有結合で標的のタンパク質に連結させる必要があるため、タンパク質の変性や機能の損失を引き起こす可能性があるという問題があった。
Protein is attracting attention as a new type of drug because of its functional specificity and high biocompatibility. In general, polymer compounds such as proteins have a problem of extremely low cell membrane permeability. Therefore, it is essential to use a carrier that enables efficient intracellular introduction.
As one approach for realizing intracellular protein uptake, a method of linking intracellular transport peptides containing a large number of arginines is known (see Non-Patent Document 1). However, in this method, since it is necessary to link the peptide to the target protein by a covalent bond, there is a problem that the protein may be denatured or the function may be lost.
もう一つのアプローチとして、カチオン性脂質を用いた非共有結合的方法が提案されている(非特許文献２参照)。この方法は、カチオン性脂質がタンパク質を内包するミセルを形成し、このミセルが細胞膜と融合することを利用して、標的タンパク質を細胞内に移行させる方法である。この方法では、前述の細胞内輸送ペプチドを用いる方法と異なり、共有結合形成を必要としないため、標的タンパク質の変性や失活を回避することができる。しかしながら、カチオン性脂質を用いたタンパク質輸送は１０μＭ以上の濃度の脂質分子を必要とするため、拡散の影響で希釈されてしまうin vivoでは十分な輸送効率を実現できていなかった。このため、in vivoで、タンパク質をそのまま効率よく細胞内に輸送できるキャリアの開発が待たれていた。 As another approach, a noncovalent method using a cationic lipid has been proposed (see Non-Patent Document 2). This method is a method in which a cationic protein forms a micelle that encapsulates a protein, and the micelle is fused with a cell membrane to transfer a target protein into the cell. In this method, unlike the method using the intracellular transport peptide described above, since no covalent bond formation is required, denaturation and inactivation of the target protein can be avoided. However, since protein transport using cationic lipids requires lipid molecules at a concentration of 10 μM or more, sufficient transport efficiency could not be realized in vivo, which is diluted by the influence of diffusion. For this reason, the development of a carrier that can efficiently transport a protein into a cell as it is in vivo has been awaited.
デンドリマーは、ギリシャ語の「dendri-」(樹木状)と「meros」(一部)を組み合わせて名づけられた、中心から規則的に分岐した構造を持つ樹状高分子で、構造が正確にコントロールされた樹木状のポリマーである。過去１０年間に５０００以上の論文が発表されてきているが、他の高分子と比べて合成が極めて困難であるため、実用化は難しいとされている。現在最もよく用いられているポリアミドアミン構造を持つＰＡＭＡＭデンドリマーなどは、既に市販されてきている。
デンドリマーは、コア (core) と呼ばれる中心分子と、デンドロン (dendron) と呼ばれる樹状の分岐構造部分、及び表面（surface）と呼ばれる末端基部分から構成され、デンドロン部分の分岐回数を世代 (generation) と言っている。一般に高分子はある程度の分子量分布を持つが、高世代のデンドリマーは、分子量数万に達するものでもほとんど単一分子量であるという、際立った特徴を持っている。
コア（core）はデンドリマー全体のサイズ・形・方向性・多様性を決定する部位であるとされており、デンドロン (dendron) は、枝状のセルが規則的に増えていく部分で、このセルが空間のタイプと大きさを決定し、枝状のセルの多重度は世代(generation)に対して指数関数的に増加する。表面（surface）は反応性・非反応性の末端基で構成され、末端基のタイプにより様々な機能を発現することができると共に、外部のゲスト分子の出入りをコントロールするゲートの役割も担っている。
Dendrimer is a dendritic polymer with a structure that is regularly branched from the center, named after a combination of the Greek words “dendri-” (dendritic) and “meros” (partial), and the structure is precisely controlled. Dendritic polymer. Over 5,000 papers have been published in the past decade, but it is considered difficult to put into practical use because it is extremely difficult to synthesize compared to other polymers. PAMAM dendrimers having a polyamidoamine structure, which are most frequently used at present, have already been marketed.
A dendrimer consists of a central molecule called the core, a dendritic branched structure called the dendron, and an end group called the surface. The number of branches of the dendron is generated. they said. In general, macromolecules have a certain molecular weight distribution, but high-generation dendrimers have the distinctive feature that even if they have a molecular weight of tens of thousands, they have almost a single molecular weight.
The core is said to determine the size, shape, orientation, and diversity of the entire dendrimer. The dendron is a part where the number of branch-like cells increases regularly. Determines the type and size of the space, and the multiplicity of the branch cells increases exponentially with generation. The surface is composed of reactive and non-reactive end groups, can express various functions depending on the type of end groups, and also plays a role of a gate that controls the entrance and exit of external guest molecules. .
デンドリマーの製造法はよく知られており、例えば、リジン単位の層に基づくデンドリマーの製造法（特許文献１参照）、ポリアミドアミンを含む他の単位に基づくデンドリマーやＰＡＭＡＭデンドリマーの製造法（特許文献２参照）などが報告されている。これらのデンドリマーは、表面修飾剤、金属キレート剤、解乳化剤又は油/水エマルジョン、製紙における湿潤紙力増強剤、及び塗料などの水性配合物での粘度調節剤などとしての使用に適するとされているが、医薬製造用の基剤としての使用（特許文献３参照）や、生物学的反応修飾物質になりうる担体物質と会合させるためのもの（特許文献４参照）なども既に報告されてきている。
また、表面の末端基としてグアニジン基のようなカチオン性の基を有するデンドリマー（樹状高分子化合物）も知られており、例えば、ポリアミドアミンデンドリマーやポリリジンデンドリマーやポリ(プロピレンイミン)デンドリマーなどの表面に４級アミノ含有部
分、ピリジニウム含有部分、グアニジウム含有部分、アミジニウム含有部分などのイオン性基を設けたデンドリマーを毒性物質による疾患の予防又は治療に用いるもの（特許文献５参照）や、同じデンドリマーを細菌などの微生物又は寄生虫による疾患の予防又は治療に用いるもの（特許文献６参照）、また、このようなイオン性末端基を有するデンドリマーをゲル形成剤として農薬や衛生用品の担体として使用するもの（特許文献７参照）などが報告されている。さらに、カチオン性の基を有するポリエチレンイミンデンドリマーなどのカチオン性物質をアニオン性の酵素活性蛍光基質と複合させて蛍光基質の膜輸送系を形成させる方法も報告されている（特許文献８参照）。
しかしながら、コア部にベンゾフェノン基を有する置換基が結合しているものは知られていない。
Methods for producing dendrimers are well known, for example, methods for producing dendrimers based on a layer of lysine units (see Patent Document 1), methods for producing dendrimers and PAMAM dendrimers based on other units containing polyamidoamine (Patent Document 2). For example). These dendrimers are considered suitable for use as surface modifiers, metal chelators, demulsifiers or oil / water emulsions, wet paper strength enhancers in papermaking, and viscosity modifiers in aqueous formulations such as paints. However, the use as a base for pharmaceutical production (see Patent Document 3) and the association with a carrier substance that can be a biological reaction modifier (see Patent Document 4) have already been reported. Yes.
In addition, dendrimers (dendritic polymer compounds) having a cationic group such as a guanidine group as a terminal group on the surface are also known. For example, surfaces such as polyamidoamine dendrimers, polylysine dendrimers, and poly (propyleneimine) dendrimers are known. A dendrimer having an ionic group such as a quaternary amino-containing moiety, a pyridinium-containing moiety, a guanidinium-containing moiety, or an amidinium-containing moiety for the prevention or treatment of a disease caused by a toxic substance (see Patent Document 5) or the same dendrimer Those used for prevention or treatment of diseases caused by microorganisms such as bacteria or parasites (see Patent Document 6), and those using dendrimers having such ionic end groups as gel forming agents as carriers for agricultural chemicals and hygiene products (See Patent Document 7) and the like have been reported. Furthermore, a method has also been reported in which a cationic substance such as polyethyleneimine dendrimer having a cationic group is combined with an anionic enzyme-active fluorescent substrate to form a membrane transport system of the fluorescent substrate (see Patent Document 8).
However, it is not known that a substituent having a benzophenone group is bonded to the core.
本発明で解決しようとする課題は、共有結合を介さず、分子間相互作用を利用して、単に混合という簡便な操作でタンパク質を細胞内に輸送することのできる、汎用性の高いタンパク質輸送剤として有用なポリイオンデンドリマーを提供すること、それを用いたタンパク質輸送剤、及びタンパク質の高効率な輸送方法を提供することにある。また、このようなタンパク質輸送剤の基本骨格となる分子の設計指針と合成手法を確立することである。 A problem to be solved by the present invention is a highly versatile protein transporter that can transport proteins into cells by simple operation of mixing using intermolecular interaction without using a covalent bond. It is an object to provide a polyion dendrimer useful as a protein transport agent, a protein transport agent using the polyion dendrimer, and a highly efficient transport method for proteins. Another goal is to establish design guidelines and synthesis methods for molecules that serve as the basic skeleton of such protein transport agents.
本発明者らは、複数のイオン種間で特に強い相互作用が働くことに着目し、分子表面にアルギニンの側鎖として知られるグアニジン基あるいはチオウレニウム基などを多数擁するポリカチオンデンドリマーの分子設計とその合成法を確立することによる、より高効率なタンパク質輸送剤の可能性の開拓に挑戦してきた。これらの化合物は、複数のイオン性官能基を表面に持つため、高い細胞膜透過性が期待できるとともに、標的タンパク質、核酸など複数のアニオン性官能基を持つ生体分子と強く結合する役割を果たすために、低濃度でのタンパク質・キャリア複合体形成が可能になることが期待できる。さらに、コア部に連結した疎水性のベンゾフェノン基は細胞膜内の疎水性の層に積極的に入り込むことで、上記のタンパク質・キャリア複合体を細胞膜上に集積・濃縮させる効果があることを見いだし、本発明に到達した。 The inventors focused on the particularly strong interaction between a plurality of ionic species, and designed the molecular design of a polycation dendrimer having many guanidine groups or thiourenium groups known as side chains of arginine on the molecular surface. We have been trying to explore the possibility of more efficient protein transport agents by establishing synthetic methods. Because these compounds have multiple ionic functional groups on the surface, they can be expected to have high cell membrane permeability and also serve to strongly bind to biomolecules with multiple anionic functional groups such as target proteins and nucleic acids. It can be expected that a protein-carrier complex can be formed at a low concentration. Furthermore, we found that the hydrophobic benzophenone group linked to the core has the effect of accumulating and concentrating the protein-carrier complex on the cell membrane by actively entering the hydrophobic layer in the cell membrane. The present invention has been reached.
即ち、本発明は、デンドリマーの表面部としてグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、かつ、コア部としてベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマーに関する。より詳細には、本発明は、下記の一般式［１］ That is, the present invention has a cationic group selected from the group consisting of a guanidine group, a thiourenium group, and an isothiourenium group as a surface portion of a dendrimer, a polyalkyleneoxy group as a branched chain, and a core. The present invention relates to a polyion dendrimer in which a substituent having a benzophenone group as a part is bonded. More specifically, the present invention relates to the following general formula [1]
［式中、Ｘは下記の一般式［２］又は［３］ [Wherein X represents the following general formula [2] or [3]
［式中、ｋは０又は１〜５の整数を表す。］ [Wherein, k represents 0 or an integer of 1 to 5. ]
［式中、ｋは０又は１〜５の整数を表す。］
で表されるベンゾフェノン基を有する置換基を示し、Ｙは、それぞれ独立してグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｌは１〜６の整数を表し、ｍは０又は１を表し、ｎは世代数を示し１〜５の整数を表す。なお、一般式［１］中の分岐部分の３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミドは、３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸アミドであってもよく、分岐鎖のエチレンオキシ鎖は、炭素数１〜６、好ましくは２〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン鎖であってもよい。］
で表されるポリイオンデンドリマーに関する。
より詳細には、本発明は、下記の一般式［４］
[Wherein, k represents 0 or an integer of 1 to 5. ]
And Y represents a cationic group independently selected from the group consisting of a guanidine group, a thiourenium group, and an isothiourenium group, and l represents 1-6. Represents an integer, m represents 0 or 1, n represents the number of generations, and represents an integer of 1 to 5; The branched 3,4,5-trihydroxybenzoic acid amide in the general formula [1] may be 3,4,5-trihydroxycinnamic acid amide, and the branched ethyleneoxy chain is It may be a linear or branched alkylene chain having 1 to 6 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms. ]
The polyion dendrimer represented by these.
