JP5317105B2 - Complex of polymer fine particle derived from cross-linked polymer having quaternized amino group and nucleic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、エチレン性不飽和重合性基から形成される主鎖を有し、側鎖に四級化された第三級アミン部分を有する架橋ポリマー由来のポリマー微粒子と核酸の複合体に関する。 The present invention relates to a complex of a polymer fine particle derived from a crosslinked polymer having a main chain formed from an ethylenically unsaturated polymerizable group and a quaternized tertiary amine moiety in a side chain and a nucleic acid.
近年、生体内での遺伝子発現やその機能のコントロールにおいて、アンチセンスＤＮＡ、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）といった塩基対の短い一本鎖、もしくは二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡが非常に重要な役割を示すことが明らかとなり、そのメカニズムの解明のみならず疾病治療への応用を目指した研究開発が活発に行われている。中でも１８〜２７塩基対程度の比較的短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）がセントラルドグマ中間体であるｍＲＮＡを配列特異的に切断し、当該遺伝子の発現を選択的に抑制するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、癌、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎をはじめとした難治性疾患に対する遺伝子レベルでの治療方法として注目を集め、その実用化が期待されている。一方で、このｓｉＲＮＡはすでに分子生物学や細胞生物学の創薬開発の分野では遺伝子やタンパク質の機能解明のためのツールとして利用されている。 In recent years, short-pair single-stranded DNA or RNA such as antisense DNA, small interfering RNA (siRNA), micro RNA (miRNA), or double-stranded DNA or RNA has been very useful for controlling gene expression and functions in vivo. It has become clear that it plays an important role in the field, and research and development aiming at application to disease treatment as well as elucidation of its mechanism are being actively conducted. Among them, RNA interference (RNAi), in which relatively short double-stranded RNA (siRNA) of about 18 to 27 base pairs cleaves mRNA that is a central dogma intermediate in a sequence-specific manner and selectively suppresses the expression of the gene, Attracting attention as a gene-level treatment method for refractory diseases such as cancer, HIV, and hepatitis C, and its practical application is expected. On the other hand, this siRNA has already been used as a tool for elucidating the functions of genes and proteins in the field of drug discovery development in molecular biology and cell biology.
しかしながら、ＤＮＡやＲＮＡといった核酸分子はリン酸基がマイナス電荷を有するため、同様にアニオン性の細胞膜との相互作用が低く、単独では細胞内導入が困難である。この問題を解決するためにカチオン性の脂質からなるリポソームがオリゴ核酸導入用試薬としてすでに市販されており、このカチオン性リポソームを用いた細胞内導入が最も一般的方法である。同様に、より安価に大量合成が可能なポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアミドアミンデンドリマーに代表されるカチオン性合成高分子を用いた方法も提唱されている。しかしながら、これらのカチオン性リポソームやカチオン性ポリマーはポリカチオンに由来する細胞毒性を示すことが知られており本来の目的の妨げになるばかりでなく、血清成分や共存するタンパク質の影響を受けやすいため、細胞実験の際に血清不含の特殊な培地などの消耗品を必要とする場合があり、その利用範囲がｉｎ ｖｉｔｒｏの実験に限定されるといった問題がある。 However, since nucleic acid molecules such as DNA and RNA have a negative charge at the phosphate group, the interaction with an anionic cell membrane is similarly low, and it is difficult to introduce into a cell alone. In order to solve this problem, liposomes composed of cationic lipids are already on the market as reagents for introducing oligonucleic acid, and intracellular introduction using such cationic liposomes is the most common method. Similarly, a method using a cationic synthetic polymer represented by polyethyleneimine, poly-L-lysine, and polyamidoamine dendrimer, which can be mass-produced at a lower cost, has been proposed. However, these cationic liposomes and cationic polymers are known to exhibit cytotoxicity derived from polycations, which not only interferes with the original purpose but also is easily affected by serum components and coexisting proteins. In some cell experiments, consumables such as a serum-free special medium may be required, and there is a problem that the range of use is limited to in vitro experiments.
これらの問題に対し、血清成分との非特異的な相互作用の抑制や、核酸との複合体の水溶性向上、また細胞毒性の低減を目的として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に代表される水溶性高分子で修飾したカチオン荷電性ポリマーが提案されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３参照）。しかしながら、ＰＥＧなどの水溶性高分子は、一般的に、同時に核酸分子の細胞内への導入を妨げることが知られており（非特許文献１）、オリゴ核酸の細胞内導入には不向きである場合もある。 To solve these problems, water-solubility typified by polyethylene glycol (PEG) is used to suppress non-specific interactions with serum components, improve the water-solubility of complexes with nucleic acids, and reduce cytotoxicity. Cationic chargeable polymers modified with polymers have been proposed (see Patent Document 1, Patent Document 2, and Patent Document 3). However, water-soluble polymers such as PEG are generally known to interfere with introduction of nucleic acid molecules into cells at the same time (Non-patent Document 1) and are not suitable for introduction of oligonucleic acids into cells. In some cases.
本発明の目的は、核酸分子、特に、短鎖またはオリゴ核酸と称される、例えば、ヌクレオチド約１８〜３０を有する、場合によれば、それよりさらに短鎖の核酸分子の、低毒性かつ、効果的な細胞内への導入手段を提供することにある。 The object of the present invention is the low toxicity of nucleic acid molecules, in particular of short-chain or oligonucleic acids, e.g. having about 18-30 nucleotides and possibly even shorter nucleic acid molecules, and The object is to provide an effective means for introduction into cells.
上記の目的を達成するために、本発明者等は、各種ポリマーもしくは各種ポリマー微粒子、またはそれらの修飾体の製造、並びにそれらの核酸担体としての機能について検討してきた。その結果、意外にも、本発明者等の一部により半導体超微粒を固定または内包せしめるために開発された、水性媒体中でコア−シェル型のポリマー微粒子を形成する架橋ポリマー（特許第４０８６１８８号公報参照）は、そのコア部に存在すると理解されている第三級アミン部分が制御された態様で容易に四級化されること、こうして四級化された架橋ポリマーが短鎖またはオリゴ核酸分子であってもそれらを細胞内に導入するための担体として効果的に使用できることが今ここに見出された。かような四級化された架橋ポリマーは、また、胆汁酸の吸着能を有することも知られているが（日本バイオマテリアル学会シンポジウム２００８予稿集 ３２８ページ）、未四級化架橋ポリマーに比べて動物細胞に対する毒性が有意に低く、かつ、核酸分子と一緒になって動物細胞に効果的に取り込まれ、しかも遊離の該酸分子が本来有している機能を該細胞内で奏することが確認された。 In order to achieve the above object, the present inventors have studied the production of various polymers or various polymer fine particles, or modified products thereof, and their functions as nucleic acid carriers. As a result, a cross-linked polymer that forms core-shell type polymer fine particles in an aqueous medium, which was developed by some of the present inventors to fix or encapsulate semiconductor ultrafine particles (Japanese Patent No. 4086188). (See publication) is that a tertiary amine moiety understood to be present in its core is easily quaternized in a controlled manner, such that the quaternized crosslinked polymer is a short chain or oligonucleic acid molecule. Even now, it has now been found that they can be used effectively as carriers for introducing them into cells. Such a quaternized crosslinked polymer is also known to have an ability to adsorb bile acids (Japan Biomaterials Society Symposium 2008 Preliminary Proceedings, page 328), but compared to non-quaternized crosslinked polymers. It has been confirmed that the toxicity to animal cells is significantly low, and it is effectively incorporated into animal cells together with nucleic acid molecules, and that the free acid molecules have the functions inherent in the cells. It was.
したがって、本発明によれば、側鎖に四級化された第三級アミン部分を有する架橋ポリマー、該ポリマーに由来するポリマー微粒子と核酸の複合体が提供される。具体的には、該微粒子は、下記マクロモノマー（ａ）、コモノマー（ｂ）および架橋剤を含んでなるモノマーを共重合せしめて得られる架橋ポリマーを、次いで四級化することにより製造できる。 Therefore, according to the present invention, there are provided a crosslinked polymer having a tertiary amine moiety quaternized in the side chain, and a polymer fine particle-nucleic acid complex derived from the polymer. Specifically, the fine particles can be produced by quaternizing a crosslinked polymer obtained by copolymerizing a monomer comprising the following macromonomer (a), comonomer (b) and a crosslinking agent.
