JP5320915B2 - Microbial contamination detection kit, microbial contamination detection method, and contamination source discrimination method - Google Patents
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Description
本発明は、超純水由来の微生物汚染を検出するためのキット、該キットを用いて微生物汚染を検出する方法、及び該キットを用いて汚染源が超純水か否かを判別する方法に関する。 The present invention relates to a kit for detecting microbial contamination derived from ultrapure water, a method for detecting microbial contamination using the kit, and a method for determining whether a contamination source is ultrapure water using the kit.
近年、物質の合成や分解等の反応を行うために、生物触媒作用を利用する手法が盛んに行われている。該生物触媒作用として、酵素等のタンパク質が有する触媒作用や、細胞や微生物が有する触媒作用等がある。例えば、抗体等のある特定の有用物質を産生し得る特殊な微生物や動物細胞等を培養することより、目的の有用物質を簡便かつ効率よく得ることができる。このような生物触媒作用を利用する手法を、工業的に用いる場合に、目的の細胞等を大量に培養するために用いられる、特殊な設備を備えた大型の培養槽は、バイオリアクターとも呼ばれている。バイオリアクターを用いることにより、目的の細胞等を、大量に純粋培養することができる。 In recent years, in order to perform reactions such as synthesis and decomposition of substances, techniques using biocatalysis have been actively performed. Examples of the biocatalytic action include a catalytic action possessed by proteins such as enzymes and a catalytic action possessed by cells and microorganisms. For example, by culturing special microorganisms or animal cells that can produce a specific useful substance such as an antibody, the target useful substance can be obtained simply and efficiently. Large-scale culture vessels equipped with special equipment used to cultivate target cells and the like in large quantities when such a technique utilizing biocatalysis is used industrially are also called bioreactors. ing. By using a bioreactor, a target cell or the like can be purely cultured in large quantities.
目的の細胞等以外の他の微生物がバイオリアクター等の装置に混入（微生物汚染）すると、生産性が低下するおそれや、目的生産物の品質が損なわれるおそれが高い。このため、微生物汚染を迅速に検出し得る方法の開発が盛んに行われている。微生物汚染を検出する方法としては、一般的に、寒天培地での培養法や蛍光試薬等を用いた染色法等がある。培養法を応用した検出方法としては、例えば、微生物を支持体上に形成させた着色培地を用いて培養し、フィルムスキャナーで該微生物の形成するコロニーを検出することを特徴とする微生物検出方法等が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。その他、染色法を応用した検出方法としては、例えば、微生物を検出する方法であって、検出対象から試料を採りこむ試料採取ステップと、前記試料採取ステップにて採りこまれた前記試料に存在する微生物を濃縮するステップと、前記微生物の存在により色調が変化する成分を有する試薬を前記試料濃縮ステップにて濃縮された試料に投入する試薬投入ステップと、前記試薬投入ステップにて投入された前記試薬の色調の変化を光学系により検出する微生物検出ステップと、を含むことを特徴とする微生物検出方法等が開示されている（例えば、特許文献２参照。)。 When microorganisms other than the target cell or the like are mixed into a device such as a bioreactor (microorganism contamination), there is a high possibility that the productivity is lowered and the quality of the target product is impaired. For this reason, development of the method which can detect microbial contamination rapidly is performed actively. As a method for detecting microbial contamination, there are generally a culture method using an agar medium, a staining method using a fluorescent reagent, and the like. As a detection method applying the culture method, for example, a microorganism detection method characterized by culturing using a colored medium in which microorganisms are formed on a support, and detecting colonies formed by the microorganisms with a film scanner, etc. Is disclosed (for example, see Patent Document 1). Other detection methods that apply the staining method include, for example, a method for detecting microorganisms, which includes a sample collection step for taking a sample from a detection target, and the sample taken in the sample collection step. A step of concentrating microorganisms, a reagent introduction step of introducing a reagent having a component whose color tone changes due to the presence of the microorganisms into the sample concentrated in the sample concentration step, and the reagent introduced in the reagent introduction step A microorganism detection method including a microorganism detection step of detecting a change in color tone by an optical system (see, for example, Patent Document 2).
また、バイオリアクター等の装置や食品工場等のプラントにおいて、微生物汚染が発見された場合には、通常は、運転が中止され、微生物により汚染された細胞培養液等の原料は廃棄される。このため、培地等の高価な培養リソースが大量に無駄になり、多大な損失を被る場合がある。また、さらなる汚染の拡大を防止すべく、装置内の汚染された全ての箇所の洗浄・滅菌作業を、汚染が無くなり、装置が所望の無菌状態で稼動できるようになるまで繰り返す必要があり、膨大な費用と労力を要するという問題がある。 In addition, when microbial contamination is found in a device such as a bioreactor or a plant such as a food factory, the operation is usually stopped, and raw materials such as a cell culture solution contaminated by the microorganism are discarded. For this reason, expensive culture resources, such as a culture medium, are wasted in large quantities and may suffer a great loss. Moreover, in order to prevent further spread of contamination, it is necessary to repeat the cleaning and sterilization work for all the contaminated parts in the device until the device is free of contamination and the device can be operated in a desired aseptic condition. There is a problem that it requires a lot of cost and labor.
微生物汚染を防止すべく、様々な対策が講じられているが、完全に防止することは困難である。一方で、汚染源を特定できた場合には、装置等の洗浄・滅菌作業をより効率よく行うことができ、再稼動までに要する時間を短縮し、コストを低減することができる。したがって、微生物汚染が発見された場合には、速やかに汚染源を特定することが肝要である。
一般的には、汚染源を特定するために、装置内の汚染源となり得るあらゆる箇所からサンプルを採取し、該サンプル中の微生物の有無を検出することにより、汚染源を特定することが行われているが、バイオリアクターやプラントのように装置が大きい場合には、サンプル数も膨大となり、迅速に汚染源を特定することは難しい。 In general, in order to specify a contamination source, a sample is taken from every possible location in the apparatus, and the contamination source is identified by detecting the presence or absence of microorganisms in the sample. When the apparatus is large like a bioreactor or a plant, the number of samples becomes enormous, and it is difficult to quickly identify the contamination source.