More specifically, the present invention relates to the following general formula [4]
［式中、Ｙは、それぞれ独立してグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｍは０又は１を表す。］
で表されるポリイオンデンドリマーに関する。
さらに詳細には本発明は、下記の式［５］で表されるポリイオンデンドリマーに関する。
[Wherein Y represents a cationic group independently selected from the group consisting of a guanidine group, a thiourenium group, and an isothiourenium group, and m represents 0 or 1. ]
The polyion dendrimer represented by these.
More specifically, the present invention relates to a polyion dendrimer represented by the following formula [5].
また、本発明は、前記した本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなるタンパク質輸送剤又はタンパク質輸送剤用組成物に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなるタンパク質輸送剤又はタンパク質輸送剤用組成物を用いて生体細胞膜内にタンパク質を輸送する方法に関する。
The present invention also relates to a protein transporter or a composition for protein transporter comprising the polyion dendrimer of the present invention described above.
Furthermore, the present invention relates to a method for transporting a protein into a biological cell membrane using the above-described protein transport agent or composition for protein transport agent comprising the polyion dendrimer of the present invention.
本発明をより詳細に説明すれば、以下のとおりとなる。
（１）デンドリマーの表面部にグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有し、分岐鎖としてポリアルキレンオキシ基を有し、かつ、コア部にベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることを特徴とするポリイオンデンドリマー。
（２）分岐鎖が、末端に１，４位で結合した１，２，３−トリアゾ−ル基を有していてもよい繰り返し回数１〜６のポリエチレンオキシ基である前記（１）に記載のポリイオンデンドリマー。
（３）分岐部分が、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミド又は３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸アミドから構成されるものである前記（１）又は（２）に記載のポリイオンデンドリマー。
（４）ベンゾフェノン基を有する置換基が、前記の一般式［２］又は［３］で表されるベンゾフェノン基を有する置換基である前記（１）〜（３）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（５）世代が、１〜５世代である前記（１）〜（４）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（６）ポリイオンデンドリマーが、前記した一般式［１］で表されるポリイオンデンドリマーである前記（１）〜（５）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（７）ポリイオンデンドリマーが、前記した一般式［４］で表されるポリイオンデンドリマーである前記（１）〜（６）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（８）ポリイオンデンドリマーが、前記した式［５］で表されるポリイオンデンドリマーである前記（１）〜（７）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。
（９）前記（１）〜（８）のいずれかに記載のポリイオンデンドリマーを含有してなるタンパク質輸送剤。
（１０）前記（９）に記載のタンパク質輸送剤を用いることを特徴とするタンパク質の輸送方法。
The present invention will be described in detail as follows.
(1) The dendrimer has a cationic group selected from the group consisting of a guanidine group, a thiourenium group, and an isothiourenium group, a polyalkyleneoxy group as a branched chain, and a benzophenone in the core portion. A polyion dendrimer, wherein a substituent having a group is bonded.
(2) The above (1), wherein the branched chain is a polyethyleneoxy group having 1 to 6 repetitions, which may have a 1,2,3-triazole group bonded to the terminal at the 1,4-position. Polyion dendrimer.
(3) The polyion dendrimer according to (1) or (2) above, wherein the branched portion is composed of 3,4,5-trihydroxybenzoic acid amide or 3,4,5-trihydroxycinnamic acid amide. .
(4) The polyion dendrimer according to any one of (1) to (3), wherein the substituent having a benzophenone group is a substituent having a benzophenone group represented by the general formula [2] or [3]. .
(5) The polyion dendrimer according to any one of (1) to (4), wherein the generation is 1 to 5 generations.
(6) The polyion dendrimer according to any one of (1) to (5), wherein the polyion dendrimer is a polyion dendrimer represented by the general formula [1].
(7) The polyion dendrimer according to any one of (1) to (6), wherein the polyion dendrimer is a polyion dendrimer represented by the general formula [4].
(8) The polyion dendrimer according to any one of (1) to (7), wherein the polyion dendrimer is a polyion dendrimer represented by the formula [5].
(9) A protein transporter comprising the polyion dendrimer according to any one of (1) to (8).
(10) A protein transporting method comprising using the protein transporting agent according to (9).
本発明のポリカチオン型デンドリマー（樹状高分子）は、共有結合を介さずに標的タンパク質と強い分子間相互作用によりタンパク質・キャリア複合体を形成することが可能であり、低濃度で、迅速に、かつタンパク質の活性を損なうことなく細胞内にタンパク質を輸送することができる。また、当該タンパク質輸送活性は血清存在下でも十分に高い効率が維持され、生体内においても十分な活性を示す。
さらに、本発明のタンパク質キャリア用のポリカチオン型デンドリマー（樹状高分子）は、実用的な１μＭの濃度でも細胞毒性を示さない。
The polycation type dendrimer (dendritic polymer) of the present invention can form a protein-carrier complex by a strong intermolecular interaction with a target protein without using a covalent bond, and can be rapidly formed at a low concentration. In addition, the protein can be transported into the cell without impairing the activity of the protein. In addition, the protein transport activity maintains sufficiently high efficiency even in the presence of serum, and exhibits sufficient activity in vivo.
Furthermore, the polycation type dendrimer (dendritic polymer) for protein carrier of the present invention does not show cytotoxicity even at a practical concentration of 1 μM.
以上のように、本発明のグアニジン等のカチオン性の基を多数有するポリカチオン型デンドリマーは、タンパク質と強く相互作用し、細胞へのタンパク質輸送剤として、従来のカチオン性脂質型タンパク質導入試薬SAINT-phDを遙かに上回る高効率なタンパク質の細胞内導入を実現することができるものである。そして、本発明のポリカチオン型デンドリマー（樹状高分子）は、従来の試薬と比較して、低濃度で迅速、かつ安全に使用できることから、従来のものでは困難であったin vivoへ応用が可能となる。
また、本発明は、表面部としてグアニジン基などのカチオン性の基、分岐鎖として親水性の高いポリエチレングリコール基、コア部としてベンゾフェノン基を有する置換基を有する樹状高分子を分子設計し、その製造法を確立した。
As described above, the polycation type dendrimer having a large number of cationic groups such as guanidine of the present invention interacts strongly with a protein, and as a protein transport agent to cells, a conventional cationic lipid type protein introduction reagent SAINT- It is possible to achieve high-efficiency protein introduction into cells that far exceeds phD. Since the polycation type dendrimer (dendritic polymer) of the present invention can be used quickly and safely at a low concentration as compared with conventional reagents, it can be applied in vivo, which has been difficult with conventional ones. It becomes possible.
In addition, the present invention molecularly designs a dendritic polymer having a cationic group such as a guanidine group as a surface portion, a highly hydrophilic polyethylene glycol group as a branched chain, and a substituent having a benzophenone group as a core portion, A manufacturing method was established.
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第一にデンドリマーの表面部にグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を有することである。このようなカチオン性の基としては、次の式［６］、［７］、及び［８］、
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The feature of the polyion dendrimer of the present invention is that it first has a cationic group selected from the group consisting of a guanidine group, a thiourenium group, and an isothiourenium group on the surface of the dendrimer. Examples of such a cationic group include the following formulas [6], [7], and [8],
が挙げられる。これらの基の水素原子部分は炭素数１〜１０、好ましくは１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基などで置換されていてもよい。
このようなカチオン性の基はデンドリマー表面部に１個以上あればよいが、好ましくは表面部の末端の全てがこれらのカチオン性の基を有するものが挙げられる。
また、デンドリマー表面部における、このようなカチオン性の基は、同一であっても異なっていてもよいが、製法の容易性からは全てが同一の場合が好ましい。
最近、グアニジン基を有するアミノ酸であるアルギニンの作用に注目が集まっている。特に、アルギニンを導入した化合物の細胞膜透過性が増すことが報告されており、この理由がグアニジン基のようなカチオン性の基にあるとされている。本発明のデンドリマー（樹状高分子）においても、本発明のデンドリマーが優れた細胞膜透過を有する一因が、グアニジン基のようなカチオン性の基を多数有していることと考えられる。
Is mentioned. The hydrogen atom portion of these groups may be substituted with a linear or branched alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, such as a methyl group, an ethyl group, or a propyl group.
One or more such cationic groups may be present on the surface of the dendrimer. Preferably, all of the terminals of the surface portion have these cationic groups.
Further, such cationic groups on the surface of the dendrimer may be the same or different, but it is preferable that they are all the same from the viewpoint of ease of production.
Recently, attention has been focused on the action of arginine, an amino acid having a guanidine group. In particular, it has been reported that a compound into which arginine is introduced increases the cell membrane permeability, and this reason is attributed to a cationic group such as a guanidine group. Also in the dendrimer (dendritic polymer) of the present invention, it is considered that one of the reasons why the dendrimer of the present invention has excellent cell membrane permeation is that it has many cationic groups such as guanidine groups.
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第二に分岐鎖として親水性の高いポリアルキレンオキシ基を有していることである。本発明におけるアルキレン基としては、炭素数１〜６、好ましくは２〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基が挙げられる。好ましいアルキレンオキシ基としては、エチレンオキシ基、プロピレンオキシ基などが挙げられるが、入手のしやすさや親水性などの点からエチレンオキシ基が好ましい。また、これらのアルキレンオキシ基は、水酸基、炭素数１〜５のアルコキシ基などの親水性の基で置換されていてもよい。
分岐鎖におけるアルキレンオキシ基の繰り返し数としては、特に制限はないが、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６、さらに好ましくは２〜４が挙げられる。また、デンドリマーの各世代において、これらの繰り返し数は同じであっても異なっていてもよい。これらの繰り返し数により、デンドリマーの内部のセル空間の広さが確保されることから、コア部に疎水性のベンゾフェノン基を有する大きな基を導入しようとする場合には、比較的大きな繰り返し数が必要となるし、疎水性のベンゾフェノン基を有する基が小さいものであれば、繰り返し数は比較的少なくてもよい。
本発明の一般式［１］においては、分岐鎖としてエチレンオキシ鎖が例示されているが、前記してきたように、本発明のポリイオンデンドリマーの分岐鎖としては、一般式［１］に例示されているエチレンオキシ鎖に限定されるものではなく、親水性の高いポリアルキレンオキシ鎖であれば炭素数１〜６、好ましくは２〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン鎖のいずれであってもよい。
A feature of the polyion dendrimer of the present invention is that it has a highly hydrophilic polyalkyleneoxy group as a branched chain. Examples of the alkylene group in the present invention include linear or branched alkylene groups having 1 to 6 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms. Preferred alkyleneoxy groups include ethyleneoxy groups and propyleneoxy groups, but ethyleneoxy groups are preferred from the standpoint of availability and hydrophilicity. Further, these alkyleneoxy groups may be substituted with a hydrophilic group such as a hydroxyl group or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms.
Although there is no restriction | limiting in particular as the repeating number of the alkyleneoxy group in a branched chain, Preferably it is 1-10, More preferably, it is 1-6, More preferably, 2-4 is mentioned. Moreover, in each generation of dendrimers, the number of these repetitions may be the same or different. These repeat numbers ensure a large cell space inside the dendrimer, so a relatively large repeat number is required when introducing a large group having a hydrophobic benzophenone group in the core. If the group having a hydrophobic benzophenone group is small, the number of repetitions may be relatively small.
In the general formula [1] of the present invention, an ethyleneoxy chain is exemplified as the branched chain. As described above, the branched chain of the polyion dendrimer of the present invention is exemplified in the general formula [1]. The chain is not limited to the ethyleneoxy chain, and may be any linear or branched alkylene chain having 1 to 6 carbon atoms, preferably 2 to 5 carbon atoms, as long as it is a highly hydrophilic polyalkyleneoxy chain. Good.