マクロモノマー（ａ）は、式Ｉ： The macromonomer (a) has the formula I:
式中、Ｘは水素原子、−ＣＯＯＺ（ここで、Ｚは水素原子または有機基を表す）、−ＣＨＲ１Ｒ２（ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｃ１−６アルキルオキシ基、フェニルオキシ基もしくはフェニル−Ｃ１−３アルキルオキシ基を表すか、またはＲ１およびＲ２は一緒になって−ＯＣＨＲ′−ＣＨ２Ｏ−であって、Ｒ′が水素原子もしくはＣ１−６アルキル基である基を表す）または−ＣＨ＝Ｏを表し、
Ｒａは水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、
Ｌ１はメチレン基またはカルボニル基を表し、
Ｌ２はカルボニル基、Ｃ１−３アルキレン基またはＣ１−３アルキルフェニレン基を表すか、あるいは
In the formula, X is a hydrogen atom, —COOZ (where Z represents a hydrogen atom or an organic group), —CHR 1 R 2 (wherein R 1 and R 2 are independently C 1-6 alkyl) Represents an oxy group, a phenyloxy group or a phenyl-C 1-3 alkyloxy group, or R 1 and R 2 together represent —OCHR′—CH 2 O—, and R ′ represents a hydrogen atom or C Represents a group that is a 1-6 alkyl group) or -CH = O,
R a represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group,
L 1 represents a methylene group or a carbonyl group,
L 2 represents a carbonyl group, a C 1-3 alkylene group or a C 1-3 alkylphenylene group, or
は、一体となって水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、
ｎは２〜１０，０００の整数であり、そして
ｐは１〜５の整数である、
で表される。コモノマー（ｂ）は、式ＩＩ：
And together represent a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group,
n is an integer from 2 to 10,000, and p is an integer from 1 to 5,
It is represented by Comonomer (b) has the formula II:
式中、Ｒ３およびＲ４は、独立してＣ１−６アルキル基を表し、Ｒｂは水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｙは−Ｏ−または−ＮＨ−を表し、そしてｑは２〜６の整数である、
で表される。架橋剤（ｃ）は、１分子中に２個または３個以上の重合性不飽和基を有する化合物である。
Wherein R 3 and R 4 independently represent a C 1-6 alkyl group, R b represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group, Y represents —O— or —NH—, and q is an integer of 2 to 6,
It is represented by The crosslinking agent (c) is a compound having two or three or more polymerizable unsaturated groups in one molecule.
四級化は、Ｃ１−６アルキル基もしくはハロゲン原子により１以上置換されていてもよいフェニル置換もしくは未置換Ｃ１−６アルキル基またはアリル基により、上記式（ＩＩ）の第三級アミン部分の少なくとも１０％が四級化されておればよい。こうして得られるエチレン性不飽和重合性基から形成される主鎖を有し、側鎖に四級化された第三級アミン部分を有する架橋ポリマーは、例えば、精製水中に分散させて動的光散乱粒子解析（ＤＬＳ）を行った場合に平均粒径が３０ｎｍ〜１０μｍの範囲にある微粒子を形成することに特徴がある。 Quaternization is achieved by a tertiary amine moiety of the above formula (II) with a phenyl substituted or unsubstituted C 1-6 alkyl group or allyl group optionally substituted by one or more C 1-6 alkyl groups or halogen atoms. It is sufficient that at least 10% of is quaternized. The resulting crosslinked polymer having a main chain formed from ethylenically unsaturated polymerizable groups and having a tertiary amine moiety quaternized in the side chain can be dispersed, for example, in purified water to generate dynamic light. It is characterized in that fine particles having an average particle diameter in the range of 30 nm to 10 μm are formed when scattering particle analysis (DLS) is performed.
このような四級化された微粒子または架橋ポリマーは、上記第三級アミン部分が四級化されていない場合の微粒子または架橋ポリマーに比べて、核酸分子を導入する標的とする動物細胞に対する毒性が著しく低く、一方では、複合体を形成する核酸分子を有意に効果的に該動物細胞内に導入することができる。 Such quaternized microparticles or cross-linked polymers are more toxic to target animal cells into which nucleic acid molecules are introduced compared to microparticles or cross-linked polymers where the tertiary amine moiety is not quaternized. On the other hand, the nucleic acid molecules forming the complex can be introduced into the animal cells significantly effectively.
＜発明の詳細な記述＞
以下、本発明または本明細書で用いる用語等について詳述するが、技術用語は、特記しない限り、当該技術分野で普通に使用されているか、または当業者に常用されている技術用語辞典（例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｐａｌ Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９８７；生化学辞典 第４版 監修 今堀和友 外、東京化学同人 ２００７等）に説明されている意味または内容有するものとして記載されている。
<Detailed Description of the Invention>
Hereinafter, the terminology used in the present invention or the present specification will be described in detail. Unless otherwise specified, technical terms are commonly used in the technical field or are commonly used by those skilled in the art (for example, technical terms dictionary) , Dictionary of Microbiology and Molecular Biology Second Edition Pal Singleton et al., John Wiley & Sons 1987; Have been described.
上記の式Ｉおよび式ＩＩにおける、Ｃ１−６アルキルを含め、本明細書で使用するところのアルキル基およびアルキルオキシ基におけるアルキル部分は、直鎖または分枝のアルキルを意味する。したがって、Ｃ１−６のアルキル基およびアルコキシのアルキル部分としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ．−ブチル、ｔｅｒｔ．−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル等が挙げられる。これらのうち、式ＩにおけるＲ１およびＲ２にいうアルキルオキシのアルキル部分、ならびに式ＩＩにおけるＲｂ、Ｒ３およびＲ４のアルキル基は、特にＣ１−３アルキルが好ましい。 The alkyl moiety in the alkyl group and the alkyloxy group as used herein, including C 1-6 alkyl in the above formula I and formula II, means a linear or branched alkyl. Accordingly, the alkyl group of C 1-6 and the alkyl moiety of alkoxy include methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, sec. -Butyl, tert. -Butyl, n-pentyl, iso-pentyl, n-hexyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl and the like. Of these, the alkyl moiety of alkyloxy referred to as R 1 and R 2 in Formula I and the alkyl group of R b , R 3 and R 4 in Formula II are particularly preferably C 1-3 alkyl.
したがって、Ｒ１およびＲ２にいうアルコキシ基として特に好ましいものとしてはメト
キシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基が挙げられる。その他、Ｒ１およびＲ２はフェニルオキシ基またはフェニルＣ１−３アルキルオキシ基、特にベンジルオキシ基もしくはフェネチルオキシ基、を好ましいものとして挙げることができる。これらの基は、同一または異なっていてもよいが、好ましくは同一の基である。また、Ｒ１およびＲ２は、一緒になって、Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよい１，２−エチレンジオキシ基（−ＯＣＨ（Ｒ′）−ＣＨ２Ｏ−：ここでＲ′はＣ１−６アルキル基である）であってもよいが、好ましくは、１，２−エチレンジオキシ基、１−メチル−１，２−エチレンジオキシ基、１−エチル−１，２−エチレンジオキシ基である。
Accordingly, particularly preferred examples of the alkoxy group for R 1 and R 2 include a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, and an isopropoxy group. In addition, R 1 and R 2 may be preferably a phenyloxy group or a phenyl C 1-3 alkyloxy group, particularly a benzyloxy group or a phenethyloxy group. These groups may be the same or different, but are preferably the same group. R 1 and R 2 together are 1,2-ethylenedioxy group (—OCH (R ′) — CH 2 O—, which may be substituted with C 1-6 alkyl: ′ May be a C 1-6 alkyl group), preferably 1,2-ethylenedioxy group, 1-methyl-1,2-ethylenedioxy group, 1-ethyl-1,2 -An ethylenedioxy group.