特に、上記（１）の方法のように培養法を利用した微生物検出法では、微生物検出に１〜数週間の時間を要し、迅速な検出には適さない。一方、上記（２）の方法のように染色法を利用した微生物検出法では、簡便かつ迅速な検出が可能であり、バイオリアクターや等の大型装置から採取された大量のサンプルの処理に適しているものの、検出感度が低く、微生物種まで特定することは難しいため、各サンプルが採取された箇所が微生物により汚染されていることは確認できるものの、汚染源を特定することは非常に困難である。 In particular, the microorganism detection method using the culture method as in the above method (1) requires one to several weeks for microorganism detection and is not suitable for rapid detection. On the other hand, the microorganism detection method using the staining method as in the method (2) above allows simple and rapid detection, and is suitable for processing a large amount of sample collected from a large-scale apparatus such as a bioreactor or the like. However, since the detection sensitivity is low and it is difficult to specify even the microorganism species, it can be confirmed that the location where each sample is collected is contaminated with microorganisms, but it is very difficult to specify the contamination source.
本発明は、迅速かつ簡便に、超純水の微生物汚染を検出し得るキット、及び、該キットを用いて、超純水を含む装置において、汚染源が超純水か否かを判別する方法を提供することを目的とする。 The present invention provides a kit capable of detecting microbial contamination of ultrapure water quickly and easily, and a method for determining whether or not the contamination source is ultrapure water in an apparatus including ultrapure water using the kit. The purpose is to provide.
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、超純水のような貧栄養の特殊な環境下においては、生息する微生物の種類が比較的限定されること、及び、汚染された超純水由来の微生物を特異的に検出し得るポリヌクレオチドプローブを用いて微生物を検出することにより、超純水の微生物汚染、及び装置の微生物汚染において、該ポリヌクレオチドプローブを用いて微生物を検出することにより、汚染源が超純水であるか否かを判別し得ることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have found that the types of microorganisms that inhabit are relatively limited and contaminated in an oligotrophic special environment such as ultrapure water. By detecting a microorganism using a polynucleotide probe that can specifically detect microorganisms derived from ultrapure water, microorganisms can be detected using the polynucleotide probe in microbial contamination of ultrapure water and microbial contamination of equipment. It has been found that it is possible to determine whether or not the contamination source is ultrapure water by detection, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は、超純水の微生物汚染の検出に用いられるキットであって、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、を有することを特徴とする微生物汚染検出用キットを提供するものである。
また、本発明は、超純水の微生物汚染を、前記記載の微生物汚染検出用キットを用いて検出することを特徴とする微生物汚染検出方法を提供するものである。
また、本発明は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法を用いて微生物を検出することを特徴とする前記記載の微生物汚染検出方法を提供するものである。
また、本発明は、内部に超純水を含む装置の微生物汚染において、前記記載の微生物汚染検出用キットを用いて微生物を検出することにより、汚染源が超純水であるか否かを判別することを特徴とする汚染源判別方法を提供するものである。
また、本発明は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法を用いて微生物を検出することを特徴とする前記記載の汚染源判別方法を提供するものである。
また、本発明は、前記装置が、バイオリアクター、超純水製造装置、及び半導体洗浄装置からなる群より選択されるものであることを特徴とする前記いずれか記載の汚染源判別方法を提供するものである。
That is, the present invention is ultra-pure water to a kit used for the detection of microbial contamination, consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide probes or SEQ ID NO: 1 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 polynucleotide a probe, of SEQ ID NO: 2 polynucleotide probes or SEQ ID NO: 2 consisting of the nucleotide sequence and the polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 polynucleotide probe or SEQ ID NO: 3 a polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence, consists of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide probe or SEQ ID NO: 4 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and the polynucleotide probe, of SEQ ID NO: 5 base sequence of the polynucleotide probe or SEQ ID NO: 5 comprising the nucleotide sequence And characterized in that it comprises a polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence complementary, a polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide probe or SEQ ID NO: 6 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, to The present invention provides a kit for detecting microbial contamination.
The present invention also provides a microbial contamination detection method characterized by detecting microbial contamination of ultrapure water using the microbial contamination detection kit described above.
The present invention also provides the microorganism contamination detection method as described above, wherein the microorganism is detected using a fluorescence in situ hybridization method.
Further, the present invention determines whether or not the contamination source is ultrapure water by detecting microorganisms using the microorganism contamination detection kit described above in microbial contamination of an apparatus containing ultrapure water inside. It is an object of the present invention to provide a contamination source discrimination method characterized by the above.
The present invention also provides the above-described contamination source determination method, wherein a microorganism is detected using a fluorescence in situ hybridization method.
Further, the present invention provides the contamination source determination method according to any one of the above, wherein the apparatus is selected from the group consisting of a bioreactor, an ultrapure water production apparatus, and a semiconductor cleaning apparatus. It is.
本発明の微生物汚染検出用キットを用いて、超純水を調べることにより、汚染微生物の具体的な種類が不明である場合であっても、該超純水の微生汚染を迅速かつ簡便に検出することができる。
また、本発明の微生物汚染検出用キットを用いて、内部に超純水を含む装置から採取されたサンプルを調べることにより、該装置の微生物汚染の汚染源が超純水であるか否かを、迅速かつ高い確率で判別することができる。
By examining ultrapure water using the kit for detecting microbial contamination of the present invention, even if the specific type of contaminating microorganism is unknown, the microbial contamination of the ultrapure water can be quickly and easily performed. Can be detected.
Further, by using the kit for detecting microbial contamination of the present invention, by examining a sample collected from a device containing ultrapure water therein, whether or not the contamination source of microbial contamination of the device is ultrapure water, The determination can be made quickly and with high probability.