本発明のポリイオンデンドリマーの特徴は、第三にコア部としてカルボキシル基を有し当該カルボキシル基にアルキレンオキシ基を介してベンゾフェノン基を有する置換基が結合していることである。当該カルボキシル基は、遊離のカルボキシル基として存在することができるのであれば、分岐鎖を形成することができる基を有している限りにおいて、どのような化合物から誘導されるものであってもよいが、好ましくは本発明のデンドリマーにおける分岐部分を形成する分子と同じ化合物から誘導されるものが挙げられる。例えば、ポリヒドロキシカルボン酸、ポリアミノカルボン酸、トリカルボン酸や、テトラカルボン酸などが挙げられる。好ましい具体例としては、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミド、３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸、又は３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸アミドなどが挙げられる。
なお、一般式［１］、［４］、及び［５］においては、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミドが例示されているが、これに限定されるものではない。
また、当該カルボキシ基に結合するアルキレンオキシ基の繰り返し数としては、特に制限はないが、好ましくは２〜７、より好ましくは２〜５、さらに好ましくは３〜５が挙げられる。ベンゾフェノン基はカルボキシル基に結合しているアルキレンオキシ基に直接結合していてもよいし、たとえばチオウレア基を介して結合していてもよい。好ましい例としては、
The third feature of the polyion dendrimer of the present invention is that a substituent having a carboxyl group as a core portion and a benzophenone group is bonded to the carboxyl group via an alkyleneoxy group. The carboxyl group may be derived from any compound as long as it has a group capable of forming a branched chain as long as it can exist as a free carboxyl group. However, those derived from the same compound as the molecule forming the branched portion in the dendrimer of the present invention are preferable. For example, polyhydroxycarboxylic acid, polyaminocarboxylic acid, tricarboxylic acid, tetracarboxylic acid and the like can be mentioned. Preferred examples include 3,4,5-trihydroxybenzoic acid, 3,4,5-trihydroxybenzoic acid amide, 3,4,5-trihydroxycinnamic acid, or 3,4,5-trihydroxycinnamic acid. Examples include acid amides.
In general formulas [1], [4], and [5], 3,4,5-trihydroxybenzoic acid amide is exemplified, but the present invention is not limited thereto.
Moreover, there is no restriction | limiting in particular as the repeating number of the alkyleneoxy group couple | bonded with the said carboxy group, Preferably it is 2-7, More preferably, it is 2-5, More preferably, 3-5 is mentioned. The benzophenone group may be directly bonded to the alkyleneoxy group bonded to the carboxyl group, or may be bonded through, for example, a thiourea group. As a preferable example,
式［９］及び式［１０］で示されるようにベンゾフェノンにカルボキシ基に共有結合させるための官能基を導入して、コア部のカルボキシ基とアミド結合させることができる。
コア部のカルボキシル基とベンゾフェノンを有する置換基との結合は、共有結合が可能であればどのような形態であってもよい。好ましい結合としては、アミド結合、エステル結合などが挙げられる。
ベンゾフェノン基を有する置換基におけるベンゾフェノンは、コア部のカルボキシ基に結合するための官能基、例えば、水酸基などの官能基のほかに、炭素数１〜１０、好ましくは１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基のような不活性な基で置換されていてもよい。また、コア部のカルボキシ基に結合するためのベンゾフェノンの官能基の位置は、特に制限はなく、２〜６位のいずれであってもよい。好ましい位置としては、４位が挙げられる。
As shown in Formula [9] and Formula [10], a functional group for covalently bonding to a carboxy group can be introduced into benzophenone to form an amide bond with the carboxy group in the core part.
The bond between the carboxyl group in the core and the substituent having benzophenone may be in any form as long as a covalent bond is possible. Preferred examples of the bond include an amide bond and an ester bond.
The benzophenone in the substituent having a benzophenone group is a linear group having 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 5 carbon atoms, in addition to a functional group for bonding to the carboxy group of the core part, for example, a functional group such as a hydroxyl group. It may be substituted with an inert group such as a branched alkyl group. Further, the position of the functional group of benzophenone for binding to the carboxy group of the core part is not particularly limited, and may be any of 2-6 positions. A preferred position is the 4th position.
本発明のポリイオンデンドリマーの分岐部分を形成する化合物としては、分岐可能なものであれば特に制限はないが、好ましくは前記したコア部の化合物と同種の化合物の使用が挙げられる。例えば、コア部におけるカルボキシ基を有する化合物として、３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸、又は３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸用いた場合には、分岐部分においてもこれを用いることが製造の容易さの点からも好ましい。
分岐部分の化合物と、分岐鎖の結合も任意に選択することができる。例えば、エステル結合、アミド結合、エーテル結合、イミノ（−Ｎ−）結合などの任意の結合を選択することができる。また、必要に応じてトリアゾリルメチル基を挿入することもできる。
The compound that forms the branched portion of the polyion dendrimer of the present invention is not particularly limited as long as it can be branched, but the use of the same type of compound as the above-mentioned core portion compound is preferable. For example, when 3,4,5-trihydroxybenzoic acid or 3,4,5-trihydroxycinnamic acid is used as the compound having a carboxy group in the core portion, it can be used even in the branched portion. It is also preferable from the viewpoint of easiness.
The bond between the branched portion compound and the branched chain can also be arbitrarily selected. For example, any bond such as an ester bond, an amide bond, an ether bond, and an imino (—N—) bond can be selected. Moreover, a triazolylmethyl group can also be inserted as needed.
本発明のポリイオンデンドリマーの製造方法としては、デンドリマーの公知の製造方法に準じた製造方法を適用することができる。例えば、コア部を形成して第一世代を製造する方法、又は第一世代を形成した状態でコア部を形成させる方法により、コア部と第一世代を製造し、次いで、必要に応じて第二世代、第三世代と成長させる方法が挙げられる。
そして、表面の末端部を形成させることにより製造することができる。
より具体的には、後記する実施例を参照されたい。
As a method for producing the polyion dendrimer of the present invention, a production method according to a known production method for dendrimers can be applied. For example, the core part and the first generation are manufactured by the method of forming the core part and manufacturing the first generation, or the method of forming the core part in the state where the first generation is formed, and then, if necessary, The method of growing with the 2nd generation and the 3rd generation is mentioned.
And it can manufacture by forming the terminal part of a surface.
More specifically, refer to the examples described later.
前記してきた一般式［１］で表される本発明のポリイオンデンドリマーは、分岐鎖がエチレンオキシ基であり、分岐部分が３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸で前の世代の分岐鎖とアミド結合で結合され、次の世代とエーテル結合で結合され、分岐鎖の繰り返し数がｌで世代がｎのものを表している。
また、前記した一般式［４］は、１世代の状態の本発明のポリイオンデンドリマーを表している。
これらはいずれも本発明の好ましいポリイオンデンドリマーの例であり、より具体的には、本発明の好ましいポリイオンデンドリマーとして、次式、
In the polyion dendrimer of the present invention represented by the general formula [1], the branched chain is an ethyleneoxy group, the branched portion is 3,4,5-trihydroxybenzoic acid, and the branched chain and amide of the previous generation are used. It is connected by a bond, and it is connected to the next generation by an ether bond, and the number of branch repeats is 1 and the generation is n.
Further, the above general formula [4] represents the polyion dendrimer of the present invention in one generation state.
These are all examples of preferred polyion dendrimers of the present invention. More specifically, as preferred polyion dendrimers of the present invention,
で表されるポリイオンデンドリマー（以下、この化合物をＧ１−ＢＰという。）が挙げられる。 The polyion dendrimer (Hereinafter, this compound is called G1-BP.) Represented by these.
本発明のポリイオンデンドリマーは、細胞膜透過性を有するだけでなくタンパク質と会合して、タンパク質・キャリア複合体を形成することができる。本発明のポリイオンデンドリマーはタンパク質と会合するだけであり、共有結合で結合されている訳ではないことからタンパク質の構造は何等変化することなくタンパク質の活性を維持したままで細胞膜内に目的のタンパク質を導入することができる。したがって、本発明は、本発明のポリイオンデンドリマーとタンパク質とのタンパク質・キャリア複合体を提供するものである。
本発明は、本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなる細胞内へのタンパク質輸送剤を提供する。本発明のタンパク質輸送剤は、０．０１μＭ以上の濃度で、好ましくは０．０５〜５μＭの濃度で、迅速かつ安全に、しかも効率よく目的のタンパク質を細胞内へ輸送することができる。また、本発明のタンパク質輸送剤は、血清に対する影響を受けにくく、生体内においても使用することが可能である。また、本発明は、本発明のポリイオンデンドリマーを含有してなる細胞内へのタンパク質輸送担体（キャリアー）を提供する。さらに、本発明は、本発明のポリイオンデンドリマー及びタンパク質輸送用溶媒を含有してなる細胞内へのタンパク質輸送用組成物を提供する。
本発明は、本発明のタンパク質輸送剤を用いることを特徴とするタンパク質の輸送方法を提供する。本発明の輸送方法は、目的とするタンパク質と本発明のタンパク質輸送剤を混合し、得られた混合物を緩衝液や培養液などにより適宜希釈し、これを標的の細胞に接触させることにより行うことができる。本発明の輸送方法によれば、目的のタンパク質を迅速かつ安全に、しかも効率よく標的とする細胞へ輸送することができる。
The polyion dendrimer of the present invention not only has cell membrane permeability but can also associate with a protein to form a protein-carrier complex. Since the polyion dendrimer of the present invention is only associated with a protein and is not covalently bound, the protein structure is maintained in the cell membrane while maintaining the protein activity without any change in the structure of the protein. Can be introduced. Accordingly, the present invention provides a protein-carrier complex of the polyion dendrimer of the present invention and a protein.
The present invention provides a protein transporter into cells comprising the polyion dendrimer of the present invention. The protein transporting agent of the present invention can transport the target protein into cells quickly, safely and efficiently at a concentration of 0.01 μM or more, preferably 0.05 to 5 μM. In addition, the protein transporter of the present invention is less susceptible to serum and can be used in vivo. The present invention also provides a protein transport carrier (carrier) into cells comprising the polyion dendrimer of the present invention. Furthermore, the present invention provides a composition for transporting proteins into cells comprising the polyion dendrimer of the present invention and a solvent for transporting proteins.
The present invention provides a method for transporting a protein, characterized by using the protein transport agent of the present invention. The transport method of the present invention is performed by mixing the target protein and the protein transport agent of the present invention, appropriately diluting the obtained mixture with a buffer solution or a culture solution, and bringing the mixture into contact with target cells. Can do. According to the transport method of the present invention, a target protein can be transported to a target cell quickly, safely and efficiently.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, this invention is not limited at all by these Examples.
Ｇ１−ＢＰの製造
次に示す化学反応式にしたがって、目的の本発明のデンドリマーＧ１−ＢＰを製造した。
Production of G1-BP The desired dendrimer G1-BP of the present invention was produced according to the chemical reaction formula shown below.
（１）化合物３の製造
ｐ−トルエンスルホン酸２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル（化合物１）１．６６ｇ（５．０４ｍｍｏｌ）と４−ヒドロキシベンゾフェノン（化合物２）１．００ｇ（５．０４ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１５ｍｌに溶解させた。炭酸カリウム２．０９ｇ（１５．１ｍｍｏｌ）を添加し、８０℃で１８時間撹拌した。クロロホルムで希釈した後、ろ過により固体を除去し、減圧下、６０℃で溶媒を除去した。得られた固体を酢酸エチルに溶解させ、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去した後、２回のカラムクロマトグラフィー（アルミナ、クロロホルム）、（シリカゲル、クロロホルム）で精製し、化合物３を薄黄色油状の透明液体として得た（１．６０ｇ；収率８９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）： δ （ｐｐｍ）
3.37 (t, 2H; ＣＨ２Ｎ３), 3.63-3.80 (m, 6H; ＯＣＨ２),
3.90 (t, 2H; Ａｒ−ＯＣＨ２ＣＨ２), 4.21 (t, 2H; Ａｒ−ＯＣＨ２),
6.98 (d, 2H; 3,5-Ar-H), 7.41-7.61 (m, 3H; 3',4',5'-Ar-H),
7.70-7.88 (m, 4H; 2,2',5,5'-Ar-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
50.6, 67.5, 69.5, 70.0, 70.6, 70.8, 113.9, 127.9,
129.5, 130.0, 131.6, 132.2, 138.0, 162.2, 195.1.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ３９４．２９，
実測値： ［Ｍ＋Ｋ＋］ ３９４．１２，
計算値： ３７８．３２，
実測値： ［Ｍ＋Ｎａ＋］ ３７８．１４，
計算値： ３５６．３５，
実測値： ［Ｍ＋Ｈ＋］ ３５６．１６．
(1) Production of Compound 3 1.66 g (5.04 mmol) of p-toluenesulfonic acid 2- (2- (2-azidoethoxy) ethoxy) ethyl (Compound 1) and 1.00 g of 4-hydroxybenzophenone (Compound 2) (5.04 mmol) was dissolved in 15 ml of dimethylformamide (DMF). 2.09 g (15.1 mmol) of potassium carbonate was added, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 18 hours. After dilution with chloroform, the solid was removed by filtration, and the solvent was removed at 60 ° C. under reduced pressure. The obtained solid was dissolved in ethyl acetate, washed successively with water and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. After removing the solvent, the residue was purified by column chromatography (alumina, chloroform), (silica gel, chloroform) twice to obtain compound 3 as a light yellow oily transparent liquid (1.60 g; yield 89%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm)
3.37 (t, 2H; CH 2 N 3 ), 3.63-3.80 (m, 6H; OCH 2 ),
3.90 (t, 2H; Ar- OCH 2 CH 2), 4.21 (t, 2H; Ar-OCH 2),
6.98 (d, 2H; 3,5-Ar-H), 7.41-7.61 (m, 3H; 3 ', 4', 5'-Ar-H),
7.70-7.88 (m, 4H; 2,2 ', 5,5'-Ar-H).