このような基からなる−ＣＨＲ１Ｒ２基（アセタール化もしくはケタール化ホルミル基に相当する。）は、例えば、酸で処理することにより、Ｒ１およびＲ２が一緒になって、オキシ（＝Ｏ）すなわち、Ｘが−ＣＨ＝Ｏを表すホルミル基（またはアルデヒド基）に容易に転化できる。従って、Ｘが水素原子または−ＣＨ＝Ｏ基以外を表す式（Ｉ）のマクロモノマーを用いて架橋ポリマーを製造した後、ポリマーを酸（例えば酢酸）で処理することによっても、ＰＥＧ鎖の分子の片末端にホルミル基（またはアルデヒド基）またはカルボキシル基を有する架橋ポリマーを提供できる。 A —CHR 1 R 2 group (corresponding to an acetalized or ketalized formyl group) composed of such a group is treated with an acid, for example, so that R 1 and R 2 are combined to form an oxy (= O), i.e., can easily be converted to a formyl group (or aldehyde group) in which X represents -CH = O. Thus, after preparing a crosslinked polymer using a macromonomer of formula (I) where X represents other than a hydrogen atom or a —CH═O group, the polymer can also be treated with an acid (eg, acetic acid) to form a PEG chain molecule. It is possible to provide a crosslinked polymer having a formyl group (or aldehyde group) or a carboxyl group at one end thereof.
ＲａおよびＲｂは、独立して、好ましくはメチル基または水素原子であり、また、Ｒ３およびＲ４は、独立して、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基であることが好ましい。 R a and R b are independently preferably a methyl group or a hydrogen atom, and R 3 and R 4 are preferably independently a methyl group, an ethyl group, or an n-propyl group.
また、Ｌはカルボニル基（＝Ｃ＝Ｏ）、Ｃ１−３アルキレン基またはＣ１−３アルキルフェニレン基 L is a carbonyl group (═C═O), a C 1-3 alkylene group or a C 1-3 alkylphenylene group.
（ここで、ｔは１〜３の整数である）
であるが、好ましくはカルボニル基、メチレンおよびベンジレン基
(Where t is an integer from 1 to 3)
Preferably carbonyl, methylene and benzylene groups
である。 It is.
ｎは２〜１０，０００の整数であることができる。したがって、本発明にいうポリマーの語「ポリマー」または「マクロモノマー」は、オリゴマーを包含する概念で使用している。 n can be an integer from 2 to 10,000. Accordingly, the term “polymer” or “macromonomer” in the context of the present invention is used in a concept that encompasses oligomers.
上記マクロモノマーは式Ｉの構造を参照し、多様な方法で製造できる。市販のＰＥＧを、例えば、（メタ）アクリル酸クロライド、ビニルベンジルクロリド、アリルクロリドを用いる脱ハロゲン化水素反応により、部分的に末端を修飾することにより製造できるが、例えば、いわゆるリビング重合によって製造すると、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（オキシエチレン）セグメントは、重合開始剤に対してエチレンオキシドの使用量を調整することによって一峰性の分子量をもつセグメントとすることが可能である。したがってｎは、２〜１０，０００の範囲内で、極めて分布の狭い数（単分散）とすることができ、好ましくは１０〜２００のいずれかの整数であることができる。ｐは、１〜５の整数である。好ましくは、１〜３の整数を挙げることができる。 The macromonomer can be prepared by various methods with reference to the structure of Formula I. Commercially available PEG can be produced, for example, by partially modifying the terminal by a dehydrohalogenation reaction using (meth) acrylic acid chloride, vinylbenzyl chloride, allyl chloride. The poly (ethylene glycol) or poly (oxyethylene) segment can be a segment having a unimodal molecular weight by adjusting the amount of ethylene oxide used relative to the polymerization initiator. Therefore, n can be an extremely narrow number (monodispersion) within a range of 2 to 10,000, and preferably an integer of 10 to 200. p is an integer of 1-5. Preferably, the integer of 1-3 can be mentioned.
式ＩＩのコモノマーは、（メタ）アクリル酸のアミノアルキルアミドまたはエステルである。Ｒｂ、Ｒ３およびＲ４について上記したとおりの定義を有するものであるが、特に好ましいものとしては、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレートもしくはメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートもしくはメタクリルアミド、およびＮ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルメタクリレートもしくはメタクリルアミド、ならびにこれらの対応するアクリレートもしくはアクリルアミドを挙げることができる。 The comonomer of formula II is an aminoalkylamide or ester of (meth) acrylic acid. R b , R 3 and R 4 have the definitions as described above, but particularly preferred are N, N-diethylaminoethyl methacrylate or methacrylamide, N, N-dimethylaminoethyl methacrylate or methacrylamide, And N, N-diethylaminopropyl methacrylate or methacrylamide and their corresponding acrylates or acrylamides.
（ｃ）の架橋剤は２個または３個以上の重合性不飽和基を有する多官能性のモノマーであって、式Ｉおよび式ＩＩのモノマーと共重合でき、本発明の目的を達成できるものであればいかなる架橋剤であってもよい。また、多種多様な市販されている架橋剤がそのまま使用できる。好ましいものとしては、限定されるものでないが、式ＩＩＩ： The crosslinking agent (c) is a polyfunctional monomer having two or three or more polymerizable unsaturated groups, which can be copolymerized with the monomers of the formulas I and II and achieve the object of the present invention. Any cross-linking agent may be used. A wide variety of commercially available crosslinking agents can be used as they are. Preferred are, but not limited to, Formula III:
（式中、Ｒｃは水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｙ′は原子価結合、ＣＯ−または−ＮＨ−を表し、Ａはフェニレン基−（ＣＨ２）ｒ−（ここで、ｒは１〜４の整数である）または−（ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ−（ここで、ｓは１〜４の整数である）で表される架橋剤を挙げることができる。より具体的に、特に好ましい架橋剤としては、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼンおよびＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドである。 (Wherein R c represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group, Y ′ represents a valence bond, CO— or —NH—, and A represents a phenylene group — (CH 2 ) r — (where, and a cross-linking agent represented by — (OCH 2 CH 2 O) s — (wherein s is an integer of 1 to 4). Particularly preferred crosslinking agents are ethylene glycol di (meth) acrylate, diethylene glycol di (meth) acrylate, triethylene glycol di (meth) acrylate, divinylbenzene and N, N′-methylenebisacrylamide.
本発明の架橋ポリマーはさらに場合により、１種以上の、好ましくは１種の重合性不飽和基を有する希釈モノマー由来の反復単位を含むことができる。限定されるものでないが、希釈モノマーとしては、スチレン、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸アミド、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、イソプレン、ブタジエン等を挙げることができる。以上の例示から理解できるとおり、本明細書で「（メタ）アクリレート」および「（メタ）アクリル酸」と称す場合、メタクリレートもしくはアクリレートおよびメタクリル酸もしくはアクリル酸を、それぞれ意味する。 The cross-linked polymers of the present invention can optionally further comprise repeating units derived from dilute monomers having one or more, preferably one, polymerizable unsaturated group. Although not limited, as a dilution monomer, styrene, methyl (meth) acrylate, butyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, (meth) acrylate amide, 2-hydroxyethyl methacrylate , Isoprene, butadiene and the like. As can be understood from the above examples, in the present specification, when “(meth) acrylate” and “(meth) acrylic acid” are referred to, methacrylate or acrylate and methacrylic acid or acrylic acid are meant, respectively.
本発明の四級化された架橋ポリマーは、上記の各モノマー、架橋剤に由来するポリマー主鎖および側鎖を含み、かつ、式ＩＩで表されるコモノマーの第三級アミン部分（Ｒ３Ｒ４Ｎ−（ＣＨ２）ｑ−）がＣ１−６アルキル基もしくはハロゲン原子により１以上置換されていてもよいフェニル置換もしくは未置換Ｃ１−６アルキル基またはアリル基により四級化されている。かような四級化に用いられる基はＣ１−３アルキル基であることが好ましい。該アミン部分の四級化率は、総アミノ基の中の少なくとも約１０％、好ましくは約３０％、より好ましくは約５０％、特に好ましくは約１００％であることができる。 The quaternized crosslinked polymer of the present invention comprises the above-mentioned monomers, a polymer main chain and a side chain derived from a crosslinking agent, and a tertiary amine moiety (R 3 R) of a comonomer represented by the formula II. 4 N- (CH 2) q - ) is quaternized C 1-6 alkyl group or substituted by one or more phenyl optionally substituted or unsubstituted C 1-6 alkyl group or an allyl group by a halogen atom . The group used for such quaternization is preferably a C 1-3 alkyl group. The quaternization rate of the amine moiety can be at least about 10%, preferably about 30%, more preferably about 50%, particularly preferably about 100% of the total amino groups.