本発明における微生物とは、原核生物である細菌やウィルス、及び真核生物である真菌を意味する。また、本発明において、「汚染された超純水由来の微生物」とは、汚染された超純水、すなわち、滅菌処理が不十分である等により、目的の生物以外の微生物（汚染の原因となる微生物、以下、汚染原因菌ということもある。）を含有する超純水が供給されたことにより、装置に混入され、汚染の原因となった微生物を意味する。 The microorganism in the present invention means bacteria and viruses that are prokaryotes and fungi that are eukaryotes. Further, in the present invention, “microorganisms derived from contaminated ultrapure water” means contaminated ultrapure water, that is, microorganisms other than the target organism (due to the cause of contamination, for example, due to insufficient sterilization treatment). This means a microorganism that is contaminated with the device and is contaminated by the supply of ultrapure water containing the microorganism, hereinafter referred to as a contamination-causing bacterium).
本発明の微生物汚染検出用キットは、超純水の微生物汚染の検出に用いられるキットであって、汚染された超純水由来の微生物に特異的な塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ（以下、超純水由来汚染原因菌検出用プローブという。）を有することを特徴とする。超純水由来汚染原因菌検出用プローブとしては、具体的には、配列番号１の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号１の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号２の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号２の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号３の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号３の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号４の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号４の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号５の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号５の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号６の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、及び配列番号６の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ等がある。 The microbial contamination detection kit of the present invention is a kit used for detecting microbial contamination of ultrapure water, and has a base sequence complementary to a base sequence specific to a contaminated microorganism derived from ultrapure water. It has a nucleotide probe (hereinafter referred to as a probe for detecting ultrapure water-derived contamination-causing bacteria). Specifically, as a probe for detecting the ultrapure water-derived contaminant causative bacteria, a polynucleotide probe having a continuous base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1, and at least 9 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 A polynucleotide probe having a base sequence complementary to a base sequence of bases, a polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 2, and at least 9 in the base sequence of SEQ ID NO: 2 A polynucleotide probe having a base sequence complementary to a base sequence of bases; a polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 3; and at least 9 in a base sequence of SEQ ID NO: 3. Polynucleotide probe and sequence having a base sequence complementary to a continuous base sequence A polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of No. 4, a polynucleotide probe having a base sequence complementary to a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 4, sequence A polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of No. 5, a polynucleotide probe having a base sequence complementary to a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID No. 5, sequence A polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of No. 6; a polynucleotide probe having a base sequence complementary to at least 9 bases of the base sequence of SEQ ID NO: 6; There is.
本発明の微生物汚染検出用キットは、これらの超純水由来汚染原因菌検出用プローブからなる群より選択される１以上を含むものであればよい。より検出精度や検出効率に優れるため、本発明の微生物汚染検出用キットとしては、配列番号１の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号１の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、配列番号２の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号２の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、配列番号３の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号３の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、配列番号４の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号４の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、配列番号５の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号５の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、配列番号６の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号６の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブとの計６種類のポリヌクレオチドプローブを有することが好ましい。 The kit for detecting microbial contamination according to the present invention only needs to include one or more selected from the group consisting of these probes for detecting contamination-causing bacteria derived from ultrapure water. In order to be more excellent in detection accuracy and detection efficiency, the kit for detecting microbial contamination of the present invention includes a polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a base sequence of SEQ ID NO: 1. A polynucleotide probe having a base sequence complementary to a continuous base sequence of at least 9 bases, and a polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 2 or a base sequence of SEQ ID NO: 2 A polynucleotide probe having a base sequence complementary to a continuous base sequence of at least 9 bases and a polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 3 or a base of SEQ ID NO: 3 It has a base sequence complementary to a continuous base sequence of at least 9 bases in the sequence A nucleotide sequence complementary to a renucleotide probe and a polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 4 or a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 4 And a polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 5 or a base sequence complementary to a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 5 And a polynucleotide probe having a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 6 or a base complementary to a base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 6 6 types of polynucleotides together with polynucleotide probes having sequences It is preferred to have a Chidopurobu.
なお、本発明において、「塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列」とは、９塩基以上の連続する塩基配列であればよく、塩基配列のうち、５’末端を含む９塩基以上の連続した塩基配列であってもよく、３’末端を含む９塩基以上の連続した塩基配列であってもよく、５’末端と３’末端の両方を含まない９塩基以上の連続した塩基配列であってもよい。 In the present invention, the “base sequence of at least 9 bases in the base sequence” may be a base sequence of 9 bases or more, and 9 bases or more including the 5 ′ end in the base sequence. The base sequence may be a continuous base sequence of 9 bases or more including the 3 ′ end, or a base sequence of 9 bases or more not including both the 5 ′ end and the 3 ′ end. There may be.
汚染された超純水に含まれている微生物の種類は、通常、超純水の原料となる水が採取された時期や場所等により変動するものである。したがって、超純水を介して装置等に混入される微生物の種類は、装置等に供給されるその時々によって異なることになるため、汚染原因菌の菌種を特定することは、非常に手間がかかる上に、困難である場合が多い。
これに対して、本発明の発明者らによって見出されたように、汚染された超純水由来の微生物は、系統的に明確に分類し得る。すなわち、各系統に属する微生物を検出し得るプローブを用いて、汚染原因菌を検出することにより、汚染原因菌の種類を明確に特定することを要することなく、超純水が微生物により汚染されているか否か、及び、超純水が汚染源であるか否かを判別することができる。
The type of microorganisms contained in the contaminated ultrapure water usually varies depending on the time and place where the water that is the raw material of the ultrapure water was collected. Therefore, since the type of microorganisms mixed into the device or the like via ultrapure water varies depending on the time when the device is supplied to the device or the like, it is very troublesome to specify the bacterial species of the contamination-causing bacteria. In addition, it is often difficult.
In contrast, as found by the inventors of the present invention, contaminated microorganisms derived from ultrapure water can be systematically clearly classified. In other words, by using a probe capable of detecting microorganisms belonging to each system and detecting contamination-causing bacteria, ultrapure water is contaminated by microorganisms without the need to clearly identify the type of contamination-causing bacteria. And whether or not ultrapure water is a contamination source can be determined.