13 C-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm)
50.6, 67.5, 69.5, 70.0, 70.6, 70.8, 113.9, 127.9,
129.5, 130.0, 131.6, 132.2, 138.0, 162.2, 195.1.
MALDI-TOF-MS m / z
Calculated value: 394.29,
Found: [M + K + ] 394.12.
Calculated value: 378.32.
Found: [M + Na + ] 378.14,
Calculated value: 356.35,
Found: [M + H + ] 356.16.
（２）化合物４の製造
１．４５ｇ（４．０８ｍｍｏｌ）の化合物３とパラジウム−炭素（Ｐｄ：１０％）１００ｍｇを混合し、エタノール１０ｍｌに懸濁させた。水素下、室温で終夜撹拌した後、クロロホルムで希釈した。セライトろ過により固体を除去し、溶媒を減圧除去することで化合物４を黄色の固体として得た（１．２４ｇ；収率９３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
3.15 (t, 2H; ＣＨ２ＮＨ２), 3.55-3.97 (m, 8H; ＯＣＨ２),
4.22 (t, 2H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 5.39 (br, 2H; ＮＨ２),
7.00 (d, 2H; 3,5-Ar-H), 7.41-7.61 (m, 3H; 3',4',5'-Ar-H),
7.70-7.88 (m, 4H; 2,2’,5,5'-Ar-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
39.8, 67.5, 69.4, 70.0, 70.6, 70.8, 114.1, 128.1,
129.6, 130.3, 131.9, 132.4, 138.0, 162.0, 195.5.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ３７０．４６，
実測値： ［Ｍ＋Ｋ＋］ ３６８．１３，
計算値： ３５２．４１，
実測値： ［Ｍ＋Ｎａ＋］ ３５２．１５，
計算値： ３３０．４３，
実測値： ［Ｍ＋Ｈ＋］ ３３０．１７．
(2) Production of Compound 4 1.45 g (4.08 mmol) of Compound 3 and 100 mg of palladium-carbon (Pd: 10%) were mixed and suspended in 10 ml of ethanol. The mixture was stirred overnight at room temperature under hydrogen, and then diluted with chloroform. The solid was removed by Celite filtration, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain Compound 4 as a yellow solid (1.24 g; yield 93%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm)
3.15 (t, 2H; CH 2 NH 2 ), 3.55-3.97 (m, 8H; OCH 2 ),
4.22 (t, 2H; Ar- OCH 2), 5.39 (br, 2H; NH 2),
7.00 (d, 2H; 3,5-Ar-H), 7.41-7.61 (m, 3H; 3 ', 4', 5'-Ar-H),
7.70-7.88 (m, 4H; 2,2 ', 5,5'-Ar-H).
13 C-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm)
39.8, 67.5, 69.4, 70.0, 70.6, 70.8, 114.1, 128.1,
129.6, 130.3, 131.9, 132.4, 138.0, 162.0, 195.5.
MALDI-TOF-MS m / z
Calculated value: 370.46
Found: [M + K + ] 368.13,
Calculated value: 352.41,
Found: [M + Na + ] 352.15
Calculated value: 330.43
Found: [M + H + ] 330.17.
（３）化合物６の製造
既知のトリアジドデンドロン（化合物５）５００ｍｇ（０．７７９ｍｍｏｌ）と２５４ｍｇ（０．７７１ｍｍｏｌ）の化合物４及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）２００μｌを混合し、アセトニトリル／クロロホルム（１／１）１０ｍｌに溶解させた。１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）１９２ｍｇ（０．８１８ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、酢酸エチルに溶解させ、２Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。アルミナでろ過し、溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン＝４／１→１／０）で精製した。これをさらにリサイクルＧＰＣで精製し、化合物６を薄黄色油状の液体として得た（３７３ｍｇ；収率５１％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
3.36 (m, 6H; ＣＨ２Ｎ３), 3.52-3.94 (m, 34H; ＯＣＨ２, ＮＨＣＨ２),
4.18 (m, 8H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 6.84 (t, 1H; ＣＯＮＨＣＨ２),
6.93 (d, 2H; 3,5-benzophenone-H), 7.08 (s, 2H; Ar-H),
7.40-7.60 (m, 3H; 3',4',5'-benzophenone-H),
7.67-7.83 (m, 4H; 2,2’,5,5’-benzophenone-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
39.8, 50.6, 67.5, 69.0, 69.4, 69.7, 69.8, 69.9, 70.1, 70.4,
70.6, 70.7, 72.3, 106.9, 113.9, 128.0, 129.6, 130.1, 131.7,
132.3, 137.9, 141.2, 152.2, 162.0, 166.7, 195.5.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ９９１．８１，
実測値： ［Ｍ＋Ｋ＋］ ９９１．３９，
計算値： ９７５．８４，
実測値： ［Ｍ＋Ｎａ＋］ ９７５．４２．
(3) Production of Compound 6 500 mg (0.779 mmol) of known triazide dendron (Compound 5) and 254 mg (0.771 mmol) of Compound 4 and 200 μl of diisopropylethylamine (DIPEA) were mixed, and acetonitrile / chloroform (1/1 ) Dissolved in 10 ml. After adding 192 mg (0.818 mmol) of 1- [bis (dimethylamino) methylene] -1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU), the mixture was stirred at room temperature for 3 hours. The solvent was removed under reduced pressure, and the residue was dissolved in ethyl acetate, washed successively with 2M aqueous sodium hydrogen sulfate solution, saturated brine, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. After filtration through alumina and removal of the solvent, purification was performed by column chromatography (silica gel, ethyl acetate / hexane = 4/1 → 1/0). This was further purified by recycled GPC to obtain Compound 6 as a pale yellow oily liquid (373 mg; yield 51%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm)
3.36 (m, 6H; CH 2 N 3 ), 3.52-3.94 (m, 34H; OCH 2 , NHCH 2 ),
4.18 (m, 8H; Ar- OCH 2), 6.84 (t, 1H; CONHCH 2),
6.93 (d, 2H; 3,5-benzophenone-H), 7.08 (s, 2H; Ar-H),
7.40-7.60 (m, 3H; 3 ', 4', 5'-benzophenone-H),
7.67-7.83 (m, 4H; 2,2 ', 5,5'-benzophenone-H).
13 C-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm)
39.8, 50.6, 67.5, 69.0, 69.4, 69.7, 69.8, 69.9, 70.1, 70.4,
70.6, 70.7, 72.3, 106.9, 113.9, 128.0, 129.6, 130.1, 131.7,
132.3, 137.9, 141.2, 152.2, 162.0, 166.7, 195.5.
MALDI-TOF-MS m / z
Calculated value: 991.81,
Actual value: [M + K + ] 991.39,
Calculated value: 975.84,
Found: [M + Na + ] 975.42.
（４）化合物８の製造
既知のデンドロン（化合物７）１．１３ｇ（０．８７６ｍｍｏｌ）とプロパルギルアミン１０３ｍｇ（１．８７ｍｍｏｌ）を混合し、アセトニトリル１０ｍｌに溶解させた。１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）２１５ｍｇ（０．９２０ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、酢酸エチルに溶解させ、２Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。これをアルミナでろ過し、減圧下で乾燥させることで化合物８を白色の固体として得た（６６１ｍｇ；収率５７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
1.46 (m, 57H; ＣＨ３), 3.48-3.86 (m, 31H; ＯＣＨ２, ＣＨ２-guanidine, CCH),
4.19 (m, 8H; Ａｒ−ＯＣＨ２, ＣＯＮＨＣＨ２), 7.12 (br, 1H; ＣＯＮＨＣＨ２),
7.25 (s, 2H; Ar-H), 8.58 (br, 3H; ＣＨ２ＮＨＣ(NBoc)(NHBoc)),
11.4 (br, 3H; NHBoc).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）
27.8, 28.0, 29.2, 40.3, 60.0, 68.6, 68.9, 69.5, 70.0,
70.1, 70.4, 70.8, 71.9, 78.8, 79.6, 82.5, 82.6, 106.8,
128.4, 140.9, 151.9, 152.4, 155.8, 162.9, 166.1.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： １３５０．１０，
実測値： ［Ｍ＋Ｎａ＋］ １３４９．７１，
計算値： １２７４．４８，
実測値： ［Ｍ−Ｃ４Ｈ９＋Ｈ＋］ １２７１．６６，
計算値： １２２９．５７，
実測値： ［Ｍ−Ｂｏｃ＋Ｈ＋］ １２２７．６７，
計算値： １１７７．３６，
実測値： ［Ｍ−Ｂｏｃ−Ｃ４Ｈ９＋Ｈ＋］ １１７１．６１，
計算値： １１２８．３８，
実測値： ［Ｍ−２Ｂｏｃ＋Ｈ＋］ １１２７．６２，
計算値： １０６４．４９，
実測値： ［Ｍ−２Ｂｏｃ−Ｃ４Ｈ９＋Ｈ＋］ １０７１．５６，
計算値： １０３１．０８，
実測値： ［Ｍ−３Ｂｏｃ＋Ｈ＋］ １０２７．５７，
計算値： ８２８．７３，
実測値： ［Ｍ−５Ｂｏｃ＋Ｈ＋］ ８２７．４６，
計算値： ７２７．２２，
実測値： ［Ｍ−６Ｂｏｃ＋Ｈ＋］ ７２７．４１．
(4) Production of Compound 8 1.13 g (0.876 mmol) of known dendron (Compound 7) and 103 mg (1.87 mmol) of propargylamine were mixed and dissolved in 10 ml of acetonitrile. After adding 215 mg (0.920 mmol) of 1- [bis (dimethylamino) methylene] -1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU), the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure, and the residue was dissolved in ethyl acetate, washed successively with 2M aqueous sodium hydrogen sulfate solution, saturated brine, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. This was filtered through alumina and dried under reduced pressure to obtain Compound 8 as a white solid (661 mg; yield 57%).
1 H-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm)
1.46 (m, 57H; CH 3 ), 3.48-3.86 (m, 31H; OCH 2 , CH 2 -guanidine, CCH),
4.19 (m, 8H; Ar- OCH 2, CONHCH 2), 7.12 (br, 1H; CONHCH 2),
7.25 (s, 2H; Ar- H), 8.58 (br, 3H; CH 2 NHC (NBoc) (NHBoc)),
11.4 (br, 3H; NHBoc).
13 C-NMR (CDCl 3 ): δ (ppm)
27.8, 28.0, 29.2, 40.3, 60.0, 68.6, 68.9, 69.5, 70.0,
70.1, 70.4, 70.8, 71.9, 78.8, 79.6, 82.5, 82.6, 106.8,
128.4, 140.9, 151.9, 152.4, 155.8, 162.9, 166.1.
MALDI-TOF-MS m / z
Calculated value: 1350.10,
Found: [M + Na + ] 1349.71,
Calculated value: 1274.48,
Found: [M-C 4 H 9 + H +] 1271.66,
Calculated value: 1229.57,
Actual value: [M-Boc + H + ] 1227.67,
Calculated value: 1177.36,
Actual value: [M-Boc-C 4 H 9 + H + ] 1171.61,
Calculated value: 11128.38,
Found: [M-2Boc + H + ] 1127.62.
Calculated value: 1064.49,
Found: [M-2Boc-C 4 H 9 + H +] 1071.56,
Calculated value: 1031.08,
Actual value: [M-3Boc + H + ] 1027.57,
Calculated value: 828.73,
Found: [M-5Boc + H + ] 827.46,
Calculated value: 727.22,
Actual value: [M-6Boc + H + ] 727.41.