好ましい態様の架橋ポリマーまたはポリマー微粒子を構成するのに必須の（ａ）のマクロモノマー（ポリマー微粒子の（ｉｉ）の側鎖をもたらす。）と（ｂ）コモノマー（ポリ
マー微粒子の（ｉ）の側鎖をもたらす。）は、モル比で１／４００、好ましくは１／２００、特に好ましくは１／１００〜２／１の範囲内で使用することができる。そして、（ａ）のマクロモノマーと（ｂ）のコモノマーの総量に対し、架橋剤（ｃ）は０．１〜２５モル％の割合で使用することができる。
The macromonomer (a) (providing the side chain of (ii) of the polymer fine particle) and (b) the comonomer (the side chain of (i) of the polymer fine particle) essential for constituting the crosslinked polymer or polymer fine particle of the preferred embodiment Can be used in a molar ratio of 1/400, preferably 1/200, particularly preferably 1/100 to 2/1. And a crosslinking agent (c) can be used in the ratio of 0.1-25 mol% with respect to the total amount of the macromonomer of (a), and the comonomer of (b).
これらのモノマー、架橋剤の共重合反応は、ラジカル重合が起こる条件下、例えば、溶媒として、必要により水混和性の有機溶媒、メタノール、エタノールが混合されていてもよい水、好ましくは水単独で、開始剤として、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム、４，４′−アゾビス−４−シアノバレリアン酸等を用いて、必要により加熱下に行うことができる。反応体の混合溶液は、不活性ガス（例えば、窒素、アルゴン等）により脱気を行った状態で、激しく攪拌しながら反応を行えばよい。反応は、反応混合物のアリコートを、例えばガスクロマトグラフィーで分析し、未反応のモノマーが消失するまで行う。こうして、一般的には、架橋ポリマーが微粒子（またはビーズ）状で得られる。 The copolymerization reaction of these monomers and the crosslinking agent is carried out under conditions where radical polymerization occurs, for example, as a solvent, water optionally mixed with a water-miscible organic solvent, methanol, ethanol, preferably water alone. As an initiator, potassium persulfate, sodium persulfate, ammonium persulfate, 4,4′-azobis-4-cyanovaleric acid or the like can be used, if necessary, under heating. The reactant mixed solution may be reacted with vigorous stirring while being deaerated with an inert gas (eg, nitrogen, argon, etc.). The reaction is carried out until an aliquot of the reaction mixture is analyzed, for example, by gas chromatography, and unreacted monomer disappears. Thus, generally, a crosslinked polymer is obtained in the form of fine particles (or beads).
四級化された架橋ポリマーは、可能であれば、上記式ＩＩで表されるコモノマーの第三級アミン部分（Ｒ３Ｒ４Ｎ−（ＣＨ２）ｑ−）が予め四級化されたものを、上記式（Ｉ）のマクロモノマーおよび架橋剤と共重合することにより得られるものであってもよい。しかし、四級化された架橋ポリマーは、都合よくは、該マクロモノマー、コモノマーおよび架橋剤を含んでなるモノマーを、例えば、重合に悪影響を及ぼさない溶媒（水、または水と水混和性溶媒、例えば、ジメチルスルホキシド、エタノール等との混合液）中でラジカル共重合せしめ、こうして得られる架橋ポリマーを低級アルカノール、またはテトラヒドロフラン、等の溶媒中で上記Ｃ１−６アルキル基もしくはハロゲン原子により１以上置換されていてもよいフェニル置換もしくは未置換Ｃ１−６アルキル基またはアリル基に対応するハロゲン化物（例えば、ヨウ化物、臭化物等）を用いて四級化することにより得ることができる。 If possible, the quaternized cross-linked polymer is obtained by previously quaternizing the tertiary amine moiety (R 3 R 4 N— (CH 2 ) q —) of the comonomer represented by the above formula II. May be obtained by copolymerizing with a macromonomer of the above formula (I) and a crosslinking agent. However, quaternized cross-linked polymers conveniently have monomers comprising the macromonomer, comonomer and cross-linking agent, such as solvents that do not adversely affect the polymerization (water or water and water miscible solvents, For example, radical copolymerization is performed in a mixed solution with dimethyl sulfoxide, ethanol, etc.), and the resulting crosslinked polymer is substituted with one or more of the above C 1-6 alkyl groups or halogen atoms in a solvent such as lower alkanol or tetrahydrofuran. It can be obtained by quaternization using a halide (for example, iodide, bromide, etc.) corresponding to an optionally substituted phenyl-substituted or unsubstituted C 1-6 alkyl group or allyl group.
こうして得られる四級化された架橋ポリマーの微粒子の粒径は、反応において、（ａ）のマクロモノマーと（ｂ）のコモノマーと（ｃ）の架橋剤の使用割合を選ぶことにより、また、（ａ）のマクロモノマーのＰＥＧの分子量を選ぶことにより、粒径を約３０ｎｍ、好ましくは５０ｎｍ〜約１μｍに調整することができ、必要により、さらに１μｍ以上、１０μｍ以下にも調整することができる。したがって、微粒子はナノスフェアもしくはミクロスフェアと称することもできる。さらに、上述したとおりこれらの粒径は、水性媒体のｐＨを変化されることにより調節することもできる。通常、コモノマーの配合比を増加させることにより大きい粒径の微粒子を形成できる。他方、架橋剤の使用割合を変化させることにより、網目の疎密を調整できる。また、希釈剤モノマーとして、例えば、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）を併用すると微粒子の水溶性を向上させることができ、例えば、スチレンを併用すると微粒子に屈折率の向上特性を付与することができる。 The particle size of the quaternized crosslinked polymer fine particles thus obtained can be determined by selecting the ratio of the macromonomer (a), the comonomer (b) and the crosslinking agent (c) used in the reaction, By selecting the molecular weight of the macromonomer PEG of a), the particle size can be adjusted to about 30 nm, preferably 50 nm to about 1 μm, and can be further adjusted to 1 μm or more and 10 μm or less if necessary. Therefore, the fine particles can also be referred to as nanospheres or microspheres. Furthermore, as described above, these particle sizes can also be adjusted by changing the pH of the aqueous medium. Usually, fine particles having a larger particle diameter can be formed by increasing the blending ratio of the comonomer. On the other hand, the density of the mesh can be adjusted by changing the use ratio of the crosslinking agent. In addition, for example, when 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) is used in combination as a diluent monomer, the water solubility of the fine particles can be improved. For example, when styrene is used in combination, the fine particles can be provided with a refractive index improving property. it can.
本発明に従う四級化された架橋ポリマーは、三次元ポリマーまたは網目ポリマーとも称され、殆どが、実質的には水を初めとする溶媒に不溶であり、一方では、水性媒体中（緩衝化された脱イオン水等を包含する）で高度の分散されたポリマー微粒子を形成する。水中ではＰＥＧマクロモノマーに由来するＰＥＧセグメントの作用により、分子全体または粒子が可溶化され、恰も、通常の意味に用いる溶液のごとき外観を呈する。したがって、本明細書で溶液と称するときは、上記のごとく溶質ポリマー全体またはポリマー微粒子が可溶化され、恰も溶液のごとき外観を呈する場合を包含する。上述したとおり、架橋ポリマーまたは四級化された架橋ポリマーは、それらの水溶液中で微粒子またはビーズ状の形態で可溶化または分散された状態で存在しうる。また、このような微粒子は、遠心分離、濾過、その他の方法により、固体粒子として溶液から分離することもできる。 Quaternized cross-linked polymers according to the present invention are also referred to as three-dimensional polymers or network polymers, and are mostly insoluble in solvents, including water, while in aqueous media (buffered). Highly dispersed polymer microparticles are formed. In water, the whole molecule or particle is solubilized by the action of the PEG segment derived from the PEG macromonomer, and the appearance of the soot is like a solution used in a normal sense. Therefore, the term “solution” in this specification includes the case where the entire solute polymer or polymer fine particles are solubilized as described above, and the appearance of a soot is like a solution. As described above, the cross-linked polymer or quaternized cross-linked polymer can exist in a solubilized or dispersed state in the form of fine particles or beads in their aqueous solution. Such fine particles can also be separated from the solution as solid particles by centrifugation, filtration, or other methods.
上述のごとく、四級化された架橋ポリマー微粒子は、精製水中に分散させて動的光散乱粒径解析（ＤＬＳ）を行った場合に平均粒径が３０ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは５０ｎｍ〜１μｍの範囲にあるとの特有の構成要件または特性を有する。 As described above, the quaternized crosslinked polymer fine particles have a mean particle size of 30 nm to 10 μm, preferably 50 nm to 1 μm when dispersed in purified water and subjected to dynamic light scattering particle size analysis (DLS). It has a specific configuration requirement or characteristic.
本発明に従う複合体を構成する核酸分子（または核酸）は、上記四級化された架橋ポリマー微粒子と安定な複合体を形成し、当該技術分野で研究のツールとして、また、何らかの疾患の治療または予防上で有用な核酸分子であれ制限されることなく使用できる。本発明にいう核酸は、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、オリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、また同一の鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ二本鎖核酸、同一の鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ一本鎖核酸が含まれる。また、核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型であってもよく、またアミノ基、チオール基、蛍光化合物等が付加されたものであってもよい。限定されるものでないが、核酸は、上記の何らかの機能をするものであればいかなる鎖長を有するものであってもよい。しかし、一般的には、５〜３０，０００塩基、好ましくは１０〜１５，０００塩基、他の核酸のベクターに比べてより顕著に本発明の特徴を発揮しるものとしては、５〜３０塩基からなるものであることができる。 The nucleic acid molecule (or nucleic acid) constituting the complex according to the present invention forms a stable complex with the quaternized cross-linked polymer fine particles, and is used as a research tool in the technical field, or for treatment of any disease or Any nucleic acid molecule useful for prevention can be used without limitation. The nucleic acid referred to in the present invention means a poly or oligonucleotide having a nucleotide unit consisting of a purine or pyrimidine base, pentose or phosphate as a basic unit, oligo or poly single stranded RNA, oligo or poly single stranded DNA, oligo or Poly double stranded RNA, oligo or poly double stranded DNA, oligo or poly double stranded nucleic acid mixed with RNA and DNA in the same strand, oligo or poly single stranded nucleic acid mixed with RNA and DNA in the same strand Is included. Moreover, the nucleotide contained in the nucleic acid may be a natural type, a non-natural type that has been chemically modified, or an amino group, a thiol group, a fluorescent compound, or the like added thereto. Although not limited, the nucleic acid may have any chain length as long as it has any of the above functions. However, in general, 5 to 30,000 bases, preferably 10 to 15,000 bases, and 5 to 30 bases that exhibit the features of the present invention more significantly than other nucleic acid vectors. It can consist of:
かような核酸分子の機能を考慮すると、核酸分子には、例えば、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アンチ−ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマー、およびリボザイムが包含される。限定されるものでないが、ｓｉＲＮＡは、一般的に１８〜２７塩基対の二本鎖ＲＮＡであり細胞内導入によって配列特異的に標的ｍＲＮＡが分解を誘起し指標的遺伝子の発現を抑制するものとして知られているものであり、アンチセンス核酸は、一般的に特定のｍＲＮＡに結合して遺伝子発現を阻止したり，ｍＲＮＡのスプライシングを操作するものとして知られているものであり、アンチ−ｍｉｃｒｏ ＲＮＡは、一般的に内在性のｍｉＲＮＡの機能を阻害するものとして知られているものであり、デコイ核酸は、一般的に標的蛋白質を捕捉することにより遺伝子の活性化に重要な転写因子を阻害する二本鎖核酸として知られているものであり、アプタマーは、一般的に特異的な三次元構造をとる化学合成の短い核酸で蛋白質など特定の化合物に結合するものとして知られているものであり、リボサイムは、一般的にＲＮＡを切断する生体触媒としての活性を持つ配列を持った核酸として知られるものである。 Considering the function of such a nucleic acid molecule, the nucleic acid molecule includes, for example, plasmid DNA, mRNA, siRNA, antisense nucleic acid, anti-micro RNA, decoy nucleic acid, aptamer, and ribozyme. Although it is not limited, siRNA is generally 18-27 base pair double-stranded RNA, and when introduced into a cell, the target mRNA induces degradation in a sequence-specific manner and suppresses the expression of an indicator gene. Antisense nucleic acids are generally known to bind to specific mRNAs to block gene expression or to manipulate mRNA splicing, and are known as anti-micro RNAs. Is generally known to inhibit the function of endogenous miRNAs, and decoy nucleic acids generally inhibit transcription factors important for gene activation by capturing target proteins. Known as a double-stranded nucleic acid, aptamers are short chemically synthesized nucleic acids that generally have a specific three-dimensional structure, and are specific for proteins, etc. Are those known as being bound to the object, Ribosaimu are those commonly known as a nucleic acid having a sequence having activity as biocatalyst cleaves the RNA.
四級化された架橋ポリマーまたは該ポリマー微粒子は、その中の第三級アミン部分のＮ原子と核酸のリン酸部分のＰ原子の比、Ｎ／Ｐは、一般的に０．１〜５０、好ましくは０．５〜３０、より好ましくは１．０〜２０、特に好ましくは３．０〜２０となるように、核酸がポリマー粒子に担持されている状態にある。 The quaternized crosslinked polymer or the polymer fine particle has a ratio of N atom of tertiary amine portion to P atom of phosphoric acid portion of nucleic acid, and N / P is generally 0.1-50, The nucleic acid is in a state of being supported on the polymer particles so that the amount is preferably 0.5 to 30, more preferably 1.0 to 20, and particularly preferably 3.0 to 20.
以下、具体例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with specific examples.
内核（コア）にカチオン性固定電荷を有する四級化架橋ポリマーの製造 Production of quaternized cross-linked polymer with cationic fixed charge in the inner core
１００ｍＬナスフラスコに反応性官能基としてアセタール基、重合性官能基としてビニルベンジル基を主鎖末端にそれぞれ有するポリエチレングリコール（ａｃｅｔａｌ−ＰＥＧ−ｖｉｎｙｌｂｅｎｚｙｌ：数平均分子量７，８７０）を９４．９μｍｏｌ（７５０ｍｇ）、開始剤として８２．７μｍｏｌ（２２．４ｍｇ）の過硫酸カリウム（ＫＰＳ）を入れて、窒素置換後に脱気した蒸留水を３０．５ｍＬ加え、架橋剤としてエチレンジメタクリレート（ＥＤＭＡ）を８１．９μｍｏｌ（１７．８μＬ １．０ｍｏｌ％）加えて溶解させた。その後、水溶性高分子架橋体の内核部位となる２−（Ｎ，Ｎ−ジチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＥＡＥＭＡ）を８．０９ｍｍｏｌ（１．６３ｍＬ）加え室温にて一晩攪拌し、乳化重合を行った（重量比ＰＥＧ：ＤＥＡＥＭＡ＝１：２、高分子架橋体７５ｍｇ／ｍＬ仕込み）。精製はメタノールを用いて限外濾過（分画分子量；２００，０００）により行い未反応のポリマー等の除去を行い、その後超純水で置換し、０．２μｍのフィルターに通して滅菌処理を行った。高分子架橋体水溶液の重量濃度は凍結乾燥後の重量より算出した。さらに、元素分析測定により窒素含有量を測定した。 94.9 μmol (750 mg) of polyethylene glycol (acetal-PEG-vinylbenzyl: number average molecular weight 7,870) having an acetal group as a reactive functional group and a vinylbenzyl group as a polymerizable functional group at the end of the main chain in a 100 mL eggplant flask. 82.7 μmol (22.4 mg) of potassium persulfate (KPS) as an initiator was added, 30.5 mL of distilled water degassed after nitrogen substitution was added, and ethylene dimethacrylate (EDMA) as a cross-linking agent was 81.9 μmol. (17.8 μL 1.0 mol%) was added and dissolved. Thereafter, 8.09 mmol (1.63 mL) of 2- (N, N-diethylamino) ethyl methacrylate (DEAEMA), which is the inner core site of the water-soluble polymer crosslinked product, was added and stirred overnight at room temperature to perform emulsion polymerization. (Weight ratio PEG: DEAEMA = 1: 2, preparation of polymer crosslinked product 75 mg / mL). Purification is performed by ultrafiltration with methanol (fractionated molecular weight; 200,000) to remove unreacted polymer, etc., and then replaced with ultrapure water and sterilized through a 0.2 μm filter. It was. The weight concentration of the crosslinked polymer aqueous solution was calculated from the weight after lyophilization. Further, the nitrogen content was measured by elemental analysis measurement.
その後、高分子架橋体に換算して２１０ｍｇ相当の高分子架橋体水溶液（３ｍＬ）を２７ｍＬのメタノールに分散させ、ヨウ化メチルを１．５ｍｍｏｌ（９３．３μＬ）加え室温にて一晩以上攪拌し、内核アミノ基の四級化を行った（高分子架橋体中のアミノ基に対するヨウ化メチル添加量は２倍モル当量）。精製はメタノールにて限外濾過（分画分子量；２００，０００）を行い未反応のヨウ化メチルの除去を行い、その後超純水で置換し、０．２μｍのフィルターに通して滅菌処理を行った。得られた四級化高分子架橋体を凍結乾燥後、重量測定により重量濃度を算出した。さらに、元素分析測定により窒素含有量と対イオンであるヨウ素含有量をそれぞれ測定し、内核アミノ基の四級化率を算出した。ま
たナノゲルの内核アミノ基数に対するヨウ化メチル添加量を様々変化させ、四級化率の制御を行った。その結果を下記表１に示す。
Thereafter, 210 mg equivalent polymer aqueous solution (3 mL) was dispersed in 27 mL of methanol in terms of polymer crosslinked product, 1.5 mmol (93.3 μL) of methyl iodide was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The quaternization of the inner core amino group was carried out (the amount of methyl iodide added to the amino group in the polymer crosslinked product was twice the molar equivalent). Purification is performed by ultrafiltration with methanol (fractionated molecular weight; 200,000) to remove unreacted methyl iodide, and then replaced with ultrapure water, followed by sterilization through a 0.2 μm filter. It was. The obtained quaternized polymer crosslinked product was freeze-dried, and the weight concentration was calculated by weight measurement. Furthermore, nitrogen content and iodine content as a counter ion were measured by elemental analysis, respectively, and the quaternization rate of the inner core amino group was calculated. In addition, the amount of methyl iodide added to the number of amino groups in the core of the nanogel was varied to control the quaternization rate. The results are shown in Table 1 below.
表１より、ナノゲルの内核アミノ基数に対するヨウ化メチル添加量を様々変化させることで、四級化率の制御が可能であることが確認できた。 From Table 1, it was confirmed that the quaternization rate can be controlled by variously changing the amount of methyl iodide added to the number of inner core amino groups of the nanogel.
内核にカチオン性固定電荷を有する四級化架橋ポリマーの物性評価
実施例１に従い製造した、四級化率の異なる高分子架橋体をｐＨ＝７．４の１０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液に１００μｇ／ｍＬとなるように分散させ、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて、粒子径とゼータ電位の測定を行った。その結果を表２に示す。
Evaluation of Physical Properties of Quaternized Crosslinked Polymer Having Cationic Fixed Charge in Inner Core Polymer crosslinked products produced according to Example 1 and having different quaternization rates were added to 100 μg / mL in 10 mM Tris-HCl buffer solution at pH = 7.4. The particle size and the zeta potential were measured using a zeta sizer (Malvern). The results are shown in Table 2.
四級化率の増加に伴い、ｐＨ＝７．４における粒子径とゼータ電位が供に増加する傾向が確認できた。内核アミノ基をカチオン性の固定電荷（四級アミノ基）へと変換することで、その電荷によりゼータ電位は上昇し、また固定電荷同士の静電反発力によるゲルの膨潤により粒子径が増大したと推測される。 As the quaternization rate increased, it was confirmed that the particle diameter and the zeta potential at pH = 7.4 increased. By converting the inner core amino group into a cationic fixed charge (quaternary amino group), the zeta potential is increased by the charge, and the particle size is increased by swelling of the gel due to electrostatic repulsion between the fixed charges. It is guessed.
架橋ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体の調製とポリアクリルアミド電気泳動による評価
この実施例では、本発明に従う四級化架橋ポリマーが四級化処理を施していない架橋ポリマーに比べより多くのｓｉＲＮＡを粒子中に担持可能であることを示す。
Preparation of cross-linked polymer / siRNA complex and evaluation by polyacrylamide electrophoresis In this example, the quaternized cross-linked polymer according to the present invention carries more siRNA in the particles than the cross-linked polymer not subjected to quaternization treatment. Indicates that it is possible.
ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を６μＭの濃度となるようにｐＨ＝７．４の１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液に溶解させた。次いで架橋ポリマーを様々な濃度でｐＨ＝７．４の１０ｍＭトリス−塩酸緩衝溶液に溶解させた。ｓｉＲＮＡに対し二倍の体積量の架橋ポリマーを加え、室温で３０分間以上静置し四級化架橋ポリマー中へのｓｉＲＮＡの担持を行った（最終ｓｉＲＮＡ濃度：２μＭ）。この際、架橋ポリマー中のアミノ基数とｓｉＲＮＡ中のリン酸基数をさまざまな比率（Ｎ／Ｐ比）で変化させて調製を行った。その後、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動を３．３ｍＭトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝溶液（ｐＨ＝７．４）を使用して１００Ｖ、１時間行った。０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムにポリアクリルアミドゲルを浸漬させ染色を行った後、ＵＶトランスイルミネーターを用いてｓｉＲＮＡ担持架橋ポリマー中に含まれる遊離のｓｉＲＮＡの検出を行った。結果を図１に示す。
siRNA (manufactured by Dharmacon) is a pH of 7.4 1 so that the concentration becomes 6 μM.
Dissolved in 0 mM Tris-HCl buffer solution. The crosslinked polymer was then dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer solution at various concentrations at pH = 7.4. A volume of the cross-linked polymer twice that of siRNA was added, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more to carry siRNA in the quaternized cross-linked polymer (final siRNA concentration: 2 μM). At this time, the number of amino groups in the crosslinked polymer and the number of phosphate groups in the siRNA were changed at various ratios (N / P ratio). Thereafter, electrophoresis using a 12% polyacrylamide gel was carried out at 100 V for 1 hour using a 3.3 mM Tris-borate-EDTA buffer solution (pH = 7.4). After staining with polyacrylamide gel immersed in 0.5 μg / mL ethidium bromide, free siRNA contained in the siRNA-supported crosslinked polymer was detected using a UV transilluminator. The results are shown in FIG.
図１によると、架橋ポリマーとｓｉＲＮＡを各種Ｎ／Ｐ比で混合した際の、複合化に関与しない遊離のｓｉＲＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出した結果である。四級化処理を施していない架橋ポリマーとｓｉＲＮＡはＮ／Ｐ＝１．５で遊離のｓｉＲＮＡのバンドが消失するが、四級化架橋ポリマーとｓｉＲＮＡはＮ／Ｐ＝１とより低いＮ／Ｐ比において遊離のｓｉＲＮＡのバンドが消失した。すなわち、四級化高分子架橋体は粒子中により多くのｓｉＲＮＡを担持可能である。 FIG. 1 shows the result of detecting free siRNA not involved in complexation by polyacrylamide gel electrophoresis when the cross-linked polymer and siRNA were mixed at various N / P ratios. The cross-linked polymer and siRNA not subjected to quaternization treatment have N / P = 1.5 and the free siRNA band disappears, but the quaternized cross-linked polymer and siRNA have lower N / P = 1 and N / P = 1. Free siRNA bands disappeared in the ratio. That is, the quaternized polymer crosslinked body can carry more siRNA in the particles.
ｓｉＲＮＡ担持四級化高分子架橋体のゼータ電位評価
この実施例では、本発明に従う四級化架橋ポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の生理条件（ｐＨ７．４）におけるゼータ電位が、四級化率により制御可能であることを示す。
Evaluation of Zeta Potential of SiRNA-Supported Quaternized Polymer Crosslinked Body In this example, the zeta potential of the quaternized crosslinked polymer-siRNA complex according to the present invention under physiological conditions (pH 7.4) can be controlled by the quaternization rate. Indicates that
ここでは、様々なＮ／Ｐ比で調製したｓｉＲＮＡ担持高分子架橋体に関して、ゼータサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ写生）を用いて、ｐＨ＝７．４トリス−塩酸緩衝溶液中でゼータ電位の測定を行った。結果を図２に示す。 Here, the zeta potential was measured in a pH = 7.4 Tris-HCl buffer solution using a Zetasizer (Malvern photocopy) for siRNA-supported polymer crosslinked products prepared at various N / P ratios. The results are shown in FIG.
図２より、Ｎ／Ｐ比を高くすることであらゆる四級化率においてより大きな正のゼータ電位を示すことがわかり、Ｎ／Ｐ比３以上ではほぼ同等のゼータ電位を示した。また四級化率の増加に伴いより大きな正のゼータ電位を示すことが示された。すなわち、架橋ポリマー微粒子の内核アミノ基の四級化率を制御することでｓｉＲＮＡ担持後の高分子架橋体複合体のゼータ電位の制御が可能であることが示された。 FIG. 2 shows that increasing the N / P ratio shows a larger positive zeta potential at all quaternization ratios, and an N / P ratio of 3 or more showed almost the same zeta potential. It was also shown that a larger positive zeta potential was exhibited as the quaternization rate increased. That is, it was shown that the zeta potential of the polymer crosslinked complex after supporting siRNA can be controlled by controlling the quaternization rate of the inner core amino group of the crosslinked polymer fine particles.
ｓｉＲＮＡ担持四級化高分子架橋体による細胞内ｓｉＲＮＡ導入量の評価
この実施例では、本発明に従うｓｉＲＮＡ担持四級化架橋ポリマーが、細胞内へのｓｉＲＮＡ送達に関して未四級化体や市販の遺伝子導入試薬等に比べ優れること示す。
In this example, the siRNA-supported quaternized cross-linked polymer according to the present invention is used for the siRNA delivery into the cell in the form of an unquaternized product or a commercially available gene. It is superior to the introduced reagent.
２４穴ポリスチレン製細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に、人肝癌細胞（ＨｕＨ−７細胞）を１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間培養した後、センス鎖５’末端をフルオレセインで修飾したホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する配列を有するｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製、ｓｅｎｓｅ鎖配列：５’−ＣＵＵ ＡＣＧ ＣＵＧ ＡＧＵ ＡＣＵ ＵＣＧ ＡｄＴｄＴ−３’，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖配列：５’−ＵＣＧ ＡＡＧ ＵＡＣ ＵＣＡ ＧＣＧ ＵＡＡ ＧｄＴｄＴ−３’）を内包した高分子架橋体（実施例３で調製した）の溶液を所定量加え（培地濃度換算［ｓｉＲＮＡ］＝２００ｎＭ）、２４時間１０％血清存在下で細胞と接触させた。その後、細胞をトリプシン処理により回収しフローサイトメーターにより細胞内ｓｉＲＮＡ導入量を評価した（ｎ＝３）。 Human liver cancer cells (HuH-7 cells) were seeded on a 24-well polystyrene cell culture plate (Falcon) at 100,000 cells / well, cultured for 24 hours, and then firefly luciferase whose sense strand 5 ′ end was modified with fluorescein. SiRNA having a sequence for a gene (manufactured by Dharmacon, including sense chain sequence: 5′-CUU ACG CUG AGU ACU UCG AdTdT-3 ′, antisense chain sequence: 5′-UCG AAG UAC UCA GCG UAA GdTdT-3 ′) A predetermined amount of a solution of the polymer cross-linked product (prepared in Example 3) was added (medium concentration conversion [siRNA] = 200 nM) and contacted with cells in the presence of 10% serum for 24 hours. Thereafter, the cells were collected by trypsin treatment, and the amount of intracellular siRNA introduced was evaluated with a flow cytometer (n = 3).
図３より僅か２．６％の四級化処理においても、未四級化体を比較して有意に細胞内ｓ
ｉＲＮＡ導入量の増加が認められる。１００％の四級化処理においては、市販のオリゴ核酸導入試薬であるＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）ならびに同Ｎ／Ｐ比における分岐型ポリエチレンイミン（Ｂ−ＰＥＩ、重量平均分子量２５，０００、シグマ−アルドリッチ社製）を凌ぐ細胞内ｓｉＲＮＡ導入量を示した。これはカチオン性のＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、Ｂ−ＰＥＩは培地中に含まれる血清由来タンパク質との相互作用によって取り込みが阻害されるのに対し、四級化高分子架橋体は表面をＰＥＧ化処理してあるため、タンパク質との非特異的相互作用を抑えるためであると推測される。
From FIG. 3, even in the quaternization treatment of only 2.6%, the intracellular s
An increase in the amount of iRNA introduced is observed. In the quaternization treatment of 100%, Oligofectamine (manufactured by Invitrogen) and Lipofectamine2000 (manufactured by Invitrogen), which are commercially available oligonucleic acid introduction reagents, and branched polyethyleneimine (B-PEI, weight average molecular weight) at the same N / P ratio. 25,000, Sigma-Aldrich)), and the amount of intracellular siRNA introduced was higher. Cationic Oligofectamine, Lipofectamine 2000, and B-PEI are inhibited by the interaction with the serum-derived protein contained in the medium, whereas the quaternized polymer cross-linked product has a PEGylated surface. Therefore, it is presumed that this is to suppress non-specific interaction with the protein.
また、各四級化率の高分子架橋体を、様々なＮ／Ｐ比において蛍光ラベル化ｓｉＲＮＡの担持を行い、フローサイトメトリー測定より得られる細胞のヒストグラム（図３）の平均蛍光強度を計算した結果が図４である。四級化率が高く、またＮ／Ｐ比が高いほど細胞内ｓｉＲＮＡ導入量が増大するという知見を得た。つまり、ｓｉＲＮＡ担持四級化高分子架橋体のゼータ電位が高いものほど、負電荷を有する細胞膜との静電的な相互作用が増加し、細胞内ｓｉＲＮＡ導入量の向上が起こったと推測される。 In addition, each cross-linked polymer of each quaternization rate is loaded with fluorescent-labeled siRNA at various N / P ratios, and the average fluorescence intensity of the cell histogram (Fig. 3) obtained from flow cytometry is calculated. The result is shown in FIG. It was found that the higher the quaternization rate and the higher the N / P ratio, the greater the amount of intracellular siRNA introduced. That is, it is presumed that the higher the zeta potential of the siRNA-supported quaternized polymer cross-linked body, the greater the electrostatic interaction with the negatively charged cell membrane, and the improvement of the amount of intracellular siRNA introduced.
架橋ポリマー／ｓｉＲＮＡ複合体による遺伝子発現抑制効果の評価
この実施例では、本発明に従う四級化架橋ポリマー−ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子発現抑制効果を市販の遺伝子導入試薬との比較に関して示す。
Evaluation of Gene Expression Inhibitory Effect by Crosslinked Polymer / siRNA Complex In this example, the gene expression inhibitory effect of the quaternized crosslinked polymer-siRNA complex according to the present invention is shown in comparison with a commercially available gene introduction reagent.
２４穴ポリスチレン製細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に、人肝癌細胞（ＨｕＨ−７細胞）を５０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間培養した後、市販の遺伝子導入試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ホタル由来ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ，８０ｎｇ／ｗｅｌｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とウミシイタケ由来ルシフェラーゼプラスミドＤＮＡ（ｐＲＬ−ＴＫ，４００ｎｇ／ｗｅｌｌ，Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のレポーター遺伝子をＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で細胞にトランスフェクションした。次に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する配列を有するｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製、ｓｅｎｓｅ鎖配列：５’−ＣＵＵ ＡＣＧ ＣＵＧ ＡＧＵ ＡＣＵ ＵＣＧ ＡｄＴｄＴ−３’，ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖配列：５’−ＵＣＧ ＡＡＧ ＵＡＣ ＵＣＡ ＧＣＧ ＵＡＡ ＧｄＴｄＴ−３’）を内包した架橋ポリマー（実施例３で調製した）の溶液を所定量加え（培地濃度換算（ｓｉＲＮＡ）＝１００ｎＭ）、２４時間１０％血清存在下で細胞と接触させた。培地交換後、さらに２４時間培養した後、細胞を回収し両レポーター遺伝子の発光量をＤｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）により測定し遺伝子発現抑制（ＲＮＡｉ）効果を評価した（ｎ＝３）。 Human liver cancer cells (HuH-7 cells) are seeded on a 24-well polystyrene cell culture plate (Falcon) at 50,000 cells / well, cultured for 24 hours, and then commercially available Lipofectamine 2000 (manufactured by Invitrogen). ), The reporter genes of firefly-derived luciferase plasmid DNA (pGL3-control, 80 ng / well, manufactured by Promega) and Renilla luciferase plasmid DNA (pRL-TK, 400 ng / well, manufactured by Promega) were used as Opti-MEM I ( The cells were transfected in Invitrogen). Next, siRNA having a sequence for the firefly luciferase gene (manufactured by Dharmacon, sense chain sequence: 5′-CUU ACG CUG AGU ACU UCG AdTdT-3 ′, antisense chain sequence: 5′-UCG AAG UAC UCA GCG UAA GTG UAT A predetermined amount of a solution of a cross-linked polymer (prepared in Example 3) encapsulating ') was added (medium concentration equivalent (siRNA) = 100 nM) and contacted with cells in the presence of 10% serum for 24 hours. After exchanging the medium, the cells were further cultured for 24 hours, and then the cells were collected, and the luminescence levels of both reporter genes were measured by Dual Luciferase Reporter System System (Promega) to evaluate the gene expression suppression (RNAi) effect (n = 3). .
実施例５において最も細胞内ｓｉＲＮＡ導入量に優れていた１００％四級化体と、未四級化体を用いた際の、遺伝子発現抑制効果を調べ図５にまとめた。１００％四級化体はＮ／Ｐ比の増加に伴い顕著な遺伝子発現抑制効果を示し、Ｎ／Ｐ＝１０ではＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ以上の抑制効果を示し、Ｎ／Ｐ＝２０においてはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００以上の効果を示した。一方、細胞内ｓｉＲＮＡ導入量の少ない未四級化体はＮ／Ｐ＝３において最大の遺伝子発現抑制効果を示し、その値はＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅより僅かに優れる程度であった。すなわち細胞内ｓｉＲＮＡ導入量に優れる四級化架橋ポリマーほどより高い遺伝子発現抑制効果を示した。 In Example 5, the effect of suppressing gene expression when using 100% quaternized form and the non-quaternized form having the most excellent amount of intracellular siRNA introduced was investigated and summarized in FIG. The 100% quaternized compound shows a remarkable gene expression suppression effect with an increase in the N / P ratio, shows an inhibitory effect over Oligofectamine at N / P = 10, and an effect over Lipofectamine 2000 at N / P = 20. Indicated. On the other hand, the unquaternized product with a small amount of intracellular siRNA introduced showed the maximum gene expression suppression effect at N / P = 3, and its value was slightly superior to Oligofectamine. That is, a quaternized cross-linked polymer having a higher intracellular siRNA introduction amount showed a higher gene expression suppression effect.
細胞に対する毒性評価
この実施例では、本発明に従う四級化架橋ポリマーと未四級化体や未架橋体の細胞毒性との比較に関して示す。
Toxicity assessment for cells This example shows the comparison of quaternized crosslinked polymers according to the present invention with the cytotoxicity of unquaternized and uncrosslinked forms.
９６穴ポリスチレン製細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に、人肝癌細胞（ＨｕＨ−７細胞）を１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、２４時間培養した後、四級化高分子架橋体（四級化率１００％）、未四級化体を所定量添加し１０％血清存在下で４８時間接触させた。その後、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同人堂社製）を１０μＬずつ各ウェルに添加し、３７度で１時間静置後マルチウェルプレートリーダーにて吸光度測定を行い、未処理細胞の細胞生存率を１００％としたときの細胞生存率を算出した（ｎ＝６）。さらに比較対象として、市販のカチオン性ポリマーであるＢ−ＰＥＩおよび、実施例１に従い合成した架橋剤未添加のＰＥＧとＰＤＥＡＥＭＡから成る未架橋ポリマーに対しても同様の実験を行った。細胞生存率が５０％となる濃度（ＩＣ５０）を各試料に対して求めたところ、四級化高分子架橋体、未四級化高分子架橋体、未架橋ポリマー、Ｂ−ＰＥＩの順でＩＣ５０値の上昇が確認でき、ＩＣ５０値はそれぞれ９５．７μｇ／ｍＬ、１８．４μｇ／ｍＬ、６．４μｇ／ｍＬ、３．１μｇ／ｍＬとなった（図６）。すなわち、四級化処理を施した高分子架橋体は細胞内へのｓｉＲＮＡの導入に優れるだけではなく、細胞毒性も優位に低減されていることが確認された。未四級化高分子架橋体と未架橋ポリマーの細胞毒性を比較した場合、架橋構造の効果によりその細胞毒性が低減されることが認められるため、四級化高分子架橋体の低毒性は架橋構造ならびに四級化アミノ基の両者の寄与により達成されたと推測される。 A 96-well polystyrene cell culture plate (Falcon) was seeded with human hepatoma cells (HuH-7 cells) at 10,000 cells / well, cultured for 24 hours, and then quaternized polymer cross-linked product (quaternization rate). 100%), a predetermined amount of non-quaternized compound was added, and contacted in the presence of 10% serum for 48 hours. Thereafter, 10 μL of Cell Counting Kit-8 (manufactured by Dojindo) was added to each well, allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour, and then subjected to absorbance measurement with a multi-well plate reader. The cell viability when calculated as% was calculated (n = 6). For comparison, the same experiment was conducted for B-PEI, which is a commercially available cationic polymer, and an uncrosslinked polymer composed of PEG and PDEAEMA without addition of a crosslinking agent synthesized according to Example 1. When the concentration (IC50) at which the cell viability was 50% was determined for each sample, IC50 was obtained in the order of quaternized polymer crosslinked product, non-quaternized polymer crosslinked product, uncrosslinked polymer, and B-PEI. An increase in the value could be confirmed, and the IC50 values were 95.7 μg / mL, 18.4 μg / mL, 6.4 μg / mL, and 3.1 μg / mL, respectively (FIG. 6). That is, it was confirmed that the crosslinked polymer subjected to the quaternization treatment is not only excellent in introducing siRNA into cells but also significantly reduced in cytotoxicity. When comparing the cytotoxicity of an unquaternized polymer crosslinked product and an uncrosslinked polymer, it is recognized that the cytotoxicity is reduced due to the effect of the crosslinked structure. It is speculated that this was achieved by the contribution of both the structure and the quaternized amino group.
Claims (7)
（ａ）式Ｉ：
Ｒａは水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、
Ｌ１はメチレン基またはカルボニル基を表し、
Ｌ２はカルボニル基、Ｃ１−３アルキレン基またはＣ１−３アルキルフェニレン基を表すか、あるいは
ｎは２〜１０，０００の整数であり、そして
ｐは１〜５の整数である、
で表されるポリ（エチレングリコール）マクロモノマーと、
（ｂ）式ＩＩ：
で表されるコモノマーと、
（ｃ）２個または３個以上の重合性不飽和基を有する架橋剤、
を含んでなるモノマーの共重合により得られ、そして上記式（ＩＩ）の第三級アミン部分の少なくとも１０％がＣ１−６アルキル基もしくはハロゲン原子により１以上置換されていてもよいフェニル置換もしくは未置換Ｃ１−６アルキル基またはアリル基により四級化されており、かつ、
精製水中に分散させて動的光散乱粒子解析（ＤＬＳ）を行った場合に平均粒径が３０ｎｍ〜１０μｍの範囲にある、上記複合体。 A polymer fine particle derived from a crosslinked polymer having a main chain formed from an ethylenically unsaturated polymerizable group and having a tertiary amine moiety quaternized in a side chain, and a nucleic acid molecule complex, Polymer fine particles
(A) Formula I:
R a represents a hydrogen atom or a C 1-6 alkyl group,
L 1 represents a methylene group or a carbonyl group,
L 2 represents a carbonyl group, a C 1-3 alkylene group or a C 1-3 alkylphenylene group, or
n is an integer from 2 to 10,000, and p is an integer from 1 to 5,
A poly (ethylene glycol) macromonomer represented by:
(B) Formula II:
A comonomer represented by
(C) a crosslinking agent having two or more polymerizable unsaturated groups,
Obtained by copolymerization of monomers comprising, and the formula (II) tertiary amine moieties of at least 10% C 1-6 alkyl group or one or more phenyl optionally substituted substituted or by halogen atoms Quaternized with an unsubstituted C 1-6 alkyl group or an allyl group, and
The said composite_body | complex which has an average particle diameter in the range of 30 nm-10 micrometers, when it disperses in refined water and a dynamic light-scattering particle analysis (DLS) is performed.
で表される、請求項１記載の複合体。 The crosslinking agent is of formula III
The composite according to claim 1, represented by:
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