例えば、超純水由来汚染原因菌検出用プローブを用いることにより、内部に超純水を含む装置から採取されたサンプルから微生物が検出された場合には、該装置における微生物汚染は、汚染された超純水が供給されたことにより起こったと推定することができる。該推定に基づき、例えば、該装置に水が供給される配管等に設置された微生物除去用フィルターの破損の有無等を重点的に検査することにより、迅速に汚染源を特定し得る。 For example, when microorganisms are detected from a sample collected from a device containing ultrapure water by using a probe for detecting the cause of contamination caused by ultrapure water, the microbial contamination in the device is contaminated. It can be estimated that it was caused by the supply of ultrapure water. Based on this estimation, for example, by intensively inspecting the presence or absence of breakage of the microorganism removal filter installed in a pipe or the like through which water is supplied to the apparatus, the contamination source can be quickly identified.
超純水由来汚染原因菌検出用プローブは、超純水中に生息する微生物を検出する試験を行い、微生物の属種の傾向を調べて分類し、各系統の微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブを作製することにより得ることができる。具体的には、例えば、以下のようにして得ることができる。
１．汚染原因菌の採取
汚染原因菌の種類は、サンプルが採取される装置の設置場所や、サンプルを採取する季節等により変動する可能性が考えられる。そこで、発明者らは、設置場所の異なる５台の超純水装置（Ａ〜Ｅ）から超純水を２Ｌずつサンプリングした。超純水装置Ａ〜Ｅからサンプリングしたサンプルを、それぞれサンプルＡ〜Ｅとした。サンプリング時期は夏〜秋とした。その他、参考として、１台の超純水装置からＲＯ水をサンプリングし、これをサンプルＦとした。
Ultrapure water-derived contamination-causing bacteria detection probe is a polynucleotide probe that conducts tests to detect microorganisms that inhabit ultrapure water, investigates and classifies the genus species of microorganisms, and detects microorganisms in each strain Can be obtained. Specifically, for example, it can be obtained as follows.
1. Collection of contamination-causing bacteria The types of contamination-causing bacteria may vary depending on the installation location of the device from which the sample is collected, the season in which the sample is collected, and the like. Therefore, the inventors sampled 2 L of ultrapure water from 5 ultrapure water apparatuses (A to E) at different installation locations. Samples sampled from the ultrapure water devices A to E were designated as samples A to E, respectively. The sampling period was summer to autumn. In addition, as a reference, RO water was sampled from one ultrapure water apparatus, and this was used as sample F.
２．汚染原因菌の回収及び特定
サンプリングした超純水Ａ〜Ｆを、直径４７ｍｍ、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターを用いて濾過し、微生物を捕集した。捕集された微生物の検出は、一枚のフィルターに対して、直接フィルター上の微生物のＤＮＡを抽出して検出する直接抽出法と、フィルター上の微生物を培養した後ＤＮＡを抽出して検出する培養法との２種類の手法で行った。具体的には、直接抽出法として、微生物を捕集したフィルターの３／４を、界面活性剤を添加して溶菌させ、クロロホルム処理により、タンパク質を変性し除去した後、エタノールを添加することにより、ＤＮＡを沈殿させて回収した。一方、培養法として、微生物を捕集したフィルターの残りの１／４を寒天培地に置き、２５〜３５℃で培養し、形成したコロニーを色又は形態の種類ごとに採取した後、直接抽出法と同様にしてＤＮＡを回収した。
得られたＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いて、１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列を有するＰＣＲ産物を得た。なお、該ＰＣＲに用いるプライマーは、通常、微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の塩基配列をＰＣＲ増幅するために用いられているプライマーを使用した。
2. Collection and identification of contamination-causing bacteria The sampled ultrapure waters A to F were filtered using a membrane filter having a diameter of 47 mm and a pore diameter of 0.22 μm to collect microorganisms. The collected microorganisms can be detected by directly extracting the microorganism's DNA on the filter and detecting it by culturing the microorganism on the filter and extracting the DNA. It was performed by two types of methods, a culture method. Specifically, as a direct extraction method, 3/4 of the filter collecting microorganisms was lysed by adding a surfactant, denatured and removed by chloroform treatment, and then ethanol was added. The DNA was precipitated and recovered. On the other hand, as a culture method, the remaining 1/4 of the filter collecting microorganisms is placed on an agar medium, cultured at 25 to 35 ° C., and colonies formed are collected for each color or form, and then directly extracted. DNA was recovered in the same manner as described above.
Using the obtained DNA as a template, a PCR product having the base sequence of 16S rDNA gene was obtained using PCR (Polymerase Chain Reaction). In addition, the primer used for this PCR was the primer currently used in order to carry out PCR amplification of the base sequence of 16S rDNA gene of microorganisms.
得られたＰＣＲ産物を、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）により、塩基対長の違いにより分離した。該電気泳動により、同一種類の微生物の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子から得られたＰＣＲ産物は、１のバンドとして検出される。そこで、１のバンドのみが検出されたＰＣＲ産物は、そのままシークエンス解析を行った。マルチバンドが検出されたＰＣＲ産物は、各バンドを切り出して、ＤＧＧＥゲルから直接回収したＤＮＡを、シークエンス解析に用いた。なお、ＤＧＧＥではなく、クローニング法によっても同様の遺伝子解析が可能である。 The obtained PCR products were separated by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) based on the difference in base pair length. By the electrophoresis, PCR products obtained from the 16S rDNA gene of the same type of microorganism are detected as one band. Therefore, the PCR product in which only one band was detected was directly subjected to sequence analysis. For PCR products in which multibands were detected, each band was cut out and DNA directly recovered from the DGGE gel was used for sequence analysis. Similar gene analysis can be performed not by DGGE but also by a cloning method.