（５）化合物９の製造
１１９ｍｇ（０．１２５ｍｍｏｌ）の化合物６と５５５ｍｇ（０．４１８ｍｍｏｌ）の化合物８と硫酸銅五水和物１１ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）及びアスコルビン酸ナトリウム１６６ｍｇ（０．８３６ｍｍｏｌ）を混合し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）／水（１／１）１０ｍｌに溶解させ、室温で１２時間撹拌した。酢酸エチルで希釈した後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。セライトろ過により固体を除去し、減圧下で溶媒を除去した後、リサイクルＧＰＣで精製することにより化合物９を薄茶色の固体として得た（４２０ｍｇ；収率６８％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
1.39 (m, 162H; ＣＨ３), 3.33-3.85 (m, 122H; ＯＣＨ２, ＣＨ２-guanidine),
3.93-4.18 (m, 26H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 4.38 (br, 6H; ＣＨ２ＣＨ２-triazol),
4.53 (br, 6H; triazol-ＣＨ２-NHCO), 6.82 (m, 3H; triazol-H),
7.08 (br, 6H; 3,5-benzophenone-H, CONH),
7.29 (br, 10H; Ar-H, 3,5-benzophenone-H),
7.33-7.53 (m, 3H; 3',4',5'-benzophenone-H),
7.55-7.86 (m, 4H; 2,2',5,5'-benzophenone-H),
8.52 (br, 9H; ＣＨ２ＮＨＣ(NBoc)(NHBoc)), 11.4 (br, 9H; NHBoc).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
27.9, 28.1, 35.2, 40.4, 49.9, 68.8, 69.0, 69.2, 69.5, 69.9,
70.2, 70.4, 70.5, 72.1, 78.8, 82.6, 106.9, 113.8, 123.2, 127.8,
128.8, 129.3, 129.5, 129.9, 131.5, 132.0, 137.8, 141.1, 152.1,
152.6, 155.8, 161.9, 163.0, 166.4, 166.6, 194.8.
(5) Preparation of compound 9 119 mg (0.125 mmol) of compound 6, 555 mg (0.418 mmol) of compound 8, copper sulfate pentahydrate 11 mg (0.04 mmol) and sodium ascorbate 166 mg (0.836 mmol) They were mixed, dissolved in 10 ml of tetrahydrofuran (THF) / water (1/1), and stirred at room temperature for 12 hours. The mixture was diluted with ethyl acetate, washed with saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. The solid was removed by Celite filtration, the solvent was removed under reduced pressure, and then purified by recycle GPC to obtain Compound 9 as a light brown solid (420 mg; yield 68%).
1 H-NMR (CDCl 3 ; ppm): δ
1.39 (m, 162H; CH 3 ), 3.33-3.85 (m, 122H; OCH 2 , CH 2 -guanidine),
3.93-4.18 (m, 26H; Ar- OCH 2), 4.38 (br, 6H; CH 2 CH 2 -triazol),
4.53 (br, 6H; triazol-CH 2 -NHCO), 6.82 (m, 3H; triazol-H),
7.08 (br, 6H; 3,5-benzophenone-H, CONH),
7.29 (br, 10H; Ar-H, 3,5-benzophenone-H),
7.33-7.53 (m, 3H; 3 ', 4', 5'-benzophenone-H),
7.55-7.86 (m, 4H; 2,2 ', 5,5'-benzophenone-H),
8.52 (br, 9H; CH 2 NHC (NBoc) (NHBoc)), 11.4 (br, 9H; NHBoc).
13 C-NMR (CDCl 3 ; ppm): δ
27.9, 28.1, 35.2, 40.4, 49.9, 68.8, 69.0, 69.2, 69.5, 69.9,
70.2, 70.4, 70.5, 72.1, 78.8, 82.6, 106.9, 113.8, 123.2, 127.8,
128.8, 129.3, 129.5, 129.9, 131.5, 132.0, 137.8, 141.1, 152.1,
152.6, 155.8, 161.9, 163.0, 166.4, 166.6, 194.8.
（６）Ｇ１−ＢＰの製造
４０５ｍｇ（０．０８２ｍｍｏｌ）の化合物９を４．０Ｍ塩化水素ジオキサン溶液５ｍｌに溶解させ、室温で６時間撹拌した後、減圧下で乾燥させてＧ１−ＢＰを薄茶色の固体として得た（２８２ｍｇ；収率＞９９％）
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ；ｐｐｍ）：δ
3.28 (m, 18H; ＣＨ２-guanidine),
3.37-4.23 (m, 106H; ＯＣＨ２, ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ),
4.36 (m, 26H; Ａｒ−ＯＣＨ２),
4.59 (br, 12H; ＣＨ２ＣＨ２-triazol, triazol-ＣＨ２-NHC),
6.65 (m, 3H; triazol-H), 6.94-7.15 (m, 10H; Ar-H, 3,5-benzophenone-H),
7.19-7.56 (m, 7H; 3',4',5'-benzophenone-H, 2,2',5,5’-benzophenone-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ；ｐｐｍ）：δ
29.0, 40.52, 42.0, 51.4, 67.2, 69.0, 69.5, 69.6, 69.7, 70.1, 70.3, 70.4,
70.7, 72.7, 106.6, 106.8, 114.7, 129.6, 130.2, 130.3, 133.2, 133.4,
137.4, 140.2, 152.4, 152.6, 157.8, 162.9, 166.7, 167.5, 168.8, 198.0.
(6) Production of G1-BP 405 mg (0.082 mmol) of Compound 9 was dissolved in 5 ml of 4.0 M hydrogen chloride dioxane solution, stirred at room temperature for 6 hours, and then dried under reduced pressure to give G1-BP a light brown As a solid (282 mg; yield> 99%)
1 H-NMR (D 2 O; ppm): δ
3.28 (m, 18H; CH 2 -guanidine),
3.37-4.23 (m, 106H; OCH 2 , CH 2 CH 2 NHCO),
4.36 (m, 26H; Ar- OCH 2),
4.59 (br, 12H; CH 2 CH 2 -triazol, triazol-CH 2 -NHC),
6.65 (m, 3H; triazol-H), 6.94-7.15 (m, 10H; Ar-H, 3,5-benzophenone-H),
7.19-7.56 (m, 7H; 3 ', 4', 5'-benzophenone-H, 2,2 ', 5,5'-benzophenone-H).
13 C-NMR (D 2 O; ppm): δ
29.0, 40.52, 42.0, 51.4, 67.2, 69.0, 69.5, 69.6, 69.7, 70.1, 70.3, 70.4,
70.7, 72.7, 106.6, 106.8, 114.7, 129.6, 130.2, 130.3, 133.2, 133.4,
137.4, 140.2, 152.4, 152.6, 157.8, 162.9, 166.7, 167.5, 168.8, 198.0.
Ｇ１−ＮＢＰの製造
次に示す化学反応式にしたがって、目的の本発明のデンドリマーＧ１−ＮＢＰを製造した。
Production of G1-NBP The objective dendrimer G1-NBP of the present invention was produced according to the following chemical reaction formula.
（１）化合物１１の製造
アミノ基をベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）で保護した、既知のトリエチレングリコール誘導体（化合物１０）３３０ｍｇ（１．１７ｍｍｏｌ）、５００ｍｇ（０．７７９ｍｍｏｌ）の化合物５、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）１７１μｌを混合し、アセトニトリル６ｍｌに溶解させた。１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）１９０ｍｇ（０．８１０ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、２回のカラムクロマトグラフィー（アルミナ、酢酸エチル＋１０％メタノール）、（シリカゲル、酢酸エチル）で精製し、化合物１１を薄黄色油状の液体として得た（４６９ｍｇ；収率６６％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
3.36 (m, 8H; ＣＨ２Ｎ３, ＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｂｎ),
3.51-3.88 (m, 34H; ＯＣＨ２, ＣＨ２ＮＨＣＯ), 4.18 (m, 6H; Ａｒ−ＯＣＨ２),
5.06 (s, 2H; ＰｈＣＨ２Ｏ), 7.04 (s, 2H; Ar-H), 7.31 (br, 5H; Ph-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
50.6, 61.7, 66.7, 69.0, 69.7, 69.9, 70.1, 70.4, 70.6, 70.7, 72.3,
107.0, 127.9, 128.3, 129.6, 136.3, 141.1, 152.2, 156.2, 166.8.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ９４４．１７，
実測値： ［Ｍ＋Ｋ＋］ ９４４．３９，
計算値： ９２８．１９，
実測値： ［Ｍ＋Ｎａ＋］ ９２８．４１．
(1) Preparation of Compound 11 330 mg (1.17 mmol) of known triethylene glycol derivative (Compound 10), 500 mg (0.779 mmol) of Compound 5, diisopropylethylamine with amino group protected with benzyloxycarbonyl group (Cbz) (DIPEA) 171 μl was mixed and dissolved in 6 ml of acetonitrile. After adding 190 mg (0.810 mmol) of 1- [bis (dimethylamino) methylene] -1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU), the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. After removing the solvent under reduced pressure, the residue was purified by column chromatography twice (alumina, ethyl acetate + 10% methanol) and (silica gel, ethyl acetate) to obtain Compound 11 as a light yellow oily liquid (469 mg; yield 66). %).
1 H-NMR (CDCl 3 ; ppm): δ
3.36 (m, 8H; CH 2 N 3 , CH 2 NHCO 2 Bn),
3.51-3.88 (m, 34H; OCH 2 , CH 2 NHCO), 4.18 (m, 6H; Ar-OCH 2),
5.06 (s, 2H; PhCH 2 O), 7.04 (s, 2H; Ar-H), 7.31 (br, 5H; Ph-H).
13 C-NMR (CDCl 3 ; ppm): δ
50.6, 61.7, 66.7, 69.0, 69.7, 69.9, 70.1, 70.4, 70.6, 70.7, 72.3,
107.0, 127.9, 128.3, 129.6, 136.3, 141.1, 152.2, 156.2, 166.8.
MALDI-TOF-MS m / z
Calculated value: 944.17,
Found: [M + K + ] 944.39,
Calculated value: 928.19,
Found: [M + Na + ] 928.41.
（２）化合物１２の製造
４１０ｍｇ（０．４５３ｍｍｏｌ）の化合物１１をＴＨＦ４ｍｌに溶解させ、０℃に冷却した。ここにトリフェニルホスフィン３９２ｍｇ（１．４９ｍｍｏｌ）を添加した後、徐々に室温まで昇温させ、その後室温で３時間撹拌した。水１ｍｌを添加した後、さらに５０℃で終夜撹拌した。室温に戻した後、水３ｍｌと１２Ｍ塩酸４５０μｌを添加した後、トルエンで３回洗浄した。これを減圧下で溶媒を除去することで化合物１２を茶色油状の液体として得た（４２３ｍｇ；収率＞９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ；ｐｐｍ）：δ
3.08 (m, 8H; ＣＨ２Ｎ３, ＣＨ２ＮＨＣＯ２Ｂｎ),
3.35-3.88 (m, 34H; ＯＣＨ２, ＣＨ２ＮＨＣＯ),
4.03-4.20 (m, 6H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 4.84 (s, 2H; ＰｈＣＨ２Ｏ),
7.00 (s, 2H; Ar-H), 7.11-7.27 (m, 5H; Ph-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ；ｐｐｍ）：δ
40.2, 61.4, 67.4, 69.3, 69.9, 70.1, 70.5, 70.8, 71.0, 73.1,
107.5, 128.3, 129.0, 129.5, 130.4, 137.3, 140.5, 152.6, 158.7, 169.7.
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ ｍ／ｚ
計算値： ８６６．００，
実測値： ［Ｍ＋Ｋ＋］ ８６６．４２，
計算値： ８５０．０４，
実測値： ［Ｍ＋Ｎａ＋］ ８５０．４４，
計算値： ８２８．０７，
実測値： ［Ｍ＋Ｈ＋］ ８２８．４６．
(2) Production of Compound 12 410 mg (0.453 mmol) of Compound 11 was dissolved in 4 ml of THF and cooled to 0 ° C. After adding 392 mg (1.49 mmol) of triphenylphosphine, the temperature was gradually raised to room temperature and then stirred at room temperature for 3 hours. After adding 1 ml of water, the mixture was further stirred at 50 ° C. overnight. After returning to room temperature, 3 ml of water and 450 μl of 12M hydrochloric acid were added, followed by washing with toluene three times. The solvent was removed under reduced pressure to obtain Compound 12 as a brown oily liquid (423 mg; yield> 99%).
1 H-NMR (D 2 O; ppm): δ
3.08 (m, 8H; CH 2 N 3 , CH 2 NHCO 2 Bn),
3.35-3.88 (m, 34H; OCH 2 , CH 2 NHCO),
4.03-4.20 (m, 6H; Ar- OCH 2), 4.84 (s, 2H; PhCH 2 O),
7.00 (s, 2H; Ar-H), 7.11-7.27 (m, 5H; Ph-H).
13 C-NMR (D 2 O; ppm): δ
40.2, 61.4, 67.4, 69.3, 69.9, 70.1, 70.5, 70.8, 71.0, 73.1,
107.5, 128.3, 129.0, 129.5, 130.4, 137.3, 140.5, 152.6, 158.7, 169.7.
MALDI-TOF-MS m / z
Calculated value: 866.00,
Found: [M + K + ] 866.42,
Calculated value: 850.04
Actual value: [M + Na + ] 850.44
Calculated value: 828.07,
Found: [M + H + ] 828.46.