国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）上で、シークエンス解析の結果得られた塩基配列情報について相同性検索を行うことにより、各汚染微生物の菌種を特定した。表１は、これらの特定された微生物を示した表である。この結果、サンプルＡからは８種類の微生物（Ａ１〜Ａ８）、サンプルＢからは７種類の微生物（Ｂ１〜Ｂ７）、サンプルＣからは１８種類の微生物（Ｃ１〜Ｃ１８）、サンプルＤからは１種類の微生物（Ｄ）、サンプルＥからは６種類の微生物（Ｅ１〜Ｅ６）、サンプルＦからは１種類の微生物（Ｆ）が、それぞれ検出された。 On the international base sequence database (GenBank / DDBJ / EMBL), a homology search was performed on the base sequence information obtained as a result of sequence analysis, thereby identifying the bacterial species of each contaminating microorganism. Table 1 is a table showing these identified microorganisms. As a result, 8 types of microorganisms (A1 to A8) from sample A, 7 types of microorganisms (B1 to B7) from sample B, 18 types of microorganisms (C1 to C18) from sample C, and 1 from sample D From the type of microorganism (D), from the sample E, six types of microorganisms (E1 to E6) and from the sample F, one type of microorganism (F) were detected.
３．系統的解析
シークエンス解析で得られた塩基配列情報を用いて系統解析を行った。この結果得られた系統樹を図１〜３に示す。また、図２は図１の系統樹中のＡ以下につながる系統樹であり、図３は図２の系統樹中のＢ以下につながる系統樹である。図中、Ａ１〜Ａ８、Ｂ１〜７、Ｃ１〜Ｃ１８、Ｄ、Ｅ１〜Ｅ６、及びＦは、表１記載の微生物をそれぞれ表している。
3. Systematic analysis Systematic analysis was performed using the nucleotide sequence information obtained by sequence analysis. The resulting phylogenetic tree is shown in FIGS. 2 is a phylogenetic tree connected to A and below in the phylogenetic tree of FIG. 1, and FIG. 3 is a phylogenetic tree connected to B and below in the phylogenetic tree of FIG. In the figure, A1 to A8, B1 to 7, C1 to C18, D, E1 to E6, and F represent the microorganisms described in Table 1, respectively.
図１〜３の系統樹から明らかであるように、サンプルＡ〜Ｆから回収された微生物は、超純水サンプルの採取場所、採取季節に関係なく、いずれもグラム陰性領域に存在し、１０種類のクラスターに分類し得ることが明らかとなった。図１〜３中、１〜１０は、各クラスターを示している。また、各クラスターの近縁の属種及び分類された微生物を表２に示す。 As is clear from the phylogenetic trees of FIGS. 1 to 3, the microorganisms collected from the samples A to F are all present in the gram-negative region regardless of the collection location and the collection season of the ultrapure water sample. It became clear that it can be classified into 1-3, 1-10 has shown each cluster. Table 2 shows the related genus species and classified microorganisms of each cluster.
この系統解析の結果から、汚染原因菌が、クラスター１〜１０のいずれかに属する微生物であれば、超純水由来汚染原因であると判別することができる。つまり、各クラスターの属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブであれば、超純水由来汚染原因菌検出用プローブとして用いることができる。
From the results of this system analysis, if the contamination-causing bacteria are microorganisms belonging to any one of
ここで、微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブは、検出対象の微生物の遺伝子の塩基配列の一部（以下、遺伝子配列ということがある。）を認識し得る塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブである。ここで、「遺伝子配列を認識し得る塩基配列」とは、検出対象の遺伝子配列と相同的又は相補的な塩基配列を意味する。
したがって、あるクラスターに属する微生物に特異的な遺伝子配列、すなわち、該クラスターに属する微生物であれば共通して有しているが、該クラスターに属さない微生物は有していない、という特徴を有する遺伝子配列を認識し得る塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであれば、該クラスターに属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブとして用いることができる。
このような各クラスターに属する微生物に特異的な遺伝子配列は、国際塩基配列データベースを用いて、常法により決定することができる。したがって、各クラスターに属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブは、常法により設計し合成することができる。なお、クラスターによっては、公知のポリヌクレオチドプローブを、該クラスターに属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブとして用いることができる場合がある。例えば、クラスター１〜３はいずれもβ−プロテオバクテリアに属する微生物である。このため、クラスター１〜３に属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブ（以下、Ｗ−８プローブという。）として、既知のβ−プロテオバクテリア検出用プローブを用いることができる。
Here, the polynucleotide probe capable of detecting the microorganism is a polynucleotide probe having a base sequence capable of recognizing a part of the base sequence of the gene of the microorganism to be detected (hereinafter also referred to as gene sequence). Here, the “base sequence capable of recognizing a gene sequence” means a base sequence that is homologous or complementary to the gene sequence to be detected.
Therefore, a gene sequence specific to microorganisms belonging to a certain cluster, that is, a gene having the characteristics that it has in common if it belongs to the cluster but does not have microorganisms that do not belong to the cluster Any polynucleotide probe having a base sequence capable of recognizing the sequence can be used as a polynucleotide probe capable of detecting a microorganism belonging to the cluster.
Such a gene sequence specific to the microorganism belonging to each cluster can be determined by an ordinary method using an international nucleotide sequence database. Therefore, polynucleotide probes that can detect microorganisms belonging to each cluster can be designed and synthesized by conventional methods. Depending on the cluster, a known polynucleotide probe may be used as a polynucleotide probe that can detect a microorganism belonging to the cluster. For example,
超純水由来汚染原因菌検出用プローブとしては、少なくともクラスター１〜１０のいずれかに属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブであれば、特に限定されるものではないが、本発明においては、表３に記載の塩基配列を有するプローブであることが好ましい。表３中、「クラスター」とは、各プローブが検出し得る微生物のクラスターを示している。
The probe for detecting the cause of contamination with ultrapure water is not particularly limited as long as it is a polynucleotide probe capable of detecting a microorganism belonging to at least one of
例えば、Ｗ−８プローブとして、特に、配列番号１の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることが好ましい。配列番号１の塩基配列は、ｂｅｔａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの２３Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の１０２３〜１０４７位の塩基配列に相同的な塩基配列である。
配列番号１の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列を有する塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであれば、配列番号１の塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を認識し得るため、配列番号１の塩基配列を遺伝子配列として有するクラスター１〜３に属する微生物を検出することができるためである。特異性に優れているために、Ｗ−８プローブは、配列番号１の塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることがより好ましい。
For example, the W-8 probe is particularly preferably a polynucleotide probe having a base sequence that is homologous or complementary to a continuous base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a nucleotide sequence that is homologous to the nucleotide sequences at positions 1023 to 1047 of the 23S rDNA gene of beta proteinbacterium.