（３）化合物１３の製造
１．７１ｇ（１．３３ｍｍｏｌ）の化合物７、３７７ｍｇ（０．４０２ｍｍｏｌ）の化合物１２及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）２９２μｌを混合し、アセトニトリル１０ｍｌに溶解させた。１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）３２４ｍｇ（１．３８ｍｍｏｌ）を添加した後、室温で４．５時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、酢酸エチルに溶解させてアルミナでろ過した。再度、溶媒を減圧除去し、クロロホルムに溶解させ、ヘキサン中で再沈殿させることにより化合物１３を薄黄色の固体として得た（１．１３ｇ；収率６０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
1.45 (m, 162H; ＣＨ３),
3.42-3.86 (m, 132H; ＯＣＨ２, ＣＨ２-guanidine, ＣＨ２ＮＨＣＯ),
3.86 (m, 24H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 7.07 (br, 8H; Ar-H), 7.22 (m, 5H; Ph-H),
8.56 (br, 9H; ＣＨ２ＮＨＣ(NBoc)(NHBoc)), 11.4 (br, 9H; NHBoc).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
28.0, 28.3, 38.5, 39.8, 40.5, 43.4, 66.4, 68.9, 69.2, 69.6, 70.1,
70.3, 70.5, 72.2, 79.1, 82.8, 106.9, 127.7, 127.8, 128.2,
129.4, 129.5, 141.1, 152.2, 152.6, 155.9, 163.1, 166.8.
(3) Production of Compound 13 1.71 g (1.33 mmol) of Compound 7, 377 mg (0.402 mmol) of Compound 12 and 292 μl of diisopropylethylamine (DIPEA) were mixed and dissolved in 10 ml of acetonitrile. After adding 324 mg (1.38 mmol) of 1- [bis (dimethylamino) methylene] -1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU), the mixture was stirred at room temperature for 4.5 hours. The solvent was removed under reduced pressure, and the residue was dissolved in ethyl acetate and filtered through alumina. Again, the solvent was removed under reduced pressure, dissolved in chloroform, and reprecipitated in hexane to obtain Compound 13 as a pale yellow solid (1.13 g; yield 60%).
1 H-NMR (CDCl 3 ; ppm): δ
1.45 (m, 162H; CH 3 ),
3.42-3.86 (m, 132H; OCH 2 , CH 2 -guanidine, CH 2 NHCO),
3.86 (m, 24H; Ar- OCH 2), 7.07 (br, 8H; Ar-H), 7.22 (m, 5H; Ph-H),
8.56 (br, 9H; CH 2 NHC (NBoc) (NHBoc)), 11.4 (br, 9H; NHBoc).
13 C-NMR (CDCl 3 ; ppm): δ
28.0, 28.3, 38.5, 39.8, 40.5, 43.4, 66.4, 68.9, 69.2, 69.6, 70.1,
70.3, 70.5, 72.2, 79.1, 82.8, 106.9, 127.7, 127.8, 128.2,
129.4, 129.5, 141.1, 152.2, 152.6, 155.9, 163.1, 166.8.
（４）化合物１４の製造
９３１ｍｇ（０．２００ｍｍｏｌ）の化合物１３とパラジウム−炭素（Ｐｄ：１０％）５０ｍｇを混合し、エタノール１０ｍｌに懸濁させた。水素下、室温で終夜撹拌した後、クロロホルムで希釈した。セライトろ過により固体を除去し、溶媒を減圧除去することで白色の固体として得た（８５２ｍｇ；収率９４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
1.41 (m, 162H; ＣＨ３), 3.07 (br, 2H; ＣＨ２ＮＨ２),
3.38-3.93 (m, 130H; ＯＣＨ２, ＣＨ２-guanidine, ＣＨ２ＮＨＣＯ),
4.11 (m, 24H; Ａｒ−ＯＣＨ２), 7.09 (m, 8H; Ar-H),
8.27 (br, 2H; ＮＨ２), 8.56 (br, 9H; ＣＨ２ＮＨＣ(NBoc)(NHBoc)),
11.2 (br, 9H; NHBoc).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
27.2, 27.4, 39.0, 41.3, 42.1, 53.8, 68.1, 68.5, 68.8, 68.9,
69.6, 69.8, 71.6, 81.6, 84.2, 106.1, 126.9, 127.1, 127.6,
128.8, 135.9, 139.7, 151.3, 154.4, 155.8, 157.9, 166.2.
(4) Production of Compound 14 931 mg (0.200 mmol) of Compound 13 and 50 mg of palladium-carbon (Pd: 10%) were mixed and suspended in 10 ml of ethanol. The mixture was stirred overnight at room temperature under hydrogen, and then diluted with chloroform. The solid was removed by Celite filtration, and the solvent was removed under reduced pressure to obtain a white solid (852 mg; yield 94%).
1 H-NMR (CDCl 3 ; ppm): δ
1.41 (m, 162H; CH 3 ), 3.07 (br, 2H; CH 2 NH 2 ),
3.38-3.93 (m, 130H; OCH 2 , CH 2 -guanidine, CH 2 NHCO),
4.11 (m, 24H; Ar- OCH 2), 7.09 (m, 8H; Ar-H),
8.27 (br, 2H; NH 2 ), 8.56 (br, 9H; CH 2 NHC (NBoc) (NHBoc)),
11.2 (br, 9H; NHBoc).
13 C-NMR (CDCl 3 ; ppm): δ
27.2, 27.4, 39.0, 41.3, 42.1, 53.8, 68.1, 68.5, 68.8, 68.9,
69.6, 69.8, 71.6, 81.6, 84.2, 106.1, 126.9, 127.1, 127.6,
128.8, 135.9, 139.7, 151.3, 154.4, 155.8, 157.9, 166.2.
（５）化合物１５の製造
４７６ｍｇ（０．１０６ｍｍｏｌ）の化合物１４、既知のベンゾフェノン−４−イソチオシアネート６３８ｍｇ（２．６７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン３６８μｌを混合し、ＤＭＦ５ｍｌに溶解させた後、室温で終夜撹拌した。酢酸エチルで希釈した後、飽和食塩水、飽和塩化アンモニウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。２回の再沈殿（クロロホルム→ヘキサン、クロロホルム→ジエチルエーテル）で精製することにより化合物１５を茶色の固体として得た（３７５ｍｇ；収率７５％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
1.44 (m, 162H; ＣＨ３), 3.34-3.84 (m, 132H; ＯＣＨ２, ＣＨ２-guanidine,
ＣＨ２ＮＨＣＯ, ＣＨ２ＮＨＣＳ), 4.22 (m, 24H; Ａｒ−ＯＣＨ２),
7.06 (m, 8H; Ar-H), 7.32-7.99 (m, 9H; benzophenone-H),
8.57 (br, 9H; ＣＨ２ＮＨＣ(NBoc)(NHBoc)), 11.4 (br, 9H; NHBoc).
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；ｐｐｍ）：δ
28.1, 28.3, 39.9, 40.6, 68.5, 68.9, 69.3, 69.8, 70.3, 70.4,
72.5, 79.2, 83.0, 102.8, 107.0, 117.7, 125.3, 128.1, 128.2,
128.3, 129.7, 129.9, 131.5, 131.8, 138.0, 140.0, 152.3,
152.7, 156.3, 162.1, 163.5, 195.5.
(5) Preparation of Compound 15 476 mg (0.106 mmol) of Compound 14, 638 mg (2.67 mmol) of known benzophenone-4-isothiocyanate and 368 μl of triethylamine were mixed, dissolved in 5 ml of DMF, and stirred at room temperature overnight. . The mixture was diluted with ethyl acetate, washed successively with saturated brine, saturated aqueous ammonium chloride and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. Purification by two reprecipitations (chloroform → hexane, chloroform → diethyl ether) gave compound 15 as a brown solid (375 mg; yield 75%).
1 H-NMR (CDCl 3 ; ppm): δ
1.44 (m, 162H; CH 3 ), 3.34-3.84 (m, 132H; OCH 2 , CH 2 -guanidine,
CH 2 NHCO, CH 2 NHCS) , 4.22 (m, 24H; Ar-OCH 2),
7.06 (m, 8H; Ar-H), 7.32-7.99 (m, 9H; benzophenone-H),
8.57 (br, 9H; CH 2 NHC (NBoc) (NHBoc)), 11.4 (br, 9H; NHBoc).
13 C-NMR (CDCl 3 ; ppm): δ
28.1, 28.3, 39.9, 40.6, 68.5, 68.9, 69.3, 69.8, 70.3, 70.4,
72.5, 79.2, 83.0, 102.8, 107.0, 117.7, 125.3, 128.1, 128.2,
128.3, 129.7, 129.9, 131.5, 131.8, 138.0, 140.0, 152.3,
152.7, 156.3, 162.1, 163.5, 195.5.
（６）Ｇ１−ＮＢＰの製造
３２５ｍｇ（０．０６８ｍｍｏｌ）の化合物１５を４．０Ｍ塩化水素ジオキサン溶液５ｍｌに溶解させ、室温で８．５時間撹拌した後、減圧下で乾燥させた。これをクロロホルムで洗浄することでＧ１−ＮＢＰを暗褐色の固体として得た（１５１ｍｇ；収率６７％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６ＤＭＳＯ；ｐｐｍ）：δ
2.85-3.15 (m, 18H; ＣＨ２-guanidine),
3.17-3.81 (m, 108H;ＯＣＨ２, ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ),
3.90-4.24 (m, 24H; Ａｒ−ＯＣＨ２),
6.92-7.20 (m, 10H; Ar-H, 3,5-benzophenone-H),
7.32-7.85 (m, 7H; 3',4',5'-benzophenone-H, 2,2',5,5'-benzophenone-H).
１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ；ｐｐｍ）：δ
40.6, 42.3, 69.4, 69.9, 70.9, 73.2, 107.6, 119.1, 129.2, 130.6,
131.6, 132.2, 133.3, 138.0, 141.1, 152.7, 158.2, 168.6, 196.6.
(6) Production of G1-NBP 325 mg (0.068 mmol) of Compound 15 was dissolved in 5 ml of 4.0 M hydrogen chloride dioxane solution, stirred at room temperature for 8.5 hours, and then dried under reduced pressure. This was washed with chloroform to obtain G1-NBP as a dark brown solid (151 mg; yield 67%).
1 H-NMR (d 6 DMSO; ppm): δ
2.85-3.15 (m, 18H; CH 2 -guanidine),
3.17-3.81 (m, 108H; OCH 2 , CH 2 CH 2 NHCO),
3.90-4.24 (m, 24H; Ar- OCH 2),
6.92-7.20 (m, 10H; Ar-H, 3,5-benzophenone-H),
7.32-7.85 (m, 7H; 3 ', 4', 5'-benzophenone-H, 2,2 ', 5,5'-benzophenone-H).
13 C-NMR (D 2 O; ppm): δ
40.6, 42.3, 69.4, 69.9, 70.9, 73.2, 107.6, 119.1, 129.2, 130.6,
131.6, 132.2, 133.3, 138.0, 141.1, 152.7, 158.2, 168.6, 196.6.
タンパク質の細胞内取り込み
（１）標識タンパク質の調整
標的タンパク質として、蛍光標識されたアクチンを以下の方法で調整した。
アクチン（ウサギ骨格筋由来）１ｍｇを２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭ塩化カリウム含有、ｐＨ７．０）５００μｌに溶解させた。これにAlexa Fluor（登録商標）６３３ Ｃ５−マレイミド（１ｍＭ）ＨＥＰＥＳ緩衝溶液５０μｌを添加し、室温で４時間静置した。脱塩カラムＧ−２５で過剰の蛍光色素を除去した後、ＨＥＰＥＳ緩衝液で２００μｇ／ｍｌに希釈して分注し、−２０℃で保存した。
（２）タンパク質取り込み活性の評価
タンパク質の取り込み活性評価は以下の方法で行った。
６−ｗｅｌｌ培養ディッシュに１００，０００個／ｗｅｌｌとなるようにＨｅＬａ細胞を、仔ウシ血清（ＦＢＳ；１０％）を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。下記に示す各種試薬とAlexa Fluor（登録商標）６３３標識アクチンを混合した後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で下記に示す濃度に希釈した。これをＰＢＳで洗浄したＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４時間接触させた。再度ＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡでディッシュから剥がしたものをフローサイトメトリーによって解析し、アクチンに結合させたAlexa Fluor（登録商標）６３３の蛍光強度を測定した。比較のため、蛍光標識アクチンのみを接触させた場合を測定した。図１に示す結果を得た。
Protein intracellular uptake (1) Adjustment of labeled protein As a target protein, fluorescently labeled actin was prepared by the following method.