If it is a polynucleotide probe having a base sequence that is homologous or complementary to a base sequence having at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1, it is homologous or complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 1 This is because a microorganism that belongs to
同様に、クラスター４に属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブ（以下、Ｗ−４プローブという。）としては、配列番号２の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることが好ましく、配列番号２の塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることがより好ましい。配列番号２の塩基配列は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｅｌｌｉｎ７０１５の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の４４１〜４５７位の塩基配列に相同的な塩基配列である。 Similarly, a polynucleotide probe (hereinafter referred to as W-4 probe) that can detect microorganisms belonging to cluster 4 is homologous or complementary to a continuous base sequence of at least 9 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 2. It is preferably a polynucleotide probe having a simple base sequence, and more preferably a polynucleotide probe having a base sequence homologous to or complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 2. The base sequence of SEQ ID NO: 2 is a base sequence that is homologous to the base sequence at positions 441 to 457 of the 16S rDNA gene of Xanthomonasaceae bacteria Elin 7015.
クラスター６に属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブ（以下、Ｗ−５プローブという。）としては、配列番号３の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることが好ましく、配列番号３の塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることがより好ましい。配列番号３の塩基配列は、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｌｋａｎｉｉの１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の８３７〜８５３位の塩基配列に実質的に相同的な塩基配列である。なお、配列番号３中、「Ｒ」はアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ）を意味する。
As a polynucleotide probe (hereinafter referred to as W-5 probe) that can detect microorganisms belonging to
クラスター５に属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブ（以下、Ｗ−６プローブという。）としては、配列番号４の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることが好ましく、配列番号４の塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることがより好ましい。配列番号４の塩基配列は、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓの１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の７０５〜７２１位の塩基配列に相同的な塩基配列である。
As a polynucleotide probe (hereinafter referred to as W-6 probe) that can detect microorganisms belonging to
クラスター７に属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブ（以下、Ｗ−３プローブという。）としては、配列番号５の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることが好ましく、配列番号４の塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることがより好ましい。配列番号５の塩基配列は、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｓａｎｇｕｉｎｉｓの１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の６５３〜６７０位の塩基配列に相同的な塩基配列である。
As a polynucleotide probe (hereinafter referred to as W-3 probe) that can detect microorganisms belonging to
クラスター８〜１０に属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブ（以下、Ｗ−７プローブという。）としては、配列番号６の塩基配列中の少なくとも９塩基の連続する塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることが好ましく、配列番号６の塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることがより好ましい。配列番号６の塩基配列は、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｖｉｂｒｉｏｉｄｅｓ ＣＢ８１の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の４８８〜５０４位の塩基配列に相同的な塩基配列である。
Polynucleotide probes that can detect microorganisms belonging to
本発明の微生物汚染検出用キットに含まれるこれらの超純水由来汚染原因菌検出用プローブは、標識されたものであってもよい。該標識は、通常、ヌクレオチドの標識に用いられるものであれば、何れの標識物質を用いるものであってもよい。該標識物質として、例えば、蛍光物質、ビオチン、ＤＮＰ（ｄｉｎｉｔｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ジゴキシゲニン、ジゴキシン、放射性物質等がある。検出感度が良好であり、かつ検出操作も簡便であることから、蛍光物質で標識されたポリヌクレオチドプローブであることが好ましい。該蛍光物質として、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ５、ＴＡＭＲＡ、ＮＢＤ、ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）等がある。 These ultrapure water-derived contamination-causing bacteria detection probes contained in the microorganism contamination detection kit of the present invention may be labeled. The label may be any labeling substance as long as it is generally used for labeling nucleotides. Examples of the labeling substance include a fluorescent substance, biotin, DNP (dinitrophenol), digoxigenin, digoxin, and a radioactive substance. A polynucleotide probe labeled with a fluorescent substance is preferable because detection sensitivity is good and detection operation is simple. Examples of the fluorescent substance include FITC (fluorescein isothiocyanate), fluorescein, rhodamine, Cy5, TAMRA, NBD, TMR (tetramethylrhodamine) and the like.
また、これらの超純水由来汚染原因菌検出用プローブは、検出対象である微生物の遺伝子配列を認識し得る塩基配列の他に、微生物の検出を妨げない限りにおいて、付加配列を有していてもよい。該付加配列として、例えば、標識物質とのリンカー配列や、制限酵素認識配列等がある。 Further, these ultrapure water-derived contamination-causing bacteria detection probes have an additional sequence in addition to a base sequence capable of recognizing the gene sequence of the microorganism to be detected, as long as the detection of the microorganism is not hindered. Also good. Examples of the additional sequence include a linker sequence with a labeling substance and a restriction enzyme recognition sequence.
なお、超純水の製造に用いられる原料水の水源が大きく異なる場合等、上記１０のクラスターに属する微生物以外の微生物が、超純水中に混入する可能性もある。超純水サンプル中に、上記のＷ−３〜８プローブで検出てきない微生物の存在が確認された場合には、例えば上述した手法により該微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブを作製し、これを含む微生物汚染検出用キットを用いることにより、効率よく、超純水の汚染の有無や、汚染源が超純水であるか否かを判別することができる。 Note that microorganisms other than those belonging to the ten clusters may be mixed in the ultrapure water when the water sources of the raw water used for the production of ultrapure water differ greatly. When the presence of a microorganism that has not been detected by the above W-3 to 8 probe is confirmed in the ultrapure water sample, for example, a polynucleotide probe capable of detecting the microorganism is prepared by the above-described method, By using the kit for detecting microbial contamination, it is possible to efficiently determine whether or not ultrapure water is contaminated and whether or not the contamination source is ultrapure water.
本発明の微生物汚染検出方法は、具体的には、以下のようにして行うことができる。まず、微生物汚染の検出に用いる超純水をサンプルとして採取する。次に、該サンプルから微生物を回収する。回収の方法は、微生物を回収し得る方法であれば、特に限定されるものではなく、遠心分離法や、微生物を通さないフィルターを用いるフィルター法等の、通常培養液等から微生物を回収するために用いられている方法で行うことができる。回収された微生物に対して、本発明の微生物汚染検出用キットを用いて検出操作を行い、微生物が検出されるか否かを調べる。本発明の微生物汚染検出用キット中の少なくとも１の超純水由来汚染原因菌検出用プローブにより微生物が検出された場合には、該サンプルが採取された超純水が汚染されていることが分かる。 Specifically, the microbial contamination detection method of the present invention can be performed as follows. First, ultrapure water used for detection of microbial contamination is collected as a sample. Next, microorganisms are collected from the sample. The method of recovery is not particularly limited as long as it is a method that can recover microorganisms. In order to recover microorganisms from a normal culture solution such as a centrifugal separation method or a filter method using a filter that does not pass microorganisms, etc. Can be carried out by the method used in the above. The recovered microorganism is subjected to a detection operation using the microorganism contamination detection kit of the present invention to check whether the microorganism is detected. When microorganisms are detected by at least one ultrapure water-derived contamination-causing bacteria detection probe in the microorganism contamination detection kit of the present invention, it is understood that the ultrapure water from which the sample has been collected is contaminated. .
同様に、本発明の汚染源判別方法は、以下のようにして行うことができる。まず、内部に超純水を含む装置の汚染源である可能性のある部位から、微生物汚染の検出に用いるサンプルを採取する。次に、該サンプルから上記と同様に微生物を回収する。回収された微生物に対して、本発明の微生物汚染検出用キットを用いて検出操作を行い、微生物が検出されるか否かを調べる。本発明の微生物汚染検出用キット中の少なくとも１の超純水由来汚染原因菌検出用プローブにより微生物が検出された場合には、該装置の微生物汚染は超純水が汚染源であると判別することができる。本発明の汚染源判別方法によって、超純水が汚染源であると推定された場合には、特に装置への超純水供給部や、そこに設置されている微生物除去用フィルターが破損されたために微生物汚染が生じた可能性が極めて高いと考えられるため、これらの箇所を重点的に検査することにより、汚染源を速やかに特定することができる。 Similarly, the contamination source discrimination method of the present invention can be performed as follows. First, a sample used for detection of microbial contamination is collected from a site that may be a contamination source of an apparatus containing ultrapure water inside. Next, the microorganism is recovered from the sample in the same manner as described above. The recovered microorganism is subjected to a detection operation using the microorganism contamination detection kit of the present invention to check whether the microorganism is detected. When microorganisms are detected by at least one ultrapure water-derived contamination-causing bacteria detection probe in the microorganism contamination detection kit of the present invention, the microbial contamination of the apparatus is determined to be ultrapure water as a contamination source. Can do. When it is estimated that the ultrapure water is the source of contamination by the contamination source determination method of the present invention, the microorganism is removed because the ultrapure water supply unit to the apparatus and the microorganism removal filter installed therein are damaged. Since it is considered that there is an extremely high possibility that contamination has occurred, it is possible to quickly identify the contamination source by focusing on these points.
なお、該検出操作は、特に限定されるものではなく、生物を、該生物の遺伝子の一部の塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブを用いて検出する際に用いられる方法であれば、いずれの方法を用いて行ってもよい。該方法として、例えば、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等がある。核酸抽出操作を要さず、簡便であることから、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法により検出することが好ましい。特に安全でかつ感度が良好であるため、蛍光標識されたプローブを用いる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法により検出することが好ましい。 The detection operation is not particularly limited, and is used when detecting an organism using a polynucleotide probe having a base sequence that is homologous or complementary to a partial base sequence of the gene of the organism. Any method may be used as long as it is a method that can be used. Examples of the method include a hybridization method and a PCR method. The detection is preferably performed by an in situ hybridization (ISH) method because it does not require a nucleic acid extraction operation and is simple. Since it is particularly safe and has good sensitivity, detection is preferably carried out by a fluorescence in situ hybridization (FISH) method using a fluorescently labeled probe.
本発明の汚染源判別方法に供される装置は、内部に超純水を含むものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、超純水製造装置であってもよく、バイオリアクターや食品製造用プラント等のように、原料の一部として超純水が供給される装置であってもよく、半導体洗浄装置等のように、洗浄液として超純水が利用される装置であってもよい。特に、バイオリアクター等の工業上利用可能な大型装置であることが好ましい。本発明は、汚染源の特定の迅速化に資するものであり、バイオプラントや化学プラント等で用いられるバイオリアクターのように、従来は汚染源の特定に長期間を要していたような装置に用いることにより、効果がより顕著に奏されるためである。 The apparatus provided for the contamination source discriminating method of the present invention is not particularly limited as long as it contains ultrapure water inside, and may be, for example, an ultrapure water production apparatus, such as a bioreactor or food. A device that supplies ultrapure water as part of the raw material, such as a manufacturing plant, or a device that uses ultrapure water as a cleaning liquid, such as a semiconductor cleaning device, may be used. . In particular, it is preferable that it is a large-sized apparatus that can be used industrially, such as a bioreactor. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention contributes to speeding up the identification of a pollution source, and is used for an apparatus that conventionally required a long time to identify a pollution source, such as a bioreactor used in a bioplant or a chemical plant. This is because the effect is more remarkable.
なお、装置がバイオリアクターである場合、培養される目的の生物は、特に限定されるものではなく、天然由来の生物であってもよく、遺伝子組換え技術等の遺伝子工学を用いて得られた生物であってもよい。また、微生物であってもよいが、細胞であることが好ましい。ここで、細胞とは、動物細胞、植物細胞、酵母類等を意味する。動物細胞は、哺乳細胞であってもよく、昆虫細胞であってもよい。 In addition, when the apparatus is a bioreactor, the target organism to be cultured is not particularly limited, and may be a naturally-derived organism, which has been obtained using genetic engineering such as a gene recombination technique. It may be a living organism. Moreover, although it may be a microorganism, it is preferably a cell. Here, the cells mean animal cells, plant cells, yeasts and the like. The animal cell may be a mammalian cell or an insect cell.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
１０Ｌ容の培養槽を用いて作成した、図４に示す構造を有する小型のバイオリアクターを用いて、本発明の汚染源判別方法を用いて、該バイオリアクターの微生物汚染が超純水由来のものか否かの判別を試みた。
なお、該バイオリアクターにおいては、培地調製槽３に、培地原料供給管４を通して粉末状等の固形の培地原料が、水供給管５を通して水が、それぞれ投入され、培地が調製される。調製された培地は、培地供給管６を通って、培養槽１に投入される。一方で、空気は、空気供給管７を通って、別途培養槽１に供給される。培養槽１内において、目的の生物が培養される。培養時には、目的の生物の沈殿を防止し、培養液を均一に保つために、攪拌羽２により、培養液は攪拌される。水供給管５、培地供給管６、及び空気供給管７には、微生物除去用フィルター８がそれぞれ設置されている。
超純水由来汚染原因菌検出用プローブとして、配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号２の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号３の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号５の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブの計６種類を用いた。
Whether the microbial contamination of the bioreactor is derived from ultrapure water by using the small bioreactor having the structure shown in FIG. 4 created using a 10 L culture tank and using the contamination source discrimination method of the present invention. An attempt was made to determine whether or not.
In the bioreactor, the
As a probe for detection of ultrapure water-derived contaminant causative bacteria, a polynucleotide probe having the base sequence of SEQ ID NO: 1, a polynucleotide probe having the base sequence of SEQ ID NO: 2, a polynucleotide probe having the base sequence of SEQ ID NO: 3, A total of six types were used: a polynucleotide probe having a base sequence of 4, a polynucleotide probe having a base sequence of SEQ ID NO: 5, and a polynucleotide probe having a base sequence of SEQ ID NO: 6.
バイオリアクターの稼働中に、培養液の濁度の急激な上昇が観測されたため、微生物汚染が疑われた。そこで、バイオリアクターの運転を停止し、５０ｍＬの培養液を採取した。採取した培養液をＦＩＳＨ用に固定処理した後、孔径０．２２μｍのポリカーボネートメンブレンフィルターを用いて濾過処理をし、該フィルター上に培養液中に存在しているであろう微生物を捕集した。
その後、ＦＩＳＨ法により、該フィルター上の微生物を検出した。具体的には、該フィルターを、上記６種類のプローブの混合溶液に、４６℃で２時間浸した後、４８℃のバッファーで洗浄した。その後、該フィルターを９９％エタノールに入れて脱水した。
こうして得られた該フィルターを、蛍光顕微鏡を用いて観察した結果、微生物は検出されなかった。これにより、該バイオリアクターの微生物汚染は、超純水由来のものではないと推定された。実際に、水供給管５、培地供給管６、及び空気供給管７にそれぞれ設置された微生物除去用フィルター８を調べたところ、実際に、空気供給管７と培養槽１との配管接続部分に隙間が生じており、該配管接続部分が汚染源であり、汚染された空気由来の微生物が、該隙間から混入したことにより発生した微生物汚染であったことが特定できた。
During the operation of the bioreactor, a rapid increase in the turbidity of the culture broth was observed, suggesting microbial contamination. Therefore, the operation of the bioreactor was stopped, and 50 mL of culture solution was collected. The collected culture solution was fixed for FISH and then filtered using a polycarbonate membrane filter having a pore size of 0.22 μm, and microorganisms that would be present in the culture solution were collected on the filter.
Thereafter, microorganisms on the filter were detected by the FISH method. Specifically, the filter was immersed in a mixed solution of the above six types of probes at 46 ° C. for 2 hours, and then washed with a buffer at 48 ° C. Thereafter, the filter was dehydrated in 99% ethanol.
As a result of observing the filter thus obtained using a fluorescence microscope, no microorganisms were detected. Thus, it was estimated that the microbial contamination of the bioreactor was not derived from ultrapure water. Actually, when the
本発明の微生物汚染検出用キット、並びに該微生物汚染検出用キットを用いて行う微生物汚染検出方法及び汚染源判別方法を用いることにより、不特定多数の汚染原因菌が存在する場合であっても、該汚染原因菌が、超純水由来の微生物であるかを、高精度かつ簡便に推定し、汚染源を迅速に特定することができるため、バイオリアクター等の大型の培養槽を用いる分野で利用が可能である。 By using the microbial contamination detection kit of the present invention, and the microbial contamination detection method and the contamination source determination method performed using the microbial contamination detection kit, It is possible to accurately and easily estimate whether the contamination-causing bacteria are microorganisms derived from ultrapure water and to quickly identify the source of contamination, so it can be used in fields that use large culture vessels such as bioreactors. It is.
１…培養槽、２…攪拌羽、３…培地調製槽、４…培地原料供給管、５…水供給管、６…培地供給管、７…空気供給管、８…微生物除去用フィルター
DESCRIPTION OF
Claims (6)
配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号１の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、
配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、
配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号３の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、
配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、
配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号５の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、
配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブ又は配列番号６の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドプローブと、
を有することを特徴とする微生物汚染検出用キット。 A kit used to detect microbial contamination of ultrapure water,
A polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide probes or SEQ ID NO: 1 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1,
A polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide probes or SEQ ID NO: 2 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
A polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide probe or SEQ ID NO: 3 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3,
A polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide probe or SEQ ID NO: 4 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4,
A polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide probe or SEQ ID NO: 5 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5,
A polynucleotide probe comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide probe or SEQ ID NO: 6 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6,
A kit for detecting microbial contamination, comprising:
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