1 mg of actin (from rabbit skeletal muscle) was dissolved in 500 μl of 20 mM HEPES buffer (containing 25 mM potassium chloride, pH 7.0). To this, 50 μl of Alexa Fluor (registered trademark) 633 C 5 -maleimide (1 mM) HEPES buffer solution was added and allowed to stand at room temperature for 4 hours. After removing the excess fluorescent dye with the desalting column G-25, it was diluted with HEPES buffer to 200 μg / ml, dispensed, and stored at −20 ° C.
(2) Evaluation of protein uptake activity Evaluation of protein uptake activity was performed by the following method.
HeLa cells were cultured in a 6-well culture dish at 100,000 cells / well in a DMEM medium containing calf serum (FBS; 10%). Various reagents shown below and Alexa Fluor (registered trademark) 633-labeled actin were mixed, and then diluted with the DMEM medium containing no FBS to the concentrations shown below. This was added to HeLa cells washed with PBS, and contacted at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 4 hours. The HeLa cells were washed again with PBS three times, and the cells detached from the dish with trypsin-EDTA were analyzed by flow cytometry, and the fluorescence intensity of Alexa Fluor (registered trademark) 633 bound to actin was measured. For comparison, the case where only fluorescently labeled actin was contacted was measured. The result shown in FIG. 1 was obtained.
使用したタンパク質、試薬の接触時の濃度は以下の通りである。
（１）蛍光標識アクチン：５０ｎＭ（共通）
（２）蛍光標識アクチン ＋ アルギニン九量体（Ａｒｇ９）：１μＭ
（３）蛍光標識アクチン ＋ Ｇ１−ＮＯＭｅ：１μＭ
（４）蛍光標識アクチン ＋ Ｇ１−ＮＦＩＴＣ：１μＭ
（５）蛍光標識アクチン ＋ SAINT-phD：１５μＭ
（６）蛍光標識アクチン ＋ Ｇ１−ＢＰ：１μＭ
なお、比較例とした用いた（２）のアルギニン九量体（Ａｒｇ９）は細胞膜透過性ペプチドであり、（３）のＧ１−ＮＯＭｅは次の化学式、
Concentrations at the time of contact of the used proteins and reagents are as follows.
(1) Fluorescently labeled actin: 50 nM (common)
(2) Fluorescently labeled actin + arginine nonamer (Arg 9 ): 1 μM
(3) Fluorescently labeled actin + G1-NOMe: 1 μM
(4) Fluorescently labeled actin + G1-NFITC: 1 μM
(5) Fluorescently labeled actin + SAINT-phD: 15 μM
(6) Fluorescently labeled actin + G1-BP: 1 μM
In addition, the arginine nonamer (Arg 9 ) of (2) used as a comparative example is a cell membrane permeable peptide, and G1-NOMe of (3) is represented by the following chemical formula:
で示されるコア部にベンゾフェノン基を有していないポリイオンデンドリマーであり、（４）のＧ１−ＮＦＩＴＣは次の化学式、 A polyion dendrimer having no benzophenone group in the core represented by the formula (4), wherein G1-NFITC is represented by the following chemical formula:
で示されるコア部にベンゾフェノン基ではなく９−フェニルキサンテン誘導体を有するポリイオンデンドリマーであり、（５）のSAINT-phDは市販のタンパク質導入剤である。
図１に示されるように、膜透過性ペプチドとして知られているＡｒｇ９は、アクチンのみを接触させた場合とほとんど違いは見られなかった。市販のタンパク質導入剤であるSAINT-phDを用いた場合は、Ａｒｇ９と比較しても有意に高い取り込み活性が見られた。
一方、本発明のＧ１−ＢＰを用いた場合では、SAINT-phDの１／１５の濃度であるにもかかわらず、３倍以上の高い取り込み活性を示した。
また、コア部にベンゾフェノン基を有していないポリイオンデンドリマーであるＧ１−ＮＯＭｅ及びＧ１−ＮＦＩＴＣは、いずれもアクチンのみを接触させた場合とほとんど違いは見られなかった。
この結果、本発明のコア部にベンゾフェノン基を有する置換基が結合しているポリイオンデンドリマーは、他のポリイオンデンドリマーに比べて顕著なタンパク質輸送作用を有していることが確認された。
Is a polyion dendrimer having a 9-phenylxanthene derivative instead of a benzophenone group at the core, and SAINT-phD in (5) is a commercially available protein introduction agent.
As shown in FIG. 1, Arg 9 known as a membrane permeable peptide showed almost no difference from the case where Arctin alone was contacted. When SAINT-phD, which is a commercially available protein introduction agent, was used, significantly higher uptake activity was seen compared to Arg 9 .
On the other hand, when the G1-BP of the present invention was used, it showed a three-fold or higher uptake activity even though the concentration was 1/15 of SAINT-phD.
In addition, G1-NOMe and G1-NFITC, which are polyion dendrimers having no benzophenone group in the core part, showed almost no difference from the case where only actin was contacted.
As a result, it was confirmed that the polyion dendrimer in which a substituent having a benzophenone group is bonded to the core of the present invention has a remarkable protein transporting action compared to other polyion dendrimers.
タンパク質取り込みの共焦点顕微鏡での観察による確認
また、本発明のＧ１−ＢＰによるAlexa Fluor（登録商標）６３３標識アクチンの細胞内への取り込みは、以下のようにしても確認した。
顕微鏡観察用のガラス底培養ディッシュに１０，０００個／枚となるようにＨｅＬａ細胞を培養した。Ｇ１−ＢＰとAlexa Fluor（登録商標）６３３標識アクチンを混合した後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で希釈した。これをＰＢＳで洗浄したＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４時間接触させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＭＥＭ培地を添加し、共焦点顕微鏡で観察し（励起波長６３３ｎｍ）、図２の結果を得た。
使用したタンパク質、試薬の接触時の濃度は以下の通りである。
（１）蛍光標識アクチン：５０ｎＭ
（２）蛍光標識アクチン ＋ Ｇ１−ＢＰ：１μＭ
図２の左側は、本発明のＧ１−ＢＰを混合した場合を示し、右側は蛍光標識アクチンのみの場合を示す。図２の左側のように、本発明のＧ１−ＢＰを混合した場合には、細胞内部にAlexa Fluor（登録商標）６３３由来の蛍光が観察され、標識したアクチンがＨｅＬａ細胞内に取り込まれていることが確認できた。
Confirmation of protein uptake by observation with a confocal microscope Further, the uptake of Alexa Fluor (registered trademark) 633-labeled actin by G1-BP of the present invention into cells was confirmed as follows.
HeLa cells were cultured at 10,000 cells / plate in a glass bottom culture dish for microscopic observation. G1-BP and Alexa Fluor (registered trademark) 633-labeled actin were mixed and then diluted with DMEM medium without FBS. This was added to HeLa cells washed with PBS, and contacted at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 4 hours. After washing 3 times with PBS, DMEM medium was added and observed with a confocal microscope (excitation wavelength: 633 nm) to obtain the results of FIG.
Concentrations at the time of contact of the used proteins and reagents are as follows.
(1) Fluorescently labeled actin: 50 nM
(2) Fluorescently labeled actin + G1-BP: 1 μM
The left side of FIG. 2 shows the case where G1-BP of the present invention is mixed, and the right side shows the case where only fluorescently labeled actin is used. As shown on the left side of FIG. 2, when the G1-BP of the present invention is mixed, fluorescence derived from Alexa Fluor (registered trademark) 633 is observed inside the cell, and the labeled actin is taken up into the HeLa cell. I was able to confirm.
血清の影響
タンパク質取り込み活性に対する血清の影響を調べるために、同様の実験を、ＦＢＳを１０％含む培地を用いて行った。具体的な操作は以下の通りである。
６−ｗｅｌｌ培養ディッシュに１００，０００個／ｗｅｌｌとなるようにＨｅＬａ細胞を、仔ウシ血清（ＦＢＳ；１０％）を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。下記に示す各種試薬とAlexa Fluor（登録商標）６３３標識アクチンを混合した後、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）で希釈した。これをＰＢＳで洗浄したＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４時間接触させた。再度ＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡでディッシュから剥がしたものをフローサイトメトリーによって解析し、図３に示す結果を得た。図３の左側は、SAINT-phDを混合した場合を示し、右側は本発明のＧ１−ＢＰを混合した場合を示す。それぞれの、左側（青色）は血清がない場合を示し、右側（黄色）は血清がある場合を示す。
使用したタンパク質、試薬の接触時の濃度は以下の通りである。
蛍光標識アクチン：５０ｎＭ（共通）
（１）蛍光標識アクチン ＋ SAINT-phD：１５μＭ
（２）蛍光標識アクチン ＋ Ｇ１−ＢＰ：１μＭ
図３にSAINT-phDとＧ１−ＢＰの血清なし・血清ありのそれぞれの結果を示す。本発明のＧ１−ＢＰは血清の存在下においても十分に高いタンパク質取り込み活性を示し、依然としてSAINT-phDの２倍以上の活性を示す。
Influence of serum In order to examine the influence of serum on protein uptake activity, a similar experiment was performed using a medium containing 10% FBS. The specific operation is as follows.
HeLa cells were cultured in a 6-well culture dish at 100,000 cells / well in a DMEM medium containing calf serum (FBS; 10%). Various reagents shown below and Alexa Fluor (registered trademark) 633 labeled actin were mixed, and then diluted with DMEM medium (10% FBS). This was added to HeLa cells washed with PBS, and contacted at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 4 hours. HeLa cells were washed again with PBS three times, and the cells detached from the dish with trypsin-EDTA were analyzed by flow cytometry, and the results shown in FIG. 3 were obtained. The left side of FIG. 3 shows the case where SAINT-phD is mixed, and the right side shows the case where G1-BP of the present invention is mixed. The left side (blue) shows the case without serum, and the right side (yellow) shows the case with serum.
Concentrations at the time of contact of the used proteins and reagents are as follows.
Fluorescently labeled actin: 50 nM (common)
(1) Fluorescently labeled actin + SAINT-phD: 15 μM
(2) Fluorescently labeled actin + G1-BP: 1 μM
FIG. 3 shows the results of SAINT-phD and G1-BP without serum and with serum, respectively. The G1-BP of the present invention exhibits sufficiently high protein uptake activity even in the presence of serum, and still exhibits more than twice the activity of SAINT-phD.
濃度及び接触時間の影響
Ｇ１−ＢＰの接触濃度、接触時間がタンパク質取り込み量に与える影響を調べるために、以下の実験を行った。
６−ｗｅｌｌ培養ディッシュに１００，０００個／ｗｅｌｌとなるようにＨｅＬａ細胞を、仔ウシ血清（ＦＢＳ；１０％）を含むＤＭＥＭ培地中で培養した。各種試薬とAlexa Fluor（登録商標）６３３標識アクチンを混合した後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で希釈した。これをＰＢＳで洗浄したＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で、Ｇ１−ＢＰ（１μＭ）の条件で１〜４時間、あるいはＧ１−ＢＰ（０．０５，０．１，０．５，１μＭ）の条件で４時間接触させた。再度ＨｅＬａ細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡでディッシュから剥がしたものをフローサイトメトリーによって解析し、図４（ａ）及び（ｂ）に示す結果を得た。図４の（ａ）［上側］は、本発明のＧ１−ＢＰ（１μＭ）の条件で１〜４時間接触させた時の結果を示し、図４（ｂ）［下側］は、本発明のＧ１−ＢＰの濃度が、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、又は１μＭの濃度で４時間接触させた時の結果を示す。
本発明のＧ１−ＢＰ １μＭを使用した場合、接触時間が１時間でもSAINT-phD４時間接触時の活性を上回る性能を示した。SAINT-phDのプロトコルでは、細胞内導入のためのインキュベート時間が４時間であるのに対し、本発明のポリカチオン型デンドリマーを１μＭの濃度で使用した場合には１時間でこれを上回る迅速なタンパク質輸送が達成されることが明らかになった。また、４時間接触では、０．５μＭ（SAINT-phDの１／３０）という低濃度でも、市販のタンパク質導入試薬SAINT-phD（カチオン性脂質）を１５μＭの濃度で用いた場合の２．５倍以上のタンパク質輸送活性を示した。
Effect of Concentration and Contact Time In order to examine the influence of the contact concentration and contact time of G1-BP on the protein uptake amount, the following experiment was performed.
HeLa cells were cultured in a 6-well culture dish at 100,000 cells / well in a DMEM medium containing calf serum (FBS; 10%). Various reagents and Alexa Fluor (registered trademark) 633 labeled actin were mixed, and then diluted with DMEM medium not containing FBS. This is added to HeLa cells washed with PBS, and at 37 ° C., 5% CO 2 atmosphere for 1 to 4 hours under the condition of G1-BP (1 μM), or G1-BP (0.05, 0.1, 0). .5, 1 μM) for 4 hours. The HeLa cells were washed again with PBS three times, and removed from the dish with trypsin-EDTA, and analyzed by flow cytometry, and the results shown in FIGS. 4 (a) and (b) were obtained. (A) [upper side] of FIG. 4 shows the results when contacted for 1 to 4 hours under the condition of G1-BP (1 μM) of the present invention, and FIG. The results are shown when the G1-BP is contacted at a concentration of 0.05 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, or 1 μM for 4 hours.
When 1 μM of G1-BP of the present invention was used, performance exceeding the activity at the time of SAINT-phD contact for 4 hours was exhibited even if the contact time was 1 hour. In the SAINT-phD protocol, the incubation time for introduction into the cell is 4 hours, whereas when the polycationic dendrimer of the present invention is used at a concentration of 1 μM, a rapid protein that exceeds this in 1 hour. It became clear that transportation was achieved. In addition, in the case of contact for 4 hours, even when the concentration is as low as 0.5 μM (1/30 of SAINT-phD), it is 2.5 times that when a commercially available protein introduction reagent SAINT-phD (cationic lipid) is used at a concentration of 15 μM The above protein transport activity was shown.
タンパク質の変性の有無
細胞内にＧ１−ＢＰによって取り込まれたタンパク質がその活性を維持しているかどうかを以下の実験により確認した。
顕微鏡観察用のガラス底培養ディッシュに１０，０００個／枚となるようにＨｅＬａ細胞を培養した。Ｇ１−ＢＰと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を混合した後、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地で希釈した。これをＰＢＳで洗浄したＨｅＬａ細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４時間接触させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＭＥＭ培地を添加し、共焦点顕微鏡で観察し（励起波長４８８ｎｍ）、図５に示す結果を得た。図５の左側は、本発明のＧ１−ＢＰを混合したときの結果を示し、右側は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のみのときの結果を示す。
使用したタンパク質、試薬の接触時の濃度は以下の通りである。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）：５ｎＭ
Ｇ１−ＢＰ：１μＭ
細胞内に取り込まれたＧＦＰ由来の蛍光が確認できることから、取り込まれたタンパク質は変性や失活を引き起こさず、その機能を維持できたことがわかる。
Presence or absence of protein denaturation It was confirmed by the following experiment whether the protein taken up by G1-BP in the cell maintained its activity.
HeLa cells were cultured at 10,000 cells / plate in a glass bottom culture dish for microscopic observation. G1-BP and green fluorescent protein (GFP) were mixed and then diluted with DMEM medium without FBS. This was added to HeLa cells washed with PBS, and contacted at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 4 hours. After washing 3 times with PBS, DMEM medium was added and observed with a confocal microscope (excitation wavelength 488 nm), and the results shown in FIG. 5 were obtained. The left side of FIG. 5 shows the result when G1-BP of the present invention is mixed, and the right side shows the result when only green fluorescent protein (GFP) is used.
Concentrations at the time of contact of the used proteins and reagents are as follows.
Green fluorescent protein (GFP): 5 nM
G1-BP: 1 μM
Since GFP-derived fluorescence incorporated into the cells can be confirmed, it can be seen that the incorporated protein could maintain its function without causing denaturation or inactivation.
細胞毒性
Ｇ１−ＢＰの細胞毒性をCell Counting Kit-8（同仁化学）を用いて以下のように調べた。
９６−ｗｅｌｌ培養プレートに５，０００個／ｗｅｌｌとなるようにＨｅＬａ細胞を培養した。ＰＢＳで洗浄したこれらのＨｅＬａ細胞にＧ１−ＢＰを含むＤＭＥＭ培地（ＦＢＳを含まない）を１００μｌずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で４時間接触させた。ここに、Cell Counting Kit-8発色試薬を１０μＬずつ添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で１時間静置下後、４５０ｎｍの吸光度測定によって毒性を評価し、図６に示す結果を得た。図６の縦軸は細胞生存率（比率）を示し、横軸はＧ１−ＢＰの濃度（μＭ）を示す。
図６のように、タンパク質取り込み活性が十分に発揮される１μＭの濃度でも細胞毒性は全く生じていない。以上のように、本発明のＧ１−ＢＰは標的の細胞に全く毒性を示さずに、既存のSAINT-phDを上回る高いタンパク質取り込み活性を示した。
Cytotoxicity The cytotoxicity of G1-BP was examined using Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories) as follows.
HeLa cells were cultured on a 96-well culture plate at 5,000 cells / well. 100 μl of DMEM medium (without FBS) containing G1-BP was added to these HeLa cells washed with PBS, and contacted at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere for 4 hours. Here, 10 μL of Cell Counting Kit-8 coloring reagent was added, and after standing at 37 ° C. and 5% CO 2 atmosphere for 1 hour, toxicity was evaluated by measuring absorbance at 450 nm, and the result shown in FIG. 6 was obtained. It was. The vertical axis of FIG. 6 indicates the cell viability (ratio), and the horizontal axis indicates the concentration of G1-BP (μM).
As shown in FIG. 6, no cytotoxicity occurs even at a concentration of 1 μM at which the protein uptake activity is sufficiently exerted. As described above, the G1-BP of the present invention did not show any toxicity to the target cells, and showed a higher protein uptake activity than the existing SAINT-phD.
本発明は、目的とするタンパク質を、迅速かつ効率よく、しかもタンパク質の活性を損なうことなく安全に細胞内に輸送することができる、タンパク質キャリア用分子としての新規なポリカチオン型デンドリマー（樹状高分子）を提供するものであり、細胞内への効率的かつ迅速なタンパク質輸送剤として有用である。 The present invention provides a novel polycationic dendrimer (dendritic high molecular weight) as a protein carrier molecule that can rapidly and efficiently transport a target protein into a cell without impairing the activity of the protein. Molecule) and is useful as an efficient and rapid protein transporter into cells.
Claims (10)
で表されるベンゾフェノン基を有する置換基である請求項１〜３のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。 The substituent having a benzophenone group is represented by the following general formula [2] or [3],
The polyion dendrimer according to any one of claims 1 to 3, which is a substituent having a benzophenone group represented by the formula:
で表されるベンゾフェノン基を有する置換基を示し、Ｙは、それぞれ独立してグアニジン基、チオウレニウム基、及びイソチオウレニウム基からなる群から選ばれるカチオン性の基を示し、ｌは１〜６の整数を表し、ｍは０又は１を表し、ｎは世代数を示し１〜５の整数を表す。なお、式中の分岐部分の３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸アミドは、３，４，５−トリヒドロキシ桂皮酸アミドであってもよく、分岐鎖のエチレンオキシ鎖は、炭素数１〜６、好ましくは２〜５の直鎖状又は分岐状のアルキレン鎖であってもよい。］
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項１〜５のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。 The polyion dendrimer has the following general formula [1]
And Y represents a cationic group independently selected from the group consisting of a guanidine group, a thiourenium group, and an isothiourenium group, and l represents 1-6. Represents an integer, m represents 0 or 1, n represents the number of generations, and represents an integer of 1 to 5; The branched 3,4,5-trihydroxybenzoic acid amide in the formula may be 3,4,5-trihydroxycinnamic acid amide, and the branched ethyleneoxy chain has 1 to 1 carbon atoms. It may be 6, preferably 2-5 linear or branched alkylene chains. ]
The polyion dendrimer according to any one of claims 1 to 5, which is represented by the following formula.
で表されるポリイオンデンドリマーである請求項１〜６のいずれかに記載のポリイオンデンドリマー。 The polyion dendrimer has the following general formula [4]
The polyion dendrimer according to any one of claims 1 to 6, wherein
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010047133A JP5346307B2 (en) | 2010-03-03 | 2010-03-03 | Polyion dendrimers for intracellular introduction of proteins |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010047133A JP5346307B2 (en) | 2010-03-03 | 2010-03-03 | Polyion dendrimers for intracellular introduction of proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011178756A JP2011178756A (en) | 2011-09-15 |
| JP5346307B2 true JP5346307B2 (en) | 2013-11-20 |
Family
ID=44690668
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010047133A Expired - Fee Related JP5346307B2 (en) | 2010-03-03 | 2010-03-03 | Polyion dendrimers for intracellular introduction of proteins |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5346307B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109661243A (en) * | 2016-05-23 | 2019-04-19 | 欧洲国家生物医学工程研究所 | Biodegradable dendritic structure, method and application thereof |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002526456A (en) * | 1998-09-23 | 2002-08-20 | スクール オブ ファーマシー， ユニヴァーシティ オブ ロンドン | Cationic compounds and their use as macromolecular carriers |
| KR100849033B1 (en) * | 2006-09-07 | 2008-07-29 | 포항공과대학교 산학협력단 | Alditol or inositol-based molecular transporters |
| EP1733742A1 (en) * | 2005-06-17 | 2006-12-20 | Universiteit Utrecht Holding B.V. | Dendrimers multivalently substituted with active groups |
| US7935816B2 (en) * | 2007-10-25 | 2011-05-03 | Gene Tools, Llc | Molecular transporter compositions comprising dendrimeric oligoguanidine with a triazine core that facilitate delivery into cells in vivo |
| JP4949206B2 (en) * | 2007-11-09 | 2012-06-06 | 独立行政法人科学技術振興機構 | Polyion dendrimers for biomolecular modification |
| EP2450392B1 (en) * | 2009-07-01 | 2014-06-25 | Japan Science And Technology Agency | Polyionic dendrimer and hydrogel comprising same |
-
2010
- 2010-03-03 JP JP2010047133A patent/JP5346307B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109661243A (en) * | 2016-05-23 | 2019-04-19 | 欧洲国家生物医学工程研究所 | Biodegradable dendritic structure, method and application thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2011178756A (en) | 2011-09-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10143753B2 (en) | Protein transduction domains mimics | |
| US10420849B2 (en) | Pyrrolidone derivatives, oligomers and polymers | |
| Zhang et al. | Linear polycations by ring-opening polymerization as non-viral gene delivery vectors | |
| Uritu et al. | Hybrid fullerene conjugates as vectors for DNA cell-delivery | |
| US8603493B2 (en) | Carbosilane dendrimers, preparation method thereof and use of same | |
| John et al. | Biomimetic pH/redox dual stimuli‐responsive zwitterionic polymer block poly (L‐histidine) micelles for intracellular delivery of doxorubicin into tumor cells | |
| Xun et al. | Low molecular weight PEI-based polycationic gene vectors via Michael addition polymerization with improved serum-tolerance | |
| US10968176B2 (en) | Pyrrolidone derivatives, oligomers and polymers | |
| KR20100119491A (en) | Oligocarbonate molecular transporters | |
| Guo et al. | Diol glycidyl ether-bridged low molecular weight PEI as potential gene delivery vehicles | |
| CN110124047B (en) | Preparation method of DNA nano robot drug-loaded system and DNA nano robot drug-loaded system obtained by same | |
| CN101218204A (en) | Modified poly(propylene-imine) dendrimers and their use as transfection agents for anionic bioactive factors | |
| Illescas et al. | Multivalent cationic dendrofullerenes for gene transfer: Synthesis and DNA complexation | |
| Pan et al. | Supramolecular assemblies of novel aminonucleoside phospholipids and their bonding to nucleic acids | |
| JP5346307B2 (en) | Polyion dendrimers for intracellular introduction of proteins | |
| Qi et al. | Guanidinated amphiphilic cationic copolymer with enhanced gene delivery efficiency | |
| JP4949206B2 (en) | Polyion dendrimers for biomolecular modification | |
| Zhang et al. | Amphiphilic polymers formed from ring-opening polymerization: a strategy for the enhancement of gene delivery | |
| US20100093094A1 (en) | Triazine dendrimers and methods of making and using the same for nucleic acid transport | |
| JP2023504718A (en) | Luminescent Zwitterionic Polymer Nanoparticles | |
| KR100578732B1 (en) | Inositol-based molecular transporters and processes for the preparation thereof | |
| Xun et al. | Polyethylenimine analogs for improved gene delivery: Effect of the type of amino groups | |
| Kim et al. | Water-soluble porphyrin–polyethylene glycol conjugates with enhanced cellular uptake for photodynamic therapy | |
| US7368240B2 (en) | Microscope system and methods for intracellular studies | |
| Yadav et al. | Dendrimeric amide-and carbamate-linked lysine-based efficient molecular transporters |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130521 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130719 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130813 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130816 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5346307 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |