JP5303981B2 - DNA methylation measurement method - Google Patents

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Abstract

Disclosed is are: a method for measuring the content of methylated DNA in a DNA region of interest in the genomic DNA contained in a organism-derived sample; and others.

Description

本発明は、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法等に関する。   The present invention relates to a method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region of genomic DNA contained in a biological specimen.

生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるDNAのメチル化状態を評価するための方法としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法が存在している(例えば、非特許文献1及び2参照)。
当該測定方法では、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、目的とするDNA領域を含むDNAを抽出する必要がある。当該抽出方法としては、例えば、ゲル濾過、シリカ支持体、有機溶媒等による抽出方法等が知られているが、いずれの抽出方法も操作が煩雑である。
次いで、抽出されたDNAの目的領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法としては、例えば、(1)亜硫酸塩等を用いて当該DNAを修飾した後、DNAポリメラーゼによるDNA合成の連鎖反応(Polymerase Chain Reaction;以下、PCRと記すこともある。)に供することにより目的領域を増幅する方法、(2)メチル化感受性制限酵素を用いて当該DNAを消化した後、PCRに供することにより、目的領域を増幅する方法等を挙げることができる。
As a method for evaluating the methylation state of DNA in the target DNA region of the genomic DNA contained in the biological specimen, for example, in the target DNA region of the genomic DNA contained in the biological specimen There are methods for measuring the content of methylated DNA (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
In this measurement method, first, it is necessary to extract DNA containing a target DNA region from a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen. As the extraction method, for example, gel filtration, a silica support, an extraction method using an organic solvent, or the like is known, but any of the extraction methods is complicated.
Next, as a method for measuring the content of methylated DNA in the target region of the extracted DNA, for example, (1) After modifying the DNA with sulfite or the like, the DNA synthesis chain reaction by DNA polymerase (Polymerase Chain Reaction; hereinafter sometimes referred to as PCR) to amplify the target region, (2) by digesting the DNA with a methylation sensitive restriction enzyme and then subjecting it to PCR, A method for amplifying a target region can be exemplified.

Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M., High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7.Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M., High sensitivity mapping of methylated cytosines.Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11; 22 (15): 2990-7. Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y, Okonogi H, Tatematsu M, Sugimura T, Nagao M., Establishment of methylation-sensitive- representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors.Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6):2284-9.Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y, Okonogi H, Tatematsu M, Sugimura T, Nagao M., Establishment of methylation-sensitive- representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors.Proc Natl Acad Sci US A. 1997 Mar 18; 94 (6): 2284-9.

上記のいずれの方法とも、PCRに供するまでの操作(具体的には例えば、メチル化検出のためのDNAの修飾及びその後の生成物の精製等)に非常に時間と労力とを要し、さらに、PCRが増幅しようとする目的領域のDNAの塩基配列に対して相補的な1組のオリゴヌクレオチドプライマー(以下、プライマー対と記すこともある。)を用いて液相中にて行われるために、増幅されたDNA断片を精製した後、これをPCRのための反応容器へ移し換える操作、また目的領域を増幅させるための前記のプライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、増幅しようとする目的領域のDNAの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、しかもその操作は極めて繁雑である。
このように、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。
In any of the methods described above, operations (specifically, for example, modification of DNA for detection of methylation and subsequent purification of the product, etc.) are very time consuming and labor intensive before being subjected to PCR. Because PCR is carried out in a liquid phase using a pair of oligonucleotide primers complementary to the base sequence of the DNA of the target region to be amplified (hereinafter also referred to as a primer pair). An operation for purifying the amplified DNA fragment and transferring it to a reaction vessel for PCR, an operation for adding a reaction reagent containing the primer pair for amplifying a target region to the reaction system, etc. Is also necessary. Furthermore, in order to confirm the amplification of the DNA of the target region to be amplified, it is necessary to use it for an analytical operation such as electrophoresis, and the operation is extremely complicated.
As described above, a series of operations for measuring the content of methylated DNA in the target DNA region possessed by the genomic DNA contained in the biological specimen had a lot of trouble.

本発明者らは、かかる状況下鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
1.生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを取得し、該一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させて一本鎖DNAを選択する第一工程、
(2)第一工程で選択された一本鎖DNAを少なくとも1種類の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理する第二工程、及び、
(3)下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖DNA(前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpGを含まない一本鎖DNA)を、前記の固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA(正鎖)にする工程(第三(前A)第三(前A)工程)と、
第三(前A)工程で分離された一本鎖状態であるDNA(正鎖)を鋳型として、当該一本鎖状態であるDNA(正鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(正鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)を有する伸長プライマー(フォーワード用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNA(正鎖)を二本鎖DNAとして伸長形成させる工程(第三(前B)工程)と、
第三(前B)工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)に一旦分離する工程(第三(前C)工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−Aと、
(b)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−Bとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法(以下、本発明測定方法と記すこともある。);
2.請求項1記載の第三工程のメチル化DNA抗体がメチルシトシン抗体である、請求項1記載の、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法;
3.生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法;
4.生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法;
5.生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法;
6.生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、当該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかの請求項記載の方法;
7.生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、少なくとも1種類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかの請求項記載の方法;
8.生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、予め精製されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜7のいずれかの請求項記載の方法;
9.少なくとも1種類の1本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする請求項1〜8のいずれかの請求項記載の方法;
10.少なくとも1種類の1本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHhaIであることを特徴とする請求項1〜9のいずれかの請求項記載の方法;
11.第二工程において一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する前項1〜10のいずれか一項に記載の方法;
12. 第一工程が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、メチル化された一本鎖DNAを分離する第一(A)工程と、
第一(A)工程で分離された一本鎖DNAと固定化メチル化DNA抗体とを結合させる第一(B)工程と、からなり、
第一(A)工程でメチル化された一本鎖DNAを分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する前項1〜11のいずれか一項に記載の方法;
等を提供するものである。
As a result of intensive studies under such circumstances, the present inventors have reached the present invention.
That is, the present invention
1. A method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region possessed by genomic DNA contained in a biological specimen,
(1) Obtaining methylated single-stranded DNA from a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological specimen, and binding the single-stranded DNA with an immobilized methylated DNA antibody A first step of selecting DNA,
(2) a second step of digesting the single-stranded DNA selected in the first step with a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA; and
(3) As a pre-process of each of the following steps, single-stranded DNA that is an undigested product obtained in the second step (the methylation state is present at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA). A single-stranded DNA containing no CpG is separated from the immobilized methylated DNA antibody into a single-stranded DNA (positive strand) (third (previous A) third (previous A) ) Process)
Using the DNA (positive strand) in the single-stranded state separated in the third (previous A) step as a template, the partial base sequence (positive strand) of the base sequence of the DNA (positive strand) in the single-stranded state And a base sequence (complementary to a partial base sequence (positive strand) located further 3 ′ end than the 3 ′ end of the base sequence (positive strand) of the target DNA region ( The extension primer (forward primer) having a negative strand) is used as an extension primer, and the extension primer is extended once to extend the single-stranded DNA (positive strand) as a double-stranded DNA. A step (third (previous B) step)
The double-stranded DNA extended and formed in the third (previous B) step contains a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and a base sequence that is complementary to the target DNA region. A single-stranded DNA (positive strand) having a step (third (previous C) step) of once separating into single-stranded DNA (negative strand) and including (a) the generated target DNA region as this step ) As a template, the forward primer as an extension primer, and the extension primer is extended once, thereby extending the single-stranded DNA containing the target DNA region as a double-stranded DNA. A and
(B) Using the generated single-stranded DNA (negative strand) containing a base sequence complementary to the target DNA region as a template, the base sequence complementary to the target DNA region is A base sequence that is a partial base sequence (negative strand) of the base sequence of the contained single-stranded DNA (negative strand) and that is complementary to the base sequence (positive strand) of the target DNA region An extension primer (reverse primer) having a base sequence (positive strand) that is complementary to the partial base sequence (negative strand) located further 3 'end than the 3' end of (negative strand) As the step-B, the extension primer is extended once to form a single-stranded DNA containing the target DNA region as a double-stranded DNA.
Furthermore, each of these steps was once methylated in the target DNA region by repeating the extension-formed double-stranded DNA obtained in each of the steps once after separating it into a single-stranded state. A method comprising a third step of amplifying the DNA to a detectable amount and quantifying the amount of the amplified DNA (hereinafter sometimes referred to as the measurement method of the present invention);
2. The content of methylated DNA in the target DNA region of the genomic DNA contained in the biological specimen according to claim 1, wherein the methylated DNA antibody in the third step according to claim 1 is a methylcytosine antibody. How to measure;
3. The method according to claim 1, wherein the biological specimen is mammalian serum or plasma;
4). The method according to any one of claims 1 to 2, wherein the biological specimen is mammalian blood or body fluid.
5. The method according to any one of claims 1 to 2, wherein the biological specimen is a cell lysate or a tissue lysate;
6). A DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is a DNA sample that has been previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site. The method according to any one of claims 1 to 5;
7). The DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen is a DNA sample obtained by digestion with at least one methylation sensitive restriction enzyme. Described method;
8). The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the DNA sample derived from genomic DNA contained in the biological specimen is a DNA sample purified in advance;
9. The methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA is a restriction enzyme having a recognition cleavage site in a target DNA region of genomic DNA contained in a biological sample. A method according to any one of claims 1 to 8;
10. The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA is HhaI which is a methylation sensitive restriction enzyme;
11. The method according to any one of the preceding items 1 to 10, wherein the third step is performed without performing a digestion treatment with a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA in the second step;
12 A first step (A) for separating methylated single-stranded DNA from a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen;
The first (B) step of binding the single-stranded DNA separated in the first (A) step and the immobilized methylated DNA antibody,
The method according to any one of 1 to 11 above, wherein a counter oligonucleotide is added when separating the methylated single-stranded DNA in the first step (A);
Etc. are provided.

本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。   According to the present invention, it is possible to provide a method for simply measuring the content of methylated DNA in a target DNA region possessed by genomic DNA contained in a biological specimen.

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液(ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。)若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物(尿や乳汁等)等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムDNAをあげることができる。また当該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料もあげられ、この場合には、本発明測定方法における「ゲノムDNA」とは、微生物、ウイルスのゲノムDNAを意味するものである。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明測定方法の利用が期待できる。
ゲノムDNAを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のDNA抽出用キット等を用いてDNAを抽出すればよい。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離DNA(胃癌細胞等の癌細胞由来のDNAが含まれる)を分析すると、血球由来のDNAを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のDNAを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
The present invention is described in detail below.
Examples of the “biological specimen” in the present invention include, for example, a cell lysate, a tissue lysate (herein, tissue has a broad meaning including blood, lymph nodes, etc.), or in mammals, plasma. And biological samples such as body fluids such as serum and lymph, body secretions (such as urine and milk), and genomic DNA obtained by extraction from these biological samples. Examples of the biological specimen include samples derived from microorganisms, viruses, etc. In this case, “genomic DNA” in the measurement method of the present invention means genomic DNA of microorganisms and viruses. .
When the mammal-derived specimen is blood, it can be expected that the measurement method of the present invention will be used in periodic health examinations and simple tests.
In order to obtain genomic DNA from a sample derived from a mammal, for example, DNA may be extracted using a commercially available DNA extraction kit or the like.
Incidentally, when blood is used as a specimen, plasma or serum is prepared from blood according to a normal method, and the prepared plasma or serum is used as a specimen, and free DNA contained therein (cancer cells such as gastric cancer cells). Analysis of cancer cells such as gastric cancer cells, avoiding blood cell-derived DNA, and sensitivity for detecting cancer cells such as gastric cancer cells and tissues containing them Can be improved.

本発明における「メチル化されたDNA」とは、下記のようなDNAを意味するものである。通常、遺伝子(ゲノムDNA)を構成する塩基は4種類である。これらの塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、このようなDNAのメチル化修飾は、5’−CG−3’で示される塩基配列(Cはシトシンを表し、Gはグアニンを表す。以下、当該塩基配列を「CpG」と記すこともある。)中のシトシンに限られている。シトシンにおいてメチル化される部位は、その5位である。細胞分裂に先立つDNA複製に際して、複製直後は鋳型鎖の「CpG」中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の「CpG」中のシトシンもメチル化される。従って、DNAのメチル化の状態は、DNA複製後も、新しい2組のDNAにそのまま引き継がれることになる。このようなメチル化修飾により生じたDNAを意味するものである。
本発明における「CpG対」とは、CpGで示される塩基配列と、これに相補するCpGが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
The “methylated DNA” in the present invention means the following DNA. Usually, there are four types of bases constituting a gene (genomic DNA). Among these bases, the phenomenon that only cytosine is methylated is known, and such methylation modification of DNA is a base sequence represented by 5′-CG-3 ′ (C represents cytosine, G represents guanine.Hereinafter, the base sequence may be referred to as “CpG”.) The site that is methylated in cytosine is at position 5. During DNA replication prior to cell division, only cytosine in the template strand “CpG” is methylated immediately after replication, but the cytosine in the nascent strand “CpG” is also immediately activated by the action of the methyltransferase. Methylated. Therefore, the DNA methylation state is inherited as it is by two new sets of DNA even after DNA replication. It means DNA produced by such methylation modification.
The “CpG pair” in the present invention means a double-stranded oligonucleotide formed by binding a base sequence represented by CpG and CpG complementary thereto.

本発明における「目的とするDNA領域」(以下、目的領域と記すこともある。)は、当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べたいDNA領域であって、少なくとも1種類以上のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有するものであり、例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列中のシトシンを含むDNAの領域等を挙げることができる。   A “target DNA region” in the present invention (hereinafter sometimes referred to as a target region) is a DNA region to be examined for the presence or absence of methylation of cytosine contained in the region, and is at least one kind of methylation. It has a recognition site for a sensitive restriction enzyme, such as Lysyl oxidase, HRAS-like suppressor, bA305P22.2.1, Gamma filamin, HAND1, Homologue of RIKEN 2210016F16, FLJ32130, PPARG angiopoietin-related protein, Thrombomodulin, p53-responsive gene 2, Promoter region of useful protein genes such as Fibrillin2, Neurofilament 3, disintegrin and metalloproteinase domain 23, G protein-coupled receptor 7, G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor, Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2, etc. A salt represented by one or more CpGs present in the base sequence of the translation region or translation region (coding region) Examples thereof include a DNA region containing cytosine in the base sequence.

具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号1で示される塩基配列(Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。)が挙げられる。配列番号1で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン1の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号1で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号1で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号1で示される塩基配列において、塩基番号1539、1560、1574、1600、1623、1635、1644、1654、1661、1682、1686、1696、1717、1767、1774、1783、1785、1787、1795等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。   Specifically, for example, when the useful protein gene is a Lysyl oxidase gene, the nucleotide sequence represented by one or more CpGs present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) As an example, a base sequence of genomic DNA containing exon 1 of a human-derived Lysyl oxidase gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof can be mentioned, and more specifically, represented by SEQ ID NO: 1. And a base sequence (corresponding to the base sequence represented by base numbers 16001 to 18661 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF270645). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, the ATG codon encoding the amino terminal methionine of Lysyl oxidase protein derived from human is represented by base numbers 2031 to 2033, and the base sequence of exon 1 is the base number 1957-2661. Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, particularly cytosine in CpG present in the region where CpG is densely present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, In cancer cells such as gastric cancer cells, a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) is exhibited. More specifically, as cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, base numbers 1539, 1560, 1574, 1600, 1623, 1635, 1644, 1654, 1661, The cytosine which is a base number shown by 1682, 1686, 1696, 1717, 1767, 1774, 1783, 1785, 1787, 1795 etc. can be mentioned.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号2で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。)があげられる。配列番号2で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン1の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。配列番号2で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号2で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号2で示される塩基配列において、塩基番号1316、1341、1357、1359、1362、1374、1390、1399、1405、1409、1414、1416、1422、1428、1434、1449、1451、1454、1463、1469、1477、1479、1483、1488、1492、1494、1496、1498、1504、1510、1513、1518、1520等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is an HRAS-like suppressor gene, it is represented by one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the nucleotide sequence that can be mentioned include the nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived HRAS-like suppressor gene and the promoter region located 5 ′ upstream thereof. 2 (corresponding to the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 172001 to 173953 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AC068162). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, the base sequence of exon 1 of the human-derived HRAS-like suppressor gene is represented by base numbers 1743 to 1953. The cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, particularly the cytosine in CpG present in the region where CpG is densely present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, In cancer cells such as gastric cancer cells, a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) is exhibited. More specifically, as cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, base numbers 1316, 1341, 1357, 1359, 1362, 1374, 1390, 1399, 1405, 1409, 1414, 1416, 1422, 1428, 1434, 1449, 1451, 1454, 1463, 1469, 1477, 1479, 1483, 1488, 1492, 1494, 1496, 1498, 1504, 1510, 1513, 1518, 1520 etc. Cytosine, which is the base number to be generated.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号3で示される塩基配列(Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。)があげられる。配列番号3で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン1の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。配列番号3で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号3で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号3で示される塩基配列において、塩基番号329、335、337、351、363、373、405、424、427、446、465、472、486等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is the bA305P22.2.1 gene, it is represented by one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the nucleotide sequence include a nucleotide sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived bA305P22.2.1 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof, and more specifically, SEQ ID NO: 3 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 13001 to 13889 of the base sequence described in Genbank Accession No. AL121673). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the human-derived bA305P22.2.1 protein is represented by base numbers 849 to 851, and the base sequence of the exon 1 is a base sequence. Nos. 663-889. The cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, particularly the cytosine in CpG present in the region where CpG is densely present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, In cancer cells such as gastric cancer cells, a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) is exhibited. More specifically, as cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, base numbers 329, 335, 337, 351, 363, 373, 405, 424, 427, The cytosine which is a base number shown by 446, 465, 472, 486 etc. can be mention | raise | lifted.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号4で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号4で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン1の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。配列番号4で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号4で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号4で示される塩基配列において、塩基番号329、333、337、350、353、360、363、370、379、382、384、409、414、419、426、432、434、445、449、459、472、474、486、490、503、505等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is a Gamma filamin gene, it is represented by one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region, or translated region (coding region). Examples of the base sequence include a genomic DNA base sequence containing exon 1 of a human-derived Gamma filamin gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. The base sequence shown (corresponding to the complementary sequence of the base sequence shown by base numbers 63528 to 64390 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC074373). In the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, the ATG codon encoding the amino terminal methionine of human-derived Gamma filamin protein is shown in base numbers 572 to 574, and the base sequence of exon 1 is the base number 463-863. The cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, particularly the cytosine in CpG present in the region where CpG is densely present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 is, for example, In cancer cells such as gastric cancer cells, a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) is exhibited. More specifically, as cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, base numbers 329, 333, 337, 350, 353, 360, 363, 370, 379, Examples thereof include cytosine having base numbers represented by 382, 384, 409, 414, 419, 426, 432, 434, 445, 449, 459, 472, 474, 486, 490, 503, 505, and the like.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号5で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号5で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン1の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号5で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号5で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号5で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is a HAND1 gene, one or more bases represented by one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the sequence include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of human-derived HAND1 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof, and more specifically, represented by SEQ ID NO: 5. And a base sequence (corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 24303 to 26500 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC026688). In the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the human-derived HAND1 protein is shown in base numbers 1656 to 1658, and the base sequence of the exon 1 is base number 1400. ~ 2198. The cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, particularly the cytosine in CpG present in the region where CpG is densely present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 is, for example, In cancer cells such as gastric cancer cells, a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) is exhibited. More specifically, as cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, base numbers 1153, 1160, 1178, 1187, 1193, 1218, 1232, 1266, 1272, Examples include cytosine having base numbers represented by 1292, 1305, 1307, 1316, 1356, 1377, 1399, 1401, 1422, 1434 and the like.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号6で示される塩基配列(Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。)があげられる。配列番号6で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン1の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。配列番号6で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号6で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号6で示される塩基配列において、塩基番号1172、1175、1180、1183、1189、1204、1209、1267、1271、1278、1281、1313、1319、1332、1334、1338、1346、1352、1358、1366、1378、1392、1402、1433、1436、1438等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   Further, specifically, for example, when the useful protein gene is a homologue of RIKEN 2210016F16 gene, one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the base sequence shown include a base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived Homologue of RIKEN 2210016F16 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof, and more specifically, And the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 (corresponding to the complementary nucleotide sequence of the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 157056 to 159000 of the nucleotide sequence described in Genbank Accession No. AL354733). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, the base sequence of exon 1 of the human-derived homologue of RIKEN 2210016F16 protein is represented by base numbers 1392 to 1945. The cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, particularly the cytosine in CpG present in the region where CpG is densely present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 is, for example, In cancer cells such as gastric cancer cells, a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) is exhibited. More specifically, as cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, base numbers 1172, 1175, 1180, 1183, 1189, 1204, 1209, 1267, 1271, Examples include cytosine having base numbers represented by 1278, 1281, 1313, 1319, 1332, 1334, 1338, 1346, 1352, 1358, 1366, 1378, 1392, 1402, 1433, 1436, 1438, and the like.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号7で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。)があげられる。配列番号7で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン1と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。配列番号7で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号7で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号7で示される塩基配列において、塩基番号1714、1716、1749、1753、1762、1795、1814、1894、1911、1915、1925、1940、1955、1968等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is the FLJ32130 gene, one or more bases represented by one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the sequence include a genomic DNA base sequence containing exon 1 of human-derived FLJ32130 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof, and more specifically, represented by SEQ ID NO: 7. Examples thereof include base sequences (corresponding to complementary base sequences of base sequences represented by base numbers 1 to 2379 of base sequences described in Genbank Accession No. AC002310). In the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, the ATG codon encoding the methionine at the amino acid terminal of human-derived FLJ32130 protein is shown in base numbers 2136 to 2138, and the base sequence considered to be exon 1 is a base sequence The number 2136-2379 is shown. The cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, particularly the cytosine in CpG present in the region where CpG is densely present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, In cancer cells such as gastric cancer cells, a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) is exhibited. More specifically, as cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 7, base numbers 1714, 1716, 1749, 1753, 1762, 1795, 1814, 1894, 1911, Examples thereof include cytosine having base numbers represented by 1915, 1925, 1940, 1955, 1968 and the like.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号8で示される塩基配列があげられる。配列番号8で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン1の5’側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号8で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号8で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号8で示される塩基配列において、塩基番号35、43、51、54、75、85、107、127、129、143、184、194、223、227、236、251、258等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is a PPARG angiopoietin-related protein gene, one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). The base sequence represented by can include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of human-derived PPARG angiopoietin-related protein gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof, and more specifically Is the base sequence represented by SEQ ID NO: 8. In the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, the ATG codon encoding the amino terminal methionine of the human-derived PPARG angiopoietin-related protein protein is represented by base numbers 717 to 719, and the 5 ′ side of exon 1 above. The base sequence of the portion is shown in base numbers 1957 to 2661. The cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, particularly the cytosine in CpG present in the region where CpG is densely present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, In cancer cells such as gastric cancer cells, a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) is exhibited. More specifically, as cytosine having a high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 8, base numbers 35, 43, 51, 54, 75, 85, 107, 127, 129, Examples thereof include cytosine having base numbers represented by 143, 184, 194, 223, 227, 236, 251 and 258.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号9で示される塩基配列(Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。)があげられる。配列番号9で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン1の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。配列番号9で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号9で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号9で示される塩基配列において、塩基番号1539、1551、1571、1579、1581、1585、1595、1598、1601、1621、1632、1638、1645、1648、1665、1667、1680、1698、1710、1724、1726、1756等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   Further, specifically, for example, when the useful protein gene is a Thrombomodulin gene, one or more bases represented by one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the sequence include a genomic DNA base sequence containing exon 1 of a human-derived Thrombomodulin gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, the sequence is represented by SEQ ID NO: 9. And a base sequence (corresponding to the base sequence represented by base numbers 1 to 6096 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF495471). In the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, the ATG codon encoding the amino terminal methionine of human-derived Thrombomodulin protein is shown in base numbers 2590 to 2592. The base sequence of exon 1 is base number 2048. ~ 6096. The cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, particularly the cytosine in CpG present in the region where CpG is densely present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 is, for example, In cancer cells such as gastric cancer cells, a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) is exhibited. More specifically, as cytosine having high methylation frequency in gastric cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, base numbers 1539, 1551, 1571, 1579, 1581, 1585, 1595, 1598, 1601, Examples include cytosine having base numbers represented by 1621, 1632, 1638, 1645, 1648, 1665, 1667, 1680, 1698, 1710, 1724, 1726, 1756, and the like.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号10で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号10で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン1の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。配列番号10で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号10で示される塩基配列において、塩基番号1282、1284、1301、1308、1315、1319、1349、1351、1357、1361、1365、1378、1383等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is p53-responsive gene 2 gene, one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the base sequence shown by can include a genomic DNA base sequence containing exon 1 of human-derived p53-responsive gene 2 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof, and more specifically, Is a base sequence represented by SEQ ID NO: 10 (corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 113501 to 116000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009471). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, the base sequence of exon 1 of human-derived p53-responsive gene 2 gene is represented by base numbers 1558 to 1808. Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as pancreatic cancer cells. . More specifically, as cytosine having high methylation frequency in pancreatic cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 10, base numbers 1282, 1284, 1301, 1308, 1315, 1319, 1349, 1351, 1357 , 1361, 1365, 1378, 1383, etc. can be mentioned cytosine.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号11で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号11で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン1の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。配列番号11で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号11で示される塩基配列において、塩基番号679、687、690、699、746、773、777、783、795、799、812、823、830、834、843等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is Fibrillin2 gene, one or more bases represented by CpG present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the sequence include a base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the Fibrillin 2 gene derived from human and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, the sequence is represented by SEQ ID NO: 11. And a base sequence (corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 118801 to 121000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC113387). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, the base sequence of exon 1 of the human-derived Fibrillin2 gene is represented by base numbers 1091 to 1345. Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as pancreatic cancer cells. . More specifically, as cytosine having high methylation frequency in pancreatic cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, base numbers 679, 687, 690, 699, 746, 773, 777, 783, 795 , 799, 812, 823, 830, 834, 843, and the like.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号12で示される塩基配列(Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号12で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン1の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。配列番号12で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号12で示される塩基配列において、塩基番号428、432、443、451、471、475、482、491、499、503、506、514、519、532、541、544、546、563、566、572、580等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is a Neurofilament 3 gene, the base represented by one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the sequence include a base sequence of genomic DNA containing exon 1 of a human-derived Neurofilament 3 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof, and more specifically, represented by SEQ ID NO: 12. And a base sequence (corresponding to a complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 28001 to 30000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AF106564). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, the base sequence of exon 1 of the human-derived Neurofilament 3 gene is represented by base numbers 614 to 1694. Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 exhibits high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as pancreatic cancer cells. . More specifically, as cytosine having high methylation frequency in pancreatic cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, base numbers 428, 432, 443, 451, 471, 475, 482, 491, 499 , 503, 506, 514, 519, 532, 541, 544, 546, 563, 566, 572, 580, and the like, can be mentioned cytosine.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号13で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。)があげられる。配列番号13で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン1の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。配列番号13で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号13で示される塩基配列において、塩基番号998、1003、1007、1011、1016、1018、1020、1026、1028、1031、1035、1041、1043、1045、1051、1053、1056、1060、1066、1068、1070、1073、1093、1096、1106、1112、1120、1124、1126等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is disintegrin and metalloproteinase domain 23 gene, one or more CpGs present in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). The base sequence represented by can include a base sequence of genomic DNA containing exon 1 of human-derived disintegrin and metalloproteinase domain 23 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof, and more specifically Is the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 21001 to 23300 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009225). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, the base sequence of exon 1 of the human-derived disintegrin and metalloproteinase domain 23 gene is represented by base numbers 1194 to 1630. Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 exhibits high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as pancreatic cancer cells. . More specifically, as cytosine having high methylation frequency in pancreatic cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 13, base numbers 998, 1003, 1007, 1011, 1016, 1018, 1020, 1026, 1028 , 1031, 1035, 1041, 1043, 1045, 1051, 1053, 1056, 1060, 1066, 1068, 1070, 1073, 1093, 1096, 1106, 1112, 1120, 1124, 1126 etc. I can give you.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号14で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。)があげられる。配列番号14で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン1の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。配列番号14で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号14で示される塩基配列において、塩基番号1480、1482、1485、1496、1513、1526、1542、1560、1564、1568、1570、1580、1590、1603、1613、1620等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   Also, specifically, for example, when the useful protein gene is a G protein-coupled receptor 7 gene, one or more existing in the base sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) Examples of the base sequence represented by CpG include a base sequence of genomic DNA containing exon 1 of a human-derived G protein-coupled receptor 7 gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. Specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 (corresponding to the base sequence represented by base numbers 75001 to 78000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC009800) can be mentioned. In the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, the base sequence of exon 1 of human-derived G protein-coupled receptor 7 gene is represented by base numbers 1666 to 2652. Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 exhibits high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as pancreatic cancer cells. . More specifically, as cytosine having high methylation frequency in pancreatic cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, base numbers 1480, 1482, 1485, 1496, 1513, 1526, 1542, 1560, 1564 , 1568, 1570, 1580, 1590, 1603, 1613, 1620, etc.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号15で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号15で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン1の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。配列番号15で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号15で示される塩基配列において、塩基番号470、472、490、497、504、506、509、514、522、540、543、552、566、582、597、610、612等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   Specifically, for example, when the useful protein gene is a G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor gene, the base of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region) of the promoter region The base sequence represented by one or more CpGs present in the sequence includes exon 1 of human-derived G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor gene and a promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, the base sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 (the base sequence represented by base numbers 5701 to 60000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC008971) can be mentioned. Corresponding to a complementary sequence). In the base sequence represented by SEQ ID NO: 15, the base sequence of exon 1 of human-derived G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor gene is represented by base numbers 776 to 2632. Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as pancreatic cancer cells. . More specifically, as cytosine with high methylation frequency in pancreatic cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 15, base numbers 470, 472, 490, 497, 504, 506, 509, 514, 522 , 540, 543, 552, 566, 582, 597, 610, 612 and the like.

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号16で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号16で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン1の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。配列番号16で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号16で示される塩基配列において、塩基番号1002、1010、1019、1021、1051、1056、1061、1063、1080、1099、1110、1139、1141、1164、1169、1184等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。   More specifically, for example, when the useful protein gene is the Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 gene, it is present in the nucleotide sequence of the promoter region, untranslated region or translated region (coding region). Examples of the base sequence represented by one or more CpG include the base sequence of genomic DNA containing exon 1 of the human-derived Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 gene and the promoter region located 5 ′ upstream thereof. More specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 (corresponding to the complementary sequence of the base sequence represented by base numbers 78801 to 81000 of the base sequence described in Genbank Accession No. AC026802) Can be given. In the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16, the nucleotide sequence of exon 1 of the human-derived Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2 gene is represented by nucleotide numbers 1479 to 1804. Cytosine in the base sequence represented by CpG present in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 exhibits a high methylation frequency (ie, hypermethylation state) in cancer cells such as pancreatic cancer cells. . More specifically, as cytosine having high methylation frequency in pancreatic cancer cells, for example, in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, base numbers 1002, 1010, 1019, 1021, 1051, 1056, 1061, 1063, 1080 , 1099, 1110, 1139, 1141, 1164, 1169, 1184, etc.

本発明測定方法における「メチル化DNA抗体」とは、DNA中のメチル化された塩基を抗原として結合する抗体を意味する。具体的には、メチルシトシン抗体であり、一本鎖DNA中の5位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることができる。また、市販されているメチル化DNA抗体であっても、本特許記載のメチル化状態のDNAを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。
メチル化DNA抗体は、メチル化された塩基、メチル化DNA等を抗原として、通常の方法により作成できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、5−メチルシチジン、5−メチルシトシン、あるいは、5−メチルシトシンを含むDNA等を抗原として作製された抗体からDNA中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。
動物に抗原を免疫して得られる抗体としては、精製した抗原を免疫した後、IgG画分の抗体(ポリクローナル抗体)を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体(モノクローナル抗体)を利用する方法がある。本特許ではメチル化DNA、あるいはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法をあげることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞(B細胞)と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体(モノクローナル抗体)を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、5−メチルシチジン、5−メチルシトシン、又は、5−メチルシトシンを含むDNA等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、5−メチルシチジン、5−メチルシトシン、又は、5−メチルシトシンを含むDNA等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。また、アジュバント溶液(例えば、流動パラフィンとAracel Aを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの)と抗原をよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。あるいは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下あるいは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。尚、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内あるいは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。
最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばHGPRT欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞(B細胞)と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス(HVJ)、ポリエチレングリコール(PEG)を用いる方法などがあげられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。
細胞融合操作の後、HAT培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法(RIA)、酵素免疫定量法(ELISA)などがあげられる。
The “methylated DNA antibody” in the measurement method of the present invention means an antibody that binds with a methylated base in DNA as an antigen. A specific example is a methylcytosine antibody, which has the property of recognizing and binding to cytosine methylated at the 5-position in single-stranded DNA. Further, even a commercially available methylated DNA antibody may be an antibody that can specifically recognize and specifically bind to the methylated DNA described in this patent.
A methylated DNA antibody can be prepared by a conventional method using a methylated base, methylated DNA or the like as an antigen. Specifically, in order to prepare a methylcytosine antibody, specificity from 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or an antibody prepared using DNA containing 5-methylcytosine as an antigen to methylcytosine in DNA It can produce by selecting as a parameter | index a simple coupling | bonding.
As an antibody obtained by immunizing an animal with an antigen, a method using an antibody (polyclonal antibody) of an IgG fraction after immunization with a purified antigen and an antibody (monoclonal antibody) producing a single clone are used. There is a way to do it. In this patent, it is desirable that the antibody is capable of specifically recognizing methylated DNA or methylcytosine, and therefore it is desirable to use a monoclonal antibody.
As a method for producing a monoclonal antibody, a cell fusion method can be mentioned. For example, in the cell fusion method, a hybridoma is prepared by cell fusion of a spleen cell (B cell) derived from an immunized mouse and a myeloma cell, an antibody produced by the hybridoma is selected, and a methylcytosine antibody (monoclonal antibody) is selected. Can be produced. When producing a monoclonal antibody by the cell fusion method, it is not necessary to purify the antigen. For example, 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or a mixture of DNA containing 5-methylcytosine is used as an antigen for immunization. It can be administered to the animals used. As an administration method, 5-methylcytidine, 5-methylcytosine, or DNA containing 5-methylcytosine is directly administered to a mouse producing an antibody. When it is difficult to produce an antibody, immunization may be performed by binding an antigen to a support. In addition, by mixing well with an adjuvant solution (for example, liquid paraffin and Aracel A mixed with Mycobacterium tuberculosis killed as an adjuvant) and immunizing by incorporating into a liposome, the immunity of the antigen Can be raised. Alternatively, add an equal amount of an antigen-containing solution and an adjuvant solution to make it sufficiently emulsion, then inject it subcutaneously or intraperitoneally into mice, or mix well with alum water and add pertussis bacteria as an adjuvant There is a way to do it. It is also possible to boost the mouse intraperitoneally or intravenously after an appropriate period after the initial immunization. When the amount of the antigen is small, a solution in which the antigen is suspended may be directly injected into the mouse spleen for immunization.
A few days after the final immunization, the spleen is removed and the adipose tissue is removed, and then a spleen cell suspension is prepared. The spleen cells are fused with, for example, HGPRT-deficient myeloma cells to produce a hybridoma. Any cell fusion agent may be used as long as it can efficiently fuse spleen cells (B cells) and myeloma cells. Examples thereof include a method using Sendai virus (HVJ) and polyethylene glycol (PEG). Further, cell fusion may be performed by a method using a high voltage pulse.
After the cell fusion operation, the cells are cultured in HAT medium, a hybridoma clone in which spleen cells and myeloma cells are fused is selected, and the cells are allowed to grow until screening becomes possible. An antigen-antibody reaction system can be used for an antibody detection method or antibody titer measurement method for selecting a hybridoma producing the target antibody. Specific examples of antibody measurement methods for soluble antigens include radioisotope immunoassay (RIA) and enzyme immunoassay (ELISA).

一本鎖DNA中に存在するCpGが少なくとも一箇所以上メチル化されていれば抗メチル化抗体と結合することができる。従って、本発明測定方法における「メチル化された一本鎖DNA」とは、一本鎖DNA中に存在するCpGが少なくとも一箇所以上メチル化されている一本鎖DNAを意味しており、一本鎖DNA中に存在するCpGの全てがメチル化されている一本鎖DNAに限った意味ではない。   If CpG present in the single-stranded DNA is methylated at least at one site, it can bind to the anti-methylated antibody. Therefore, the “methylated single-stranded DNA” in the measurement method of the present invention means a single-stranded DNA in which CpG present in the single-stranded DNA is methylated in at least one site. This is not limited to single-stranded DNA in which all CpGs present in the double-stranded DNA are methylated.

本発明における「(目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、)増幅されたDNAの量」とは、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的領域におけるメチル化されたDNAの増幅後の量そのもの、即ち、本発明測定方法の第三工程で求めた量を意味するものである。例えば、生物由来検体が1mLの血清であった場合には、血清1mL中に含まれる前記のメチル化されたDNAに基づいて増幅されたDNAの量を意味する。   In the present invention, “the amount of amplified DNA (amplified to a detectable amount of methylated DNA in the target DNA region)” refers to the purpose of genomic DNA contained in a biological sample. This means the amount of methylated DNA in the region after amplification itself, that is, the amount determined in the third step of the measurement method of the present invention. For example, when the biological specimen is 1 mL of serum, it means the amount of DNA amplified based on the methylated DNA contained in 1 mL of serum.

本発明における「前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも1つ以上のアンメチル状態のCpGを含む一本鎖DNA」とは、前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも1つ以上のCpGにおけるシトシンがメチル化されていないシトシンである一本鎖DNAを意味するものである。また「前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpGを含まない一本鎖DNA」とは、一本鎖DNAにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している全てのCpGにおけるシトシンがメチル化されている一本鎖DNAを意味するものである。   In the present invention, the “single-stranded DNA containing at least one CpG in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA” includes the recognition site of the restriction enzyme. It means single-stranded DNA in which cytosine in at least one or more existing CpGs is unmethylated cytosine. The “single-stranded DNA containing no CpG in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA” is present in the recognition site of the restriction enzyme in the single-stranded DNA. It means single-stranded DNA in which cytosine in all CpGs is methylated.

「相補性によって結合(相補的な(塩基対合による)結合)」とは、塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖DNAを形成することを意味する。例えば、DNAを構成する二本鎖の各々一本鎖DNAを構成する塩基が、プリンとピリミジンの塩基対合により二本鎖を形成することであり、より具体的には、複数の連続した、チミンとシトシン、グアニンとアデニンの水素結合による塩基結合により、二本鎖DNAを形成することを意味する。相補性によって結合することを「相補的な結合」と呼ぶこともある。「相補的な結合」は、「相補的に塩基対合しうる」又は「相補性により結合」と表現することもある。また、相補的に結合しうる塩基配列を互いに「相補性を有する」[相補性である]と表現することもある。尚、人工的に作成されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンがシトシン、アデニン、チミンと水素結合の水素結合で結合することも意味する。
「目的とするDNA領域(に対して相補性である塩基配列)を含む一本鎖DNA」とは、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAとの結合体(二本鎖)を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするDNA領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」と表現することもある。
“Binding by complementarity (complementary (by base pairing) binding)” means forming a double-stranded DNA by base pairing by hydrogen bonding between bases. For example, the bases constituting each single-stranded DNA of the double-stranded DNA constituting the DNA form a double strand by purine and pyrimidine base pairing, more specifically, a plurality of consecutive, This means that double-stranded DNA is formed by base bonding by hydrogen bonding between thymine and cytosine and guanine and adenine. Binding by complementarity is sometimes referred to as “complementary binding”. “Complementary binding” may also be expressed as “complementary base pairing” or “binding by complementarity”. In addition, base sequences that can bind complementarily may be expressed as “complementary” [complementary] to each other. It also means that inosine contained in an artificially prepared oligonucleotide binds to cytosine, adenine, and thymine by hydrogen bonding.
“Single-stranded DNA containing the target DNA region (base sequence complementary to the target DNA)” forms a conjugate (double-stranded) with the single-stranded DNA containing the target DNA region. This means that it is a base sequence necessary for this purpose, that is, a base sequence containing a base sequence complementary to a part of the base sequence of the target DNA region, and may be expressed as a “complementary base sequence”. A complementary base sequence may be expressed as “complementary”.

本発明測定方法の第一工程において、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを取得し、該一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させて一本鎖DNAを選択する。また、第一工程は、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、メチル化された一本鎖DNAを分離する第一(A)工程と、メチル化された一本鎖DNAを固定化メチル化DNA抗体とを結合させることにより、前記の一本鎖DNAを選択する第一(B)工程からなる。
一本鎖DNAを取得するには、二本鎖DNAを一本鎖DNAに分離して取得してもよいし、元来検体中に含まれる一本鎖DNAをそのまま取得してもよい。尚、この二本鎖DNAを一本鎖DNAに分離するには、通常の手法を用いて行うことができる。
In the first step of the measurement method of the present invention, methylated single-stranded DNA is obtained from a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological specimen, the single-stranded DNA, an immobilized methylated DNA antibody, To select single-stranded DNA. In the first step, a first (A) step of separating methylated single-stranded DNA from a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological sample, and methylated single-stranded DNA This comprises the first step (B) of selecting the single-stranded DNA by binding with an immobilized methylated DNA antibody.
In order to obtain single-stranded DNA, the double-stranded DNA may be obtained by separating into single-stranded DNA, or the single-stranded DNA originally contained in the sample may be obtained as it is. In order to separate the double-stranded DNA into single-stranded DNA, a normal technique can be used.

本発明測定方法の第一(A)工程において、「生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、メチル化された一本鎖DNAを分離する」際、二本鎖DNAを一本鎖DNAにするための一般的な操作を行えばよい。具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料を適当量の超純水に溶解し、95℃で10分間加熱し、氷中で急冷すればよい。   In the first (A) step of the measurement method of the present invention, when “isolating methylated single-stranded DNA from a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological sample”, one double-stranded DNA What is necessary is just to perform general operation for making into strand DNA. Specifically, a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological specimen may be dissolved in an appropriate amount of ultrapure water, heated at 95 ° C. for 10 minutes, and rapidly cooled in ice.

本発明測定方法の第一(B)工程における「固定化メチル化DNA抗体」は、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを選択するために用いられる。当該固定化メチル化DNA抗体は、支持体に固定化され得るものであればよく、「支持体に固定化され得るもの」とは、メチル化DNA抗体を支持体へ直接的又は間接的に固定できることを意味する。
このように固定化されるためには、メチル化DNA抗体を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従って、支持体に固定すればよい(固相への結合)。具体的には、メチル化DNA抗体をビオチン化して得られたビオチン化メチル化DNA抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体(例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等)に固定する方法を挙げることができる。
また、メチル化DNA抗体に、例えば、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これをシランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、あるいは前記合成樹脂等、若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。尚、共有結合の際には、例えば、トリグリセライドを5個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等を利用して共有結合させてもよい。
さらに、メチル化DNA抗体を直接支持体に固定化してもよく、また、メチル化DNA抗体に対する抗体(二次抗体)を支持体に固定化し、二次抗体にメチル化抗体を結合させることで支持体に固定してもよい。
尚、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を選択する際には、固定化メチル化DNA抗体が支持体に固定化されていればよく、(1)当該一本鎖DNA(正鎖)と固定化メチル化DNA抗体との結合前の段階で、固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよく、また(2)当該一本鎖DNA(正鎖)と固定化メチル化DNA抗体との結合後の段階で、固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよい。
The “immobilized methylated DNA antibody” in the first (B) step of the measurement method of the present invention is used to select methylated single-stranded DNA from a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological specimen. It is done. The immobilized methylated DNA antibody may be any antibody that can be immobilized on a support, and “an antibody that can be immobilized on a support” means that a methylated DNA antibody is directly or indirectly immobilized on a support. Means you can.
In order to be immobilized in this way, the methylated DNA antibody may be immobilized on a support according to a normal genetic engineering operation method or a commercially available kit / device (binding to a solid phase). Specifically, a support in which a biotinylated methylated DNA antibody obtained by biotinylating a methylated DNA antibody is coated with streptavidin (for example, a PCR tube coated with streptavidin, a magnetic bead coated with streptavidin, etc.) The method of fixing to can be mentioned.
Further, for example, a glass having a surface in which a molecule having an active functional group such as an amino group, a thiol group, or an aldehyde group is covalently bonded to a methylated DNA antibody, and the surface thereof is activated with a silane coupling agent or the like. There is also a method of covalently bonding to a saccharide derivative, silica gel, the above synthetic resin or the like, or a heat-resistant plastic support. In the case of covalent bonding, for example, the covalent bonding may be performed using a spacer, a cross linker, or the like formed by connecting five triglycerides in series.
Furthermore, the methylated DNA antibody may be directly immobilized on the support, and the antibody against the methylated DNA antibody (secondary antibody) is immobilized on the support and the methylated antibody is bound to the secondary antibody. It may be fixed to the body.
In selecting the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region, the immobilized methylated DNA antibody may be immobilized on a support, and (1) the single-stranded DNA It may be immobilized by the binding of the immobilized methylated DNA antibody and the support at the stage before the binding of the strand DNA (positive strand) and the immobilized methylated DNA antibody, and (2) It may be immobilized by the binding of the immobilized methylated DNA antibody and the support at the stage after the binding of the single-stranded DNA (positive strand) and the immobilized methylated DNA antibody.

本発明測定方法の第一(B)工程において、「メチル化された一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させることにより、前記の一本鎖DNAを選択する」には、具体的には例えば、固定化メチル化DNA抗体として「ビオチン標識されたビオチン化メチルシトシン抗体」を使用して、以下のように実施すればよい。
(a)ビオチン化メチルシトシン抗体の適当量(例えば、0.1μg/50μL)をアビジン被覆PCRチューブに添加して得られた混合物を、室温で約1時間静置することにより、ビオチン化メチルシトシン抗体とストレプトアビジンとの固定化を促す。当該操作後、残溶液の除去及び洗浄を行う。得られたアビジン被覆PCRチューブに洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4))を100μL/チューブの割合で添加した後、当該アビジン被覆PCRチューブから溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返することにより、支持体に固定化されたビオチン化メチルシトシン抗体をアビジン被覆PCRチューブ内に残す。
(b)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来の二本鎖DNAをバッファー(例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc2、0.5mM Dithothreitol)とを混合して、95℃で数分間加熱する。その後、約0〜4℃の温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温し、一本鎖DNAを形成させる。その後、室温に戻す。
(c)形成された前記一本鎖DNAを、ビオチン化メチルシトシン抗体が固定化されたアビジン被覆PCRチューブに添加し、その後、室温で約1時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体と、前記一本鎖DNAのうちメチル化された一本鎖DNAとの結合を促す(結合体の形成)(この段階で、少なくともメチル化されてないDNA領域を含む一本鎖DNAは、結合体を形成しない。)。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を、100μL/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、結合体をPCRチューブ内に残す(結合体の選択)。
In the first step (B) of the measurement method of the present invention, “selecting the single-stranded DNA by binding a methylated single-stranded DNA and an immobilized methylated DNA antibody” Specifically, for example, a “biotinylated biotinylated methylcytosine antibody” may be used as an immobilized methylated DNA antibody as follows.
(A) A mixture obtained by adding an appropriate amount (for example, 0.1 μg / 50 μL) of a biotinylated methylcytosine antibody to an avidin-coated PCR tube is allowed to stand at room temperature for about 1 hour, whereby a biotinylated methylcytosine antibody is obtained. And immobilization of streptavidin. After the operation, the remaining solution is removed and washed. Wash buffer [for example, 0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] is added to the obtained avidin-coated PCR tube at 100 μL / tube. After adding in proportion, remove the solution from the avidin-coated PCR tube. By repeating this washing operation several times, the biotinylated methylcytosine antibody immobilized on the support remains in the avidin-coated PCR tube.
(B) A double-stranded DNA derived from genomic DNA contained in a biological sample is mixed with a buffer (for example, 33 mM Tris-Acetate pH 7.9, 66 mM KOAc, 10 mM MgOAc2, 0.5 mM Dithothreitol), and the number is 95 ° C. Heat for minutes. Thereafter, it is quickly cooled to a temperature of about 0 to 4 ° C., and kept at that temperature for several minutes to form single-stranded DNA. Then return to room temperature.
(C) The formed single-stranded DNA is added to an avidin-coated PCR tube on which a biotinylated methylcytosine antibody is immobilized, and then allowed to stand at room temperature for about 1 hour to obtain a biotinylated methylcytosine antibody, Facilitates binding with methylated single-stranded DNA of single-stranded DNA (formation of a conjugate) (At this stage, single-stranded DNA containing at least an unmethylated DNA region forms a conjugate. do not do.). Thereafter, the remaining solution is removed and washed. Washing buffer [eg, 0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH2PO4, 3 mM Na2HPO · 7H2O, 154 mM NaCl pH 7.4)] is added at a rate of 100 μL / tube, and the solution is removed. This washing operation is repeated several times to leave the conjugate in the PCR tube (selection of conjugate).

なお、第一(B)工程を具体的に実施する上では、前記記述に限定されない。 例えば、(b)において使用するバッファーとしては、生物試料由来のゲノムDNA由来の二本鎖DNAを一本鎖DNAへ分離するために適していれば良く、前記バッファーに限らない。
また例えば、(a)及び(c)における洗浄操作は、溶液中に浮遊している固定化されていないメチル化DNA抗体、メチル化DNA抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖DNA、または、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているDNA等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離のメチル化DNA抗体、溶液中に浮遊している一本鎖DNA等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、DELFIAバッファー(PerkinElmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80)、TEバッファー等でも良い。
The specific description of the first step (B) is not limited to the above description. For example, the buffer used in (b) is not limited to the buffer as long as it is suitable for separating double-stranded DNA derived from a genomic DNA derived from a biological sample into single-stranded DNA.
In addition, for example, the washing operations in (a) and (c) are performed by the non-immobilized methylated DNA antibody floating in the solution or the methylation floating in the solution that did not bind to the methylated DNA antibody. This is important in order to remove single-stranded DNA that has not been removed or DNA floating in a solution digested with a restriction enzyme described later from the reaction solution. The washing buffer only needs to be suitable for removing the above-mentioned free methylated DNA antibody, single-stranded DNA floating in the solution, etc., and is not limited to the washing buffer. Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80), TE buffer, etc. may be used.

本発明測定方法の第二工程にでは、第一工程で選択された一本鎖DNAを少なくとも1種類の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理する。尚、第一工程で選択された一本鎖DNAを少なくとも1種類以上の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物(前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも1つ以上のアンメチル状態のCpGを含む一本鎖DNA)を除去すればよい。
本発明測定方法の第二工程における「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているDNAの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該DNAに作用させても、当該DNAは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないDNAの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該DNAに作用させれば、当該DNAは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、ヘミメチル状態のCpG対を含む二本鎖DNA(即ち、前記CpG対のうち、一方の鎖のシトシンがメチル化されており、他方の鎖のシトシンがメチル化されていないような二本鎖DNA)を切断しないものであり、すでにGruenbaumらにより明らかにされている(Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515)。
また、「一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素」とは、例えば、一本鎖DNA中の、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素の中には、一本鎖DNAを消化するものもある。例えば、HhaI等を挙げることができる。
In the second step of the measurement method of the present invention, the single-stranded DNA selected in the first step is digested with a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA. The single-stranded DNA selected in the first step is digested with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA, and then the free digest produced (the single-stranded DNA described above). The single-stranded DNA containing at least one CpG in the ammethyl state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting.
The “methylation-sensitive restriction enzyme” in the second step of the measurement method of the present invention means, for example, that only a recognition sequence containing unmethylated cytosine is digested without digesting a recognition sequence containing methylated cytosine. It means a restriction enzyme etc. That is, in the case of DNA in which cytosine contained in a recognition sequence that can be originally recognized by a methylation-sensitive restriction enzyme is methylated, even if the methylation-sensitive restriction enzyme is allowed to act on the DNA, the DNA is Not cut. On the other hand, in the case where the cytosine contained in the recognition sequence that can be originally recognized by the methylation-sensitive restriction enzyme is not methylated, if the methylation-sensitive restriction enzyme acts on the DNA, The DNA is cleaved. Specific examples of such a methylation-sensitive enzyme include HpaII, BstUI, NarI, SacII, HhaI and the like. The methylation-sensitive restriction enzyme is a double-stranded DNA containing a CpG pair in a hemimethyl state (that is, cytosine on one strand of the CpG pair is methylated, and cytosine on the other strand is methylated. (Not double-stranded DNA), which has not been cleaved, and has already been clarified by Gruenbaum et al. (Nucleic Acid Research, 9, 2509-2515).
The “methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA” includes, for example, non-methylated cytosine that does not digest a recognition sequence containing methylated cytosine in single-stranded DNA. It means a restriction enzyme that can digest only the recognition sequence. That is, some methylation sensitive restriction enzymes digest single-stranded DNA. For example, HhaI etc. can be mentioned.

当該一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、具体的には例えば、前記のメチル化された一本鎖DNAの内、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含むDNAを増幅可能なプライマー対を用いてPCRを行い、DNAの増幅(増幅産物)の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。このようにして、増幅されたDNAの量を比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化されている割合を測定することができる。
因みに、第一工程で選択されたメチル化された一本鎖DNAにおいて、目的とするDNA領域は一本鎖状態であり、負鎖としてのオリゴヌクレオチドは、目的とするDNA領域とは結合しないため、当該一本鎖DNAは生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来の一本鎖である。また、当該一本鎖DNAは、前述の通り、目的とするDNA領域の全てのCpGがメチル化されているとは限らない。したがって、前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素がメチル状態である一本鎖DNAを切断しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも1つ以上のCpGにおけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができ、目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量をより精度良く求めることができる。つまり、目的とするDNA領域または目的とするDNA領域以外のほんの一部のCpGがメチル化されていたためメチル化抗体と結合体を形成し選択された一本鎖DNAについて、前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより消化し、真にメチル化された目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAのみを選択することを可能にしている。即ち、前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来検体中に含まれるゲノム由来の一本鎖DNAの目的とするDNA領域に含まれる一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位のCpGのシトシンがメチル化されている場合には、一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にはメチル化DNA抗体が結合しているが、ゲノム由来の一本鎖DNAの目的とするDNA領域に含まれる一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位のCpGのシトシンがメチル化されていない場合には、メチル化DNA抗体が結合していないため、一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素によって消化される。
したがって、消化処理を実施した後、後述のように、前記の目的とするDNA領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたPCRを実施すると、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している、少なくとも1つ以上のCpGにおけるシトシンがメチル化されていないのであれば、PCRによる増幅産物は得られず、一方、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおける前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのCpGにおけるシトシンがメチル化されていたのであれば、PCRによる増幅産物が得られることになる。
殆どのメチル化感受性制限酵素は、アンメチル化状態であっても一本鎖DNAを消化できないが、前述の通り、一部のメチル化感受性制限酵素はアンメチル化状態の一本鎖DNAを消化できる。一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素としては、例えば、HhaIがあり、このような酵素を利用することにより、一本鎖DNAのメチル化の有無を判別することができる。即ち、上記の操作で得られた固定化メチル化抗体と結合した検体中のDNAの一本鎖部分の、HhaIの認識部位に含まれるCpGのシトシンがメチル化されていたならば、HhaIは、このDNAを消化することができず、メチル化されていなければ、HhaIは、このDNAを消化する。従って、上記反応を実施後、目的とするDNA領域を増幅可能な一対のプライマーを用いてPCR反応を実施すると、検体中のDNAがアンメチル化状態であれば増幅産物は得られず、検体中のDNAがメチル化状態であれば増幅産物が得られることになる。
Specific examples of the method for examining the presence or absence of digestion with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA include, for example, one containing the target DNA region in the methylated single-stranded DNA. A method of examining the presence or absence of DNA amplification (amplified product) by performing PCR using a primer pair capable of amplifying DNA containing cytosine to be analyzed as a recognition sequence using the double-stranded DNA as a template can be mentioned. When cytosine to be analyzed is methylated, an amplification product is obtained. On the other hand, when the cytosine to be analyzed is not methylated, an amplification product cannot be obtained. In this way, by comparing the amounts of amplified DNA, the ratio of cytosine to be analyzed can be measured.
Incidentally, in the methylated single-stranded DNA selected in the first step, the target DNA region is in a single-stranded state, and the oligonucleotide as a negative strand does not bind to the target DNA region. The single-stranded DNA is a single strand derived from genomic DNA contained in a biological specimen. Further, as described above, not all CpGs in the target DNA region are methylated in the single-stranded DNA. Therefore, by utilizing the property that the methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA does not cleave the single-stranded DNA in the methyl state, the genomic DNA contained in the biological sample is It is possible to distinguish whether or not cytosine in at least one CpG existing in the recognition site of a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA is methylated, and the target DNA region The content of methylated DNA in can be determined with higher accuracy. That is, since the target DNA region or only a part of the CpG other than the target DNA region is methylated, the single-stranded DNA selected from the single-stranded DNA that forms a conjugate with the methylated antibody is selected. It is possible to select only single-stranded DNA containing a target DNA region which is digested by a digestion treatment with a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting DNA. That is, the single-stranded DNA contained in the target DNA region of the genomic-derived single-stranded DNA contained in the biological specimen is obtained by digestion with the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA. When the CpG cytosine at the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting DNA is methylated, the methylated DNA antibody binds to the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA. However, when the cytosine of CpG at the recognition site of the methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA contained in the target DNA region of the single-stranded DNA derived from the genome is not methylated, Since the DNA antibody is not bound, it is digested by a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA.
Therefore, after the digestion treatment, as described below, when PCR is performed using a pair of primers capable of amplifying the target DNA region, the restriction enzyme in the genomic DNA contained in the biological sample is detected. If cytosine in at least one or more CpGs present in the recognition site is not methylated, an amplification product by PCR cannot be obtained, while the genomic DNA contained in the biological sample is not If cytosine in all CpGs existing in the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA is methylated, an amplified product by PCR is obtained.
Most methylation-sensitive restriction enzymes cannot digest single-stranded DNA even in an unmethylated state, but as described above, some methylation-sensitive restriction enzymes can digest single-stranded DNA in an unmethylated state. An example of a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA is HhaI. By using such an enzyme, the presence or absence of methylation of single-stranded DNA can be determined. That is, if CpG cytosine contained in the recognition site of HhaI in the single-stranded DNA in the sample bound to the immobilized methylated antibody obtained by the above operation is methylated, If this DNA cannot be digested and is not methylated, HhaI will digest this DNA. Therefore, after performing the above reaction, if a PCR reaction is performed using a pair of primers capable of amplifying the target DNA region, an amplification product cannot be obtained if the DNA in the sample is in an unmethylated state. If the DNA is methylated, an amplification product will be obtained.

本発明測定方法の第二工程は、具体的には例えば、以下のように実施すればよい。第一工程で選択した一本鎖DNAに、最適な10×緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol)を3μL、1mg/mL BSA水溶液を3μL、一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素HhaI(10U/μL)を夫々1.5μL加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で1時間〜3時間インキュベーションすればよい。   Specifically, for example, the second step of the measurement method of the present invention may be performed as follows. For the single-stranded DNA selected in the first step, 3 μL of the optimal 10 × buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc2, 5 mM Dithothreitol), 3 μL of 1 mg / mL BSA aqueous solution, single-stranded DNA Methylation-sensitive restriction enzyme HhaI (10 U / μL) capable of digesting can be added to each mixture, and then sterilized ultrapure water is added to the mixture to a volume of 30 μL, followed by incubation at 37 ° C. for 1 to 3 hours.

このようにして第一工程で選択された一本鎖DNAを少なくとも1種類以上の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物(前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも1つ以上のアンメチル状態のCpGを含む一本鎖DNA)の除去及び洗浄(DNA精製)を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したPCRチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加した後、当該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合は、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量のTEバッファーを添加した後、当該TEバッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、消化物(前記制限酵素の認識部位に少なくとも1つ以上のアンメチル状態のCpGを含む一本鎖DNA)の除去及び洗浄(DNA精製)する。
尚、上記洗浄操作は、必ずしも必要ではない。例えば、前記メチル化感受性制限酵素処理で得られた溶液全てを、第三工程に用いることも可能である。
The single-stranded DNA selected in the first step in this way is digested with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA, and then the free digest produced (the one Removal and washing (DNA purification) of at least one single-stranded DNA containing CpG in an ammethyl state at the recognition site of a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting the strand DNA.
More specifically, for example, when using a PCR tube coated with streptavidin, first remove the solution by pipetting or decantation, and then add TE buffer approximately equal to the volume of the biological specimen. After that, the TE buffer may be removed by pipetting or decantation. In addition, when using magnetic beads coated with streptavidin, after fixing the beads with a magnet, the solution was first removed by pipetting or decantation, and then TE buffer was added in an amount approximately equal to the volume of the biological specimen. Thereafter, the TE buffer may be removed by pipetting or decantation.
Subsequently, by performing such an operation several times, the digest (a single-stranded DNA containing at least one or more amethylated CpG at the recognition site of the restriction enzyme) is removed and washed (DNA purification).
The above washing operation is not always necessary. For example, all the solutions obtained by the methylation sensitive restriction enzyme treatment can be used in the third step.

尚、本発明測定方法の第二工程における一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素による消化処理での懸念点として、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない(所謂「DNAの切れ残し」)虞を挙げることができる。このような虞が問題となる場合には、一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、「DNAの切れ残し」を最小限に抑えることができるので、目的とするDNA領域としては、一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位を少なくとも1つ以上有しており、その認識部位が多ければ多いほどよいと考えられる。   As a concern in the digestion treatment with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA in the second step of the measurement method of the present invention, a recognition sequence containing cytosine that is not methylated cannot be completely digested (so-called “ There is a concern that "DNA remains uncut"). When such a concern becomes a problem, if there are many recognition sites for a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA, it is possible to minimize “DNA fragmentation”. As the DNA region, it has at least one recognition site for a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA, and it is considered that the more recognition sites, the better.

尚、本発明測定方法において、「生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料」が、当該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるDNA試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。ここで、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA(鋳型DNA)を本固定化オリゴヌクレオチドで選択する場合には、短い鋳型DNAの方がより選択され易く、また、PCRで目的領域を増幅する場合にも、鋳型DNAが短い方がよいと考えられるので、目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料に直接使用し消化処理を実施してもよい。尚、目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、一般的な制限酵素処理法を用いればよい。
また、「生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料」が、少なくとも1種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるDNA試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理しておくことにより、メチル化量を精度良く求めることができるためである。当該方法は、上記のような「DNAの切れ残し」を無くすのに有用である。
生物由来検体に含まれるゲノムDNA由来の試料をメチル化感受性制限酵素により消化する方法としては、生物由来検体がゲノムDNA自体の場合には前記の方法と同様な方法でよく、生物由来検体が組織溶解液、細胞溶解液等の場合には前記の方法と同様な方法に準じて、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、25ngのDNA量に対して500倍量(10U)又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実施すればよい。
ゲノムDNAは、基本的には二本鎖DNAとして存在している。したがって、本操作においては、一本鎖を消化できるメチル化感受性制限酵素(例えば、HhaI)だけでなく、二本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素(例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等)を用いることができる。
In the measurement method of the present invention, “a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample” is pre-digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site. One preferred embodiment is that it is a DNA sample. Here, when genomic DNA (template DNA) contained in a biological sample is selected with the present immobilized oligonucleotide, a short template DNA is more easily selected, and a target region is amplified by PCR. In addition, since it is considered better to have a shorter template DNA, digestion is performed by directly using a restriction enzyme that does not recognize the target DNA region as a recognition cleavage site for genomic DNA-derived DNA samples contained in biological samples. May be. A general restriction enzyme treatment method may be used as a method for digesting with a restriction enzyme that does not use the target DNA region as a recognition cleavage site.
Moreover, it is mentioned as one of the preferable embodiments that the “DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen” is a DNA sample digested with at least one kind of methylation sensitive restriction enzyme. it can.
These preferred embodiments are because the amount of methylation can be obtained with high precision by digesting the biological specimen itself with the restriction enzymes as described above. This method is useful for eliminating the “DNA residue” as described above.
As a method for digesting a genomic DNA-derived sample contained in a biological sample with a methylation-sensitive restriction enzyme, when the biological sample is genomic DNA itself, the same method as described above may be used. In the case of a lysate, a cell lysate, etc., in accordance with the same method as described above, a large excess of methylation sensitive restriction enzyme, for example, 500 times (10 U) or more of 25 ng of DNA Digestion treatment may be performed using a methylation sensitive restriction enzyme.
Genomic DNA basically exists as double-stranded DNA. Therefore, in this operation, not only a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting a single strand (eg, HhaI) but also a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting a double stranded DNA (eg, HpaII, BstUI, NarI, SacII, HhaI etc.) can be used.

本発明測定方法の第三工程において、下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖DNA(前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpGを含まない一本鎖DNA)を、前記の固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA(正鎖)にする工程(第三(前A)工程)と、
第三(前A)工程で分離された一本鎖状態であるDNA(正鎖)を鋳型として、当該一本鎖状態であるDNA(正鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(正鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)を有する伸長プライマー(フォーワード用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNA(正鎖)を二本鎖DNAとして伸長形成させる工程(第三(前B)工程)と、
第三(前B)工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)に一旦分離する工程(第三(前C)工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−Aと、
(b)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−Bとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する。
In the third step of the measurement method of the present invention, a single-stranded DNA that is an undigested product obtained in the second step (a methylation-sensitive restriction that can digest the single-stranded DNA described above) A step of separating single-stranded DNA containing no CpG in the methylated state at the enzyme recognition site from the immobilized methylated DNA antibody into a single-stranded DNA (positive strand) (third (previous) A) Step)
Using the DNA (positive strand) in the single-stranded state separated in the third (previous A) step as a template, the partial base sequence (positive strand) of the base sequence of the DNA (positive strand) in the single-stranded state And a base sequence (complementary to a partial base sequence (positive strand) located further 3 ′ end than the 3 ′ end of the base sequence (positive strand) of the target DNA region ( The extension primer (forward primer) having a negative strand) is used as an extension primer, and the extension primer is extended once to extend the single-stranded DNA (positive strand) as a double-stranded DNA. A step (third (previous B) step)
The double-stranded DNA extended and formed in the third (previous B) step contains a single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region and a base sequence that is complementary to the target DNA region. A single-stranded DNA (positive strand) having a step (third (previous C) step) of once separating into single-stranded DNA (negative strand) and including (a) the generated target DNA region as this step ) As a template, the forward primer as an extension primer, and the extension primer is extended once, thereby extending the single-stranded DNA containing the target DNA region as a double-stranded DNA. A and
(B) Using the generated single-stranded DNA (negative strand) containing a base sequence complementary to the target DNA region as a template, the base sequence complementary to the target DNA region is A base sequence that is a partial base sequence (negative strand) of the base sequence of the contained single-stranded DNA (negative strand) and that is complementary to the base sequence (positive strand) of the target DNA region An extension primer (reverse primer) having a base sequence (positive strand) that is complementary to the partial base sequence (negative strand) located further 3 'end than the 3' end of (negative strand) As the step-B, the extension primer is extended once to form a single-stranded DNA containing the target DNA region as a double-stranded DNA.
Furthermore, each of these steps was once methylated in the target DNA region by repeating the extension-formed double-stranded DNA obtained in each of the steps once after separating it into a single-stranded state. Amplify the DNA to a detectable amount and quantify the amount of amplified DNA.

本発明測定方法の第三工程では、まず、下記の各本工程の前工程のうち第三(前A)工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖DNA(前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpGを含まない一本鎖DNA)を、前記の固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA(正鎖)にする。具体的には例えば、第二工程で得られた未消化物である一本鎖DNA(前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpGを含まない一本鎖DNA)に、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を95℃で数分間加熱することにより、一本鎖状態であるDNA(正鎖)を得る。その後、第三(前B)工程では、具体的には例えば、第三(前A)工程で得られた一本鎖状態のDNA(正鎖)とフォワードプライマーを、滅菌超純水を17.85μL、最適な緩衝液(例えば、100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2)を3μL、2mM dNTPを3μL、5N ベタインを6μL加え、次いで当該混合物にAmpliTaq(DNAポリメラーゼの1種:5U/μL)を0.15μL加えて液量を30μLとした溶液中で混合し、37℃で約2時間インキュベーションし、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を二本鎖DNAに伸長形成させる。第三(前C)工程においては、具体的には例えば、第三(前B)工程で伸長形成された二本鎖DNAに、アニーリングバッファーを添加することにより混合物を得て、得られた混合物を95℃で数分間加熱することにより、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAに一旦分離する。
その後、本工程として、
(i) 生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)に、前記のフォワード用プライマーをアニーリングさせるために、例えば、前記のフォワード用プライマーのTm値の約0〜20℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ii)その後、室温に戻す。
(iii)上記(i)でアニーリングさせた前記の一本鎖状態であるDNAを鋳型として、前記のフォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる(即ち、第三工程−A)。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明測定方法の第三(前B)工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補性である塩基配列(負鎖)の3'末端よりさらに3'末端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補性である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNAを伸長形成された二本鎖DNAとする(即ち、第三工程−B)。具体的には例えば、上記(iii)の第三工程−Aと同様に、第三(前B)工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(v)さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと(例えば、第三工程−A及び第三工程−B)により、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する。
In the third step of the measurement method of the present invention, first, a single-stranded DNA that is an undigested product obtained in the second step as the third (previous A) step among the following steps of each of the following steps (described above) DNA that is in a single-stranded state is separated from the immobilized methylated DNA antibody by separating a single-stranded DNA that does not contain CpG in the methylated state at the recognition site of a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA ( A positive strand). Specifically, for example, a single-stranded DNA which is an undigested product obtained in the second step (a single-stranded DNA containing no CpG in the methylated state at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA) An annealing buffer is added to the strand DNA) to obtain a mixture. Next, the obtained mixture is heated at 95 ° C. for several minutes to obtain DNA (positive strand) in a single-stranded state. Thereafter, in the third (front B) step, specifically, for example, the single-stranded DNA (forward strand) obtained in the third (previous A) step and the forward primer are mixed with 17.85 μL of sterilized ultrapure water. Add 3 μL of optimal buffer (eg, 100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 ), 3 μL of 2 mM dNTP, 6 μL of 5N betaine, and then add AmpliTaq (1 type of DNA polymerase: 5 U / μL) is mixed in a solution with a volume of 30 μL and incubated at 37 ° C. for about 2 hours to extend the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region into double-stranded DNA. Let it form. In the third (previous C) step, specifically, for example, a mixture is obtained by adding an annealing buffer to the double-stranded DNA formed by extension in the third (previous B) step. Is heated to 95 ° C. for several minutes to be once separated into single-stranded DNA containing the target DNA region.
Then, as this process,
(i) In order to anneal the forward primer to the single-stranded DNA (positive strand) containing the target DNA region that has been generated, for example, the Tm value of the forward primer is about 0 to 20 ° C. lower Cool quickly to temperature and keep at that temperature for several minutes.
(ii) Then, return to room temperature.
(iii) The DNA of interest is obtained by extending the primer once using the DNA in the single-stranded state annealed in (i) above as a template and the forward primer as an extension primer. The single-stranded DNA containing the region is elongated as a double-stranded DNA (ie, the third step-A). Specifically, it may be carried out in accordance with, for example, the following description or the operation method in the extension reaction in the third (previous B) step of the above-described measurement method of the present invention.
(iv) Using the generated single-stranded DNA (negative strand) containing a base sequence complementary to the target DNA region as a template, the base sequence complementary to the target DNA region is A base sequence that is a partial base sequence (negative strand) of the base sequence of the contained single-stranded DNA (negative strand) and that is complementary to the base sequence (positive strand) of the target DNA region An extension primer (reverse primer) having a base sequence (positive strand) that is complementary to the partial base sequence (negative strand) located further 3 'end than the 3' end of (negative strand) As described above, by extending the extension primer once, the single-stranded DNA is converted into an extended double-stranded DNA (ie, the third step-B). Specifically, for example, it may be carried out according to the operation method in the extension reaction in the third (previous B) step, as in the third step-A in (iii) above.
(v) Further, each of these steps is repeated after separating the double-stranded DNA formed in the extension obtained in each of the steps into a single-stranded state (for example, the third step-A and the third step). By step-B), the methylated DNA in the target DNA region is amplified to a detectable amount, and the amount of the amplified DNA is quantified.

第三工程は、具体的には、第三(前A)工程から開始して本工程に至るまでの反応を、一つのPCR反応として実施することもできる。また、第三(前A)工程から第三(前C)工程まで、各々、独立した反応として実施し、本工程のみをPCR反応として実施することもできる。   Specifically, in the third step, the reaction from the third (previous A) step to the present step can be performed as one PCR reaction. Further, the third (previous A) step to the third (previous C) step can be performed as independent reactions, and only this step can be performed as a PCR reaction.

一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素による消化処理の後に目的とするDNA領域(即ち、目的領域)を増幅する方法としては、例えば、PCRを用いることができる。目的領域を増幅する際に、予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。PCR反応液としては、例えば、本発明測定方法の第二工程で得たDNAに、50μMのプライマーの溶液を0.15μlと、2mM dNTPを2.5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、20mM MgCl2、0.01% Gelatin)を2.5μlと、AmpliTaq Gold (耐熱性DNAポリメラーゼの一種: 5U/μl)を0.2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液をあげることができる。
目的とするDNA領域(即ち、目的領域)は、GCリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、DMSO等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件があげられる。かかるPCRを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施した後、蛍光標識体の量の測定によりPCR反応での増幅量を評価することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたPCRを実施した場合には、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した当該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムPCR法を用いればよい。リアルタイムPCR法とは、PCRをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して2倍程度のほんの僅かな差異をも検出できる高精度の定量PCR法として知られる方法である。当該リアルタイムPCR法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムPCR法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
As a method for amplifying a target DNA region (that is, a target region) after digestion with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA, for example, PCR can be used. When a target region is amplified, if a primer previously labeled with fluorescence or the like is used and the label is used as an index, the presence or absence of an amplification product can be evaluated without performing a cumbersome operation such as electrophoresis. Examples of the PCR reaction solution include DNA obtained in the second step of the measurement method of the present invention, 0.15 μl of a 50 μM primer solution, 2.5 μl of 2 mM dNTP, 10 × buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3). , 500 mM KCl, 20 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 2.5 μl and AmpliTaq Gold (a kind of heat-resistant DNA polymerase: 5 U / μl) are mixed with 0.2 μl, and sterilized ultrapure water is added to the solution. The reaction solution containing 25 μl of can be used.
Since the target DNA region (that is, the target region) has many GC-rich base sequences, the reaction may be carried out by adding an appropriate amount of betaine, DMSO or the like. As the reaction conditions, for example, the above reaction solution is kept at 95 ° C. for 10 minutes, then at 95 ° C. for 30 seconds, then at 55 to 65 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 30 seconds for one cycle. The conditions for performing the heat insulation for 30 to 40 cycles are mentioned. After performing such PCR, the obtained amplification product is detected. For example, when a pre-labeled primer is used, the amplification amount in the PCR reaction can be evaluated by measuring the amount of the fluorescent label after performing the same washing / purification operation as before. In addition, when PCR is performed using ordinary unlabeled primers, detection is performed by annealing the colloidal gold particles, probes labeled with fluorescence, etc., and measuring the amount of the probe bound to the target region. can do. Further, in order to obtain the amount of the amplification product more accurately, for example, a real-time PCR method may be used. The real-time PCR method is a method for monitoring PCR in real time and kinetics analysis of the obtained monitoring results. For example, a high-precision quantitative PCR capable of detecting even a slight difference of about 2 times in terms of gene amount. It is a method known as law. Examples of the real-time PCR method include a method using a probe such as a template-dependent nucleic acid polymerase probe and a method using an intercalator such as Cyber Green. Commercially available devices and kits for the real-time PCR method may be used. As described above, detection is not particularly limited, and detection by any known method can be performed. In these methods, operations up to detection can be performed without changing the reaction container.

他に、第二工程の態様としては、一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第三工程を実施する等を挙げることができる。目的とするDNA領域に一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で切断される塩基配列が無い場合には、第二工程を実施せずに第三工程を実施しても構わない。   In addition, examples of the second step include performing the third step without performing a digestion treatment with a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA. If the target DNA region does not have a base sequence that can be digested with a methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting single-stranded DNA, the third step may be performed without performing the second step.

他に第一(A)工程において、メチル化された一本鎖DNAを分離する際の好ましい態様としては、カウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げることができる。カウンターオリゴヌクレオチドとは、目的とするDNA領域と同じ塩基配列を短いオリゴヌクレオチドに分割したものである。通常10〜100塩基、より好ましくは、20〜50塩基の長さに設計したものであればよい。尚、カウンターオリゴヌクレオチドは、フォーワード用プライマーあるいはリバース用プライマーが目的とするDNA領域と相補的に結合する塩基配列上には設計しない。カウンターオリゴヌクレオチドは、ゲノムDNAに比し、大過剰で添加され、目的とするDNA領域を一本鎖(正鎖)にした後、固定化メチル化DNA抗体と結合させる際に、目的とするDNA領域の相補鎖(負鎖)と目的とするDNA領域を一本鎖(正鎖)が相補性により再結合することを妨げるために添加する。目的とするDNA領域にメチル化DNA抗体を結合させて、DNAのメチル化頻度又はそれに相関関係のある指標値を測定する際に、目的領域が一本鎖である方がメチル化DNA抗体に結合しやすいからである。尚、カンウターオリゴヌクレオチドは、目的とするDNA領域に比べて、少なくとも10倍、通常は100倍以上の量が添加されることが望ましい。   In addition, in the first step (A), a preferred embodiment for separating methylated single-stranded DNA includes addition of a counter oligonucleotide. The counter oligonucleotide is obtained by dividing the same base sequence as the target DNA region into short oligonucleotides. The length is usually 10 to 100 bases, more preferably 20 to 50 bases. The counter oligonucleotide is not designed on the base sequence that the forward primer or reverse primer binds complementarily to the target DNA region. The counter oligonucleotide is added in a large excess compared to genomic DNA, and the target DNA region is converted into a single strand (positive strand) and then combined with the immobilized methylated DNA antibody. The complementary strand (negative strand) of the region and the target DNA region are added to prevent the single strand (positive strand) from recombining due to complementarity. When a methylated DNA antibody is bound to the target DNA region and the DNA methylation frequency or an index value correlated therewith is measured, the target region that is single-stranded binds to the methylated DNA antibody. Because it is easy to do. The counter oligonucleotide is preferably added in an amount of at least 10 times, usually 100 times or more, as compared with the target DNA region.

「メチル化された一本鎖DNAを分離する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する」とは、具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、メチル化された一本鎖DNAを選択するために、生物由来生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料をカウンターオリゴヌクレオチドと混合して、目的とするDNA領域の相補鎖とカウンターオリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させればよい。例えば、前記DNA試料と、前記カウンターオリゴヌクレオチドを、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合して、95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温し、次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻せばよい。 Specifically, “adding a counter oligonucleotide when separating methylated single-stranded DNA” specifically refers to a methylated single DNA from a DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample. In order to select a strand DNA, a DNA sample derived from a genomic DNA contained in a biological specimen is mixed with a counter oligonucleotide, and a double strand of a complementary strand of the target DNA region and the counter oligonucleotide is obtained. What is necessary is just to form. For example, the DNA sample and the counter oligonucleotide are mixed with 5 μL of a buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 5 μL of 100 mM MgCl 2 solution, and 1 mg / mL BSA solution. Add 5 μL, add sterilized ultrapure water to the mixture to make 50 μL, mix, heat at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cool to 70 ° C., keep at that temperature for 10 minutes, Then, it is cooled to 50 ° C., kept at temperature for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature.

各種疾患(例えば、癌)においてDNAのメチル化異常が起こることが知られており、このDNAメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。
例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて100%メチル化されているDNA領域があり、そのDNA領域について、本発明測定方法を実施すれば、メチル化されたDNAの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて100%メチル化されていないDNA領域があり、そのDNA領域について、本発明測定方法を実施すれば、メチル化されたDNAの量はほぼ0に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて低メチル化状態(hypomethylation)で、且つ、疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムDNAにおいて高メチル化状態(hypermethylation)であるDNA領域があり、そのDNA領域について、本発明測定方法を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたDNAの量は、0に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、生物由来検体が組織である場合には当該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。さらに、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明測定方法は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
It is known that abnormal DNA methylation occurs in various diseases (for example, cancer), and it is considered possible to measure the degree of various diseases by detecting this abnormal DNA methylation.
For example, there is a DNA region that is 100% methylated in genomic DNA contained in a biological specimen derived from a disease. If the measurement method of the present invention is carried out for that DNA region, the amount of methylated DNA is large. For example, if there is a DNA region that is not 100% methylated in genomic DNA contained in a biological specimen derived from a disease, and the measurement method of the present invention is carried out for that DNA region, the amount of methylated DNA Will be close to zero. In addition, for example, hypomethylation is present in the genomic DNA contained in the biological sample from a healthy person, and hypermethylation is present in the genomic DNA contained in the biological sample from the disease patient. If there is a DNA region and the measurement method of the present invention is performed on the DNA region, the amount of methylated DNA is close to 0 in the case of a healthy person, whereas in the case of a patient with a disease, Since the value is significantly higher than the value in the case of a healthy person, the “degree of disease” can be determined based on the difference between the values. The “degree of disease” here is the same as the meaning generally used in the field, and specifically, for example, when the biological specimen is a cell, it means the malignancy of the cell. For example, when the biological specimen is a tissue, it means the abundance of disease cells in the tissue. Furthermore, when the biological specimen is plasma / serum, it means the probability that the individual has a disease. Therefore, the measurement method of the present invention makes it possible to diagnose various diseases by examining methylation abnormality.

このような本発明測定方法における、目的領域のメチル化されたDNA量の測定を行うための各種方法で使用し得る制限酵素、プライマー又はプローブは、検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これら制限酵素、プライマー又はプローブ等を試薬として含有する検出用キットや、これらプライマー又はプローブ等が支持体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、本発明測定方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。   In such a measurement method of the present invention, a restriction enzyme, primer or probe that can be used in various methods for measuring the amount of methylated DNA in a target region is useful as a reagent for a detection kit. The present invention also provides a detection kit containing these restriction enzymes, primers or probes as reagents, and a detection chip in which these primers or probes are immobilized on a support. The scope of right includes, of course, the use in the form of the detection kit or the detection chip as described above using the substantial principle of the method.

以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   EXAMPLES The present invention will be described in detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例1
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 1
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. Refrigerate the obtained biotin-labeled methylcytosine antibody as a solution [antibody 0.1 μg / 100 μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] saved.

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計8本)に、上記のビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各100μLの割合で添加し、約1時間室温で放置することによりPCRチューブに固定化した。その後、当該PCRチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、前記PCRチューブ内に100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した。次いで、前記バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した。 The biotin-labeled methylcytosine antibody solution was added at a ratio of 100 μL to each of the streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes), and the mixture was allowed to stand at room temperature for about 1 hour to be immobilized on the PCR tubes. Thereafter, the solution in the PCR tube was removed by pipetting, and then 100 μL of washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM) was added to the PCR tube. NaCl pH 7.4)] was added. The buffer was then removed by pipetting. This operation was repeated two more times.

配列番号17で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドUBC−M、及び、配列番号18で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドUBC−Uを別々合成して、夫々につき以下の溶液(以下、オリゴヌクレオチド溶液と記す。)を調製した。
溶液A:0.01pmoL/100μL TEバッファー溶液
溶液B:0.001pmoL/100μL TEバッファー溶液
溶液C:0.0001pmoL/100μL TEバッファー溶液
溶液D:0pmoL/100μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液)
The methylated oligonucleotide UBC-M consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 17 and the unmethylated oligonucleotide UBC-U consisting of the base sequence shown by SEQ ID NO: 18 were separately synthesized, This is referred to as an oligonucleotide solution).
Solution A: 0.01 pmoL / 100 μL TE buffer solution Solution B: 0.001 pmoL / 100 μL TE buffer solution
Solution C: 0.0001 pmoL / 100 μL TE buffer solution Solution D: 0 pmoL / 100 μL TE buffer solution (negative control solution)

<メチル化オリゴヌクレオチド> Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M:5'-
AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCNGGATCAGAGNGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA -3'(配列番号17)
<アンメチル化オリゴヌクレオチド>
UBC-U:5'-AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3'(配列番号18)
<Methylated oligonucleotide> N represents 5-methylcytosine.
UBC-M: 5'-
AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCNGGATCAGAGNGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3 '(SEQ ID NO: 17)
<Unmethylated oligonucleotide>
UBC-U: 5'-AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3 '(SEQ ID NO: 18)

得られた夫々の溶液について、以下の処理を施した(各溶液について1本ずつ調製)。   Each of the obtained solutions was subjected to the following treatment (prepared one for each solution).

前記のビオチン標識メチル化シトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製されたオリゴヌクレオチド溶液100μLを加え、室温で2時間放置した。その後、当該PCRチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、前記チューブ内に200μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した。次いで、当該PCRチューブ内の前記バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一工程に相当する)。 To the PCR tube coated with streptavidin on which the biotin-labeled methylated cytosine antibody was immobilized, 100 μL of the oligonucleotide solution prepared above was added and left at room temperature for 2 hours. Then, after removing the solution in the PCR tube by pipetting, 200 μL of the washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM NaCl] pH 7.4)] was added. Next, the buffer in the PCR tube was removed by pipetting. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step of the measurement method of the present invention).

次に、このようにして得られたPCRチューブに、配列番号19及び配列番号20で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液(PF及びPR)及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、目的とするDNA領域UBC(配列番号21、メチル化シトシンもCで表す)におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is performed on the PCR tube thus obtained using each solution (PF and PR) of the primer consisting of the base sequences shown in SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 and the following reaction conditions. The DNA methylated in the target DNA region UBC (SEQ ID NO: 21, methylated cytosine is also represented by C) was amplified.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF:5'-AGTGACACCATCGAGAATGTCA-3'(配列番号19)
PR:5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3'(配列番号20)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF: 5'-AGTGACACCATCGAGAATGTCA-3 '(SEQ ID NO: 19)
PR: 5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3 '(SEQ ID NO: 20)

<目的とするDNA領域>
UBC:5'-AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3'(配列番号21)
<Target DNA region>
UBC: 5'-AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3 '(SEQ ID NO: 21)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、50μMに調製された配列番号19及び配列番号20で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各0.3μLと、each 2mM dNTP5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold)5U/μL、0.25μLとを混合した後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで59℃にて30秒間さらに72℃にて45秒間を1サイクルとする保温を22サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動に供することによりDNAの増幅を確認した。その結果を図1に示した(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。UBC−Mの溶液A(0.01pmol)、溶液B(0001pmol)、及び、溶液C(0.0001pmol)で、DNAの増幅が確認されその増幅産物(目的とするDNA領域:UBC)が得られた。UBC−Mの溶液D(0pmol)では、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。一方、UBC−Uの溶液A(0,01pmol)、溶液B(0.001pmol)、溶液C(0.0001pmol)、及び、溶液D(0pmol)の全ての群において、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
As a PCR reaction solution, a template solution was prepared by adding 0.3 μL each of a primer solution consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 prepared in 50 μM, each 2 mM dNTP 5 μL, and a buffer solution (100 mM). Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 μL, heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5 U / μL, 0.25 μL were mixed, and then sterilized ultrapure water was added to the mixture. In addition, the liquid volume was 50 μL. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then subjected to PCR under the conditions of 22 cycles of incubation at 95 ° C. for 30 seconds, then 59 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 45 seconds. It was.
After PCR, amplification of DNA was confirmed by subjecting to 1.5% agarose gel electrophoresis. The result is shown in FIG. 1 (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention). DNA amplification was confirmed in UBC-M solution A (0.01 pmol), solution B (0001 pmol), and solution C (0.0001 pmol), and an amplification product (target DNA region: UBC) was obtained. In UBC-M solution D (0 pmol), amplification of DNA was not confirmed and the amplification product was not obtained. On the other hand, in all groups of UBC-U solution A (0,01 pmol), solution B (0.001 pmol), solution C (0.0001 pmol), and solution D (0 pmol), DNA amplification was not confirmed. No product was obtained.

以上より、固定化されたメチル化シトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを選択することが可能であること、且つ、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されていないDNAを増幅することなく、メチル化されたDNAのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量できること等が確認された。   From the above, it is possible to select a single-stranded DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylated cytosine antibody, and methylation in the target DNA region. It was confirmed that the amount of the amplified DNA can be quantified by amplifying only the methylated DNA to a detectable amount without amplifying the untreated DNA.

実施例2
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/50μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 2
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody is refrigerated as a solution [antibody 0.1 μg / 50 μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] saved.

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計6本)に、上記のビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置することによりPCRチューブに固定化した。その後、当該PCRチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した。次いで、当該PCRチューブ内の当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した。 The above biotin-labeled methylcytosine antibody solution was added at a ratio of 50 μL to each of the streptavidin-coated PCR tubes (total of 6 tubes) and allowed to stand at room temperature for about 1 hour to be immobilized on the PCR tubes. Thereafter, the solution in the PCR tube is removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] Added. Next, the buffer in the PCR tube was removed by pipetting. This operation was repeated two more times.

配列番号22で示される塩基配列からなるHhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)、配列番号23で示される塩基配列からなるHhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)、配列番号24で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UMを別々合成して、夫々につき0.1pmol/50μL TEバッファー溶液(以下、オリゴヌクレオチド溶液と記す。)を調製した。   Partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) not digested with HhaI consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22, partial methylation digested with HhaI consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23 Oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-HM (5) and an unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-UM consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 were synthesized separately, and 0.1 pmol / A 50 μL TE buffer solution (hereinafter referred to as an oligonucleotide solution) was prepared.

<HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチド>
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号22)
<HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチド>
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号23)
<アンメチル化オリゴヌクレオチド>
GPR7-2079-2176/98mer-UM:
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号24)
<Partially methylated oligonucleotide not digested with HhaI>
N represents 5-methylcytosine.
GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 '(SEQ ID NO: 22)
<Partially methylated oligonucleotide digested with HhaI>
N represents 5-methylcytosine.
GPR7-2079-2176 / 98mer-HM (5):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 '(SEQ ID NO: 23)
<Unmethylated oligonucleotide>
GPR7-2079-2176 / 98mer-UM:
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 '(SEQ ID NO: 24)

得られた夫々の溶液について、以下の処理を施した(各溶液について2本ずつ調製)。   Each of the obtained solutions was subjected to the following treatment (prepared two for each solution).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製wされたオリゴヌクレオチド溶液50μLを加え、室温で1時間放置した。その後、当該PCRチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、前記のPCRチューブ内に100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した。次いで、当該チューブ内の前記バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一工程に相当する)。 50 μL of the oligonucleotide solution prepared above was added to the PCR tube coated with streptavidin on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution in the PCR tube was removed by pipetting, and then 100 μL of the washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added. Next, the buffer in the tube was removed by pipetting. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step of the measurement method of the present invention).

このようにして得られたサンプルに、以下のA処理又はB処理を施した(各1本ずつ調製)。   The samples obtained in this manner were subjected to the following A treatment or B treatment (prepared for each one).

A処理群(無処理群):前記で調製されたサンプルに、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)10μLと、BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL)10μLとを加えた後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を100μLとした。 A treatment group (non-treatment group): 10 μL of buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) and 10 μL of BSA (Bovine serum albumin 1 mg / mL) were prepared. Then, sterilized ultrapure water was further added to the mixture to make the liquid volume 100 μL.

B処理群(HhaI処理群):前記で調製されたサンプルに、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)10μLと、BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL)10μLと、HhaIを64Uとを加えた後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとした。 B treatment group (HhaI treatment group): The sample prepared above was mixed with 10 μL of buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) and 10 μL of BSA (Bovine serum albumin 1 mg / mL). After adding 64 U of HhaI, sterilized ultrapure water was further added to the mixture to make the volume 50 μL.

各々の反応液を37℃で3時間インキュベーションした。次いで、PCRチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した。その後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第二工程に相当する)。 Each reaction was incubated at 37 ° C. for 3 hours. Next, the solution in the PCR tube was removed by pipetting, and then 100 μL of washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] Was added. Thereafter, the buffer was removed by pipetting. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).

次に、このようにして得られたPCRチューブに、配列番号25及び配列番号26で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液(PF2及びPR2)及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、目的とするDNA領域(GPR7-2079-2176、配列番号27、メチル化シトシンもCで表す)におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is performed on the PCR tubes thus obtained using the primer solutions (PF2 and PR2) consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 and the following reaction conditions: Was used to amplify methylated DNA in the target DNA region (GPR7-2079-2176, SEQ ID NO: 27, methylated cytosine is also represented by C).

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF2:5'-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3'(配列番号25)
PR2:5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3'(配列番号26)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF2: 5'-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3 '(SEQ ID NO: 25)
PR2: 5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3 '(SEQ ID NO: 26)

<目的とするDNA領域>
GPR7-2079-2176:5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号27)
<Target DNA region>
GPR7-2079-2176: 5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 '(SEQ ID NO: 27)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、3μMに調製された配列番号25及び配列番号26で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各5μLと、each 2mM dNTP5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold)5U/μL、0.25μLと、5Nベタイン水溶液10μLとを混合した後、更に当該混合物これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで59℃にて30秒間さらに72℃にて45秒間を1サイクルとする保温を18サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動に供することによりDNAの増幅を確認した。その結果を図2に示した(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。A処理群(無処理群)の場合、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)と、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)とでは、DNAの増幅が確認されその増幅産物(目的とするDNA領域:GPR7−2079−2176)が得られた。アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UMでは、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。B処理群(HhaI処理群)の場合、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)では、DNAの増幅が確認されその増幅産物(目的とするDNA領域:GPR7−2079−2176)が得られたが、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UMでは、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
As a PCR reaction solution, 5 μL each of a primer solution consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 prepared in 3 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer (100 mM Tris- HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) 5 μL, heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5 U / μL, 0.25 μL, and 5 N betaine aqueous solution 10 μL were mixed, and the mixture was further mixed. Sterile ultrapure water was added to make the volume 50 μL. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was carried out under the conditions of 18 cycles of incubation at 95 ° C. for 30 seconds, then 59 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 45 seconds. It was.
After performing PCR, amplification of DNA was confirmed by subjecting the obtained amplification product to 1.5% agarose gel electrophoresis. The result is shown in FIG. 2 (this corresponds to the third step of the measurement method of the present invention). In the case of the A treatment group (non-treatment group), a partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) not digested with HhaI and a partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / digested with HhaI With 98mer-HM (5), amplification of DNA was confirmed and the amplification product (target DNA region: GPR7-2079-2176) was obtained. In the unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-UM, amplification of DNA was not confirmed and the amplification product was not obtained. In the case of the B treatment group (HhaI treatment group), in the partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) that is not digested with HhaI, amplification of DNA was confirmed and the amplification product (target DNA region: GPR7-2079-2176) was obtained, but partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-HM (5) digested with HhaI and unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-UM Then, amplification of DNA was not confirmed and the amplification product was not obtained.

以上より、固定化されたメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを選択することが可能であること、また、メチル化感受性制限酵素で処理することにより、メチル化感受性制限酵素認識部位がメチル化されていない目的とするDNA領域を消化できること、且つ、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されていないDNAを増幅することなく、メチル化されたDNAのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量できること等が確認された。   From the above, it is possible to select a single-stranded DNA containing a methylated target DNA region with an immobilized methylcytosine antibody, and by treating with a methylation-sensitive restriction enzyme, A methylation sensitive restriction enzyme recognition site can digest a target DNA region that is not methylated, and only a methylated DNA without amplifying a non-methylated DNA in the target DNA region. It was confirmed that the amount of amplified DNA could be quantified and so on.

実施例3
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/50μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 3
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH2, manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody is refrigerated as a solution [antibody 0.1 μg / 50 μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution] saved.

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計6本)に、上記のビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置することによりPCRチューブに固定化した。次いで、当該PCRチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、前記PCRチューブ内に100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した。その後、当該チューブ内の前記バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した。 The above biotin-labeled methylcytosine antibody solution was added to each streptavidin-coated PCR tube (total of 6 tubes) at a ratio of 50 μL, and the mixture was allowed to stand at room temperature for about 1 hour to be immobilized on the PCR tube. Next, after removing the solution in the PCR tube by pipetting, 100 μL of the washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM) was added to the PCR tube. NaCl pH 7.4)] was added. Thereafter, the buffer in the tube was removed by pipetting. This operation was repeated two more times.

配列番号22で示される塩基配列からなるHhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)、配列番号23で示される塩基配列からなるHhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)、配列番号24で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UMを別々合成して、夫々につき0.1pmol/50μL TEバッファー溶液(以下、オリゴヌクレオチド溶液と記す。)を調製した。   Partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) not digested with HhaI consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 22, partial methylation digested with HhaI consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 23 Oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-HM (5) and an unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-UM consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 24 were synthesized separately, and 0.1 pmol / A 50 μL TE buffer solution (hereinafter referred to as an oligonucleotide solution) was prepared.

<HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチド>
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号22)
<HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチド>
Nは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号23)
<アンメチル化オリゴヌクレオチド>
GPR7-2079-2176/98mer-UM:
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号24)
<Partially methylated oligonucleotide not digested with HhaI>
N represents 5-methylcytosine.
GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 '(SEQ ID NO: 22)
<Partially methylated oligonucleotide digested with HhaI>
N represents 5-methylcytosine.
GPR7-2079-2176 / 98mer-HM (5):
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 '(SEQ ID NO: 23)
<Unmethylated oligonucleotide>
GPR7-2079-2176 / 98mer-UM:
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 '(SEQ ID NO: 24)

このようにして得られたサンプルについて、以下のA処理又はB処理を施した(各1本ずつ調製)。   The sample thus obtained was subjected to the following A treatment or B treatment (prepared for each one).

A処理群(無処理群):前記で調製されたサンプル(各10μL)に、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL)5μLとを加えた後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとした。 A-treated group (untreated group): The sample prepared above (each 10 μL) was mixed with 5 μL of a buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) and BSA (Bovine serum albumin 1 mg). After adding 5 μL, sterilized ultrapure water was further added to the mixture to make the volume 50 μL.

B処理群(HhaI処理群):前記で調製されたサンプル(各10μL)に、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、BSA(Bovine serum albumin 1mg/mL)5μLと、HhaIを64Uとを加えた後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとした。 B treatment group (HhaI treatment group): The sample prepared above (each 10 μL) was mixed with 5 μL of a buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) and BSA (Bovine serum albumin 1 mg). / mL) 5 μL and 64 U of HhaI were added, and sterilized ultrapure water was further added to the mixture to make the volume 50 μL.

各々の反応液を37℃で3時間インキュベーションした。反応液全てを、前記で調製されたビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに添加した後、室温で1時間放置した。次いで、PCRチューブ内の溶液をピペッティングにより取り除いた後、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した。その後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一工程に相当する)。 Each reaction was incubated at 37 ° C. for 3 hours. All the reaction solutions were added to the PCR tube coated with streptavidin to which the biotin-labeled methylcytosine antibody prepared above was immobilized, and then allowed to stand at room temperature for 1 hour. Next, the solution in the PCR tube was removed by pipetting, and then 100 μL of washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO · 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] Was added. Thereafter, the buffer was removed by pipetting. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step of the measurement method of the present invention).

次に、このようにして得られたPCRチューブに、配列番号25及び配列番号26で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液(PF2及びPR2)及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、目的とするDNA領域(GPR7-2079-2176、配列番号27、メチル化シトシンもCで表す)におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is performed on the PCR tubes thus obtained using the primer solutions (PF2 and PR2) consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 and the following reaction conditions: Was used to amplify methylated DNA in the target DNA region (GPR7-2079-2176, SEQ ID NO: 27, methylated cytosine is also represented by C).

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF2:5'-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3'(配列番号25)
PR2:5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3'(配列番号26)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF2: 5'-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3 '(SEQ ID NO: 25)
PR2: 5'-TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG-3 '(SEQ ID NO: 26)

<目的とするDNA領域>
GPR7-2079-2176:5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'(配列番号27)
<Target DNA region>
GPR7-2079-2176: 5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3 '(SEQ ID NO: 27)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、3μMに調製された配列番号25及び配列番号26で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各5μLと、each 2mM dNTP5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold)5U/μLを0.25μLと、5Nベタイン水溶液10μLとを混合した後、更に当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで59℃にて30秒間さらに72℃にて45秒間を1サイクルとする保温を18サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、得られたPCR産物を1.5%アガロースゲル電気泳動に供することによりDNAの増幅を確認した。その結果を図2に示した(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。A処理群(無処理群)の場合、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)と、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)とは、DNAの増幅が確認されその増幅産物(目的とするDNA領域:GPR7−2079−2176)が得られた。アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UMでは、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。B処理群(HhaI処理群)の場合、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)では、増幅が確認されその増幅産物(目的とするDNA領域:GPR7−2079−2176)が得られたが、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UMでは、DNAの増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
As a PCR reaction solution, 5 μL each of a primer solution consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 prepared in 3 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer (100 mM Tris- 5 μL of HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin), 0.25 μL of thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold) 5 U / μL, and 10 μL of 5N betaine aqueous solution were mixed. Sterile ultrapure water was added to make the volume 50 μL. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was carried out under the conditions of 18 cycles of incubation at 95 ° C. for 30 seconds, then 59 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 45 seconds. It was.
After PCR, the obtained PCR product was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis to confirm DNA amplification. The result is shown in FIG. 2 (this corresponds to the third step of the measurement method of the present invention). In the case of the A treatment group (non-treatment group), a partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) not digested with HhaI and a partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / digested with HhaI With 98mer-HM (5), amplification of DNA was confirmed and the amplification product (target DNA region: GPR7-2079-2176) was obtained. In the unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-UM, amplification of DNA was not confirmed and the amplification product was not obtained. In the case of the B treatment group (HhaI treatment group), in the partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) that is not digested with HhaI, amplification was confirmed and the amplification product (target DNA region: GPR7- 2079-2176) was obtained, but with HhaI digested partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-HM (5) and unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-UM, No amplification of DNA was confirmed, and no amplification product was obtained.

実施例4
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 4
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計8本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムDNAについて、以下の配列番号28及び配列番号29で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマープライマー(PF1及びPR1)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(X、配列番号30、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域)を増幅した。   For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, PCR is performed using oligonucleotide primer primers (PF1 and PR1) and reaction conditions designed for PCR shown in SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 below. As a result, a DNA fragment (region corresponding to base number 25687390-25687775 shown in X, SEQ ID NO: 30, Genbank Accession No. NT — 029419, etc.) used as a test sample was amplified.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF1:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号28)
PR1:5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号29)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF1: 5′-CTCAGCACCCAGGCGGCC -3 ′ (SEQ ID NO: 28)
PR1: 5′-CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3 ′ (SEQ ID NO: 29)

<DNAフラグメント>
X:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3'(配列番号30)
<DNA fragment>
X: 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3 '(SEQ ID NO: 30)

PCRの反応液としては、鋳型とするゲノムDNAを5ngと、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μlと、each 2mM dNTPを5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μlと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μlを0.25μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μlとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで61℃にて30秒間更に72℃にて45秒間を1サイクルとする保温を40サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントXを精製した。
As PCR reaction solution, 5 ng of genomic DNA as a template, 3 μl each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μl each 2 mM dNTP, 10 × buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl) , 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) and 5 μl of thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μl are mixed, and sterilized ultrapure water is added thereto to bring the volume to 50 μl. What was used was used. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 40 cycles of incubation at 95 ° C. for 30 seconds, then at 61 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 45 seconds. It was.
After performing PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis, and DNA fragment X was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA).

得られたDNAフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこれらの操作を5回繰り返し、メチル化したDNAフラグメント(MX、配列番号31)を得た。   For a part of the obtained DNA fragment solution, 1 μl of SssI methylase (NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (NEB) and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) are mixed. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). Furthermore, these operations were repeated 5 times to obtain a methylated DNA fragment (MX, SEQ ID NO: 31).

<DNAフラグメント>(Nは5-メチルシトシンを示す)
MX:5'- CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG -3'(配列番号31)
<DNA fragment> (N represents 5-methylcytosine)
MX: 5'- CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG -3 '(SEQ ID NO: 31)

得られたDNAフラグメントXについて、以下の溶液を調製した。
溶液A:100pg/10μL TE溶液
溶液B:10pg/10μL TE溶液
溶液C:1pg/10μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the obtained DNA fragment X, the following solution was prepared.
Solution A: 100 pg / 10 μL TE solution Solution B: 10 pg / 10 μL TE solution Solution C: 1 pg / 10 μL TE solution Solution D: TE solution (negative control solution)

得られたDNAフラグメントMXについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA:100pg/10μL TE溶液
溶液MB:10pg/10μL TE溶液
溶液MC:1pg/10μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
The following solution was prepared for the obtained DNA fragment MX.
Solution MA: 100 pg / 10 μL TE solution Solution MB: 10 pg / 10 μL TE solution Solution MC: 1 pg / 10 μL TE solution Solution MD: TE solution (negative control solution)

また、配列番号32で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域の負鎖に相補性により結合可能な配列番号33〜配列番号44で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC1〜C12を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   In addition, counter oligonucleotides C1 to C12 having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 44 capable of binding by complementarity to the negative strand of the target DNA region comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 were synthesized. A TE buffer solution having a concentration of 0.01 μM was prepared.

<目的とするDNA領域>
X’:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号32)
<Target DNA region>
X ': 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (SEQ ID NO: 32)

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C1:5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' (配列番号33)
C2:5'- GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' (配列番号34)
C3:5'- CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' (配列番号35)
C4:5'- AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' (配列番号36)
C5:5'- ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' (配列番号37)
C6:5'- TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' (配列番号38)
C7:5'- CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' (配列番号39)
C8:5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' (配列番号40)
C9:5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3' (配列番号41)
C10:5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3' (配列番号42)
C11:5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3' (配列番号43)
C12:5'- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3' (配列番号44)
<Counter oligonucleotide>
C1: 5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG-3 '(SEQ ID NO: 33)
C2: 5'-GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG-3 '(SEQ ID NO: 34)
C3: 5′-CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3 ′ (SEQ ID NO: 35)
C4: 5'-AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG-3 '(SEQ ID NO: 36)
C5: 5'-ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 37)
C6: 5′-TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3 ′ (SEQ ID NO: 38)
C7: 5'-CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG-3 '(SEQ ID NO: 39)
C8: 5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG-3 '(SEQ ID NO: 40)
C9: 5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC-3 '(SEQ ID NO: 41)
C10: 5'-TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC-3 '(SEQ ID NO: 42)
C11: 5′-CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 43)
C12: 5'-CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG-3 '(SEQ ID NO: 44)

前記のDNAフラグメントXの溶液及びメチル化したDNAフラグメントMXの溶液の夫々について、以下の処理を施した。   The following treatment was applied to each of the DNA fragment X solution and the methylated DNA fragment MX solution.

PCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメント溶液10μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 10 μL of the DNA fragment solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of a buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 100 mM 5 μL of MgCl 2 solution and 5 μL of 1 mg / mL BSA solution were added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号28及び配列番号29で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF1及びPR1の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号32で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域X’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF1 and PR1 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, and the following reaction conditions, whereby SEQ ID NO: 32 The methylated DNA in the target DNA region X ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF1:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号28)
PR1:5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号29)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF1: 5'-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 28)
PR1: 5′-CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3 ′ (SEQ ID NO: 29)

<目的とするDNA領域>
X’:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号32)
<Target DNA region>
X ': 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (SEQ ID NO: 32)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで61℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を25サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 25 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 61 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図4に示した。メチル化されたDNAフラグメントMXの溶液MA、MB及びMCでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液MDでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていないDNAフラグメントXの溶液A、B、C及びDでは、増幅が確認されなかった。   The results are shown in FIG. Amplification was confirmed in the solutions MA, MB and MC of the methylated DNA fragment MX. No amplification was confirmed in the negative control solution MD. No amplification was confirmed in solutions A, B, C and D of DNA fragment X which was not methylated.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例5
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 5
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計8本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムDNAについて、以下の配列番号45及び配列番号46で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマープライマー(PF2及びPR2)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(Y、配列番号47、Genbank Accession No. ac009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域)を増幅した。   For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, PCR is performed using oligonucleotide primer primers (PF2 and PR2) and reaction conditions designed for PCR shown in SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46 below. Thus, a DNA fragment (region corresponding to base number 76606-76726 shown in Y, SEQ ID NO: 47, Genbank Accession No. ac009800, etc.) used as a test sample was amplified.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF2:5'- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' (配列番号45)
PR2:5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' (配列番号46)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF2: 5′-TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3 ′ (SEQ ID NO: 45)
PR2: 5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3 '(SEQ ID NO: 46)

<DNAフラグメント>
Y:5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'(配列番号47)
<DNA fragment>
Y: 5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3 '(SEQ ID NO: 47)

PCRの反応液としては、鋳型とするゲノムDNAを5ngと、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μlと、each 2mM dNTPを5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μlと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μlを0.25μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μlとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで60℃にて30秒間更に72℃にて45秒間を1サイクルとする保温を50サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントYを精製した。
As PCR reaction solution, 5 ng of genomic DNA as a template, 3 μl each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μl each 2 mM dNTP, 10 × buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl) , 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) and 5 μl of thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μl are mixed, and sterilized ultrapure water is added thereto to bring the volume to 50 μl. What was used was used. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 50 cycles of incubation at 95 ° C. for 30 seconds, then 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 45 seconds. It was.
After performing PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis, and DNA fragment Y was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA).

得られたDNAフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこの操作を5回繰り返し、メチル化したDNAフラグメント(MY、配列番号48)を得た。   For a part of the obtained DNA fragment solution, 1 μl of SssI methylase (NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (NEB) and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) are mixed. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). This operation was further repeated 5 times to obtain a methylated DNA fragment (MY, SEQ ID NO: 48).

<DNAフラグメント>(Nは5-メチルシトシンを示す)
MY:5'- GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3'(配列番号48)
<DNA fragment> (N represents 5-methylcytosine)
MY: 5'- GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3 '(SEQ ID NO: 48)

得られたDNAフラグメントYについて、以下の溶液を調製した。
溶液A:100pg/10μL TE溶液
溶液B:10pg/10μL TE溶液
溶液C:1pg/10μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the obtained DNA fragment Y, the following solution was prepared.
Solution A: 100 pg / 10 μL TE solution Solution B: 10 pg / 10 μL TE solution Solution C: 1 pg / 10 μL TE solution Solution D: TE solution (negative control solution)

得られたDNAフラグメントMYについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA:100pg/10μL TE溶液
溶液MB:10pg/10μL TE溶液
溶液MC:1pg/10μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
The following solution was prepared for the obtained DNA fragment MY.
Solution MA: 100 pg / 10 μL TE solution Solution MB: 10 pg / 10 μL TE solution Solution MC: 1 pg / 10 μL TE solution Solution MD: TE solution (negative control solution)

また、配列番号49で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域Y’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号50、塩基配列24及び配列番号52で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC13、C14、及びC15を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   Further, a counter oligonucleotide consisting of the base sequences represented by SEQ ID NO: 50, base sequence 24 and SEQ ID NO: 52, which can bind to the negative strand of the target DNA region Y ′ comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 by complementarity. C13, C14, and C15 were synthesized, and a TE buffer solution having a concentration of 0.01 μM was prepared.

<目的とするDNA領域>
Y’:5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'(配列番号49)
<Target DNA region>
Y ': 5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' (SEQ ID NO: 49)

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C13:5'- GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' (配列番号50)
C14:5'- CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG -3' (配列番号51)
C15:5'- CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG -3' (配列番号52)
<Counter oligonucleotide>
C13: 5'-GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA-3 '(SEQ ID NO: 50)
C14: 5′-CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG -3 ′ (SEQ ID NO: 51)
C15: 5'-CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG-3 '(SEQ ID NO: 52)

前記のDNAフラグメントYの溶液及びメチル化したDNAフラグメントMYの溶液の夫々について、以下の処理を施した。 The following treatment was performed on each of the DNA fragment Y solution and the methylated DNA fragment MY solution.

PCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメント溶液10μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 10 μL of the DNA fragment solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of a buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 100 mM 5 μL of MgCl 2 solution and 5 μL of 1 mg / mL BSA solution were added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で1時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号45及び配列番号46で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF2及びPR2の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号49で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域Y’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is carried out on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF2 and PR2 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46, and the following reaction conditions, whereby SEQ ID NO: 49 The methylated DNA in the target DNA region Y ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF2:5'- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3' (配列番号45)
PR2:5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3' (配列番号46)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF2: 5′-TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3 ′ (SEQ ID NO: 45)
PR2: 5'- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3 '(SEQ ID NO: 46)

<目的とするDNA領域>
Y’:5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3'(配列番号49)
<Target DNA region>
Y ': 5'- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3' (SEQ ID NO: 49)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで60℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を25サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 25 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図5に示した。メチル化されたDNAフラグメントMYの溶液MA、MB及びMCでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液MDでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていないDNAフラグメントYの溶液A、B、C及びDでは、増幅が確認されなかった。   The results are shown in FIG. Amplification was confirmed in the solutions MA, MB and MC of the methylated DNA fragment MY. No amplification was confirmed in the negative control solution MD. No amplification was confirmed in solutions A, B, C and D of DNA fragment Y which was not methylated.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例6
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 6
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計6本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 6 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

パン酵母酵母株X2180−1AをYPD培地(1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0)で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1x107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
得られたゲノムDNAから、以下の配列番号53及び配列番号54で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー(PF3及びPR3)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(S、配列番号55、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域)を増幅した。
Baker's yeast strain X2180-1A is cultured in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) until the turbidity is OD 600 0.6-1.0, and 10,000 g for 10 minutes Centrifugation was performed to prepare 1 × 10 7 yeast cells. The yeast genome was obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
The prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added, and the solution becomes clear. Incubated with stirring at 30 ° C for 1 hour until complete. Protoplasts were collected by centrifugation at 550 g for 10 minutes, suspended in buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then sodium dodecyl sulfate was added to 1% (w / v). Thereafter, it was incubated at 65 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 5M CH 3 COOK in a volume ratio of 2/5 was added and mixed, and after ice cooling for 30 minutes, the supernatant was recovered by centrifugation at 15,000 g for 30 minutes. Add 1/10 volume ratio of 3M CH 3 COONa and an equal amount of isopropanol to the collected supernatant, mix well, and centrifuge at 15,000g for 30 minutes at 4 ° C to rinse the precipitate with 70% ethanol. And recovered. The precipitate is dried, dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), RNase A (manufactured by Sigma) is added to a concentration of 40 μg / ml, and 1 at 37 ° C. After incubating for a time, proteinase K (manufactured by Sigma) was added to the mixture at 500 μg / ml and sodium dodecyl sulfate at 1% (w / v), and this was shaken at 55 ° C. for about 16 hours. That ’s it. After completion of the shaking, the mixture was extracted with phenol [saturated with 1M Tris-HCl (pH 8.0)] and chloroform. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added to this to 0.5 N, and then the resulting precipitate was recovered by ethanol precipitation. Genomic DNA was obtained by rinsing the collected precipitate with 70% ethanol.
From the obtained genomic DNA, PCR was carried out using oligonucleotide primers (PF3 and PR3) and reaction conditions designed for PCR shown in SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 below, as test samples. The DNA fragment used (S, SEQ ID NO: 55, region corresponding to base number 271743-272083 of yeast chromosome VII shown in Genbank Accession No. NC — 001139, etc.) was amplified.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF3: 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 53)
PR3: 5'-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3 '(SEQ ID NO: 54)

<DNAフラグメント>
S:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号55)
<DNA fragment>
S: 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3 '(SEQ ID NO: 55)

PCRの反応液としては、鋳型とするゲノムDNAを10ngと、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μlと、each 2mM dNTPを5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μlと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μlを0.25μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μlとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間更に72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を40サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントSを精製した。
As PCR reaction solution, 10 ng of genomic DNA as a template, 3 μl each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μl each 2 mM dNTP, 10 × buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl) , 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) and 5 μl of thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μl are mixed, and sterilized ultrapure water is added thereto to bring the volume to 50 μl. What was used was used. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 40 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 58 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After performing PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis, and DNA fragment S was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA).

得られたDNAフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこの操作を3回繰り返し、メチル化したDNAフラグメント(MS、配列番号56)を得た。   For a part of the obtained DNA fragment solution, 1 μl of SssI methylase (NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (NEB) and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) are mixed. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). This operation was further repeated three times to obtain a methylated DNA fragment (MS, SEQ ID NO: 56).

<DNAフラグメント>(Nは5-メチルシトシンを示す)
MS:5'- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号56)
<DNA fragment> (N represents 5-methylcytosine)
MS: 5'- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3 '(SEQ ID NO: 56)

得られたDNAフラグメントSについて、以下の溶液を調製した。
溶液A: 10pg/10μL TE溶液
溶液B: 1pg/10μL TE溶液
溶液C: TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the obtained DNA fragment S, the following solution was prepared.
Solution A: 10 pg / 10 μL TE solution Solution B: 1 pg / 10 μL TE solution Solution C: TE solution (negative control solution)

得られたDNAフラグメントMSについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA: 10pg/10μL TE溶液
溶液MB: 1pg/10μL TE溶液
溶液MC: TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the obtained DNA fragment MS, the following solution was prepared.
Solution MA: 10 pg / 10 μL TE solution Solution MB: 1 pg / 10 μL TE solution Solution MC: TE solution (negative control solution)

また、配列番号57で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域S’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号58〜配列番号67で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC16〜C25を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   In addition, counter oligonucleotides C16 to C25 having the base sequence represented by SEQ ID NO: 58 to SEQ ID NO: 67 capable of binding by complementarity to the negative strand of the target DNA region S ′ comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 A TE buffer solution having a concentration of 0.01 μM was prepared.

<目的とするDNA領域>
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号57)
<Target DNA region>
S ': 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (SEQ ID NO: 57)

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C16:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号58)
C17:5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号59)
C18:5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号60)
C19:5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号61)
C20:5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号62)
C21:5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号63)
C22:5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号64)
C23:5'- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号65)
C24:5'- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号66)
C25:5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号67)
<Counter oligonucleotide>
C16: 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 58)
C17: 5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3 '(SEQ ID NO: 59)
C18: 5'-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3 '(SEQ ID NO: 60)
C19: 5'-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 61)
C20: 5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3 '(SEQ ID NO: 62)
C21: 5'-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3 '(SEQ ID NO: 63)
C22: 5′-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3 ′ (SEQ ID NO: 64)
C23: 5'-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3 '(SEQ ID NO: 65)
C24: 5′-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 66)
C25: 5'-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 67)

前記のDNAフラグメントSの溶液及びメチル化したDNAフラグメントMSの溶液の夫々について、以下の処理を施した。   The following treatment was performed on each of the DNA fragment S solution and the methylated DNA fragment MS solution.

PCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメント溶液10μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 10 μL of the DNA fragment solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of a buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 100 mM 5 μL of MgCl 2 solution and 5 μL of 1 mg / mL BSA solution were added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号53及び配列番号54で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF3及びPR3の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号57で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域S’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is carried out on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF3 and PR3 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 and the following reaction conditions, so that SEQ ID NO: 57 The methylated DNA in the target DNA region S ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF3: 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 53)
PR3: 5′-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 54)

<目的とするDNA領域>
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号57)
<Target DNA region>
S ': 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (SEQ ID NO: 57)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を25サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then subjected to PCR under the conditions of 25 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 58 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図6に示した。メチル化されたDNAフラグメントMSの溶液MA、及びMBでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液MCでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていないDNAフラグメントSの溶液A、B、及びCでは、増幅が確認されなかった。   The results are shown in FIG. Amplification was confirmed in the solutions MA and MB of the methylated DNA fragment MS. No amplification was confirmed in the negative control solution MC. Amplification was not confirmed in solutions A, B, and C of DNA fragment S that was not methylated.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例7
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 7
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計6本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 6 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

パン酵母酵母株X2180−1AをYPD培地(1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0)で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1x107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
得られたゲノムDNAから、以下の配列番号68及び配列番号69で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー(PF4及びPR4)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(T、配列番号70、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域)を増幅した。
Baker's yeast strain X2180-1A is cultured in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) until the turbidity is OD 600 0.6-1.0, and 10,000 g for 10 minutes Centrifugation was performed to prepare 1 × 10 7 yeast cells. The yeast genome was obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
The prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added, and the solution becomes clear. Incubated with stirring at 30 ° C for 1 hour until complete. Protoplasts were collected by centrifugation at 550 g for 10 minutes, suspended in buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then sodium dodecyl sulfate was added to 1% (w / v). Thereafter, it was incubated at 65 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 5M CH 3 COOK in a volume ratio of 2/5 was added and mixed, and after ice cooling for 30 minutes, the supernatant was recovered by centrifugation at 15,000 g for 30 minutes. Add 1/10 volume ratio of 3M CH 3 COONa and an equal amount of isopropanol to the collected supernatant, mix well, and centrifuge at 15,000g for 30 minutes at 4 ° C to rinse the precipitate with 70% ethanol. And recovered. The precipitate is dried, dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), RNase A (manufactured by Sigma) is added to a concentration of 40 μg / ml, and 1 at 37 ° C. After incubating for a time, proteinase K (manufactured by Sigma) was added to the mixture at 500 μg / ml and sodium dodecyl sulfate at 1% (w / v), and this was shaken at 55 ° C. for about 16 hours. That ’s it. After completion of the shaking, the mixture was extracted with phenol [saturated with 1M Tris-HCl (pH 8.0)] and chloroform. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added to this to 0.5 N, and then the resulting precipitate was recovered by ethanol precipitation. Genomic DNA was obtained by rinsing the collected precipitate with 70% ethanol.
From the obtained genomic DNA, PCR was performed using the oligonucleotide primers (PF4 and PR4) and reaction conditions designed for PCR shown in SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69 below, as test samples. The DNA fragment to be used (T, the region corresponding to nucleotide number 384569-384685 of yeast chromosome VII shown in SEQ ID NO: 70, Genbank Accession No. NC — 001139, etc.) was amplified.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF4: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 68)
PR4: 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 69)

<DNAフラグメント>
T:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号70)
<DNA fragment>
T: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3 '(SEQ ID NO: 70)

PCRの反応液としては、鋳型とするゲノムDNAを10ngと、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μlと、each 2mM dNTPを5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μlと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μlを0.25μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μlとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間更に72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を40サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントTを精製した。
As PCR reaction solution, 10 ng of genomic DNA as a template, 3 μl each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μl each 2 mM dNTP, 10 × buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl) , 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) and 5 μl of thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μl are mixed, and sterilized ultrapure water is added thereto to bring the volume to 50 μl. What was used was used. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 40 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 58 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After performing PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis, and DNA fragment T was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA).

得られたDNAフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこの操作を3回繰り返し、メチル化したDNAフラグメント(MT、配列番号71)を得た。   For a part of the obtained DNA fragment solution, 1 μl of SssI methylase (NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (NEB) and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) are mixed. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). This operation was further repeated three times to obtain a methylated DNA fragment (MT, SEQ ID NO: 71).

<DNAフラグメント>(Nは5-メチルシトシンを示す)
MT:5'- GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号71)
<DNA fragment> (N represents 5-methylcytosine)
MT: 5'-GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT-3 '(SEQ ID NO: 71)

得られたDNAフラグメントTについて、以下の溶液を調製した。
溶液A: 10pg/10μL TE溶液
溶液B: 1pg/10μL TE溶液
溶液C: TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the DNA fragment T obtained, the following solution was prepared.
Solution A: 10 pg / 10 μL TE solution Solution B: 1 pg / 10 μL TE solution Solution C: TE solution (negative control solution)

得られたDNAフラグメントMTについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA: 10pg/10μL TE溶液
溶液MB: 1pg/10μL TE溶液
溶液MC: TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the obtained DNA fragment MT, the following solution was prepared.
Solution MA: 10 pg / 10 μL TE solution Solution MB: 1 pg / 10 μL TE solution Solution MC: TE solution (negative control solution)

また、配列番号72で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域T’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号73〜配列番号76で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC26〜C29を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   In addition, counter oligonucleotides C26 to C29 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 73 to SEQ ID NO: 76 capable of binding by complementarity to the negative strand of the target DNA region T ′ comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 A TE buffer solution having a concentration of 0.01 μM was prepared.

<目的とするDNA領域>
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号72)
<Target DNA region>
T ′: 5′-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3 ′ (SEQ ID NO: 72)

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C26:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号73)
C27:5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号74)
C28:5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号75)
C29:5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号76)
<Counter oligonucleotide>
C26: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 73)
C27: 5'-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3 '(SEQ ID NO: 74)
C28: 5'-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3 '(SEQ ID NO: 75)
C29: 5'-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 76)

前記のDNAフラグメントTの溶液及びメチル化したDNAフラグメントMTの溶液の夫々について、以下の処理を施した。   Each of the solution of the DNA fragment T and the solution of the methylated DNA fragment MT was subjected to the following treatment.

PCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメント溶液10μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 10 μL of the DNA fragment solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of a buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 100 mM 5 μL of MgCl 2 solution and 5 μL of 1 mg / mL BSA solution were added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号68及び配列番号69で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF4及びPR4の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号72で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域T’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF4 and PR4 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69, and the following reaction conditions, whereby SEQ ID NO: 72 The methylated DNA in the target DNA region T ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF4: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 68)
PR4: 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 69)

<目的とするDNA領域>
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号72)
<Target DNA region>
T ': 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3' (SEQ ID NO: 72)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を28サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of performing incubation for 28 cycles of 95 ° C. for 20 seconds, then 58 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図7に示した。メチル化されたDNAフラグメントMTの溶液MA、及びMBでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液MCでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていないDNAフラグメントTの溶液A、B、及びCでは、増幅が確認されなかった。   The results are shown in FIG. Amplification was confirmed in the solutions MA and MB of the methylated DNA fragment MT. No amplification was confirmed in the negative control solution MC. Amplification was not confirmed in solutions A, B, and C of DNA fragment T that was not methylated.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例8
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 8
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計8本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

パン酵母酵母株X2180−1AをYPD培地(1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0)で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1x107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
Baker's yeast strain X2180-1A is cultured in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) until the turbidity is OD 600 0.6-1.0, and 10,000 g for 10 minutes Centrifugation was performed to prepare 1 × 10 7 yeast cells. The yeast genome was obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
The prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added, and the solution becomes clear. Incubated with stirring at 30 ° C for 1 hour until complete. Protoplasts were collected by centrifugation at 550 g for 10 minutes, suspended in buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then sodium dodecyl sulfate was added to 1% (w / v). Thereafter, it was incubated at 65 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 5M CH 3 COOK in a volume ratio of 2/5 was added and mixed, and after ice cooling for 30 minutes, the supernatant was recovered by centrifugation at 15,000 g for 30 minutes. Add 1/10 volume ratio of 3M CH 3 COONa and an equal amount of isopropanol to the collected supernatant, mix well, and centrifuge at 15,000g for 30 minutes at 4 ° C to rinse the precipitate with 70% ethanol. And recovered. The precipitate is dried, dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), RNase A (manufactured by Sigma) is added to a concentration of 40 μg / ml, and 1 at 37 ° C. After incubating for a time, proteinase K (manufactured by Sigma) was added to the mixture at 500 μg / ml and sodium dodecyl sulfate at 1% (w / v), and this was shaken at 55 ° C. for about 16 hours. That ’s it. After completion of the shaking, the mixture was extracted with phenol [saturated with 1M Tris-HCl (pH 8.0)] and chloroform. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added to this to 0.5 N, and then the resulting precipitate was recovered by ethanol precipitation. Genomic DNA was obtained by rinsing the collected precipitate with 70% ethanol.

得られた酵母ゲノムDNAの一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこの操作を3回繰り返し、メチル化酵母ゲノムDNAを得た。   Part of the obtained yeast genomic DNA was mixed with 1 μl of SssI methylase (manufactured by NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (manufactured by NEB), and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB). Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). Further, this operation was repeated three times to obtain methylated yeast genomic DNA.

得られた酵母ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:0.1ng/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
About the obtained yeast genomic DNA, the following solutions were prepared.
Solution A: 10 ng / 5 μL TE solution Solution B: 1 ng / 5 μL TE solution Solution C: 0.1 ng / 5 μL TE solution Solution D: TE solution (negative control solution)

得られたメチル化酵母ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:0.1ng/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
About the obtained methylated yeast genomic DNA, the following solutions were prepared.
Solution MA: 10 ng / 5 μL TE solution Solution MB: 1 ng / 5 μL TE solution Solution MC: 0.1 ng / 5 μL TE solution Solution MD: TE solution (negative control solution)

上記の酵母ゲノムDNAの溶液及びメチル化酵母ゲノムDNAの溶液の夫々について、以下の処理を施した。   The following treatment was applied to each of the above-described yeast genomic DNA solution and methylated yeast genomic DNA solution.

PCRチューブに、上記に調製したゲノムDNA溶液5μLと、制限酵素XspIを5Uと、XspIに最適な10x緩衝液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl)2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を20μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。 In a PCR tube, mix 5 μL of the genomic DNA solution prepared above, 5 U of restriction enzyme XspI, and 2 μl of 10 × buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM MgCl 2 , 10 mM Dithiothreitol, 1000 mM KCl) optimal for XspI. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 20 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 1 hour.

配列番号77で示される塩基配列からなるDNAフラグメントS”(Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271742-272080に相当する領域)の負鎖に相補性により結合可能な配列番号58〜配列番号67で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC16〜C25を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   SEQ ID NO: that can bind by complementarity to the negative strand of DNA fragment S ″ (the region corresponding to base numbers 271742-272080 of yeast chromosome VII shown in Genbank Accession No. NC_001139 etc.) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 77 Counter oligonucleotides C16 to C25 having a nucleotide sequence represented by 58 to SEQ ID NO: 67 were synthesized, and TE buffer solutions having respective concentrations of 0.01 μM were prepared.

<DNAフラグメント>
S:5'- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3'(配列番号77)
<DNA fragment>
S: 5'- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3 '(SEQ ID NO: 77)

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C16:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号58)
C17:5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号59)
C18:5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号60)
C19:5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号61)
C20:5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号62)
C21:5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号63)
C22:5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号64)
C23:5'- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号65)
C24:5'- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号66)
C25:5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号67)
<Counter oligonucleotide>
C16: 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 58)
C17: 5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3 '(SEQ ID NO: 59)
C18: 5'-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3 '(SEQ ID NO: 60)
C19: 5'-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 61)
C20: 5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3 '(SEQ ID NO: 62)
C21: 5'-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3 '(SEQ ID NO: 63)
C22: 5′-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3 ′ (SEQ ID NO: 64)
C23: 5'-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3 '(SEQ ID NO: 65)
C24: 5′-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 66)
C25: 5'-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 67)

前記の酵母ゲノムDNA及びメチル化酵母ゲノムDNAの夫々の反応液について、以下の処理を施した。   Each reaction solution of the yeast genomic DNA and methylated yeast genomic DNA was subjected to the following treatment.

PCRチューブに、前記で調製したゲノムDNA反応液20μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 20 μL of the genomic DNA reaction solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 100 mM MgCl 2 solution (5 μL) and 1 mg / mL BSA solution (5 μL) were added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make a volume of 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号53及び配列番号54で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF3及びPR3の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号57で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域S’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is carried out on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF3 and PR3 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 and the following reaction conditions, so that SEQ ID NO: 57 The methylated DNA in the target DNA region S ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF3: 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 53)
PR3: 5′-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 54)

<目的とするDNA領域>
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号57)
<Target DNA region>
S ': 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (SEQ ID NO: 57)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を31サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was carried out under the conditions of 31 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 58 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図8に示した。メチル化酵母ゲノムDNAの溶液MA、MB及びMCでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液MDでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液A、B、C及びDでは、増幅が確認されなかった。   The results are shown in FIG. Amplification was confirmed in the solutions MA, MB and MC of methylated yeast genomic DNA. No amplification was confirmed in the negative control solution MD. No amplification was confirmed in the unmethylated yeast genomic DNA solutions A, B, C and D.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例9
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 9
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計8本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

パン酵母酵母株X2180−1AをYPD培地(1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0)で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1x107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
Baker's yeast strain X2180-1A is cultured in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) until the turbidity is OD 600 0.6-1.0, and 10,000 g for 10 minutes Centrifugation was performed to prepare 1 × 10 7 yeast cells. The yeast genome was obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
The prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added, and the solution becomes clear. Incubated with stirring at 30 ° C for 1 hour until complete. Protoplasts were collected by centrifugation at 550 g for 10 minutes, suspended in buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then sodium dodecyl sulfate was added to 1% (w / v). Thereafter, it was incubated at 65 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 5M CH 3 COOK in a volume ratio of 2/5 was added and mixed, and after ice cooling for 30 minutes, the supernatant was recovered by centrifugation at 15,000 g for 30 minutes. Add 1/10 volume ratio of 3M CH 3 COONa and an equal amount of isopropanol to the collected supernatant, mix well, and centrifuge at 15,000g for 30 minutes at 4 ° C to rinse the precipitate with 70% ethanol. And recovered. The precipitate is dried, dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), RNase A (manufactured by Sigma) is added to a concentration of 40 μg / ml, and 1 at 37 ° C. After incubating for a time, proteinase K (manufactured by Sigma) was added to the mixture at 500 μg / ml and sodium dodecyl sulfate at 1% (w / v), and this was shaken at 55 ° C. for about 16 hours. That ’s it. After completion of the shaking, the mixture was extracted with phenol [saturated with 1M Tris-HCl (pH 8.0)] and chloroform. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added to this to 0.5 N, and then the resulting precipitate was recovered by ethanol precipitation. Genomic DNA was obtained by rinsing the collected precipitate with 70% ethanol.

得られた酵母ゲノムDNAの一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこの操作を3回繰り返し、メチル化酵母ゲノムDNAを得た。   Part of the obtained yeast genomic DNA was mixed with 1 μl of SssI methylase (manufactured by NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (manufactured by NEB), and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB). Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). Further, this operation was repeated three times to obtain methylated yeast genomic DNA.

得られた酵母ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:0.1ng/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
About the obtained yeast genomic DNA, the following solutions were prepared.
Solution A: 10 ng / 5 μL TE solution Solution B: 1 ng / 5 μL TE solution Solution C: 0.1 ng / 5 μL TE solution Solution D: TE solution (negative control solution)

得られたメチル化酵母ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:0.1ng/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
About the obtained methylated yeast genomic DNA, the following solutions were prepared.
Solution MA: 10 ng / 5 μL TE solution Solution MB: 1 ng / 5 μL TE solution Solution MC: 0.1 ng / 5 μL TE solution Solution MD: TE solution (negative control solution)

上記の酵母ゲノムDNAの溶液及びメチル化酵母ゲノムDNAの溶液の夫々について、以下の処理を施した。 The following treatment was applied to each of the above-described yeast genomic DNA solution and methylated yeast genomic DNA solution.

PCRチューブに、上記に調製したゲノムDNA溶液5μLと、制限酵素XspIを5Uと、XspIに最適な10x緩衝液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl)2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を20μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。 In a PCR tube, mix 5 μL of the genomic DNA solution prepared above, 5 U of restriction enzyme XspI, and 2 μl of 10 × buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM MgCl 2 , 10 mM Dithiothreitol, 1000 mM KCl) optimal for XspI. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 20 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 1 hour.

配列番号78で示される塩基配列からなるDNAフラグメントT”(Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域)の負鎖に相補性により結合可能な配列番号73〜配列番号76及び配列番号79〜配列番号82で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC26〜C33を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   SEQ ID NO: that can bind by complementarity to the negative strand of DNA fragment T ″ (the region corresponding to base numbers 384523-384766 of yeast chromosome VII shown in Genbank Accession No. NC — 001139 etc.) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 78 Counter oligonucleotides C26 to C33 consisting of the nucleotide sequences represented by 73 to SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 79 to SEQ ID NO: 82 were synthesized, and TE buffer solutions each having a concentration of 0.01 μM were prepared.

<DNAフラグメント>
T:5'- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3'(配列番号78)
<DNA fragment>
T: 5'-TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGCATGTGTGTTGCGCGCTG

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C26:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号73)
C27:5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号74)
C28:5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号75)
C29:5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号76)
C30:5'- AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3' (配列番号79)
C31:5'- GCGATCGCACACGAGGAGACA -3' (配列番号80)
C32:5'- AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3' (配列番号81)
C33:5'- AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3' (配列番号82)
<Counter oligonucleotide>
C26: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 73)
C27: 5'-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3 '(SEQ ID NO: 74)
C28: 5'-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3 '(SEQ ID NO: 75)
C29: 5'-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 76)
C30: 5′-AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3 ′ (SEQ ID NO: 79)
C31: 5′-GCGATCGCACACGAGGAGACA -3 ′ (SEQ ID NO: 80)
C32: 5'-AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC-3 '(SEQ ID NO: 81)
C33: 5'-AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC-3 '(SEQ ID NO: 82)

前記の酵母ゲノムDNA及びメチル化酵母ゲノムDNAの夫々の反応液について、以下の処理を施した。 Each reaction solution of the yeast genomic DNA and methylated yeast genomic DNA was subjected to the following treatment.

PCRチューブに、前記で調製したゲノムDNAの反応液20μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 20 μL of the genomic DNA reaction solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of a buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 5 μL of 100 mM MgCl 2 solution and 5 μL of 1 mg / mL BSA solution were added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to adjust the volume to 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号68及び配列番号69で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF4及びPR4の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号72で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域T’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF4 and PR4 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69, and the following reaction conditions, whereby SEQ ID NO: 72 The methylated DNA in the target DNA region T ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF4: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 68)
PR4: 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 69)

<目的とするDNA領域>
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号72)
<Target DNA region>
T ': 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3' (SEQ ID NO: 72)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を31サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was carried out under the conditions of 31 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 58 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図9に示した。メチル化酵母ゲノムDNAの溶液MA、MB及びMCでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液MDでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液A、B、C及びDでは、増幅が確認されなかった。   The results are shown in FIG. Amplification was confirmed in the solutions MA, MB and MC of methylated yeast genomic DNA. No amplification was confirmed in the negative control solution MD. No amplification was confirmed in the unmethylated yeast genomic DNA solutions A, B, C and D.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例10
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 10
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計8本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムDNAについて、以下の配列番号28及び配列番号29で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマープライマー(PF1及びPR1)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(X、配列番号30、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域)を増幅した。   For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, PCR is performed using oligonucleotide primer primers (PF1 and PR1) and reaction conditions designed for PCR shown in SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 below. As a result, a DNA fragment (region corresponding to base number 25687390-25687775 shown in X, SEQ ID NO: 30, Genbank Accession No. NT — 029419, etc.) used as a test sample was amplified.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF1:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号28)
PR1:5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号29)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF1: 5′-CTCAGCACCCAGGCGGCC -3 ′ (SEQ ID NO: 28)
PR1: 5′-CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3 ′ (SEQ ID NO: 29)

<DNAフラグメント>
X:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3'(配列番号30)
<DNA fragment>
X: 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3 '(SEQ ID NO: 30)

PCRの反応液としては、鋳型とするゲノムDNAを5ngと、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μlと、each 2mM dNTPを5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μlと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μlを0.25μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μlとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで61℃にて30秒間更に72℃にて45秒間を1サイクルとする保温を40サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントXを精製した。
As PCR reaction solution, 5 ng of genomic DNA as a template, 3 μl each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μl each 2 mM dNTP, 10 × buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl) , 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) and 5 μl of thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μl are mixed, and sterilized ultrapure water is added thereto to bring the volume to 50 μl. What was used was used. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 40 cycles of incubation at 95 ° C. for 30 seconds, then at 61 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 45 seconds. It was.
After performing PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis, and DNA fragment X was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA).

得られたDNAフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこれらの操作を5回繰り返し、メチル化したDNAフラグメント(MX、配列番号31)を得た。   For a part of the obtained DNA fragment solution, 1 μl of SssI methylase (NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (NEB) and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) are mixed. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). Furthermore, these operations were repeated 5 times to obtain a methylated DNA fragment (MX, SEQ ID NO: 31).

<DNAフラグメント>(Nは5-メチルシトシンを示す)
MX:5'- CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG -3'(配列番号31)
<DNA fragment> (N represents 5-methylcytosine)
MX: 5'- CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG -3 '(SEQ ID NO: 31)

得られたDNAフラグメントXについて、以下の溶液を調製した。
溶液A:100pg/10μL TE溶液
溶液B:10pg/10μL TE溶液
溶液C:1pg/10μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the obtained DNA fragment X, the following solution was prepared.
Solution A: 100 pg / 10 μL TE solution Solution B: 10 pg / 10 μL TE solution Solution C: 1 pg / 10 μL TE solution Solution D: TE solution (negative control solution)

得られたDNAフラグメントMXについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA:100pg/10μL TE溶液
溶液MB:10pg/10μL TE溶液
溶液MC:1pg/10μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
The following solution was prepared for the obtained DNA fragment MX.
Solution MA: 100 pg / 10 μL TE solution Solution MB: 10 pg / 10 μL TE solution Solution MC: 1 pg / 10 μL TE solution Solution MD: TE solution (negative control solution)

また配列番号32で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域X’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号33〜配列番号44で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC1〜C12を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   In addition, counter oligonucleotides C1 to C12 having the base sequence represented by SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 44, which can bind to the negative strand of the target DNA region X ′ comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 by complementarity, are synthesized Then, TE buffer solutions each having a concentration of 0.01 μM were prepared.

<目的とするDNA領域>
X’:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号32)
<Target DNA region>
X ': 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (SEQ ID NO: 32)

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C1:5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' (配列番号33)
C2:5'- GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' (配列番号34)
C3:5'- CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' (配列番号35)
C4:5'- AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' (配列番号36)
C5:5'- ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' (配列番号37)
C6:5'- TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' (配列番号38)
C7:5'- CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' (配列番号39)
C8:5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' (配列番号40)
C9:5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3' (配列番号41)
C10:5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3' (配列番号42)
C11:5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3' (配列番号43)
C12:5'- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3' (配列番号44)
<Counter oligonucleotide>
C1: 5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG-3 '(SEQ ID NO: 33)
C2: 5'-GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG-3 '(SEQ ID NO: 34)
C3: 5′-CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3 ′ (SEQ ID NO: 35)
C4: 5'-AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG-3 '(SEQ ID NO: 36)
C5: 5'-ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 37)
C6: 5′-TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3 ′ (SEQ ID NO: 38)
C7: 5'-CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG-3 '(SEQ ID NO: 39)
C8: 5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG-3 '(SEQ ID NO: 40)
C9: 5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC-3 '(SEQ ID NO: 41)
C10: 5'-TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC-3 '(SEQ ID NO: 42)
C11: 5′-CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 43)
C12: 5'-CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG-3 '(SEQ ID NO: 44)

PCRチューブに前記に調製したDNAフラグメント溶液10μLと、調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In the PCR tube, 10 μL of the DNA fragment solution prepared above, 10 μL of the prepared counter oligonucleotide solution, 5 μL of buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 100 mM MgCl 2 solution 5 μL and 5 μL of 1 mg / mL BSA solution were added, and sterilized ultrapure water was further added to the mixture to make a liquid volume of 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、上記に調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第二工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).

上記の処理を施したビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)を5μLと、BSA(Bovine serum albumin 1mg/ml)を5μLと、メチル化感受性制限酵素HhaIを16Uを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとした各々の混合液を37℃で1時間インキュベーションした。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第二工程に相当する)。 A buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc2, 5 mM Dithiothreitol) and 5 μL of BSA (Bovine) were added to the PCR tube coated with streptavidin to which the biotin-labeled methylcytosine antibody subjected to the above treatment was immobilized. 5 μL of serum albumin (1 mg / ml) and 16 U of methylation sensitive restriction enzyme HhaI were added, and each mixture was further incubated at 37 ° C. for 1 hour by adding sterile ultrapure water to the mixture to a volume of 50 μL. . Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号28及び配列番号29で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF1及びPR1の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号32で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域X’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF1 and PR1 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, and the following reaction conditions, whereby SEQ ID NO: 32 The methylated DNA in the target DNA region X ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF1:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号28)
PR1:5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号29)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF1: 5'-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 28)
PR1: 5′-CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3 ′ (SEQ ID NO: 29)

<目的とするDNA領域>
X’:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号32)
<Target DNA region>
X ': 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (SEQ ID NO: 32)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで61℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を25サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 25 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 61 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図10に示した。メチル化されたDNAフラグメントMXの溶液MA、MB及びMCでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液MDでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていないDNAフラグメントXの溶液A、B、C及びDでは、増幅が確認されなかった。   The results are shown in FIG. Amplification was confirmed in the solutions MA, MB and MC of the methylated DNA fragment MX. No amplification was confirmed in the negative control solution MD. No amplification was confirmed in solutions A, B, C and D of DNA fragment X which was not methylated.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例11
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 11
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計8本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

パン酵母酵母株X2180−1AをYPD培地(1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0)で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1x107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
得られたゲノムDNAから、以下の配列番号53及び配列番号54で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー(PF3及びPR3)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(S、配列番号55、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域)を増幅した。
Baker's yeast strain X2180-1A is cultured in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) until the turbidity is OD 600 0.6-1.0, and 10,000 g for 10 minutes Centrifugation was performed to prepare 1 × 10 7 yeast cells. The yeast genome was obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
The prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added, and the solution becomes clear. Incubated with stirring at 30 ° C for 1 hour until complete. Protoplasts were collected by centrifugation at 550 g for 10 minutes, suspended in buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then sodium dodecyl sulfate was added to 1% (w / v). Thereafter, it was incubated at 65 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 5M CH 3 COOK in a volume ratio of 2/5 was added and mixed, and after ice cooling for 30 minutes, the supernatant was recovered by centrifugation at 15,000 g for 30 minutes. Add 1/10 volume ratio of 3M CH 3 COONa and an equal amount of isopropanol to the collected supernatant, mix well, and centrifuge at 15,000g for 30 minutes at 4 ° C to rinse the precipitate with 70% ethanol. And recovered. The precipitate is dried, dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), RNase A (manufactured by Sigma) is added to a concentration of 40 μg / ml, and 1 at 37 ° C. After incubating for a time, proteinase K (manufactured by Sigma) was added to the mixture at 500 μg / ml and sodium dodecyl sulfate at 1% (w / v), and this was shaken at 55 ° C. for about 16 hours. That ’s it. After completion of the shaking, the mixture was extracted with phenol [saturated with 1M Tris-HCl (pH 8.0)] and chloroform. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added to this to 0.5 N, and then the resulting precipitate was recovered by ethanol precipitation. Genomic DNA was obtained by rinsing the collected precipitate with 70% ethanol.
From the obtained genomic DNA, PCR was carried out using oligonucleotide primers (PF3 and PR3) and reaction conditions designed for PCR shown in SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 below, as test samples. The DNA fragment used (S, SEQ ID NO: 55, region corresponding to base number 271743-272083 of yeast chromosome VII shown in Genbank Accession No. NC — 001139, etc.) was amplified.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF3: 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 53)
PR3: 5'-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3 '(SEQ ID NO: 54)

<DNAフラグメント>
S:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号55)
<DNA fragment>
S: 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3 '(SEQ ID NO: 55)

PCRの反応液としては、鋳型とするゲノムDNAを10ngと、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μlと、each 2mM dNTPを5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μlと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μlを0.25μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μlとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間更に72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を40サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントSを精製した。
As PCR reaction solution, 10 ng of genomic DNA as a template, 3 μl each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μl each 2 mM dNTP, 10 × buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl) , 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) and 5 μl of thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μl are mixed, and sterilized ultrapure water is added thereto to bring the volume to 50 μl. What was used was used. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 40 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 58 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After performing PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis, and DNA fragment S was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA).

得られたDNAフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこの操作を3回繰り返し、メチル化したDNAフラグメント(MS、配列番号56)を得た。   For a part of the obtained DNA fragment solution, 1 μl of SssI methylase (NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (NEB) and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) are mixed. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). This operation was further repeated three times to obtain a methylated DNA fragment (MS, SEQ ID NO: 56).

<DNAフラグメント>(Nは5-メチルシトシンを示す)
MS:5'- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号56)
<DNA fragment> (N represents 5-methylcytosine)
MS: 5'- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3 '(SEQ ID NO: 56)

得られたDNAフラグメントSについて、以下の溶液を調製した。
溶液A:100pg/10μL TE溶液
溶液B:10pg/10μL TE溶液
溶液C:1pg/10μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the obtained DNA fragment S, the following solution was prepared.
Solution A: 100 pg / 10 μL TE solution Solution B: 10 pg / 10 μL TE solution Solution C: 1 pg / 10 μL TE solution Solution D: TE solution (negative control solution)

得られたDNAフラグメントMSについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA:100pg/10μL TE溶液
溶液MB:10pg/10μL TE溶液
溶液MC:1pg/10μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the obtained DNA fragment MS, the following solution was prepared.
Solution MA: 100 pg / 10 μL TE solution Solution MB: 10 pg / 10 μL TE solution Solution MC: 1 pg / 10 μL TE solution Solution MD: TE solution (negative control solution)

また、配列番号57で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域S’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号58〜配列番号67で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC16〜C25を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   In addition, counter oligonucleotides C16 to C25 having the base sequence represented by SEQ ID NO: 58 to SEQ ID NO: 67 capable of binding by complementarity to the negative strand of the target DNA region S ′ comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 A TE buffer solution having a concentration of 0.01 μM was prepared.

<目的とするDNA領域>
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3'(配列番号57)
<Target DNA region>
S ': 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (SEQ ID NO: 57)

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C16:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号58)
C17:5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号59)
C18:5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号60)
C19:5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号61)
C20:5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号62)
C21:5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号63)
C22:5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号64)
C23:5'- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号65)
C24:5'- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号66)
C25:5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号67)
<Counter oligonucleotide>
C16: 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 58)
C17: 5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3 '(SEQ ID NO: 59)
C18: 5'-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3 '(SEQ ID NO: 60)
C19: 5'-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 61)
C20: 5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3 '(SEQ ID NO: 62)
C21: 5'-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3 '(SEQ ID NO: 63)
C22: 5′-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3 ′ (SEQ ID NO: 64)
C23: 5'-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3 '(SEQ ID NO: 65)
C24: 5′-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 66)
C25: 5'-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 67)

前記のDNAフラグメントSの溶液及びメチル化したDNAフラグメントMSの溶液の夫々について、以下の処理を施した。   The following treatment was performed on each of the DNA fragment S solution and the methylated DNA fragment MS solution.

PCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメント溶液10μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 10 μL of the DNA fragment solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of a buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 100 mM 5 μL of MgCl 2 solution and 5 μL of 1 mg / mL BSA solution were added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

上記の処理を施したビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)を5μLと、BSA(Bovine serum albumin 1mg/ml)を5μLと、メチル化感受性制限酵素HhaIを16Uを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとした各々の混合液を37℃で1時間インキュベーションした。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第二工程に相当する)。 To the PCR tube coated with the biotin-labeled methylcytosine antibody subjected to the above treatment and coated with streptavidin, 5 μL of a buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) and BSA ( Bovine serum albumin (1 mg / ml), 5 μL, methylation sensitive restriction enzyme HhaI, 16 U, and sterilized ultrapure water were added to the mixture to bring the volume to 50 μL. did. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号53及び配列番号54で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF3及びPR3の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号57で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域S’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is carried out on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF3 and PR3 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 and the following reaction conditions, so that SEQ ID NO: 57 The methylated DNA in the target DNA region S ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF3: 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 53)
PR3: 5′-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 54)

<目的とするDNA領域>
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号57)
<Target DNA region>
S ': 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (SEQ ID NO: 57)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を25サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then subjected to PCR under the conditions of 25 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 58 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図11に示した。メチル化されたDNAフラグメントMSの溶液MA、MB及びMCでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液MDでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていないDNAフラグメントSの溶液A、B、C及びDでは、増幅が確認されなかった。   The results are shown in FIG. Amplification was confirmed in the solutions MA, MB and MC of the methylated DNA fragment MS. No amplification was confirmed in the negative control solution MD. No amplification was confirmed in solutions A, B, C and D of DNA fragment S which was not methylated.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例12
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 12
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計8本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

パン酵母酵母株X2180−1AをYPD培地(1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0)で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1x107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
得られたゲノムDNAから、以下の配列番号68及び配列番号69で示されるPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー(PF4及びPR4)及び反応条件を用いてPCRを行うことにより、供試サンプルとして用いられるDNAフラグメント(T、配列番号70、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域)を増幅した。
Baker's yeast strain X2180-1A is cultured in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) until the turbidity is OD 600 0.6-1.0, and 10,000 g for 10 minutes Centrifugation was performed to prepare 1 × 10 7 yeast cells. The yeast genome was obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
The prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added, and the solution becomes clear. Incubated with stirring at 30 ° C for 1 hour until complete. Protoplasts were collected by centrifugation at 550 g for 10 minutes, suspended in buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then sodium dodecyl sulfate was added to 1% (w / v). Thereafter, it was incubated at 65 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 5M CH 3 COOK in a volume ratio of 2/5 was added and mixed, and after ice cooling for 30 minutes, the supernatant was recovered by centrifugation at 15,000 g for 30 minutes. Add 1/10 volume ratio of 3M CH 3 COONa and an equal amount of isopropanol to the collected supernatant, mix well, and centrifuge at 15,000g for 30 minutes at 4 ° C to rinse the precipitate with 70% ethanol. And recovered. The precipitate is dried, dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), RNase A (manufactured by Sigma) is added to a concentration of 40 μg / ml, and 1 at 37 ° C. After incubating for a time, proteinase K (manufactured by Sigma) was added to the mixture at 500 μg / ml and sodium dodecyl sulfate at 1% (w / v), and this was shaken at 55 ° C. for about 16 hours. That ’s it. After completion of the shaking, the mixture was extracted with phenol [saturated with 1M Tris-HCl (pH 8.0)] and chloroform. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added to this to 0.5 N, and then the resulting precipitate was recovered by ethanol precipitation. Genomic DNA was obtained by rinsing the collected precipitate with 70% ethanol.
From the obtained genomic DNA, PCR was performed using the oligonucleotide primers (PF4 and PR4) and reaction conditions designed for PCR shown in SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69 below, as test samples. The DNA fragment to be used (T, the region corresponding to nucleotide number 384569-384685 of yeast chromosome VII shown in SEQ ID NO: 70, Genbank Accession No. NC — 001139, etc.) was amplified.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF4: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 68)
PR4: 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 69)

<DNAフラグメント>
T:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号70)
<DNA fragment>
T: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3 '(SEQ ID NO: 70)

PCRの反応液としては、鋳型とするゲノムDNAを10ngと、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μlと、each 2mM dNTPを5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μlと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μlを0.25μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μlとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間更に72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を40サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により、DNAフラグメントTを精製した。
As PCR reaction solution, 10 ng of genomic DNA as a template, 3 μl each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μl each 2 mM dNTP, 10 × buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl) , 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) and 5 μl of thermostable DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μl are mixed, and sterilized ultrapure water is added thereto to bring the volume to 50 μl. What was used was used. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 40 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 58 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After performing PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis, and DNA fragment T was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA).

得られたDNAフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこの操作を3回繰り返し、メチル化したDNAフラグメント(MT、配列番号71)を得た。   For a part of the obtained DNA fragment solution, 1 μl of SssI methylase (NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (NEB) and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) are mixed. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). This operation was further repeated three times to obtain a methylated DNA fragment (MT, SEQ ID NO: 71).

<DNAフラグメント>(Nは5-メチルシトシンを示す)
MT:5'- GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号71)
<DNA fragment> (N represents 5-methylcytosine)
MT: 5'-GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT-3 '(SEQ ID NO: 71)

得られたDNAフラグメントTについて、以下の溶液を調製した。
溶液A:100pg/10μL TE溶液
溶液B:10pg/10μL TE溶液
溶液C:1pg/10μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the DNA fragment T obtained, the following solution was prepared.
Solution A: 100 pg / 10 μL TE solution Solution B: 10 pg / 10 μL TE solution Solution C: 1 pg / 10 μL TE solution Solution D: TE solution (negative control solution)

得られたDNAフラグメントMTについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA:100pg/10μL TE溶液
溶液MB:10pg/10μL TE溶液
溶液MC:1pg/10μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
For the obtained DNA fragment MT, the following solution was prepared.
Solution MA: 100 pg / 10 μL TE solution Solution MB: 10 pg / 10 μL TE solution Solution MC: 1 pg / 10 μL TE solution Solution MD: TE solution (negative control solution)

また、配列番号72で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域T’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号73〜配列番号76で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC26〜C29を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   In addition, counter oligonucleotides C26 to C29 consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 73 to SEQ ID NO: 76 capable of binding by complementarity to the negative strand of the target DNA region T ′ comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 A TE buffer solution having a concentration of 0.01 μM was prepared.

<目的とするDNA領域>
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3'(配列番号72)
<Target DNA region>
T ′: 5′-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3 ′ (SEQ ID NO: 72)

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C26:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号73)
C27:5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号74)
C28:5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号75)
C29:5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号76)
<Counter oligonucleotide>
C26: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 73)
C27: 5'-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3 '(SEQ ID NO: 74)
C28: 5'-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3 '(SEQ ID NO: 75)
C29: 5'-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 76)

前記のDNAフラグメントTの溶液及びメチル化したDNAフラグメントMTの溶液の夫々について、以下の処理を施した。   Each of the solution of the DNA fragment T and the solution of the methylated DNA fragment MT was subjected to the following treatment.

PCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメント溶液10μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 10 μL of the DNA fragment solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of a buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 100 mM 5 μL of MgCl 2 solution and 5 μL of 1 mg / mL BSA solution were added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to make the volume 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

上記の処理を施したビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)を5μLと、BSA(Bovine serum albumin 1mg/ml)を5μLと、メチル化感受性制限酵素HhaIを16Uを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとした各々の混合液を37℃で1時間インキュベーションした。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第二工程に相当する)。 A buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc2, 5 mM Dithiothreitol) and 5 μL of BSA (Bovine) were added to the PCR tube coated with streptavidin to which the biotin-labeled methylcytosine antibody subjected to the above treatment was immobilized. 5 μL of serum albumin (1 mg / ml) and 16 U of methylation sensitive restriction enzyme HhaI were added, and each mixture was further incubated at 37 ° C. for 1 hour by adding sterile ultrapure water to the mixture to a volume of 50 μL. . Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号68及び配列番号69で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF4及びPR4の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号72で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域T’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF4 and PR4 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69, and the following reaction conditions, whereby SEQ ID NO: 72 The methylated DNA in the target DNA region T ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF4: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 68)
PR4: 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 69)

<目的とするDNA領域>
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号72)
<Target DNA region>
T ': 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3' (SEQ ID NO: 72)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を28サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of performing incubation for 28 cycles of 95 ° C. for 20 seconds, then 58 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図12に示した。メチル化されたDNAフラグメントMTの溶液MA、MB及びMCでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液MDでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていないDNAフラグメントTの溶液A、B、C及びDでは、増幅が確認されなかった。   The results are shown in FIG. Amplification was confirmed in the solutions MA, MB and MC of the methylated DNA fragment MT. No amplification was confirmed in the negative control solution MD. No amplification was confirmed in solutions A, B, C and D of DNA fragment T which was not methylated.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例13
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 13
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計6本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 6 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムDNAについて、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこの操作を3回繰り返し、メチル化ヒトゲノムDNAを得た。   For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, 1 μl of SssI methylase (NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (NEB), and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB) The mixture was mixed, and sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). This operation was further repeated three times to obtain methylated human genomic DNA.

クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:TE溶液(ネガティブコントロール液)
For human blood-derived genomic DNA purchased from Clontech, the following solution was prepared.
Solution A: 10ng / 5μL TE solution Solution B: 1ng / 5μL TE solution Solution C: TE solution (negative control solution)

得られたメチル化ヒトゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:TE溶液(ネガティブコントロール液)
The following solutions were prepared for the obtained methylated human genomic DNA.
Solution MA: 10 ng / 5 μL TE solution Solution MB: 1 ng / 5 μL TE solution Solution MC: TE solution (negative control solution)

上記のヒトゲノムDNAの溶液及びメチル化ヒトゲノムDNAの溶液の夫々について、以下の処理を施した。   The following treatment was applied to each of the above-described human genomic DNA solution and methylated human genomic DNA solution.

PCRチューブに、上記に調製したゲノムDNA溶液5μLと、制限酵素AluIを6Uと、AluIに最適な10x緩衝液(100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、500mM NaCl)1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を10μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。 In a PCR tube, mix 5 μL of the genomic DNA solution prepared above, 6 U of restriction enzyme AluI, and 1 μl of 10 × buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM MgCl 2 , 10 mM Dithiothreitol, 500 mM NaCl) optimal for AluI. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 10 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 1 hour.

配列番号83で示される塩基配列からなるDNAフラグメントX”(Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域)の負鎖に相補性により結合可能な配列番号33〜配列番号44で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC1〜C12を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: that can bind by complementarity to the negative strand of DNA fragment X ″ (region corresponding to base numbers 25687390-25687775 shown in Genbank Accession No. NT_029419 etc.) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 83 Counter oligonucleotides C1 to C12 having a base sequence represented by 44 were synthesized, and TE buffer solutions having a concentration of 0.01 μM were prepared.

<DNAフラグメント>
X”:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号83)
<DNA fragment>
X ": 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3 '(SEQ ID NO: 83)

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C1:5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3' (配列番号33)
C2:5'- GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3' (配列番号34)
C3:5'- CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3' (配列番号35)
C4:5'- AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3' (配列番号36)
C5:5'- ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3' (配列番号37)
C6:5'- TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3' (配列番号38)
C7:5'- CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3' (配列番号39)
C8:5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3' (配列番号40)
C9:5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3' (配列番号41)
C10:5'- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3' (配列番号42)
C11:5'- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3' (配列番号43)
C12:5'- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3' (配列番号44)
<Counter oligonucleotide>
C1: 5'- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG-3 '(SEQ ID NO: 33)
C2: 5'-GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG-3 '(SEQ ID NO: 34)
C3: 5′-CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3 ′ (SEQ ID NO: 35)
C4: 5'-AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG-3 '(SEQ ID NO: 36)
C5: 5'-ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 37)
C6: 5′-TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3 ′ (SEQ ID NO: 38)
C7: 5'-CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG-3 '(SEQ ID NO: 39)
C8: 5'- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG-3 '(SEQ ID NO: 40)
C9: 5'- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC-3 '(SEQ ID NO: 41)
C10: 5'-TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC-3 '(SEQ ID NO: 42)
C11: 5′-CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG-3 ′ (SEQ ID NO: 43)
C12: 5'-CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG-3 '(SEQ ID NO: 44)

前記のヒトゲノムDNA及びメチル化ヒトゲノムDNAの夫々の反応液について、以下の処理を施した。   Each reaction solution of the above human genomic DNA and methylated human genomic DNA was subjected to the following treatment.

PCRチューブに、前記で調製したゲノムDNAの反応液10μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 10 μL of the genomic DNA reaction solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of a buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 5 μL of 100 mM MgCl 2 solution and 5 μL of 1 mg / mL BSA solution were added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to adjust the volume to 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

上記の処理を施したビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)を5μLと、BSA(Bovine serum albumin 1mg/ml)を5μLと、メチル化感受性制限酵素HhaIを16Uを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとした各々の混合液を37℃で1時間インキュベーションした。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第二工程に相当する)。 To the PCR tube coated with the biotin-labeled methylcytosine antibody subjected to the above treatment and coated with streptavidin, 5 μL of a buffer (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol) and BSA ( Bovine serum albumin (1 mg / ml), 5 μL, methylation sensitive restriction enzyme HhaI, 16 U, and sterilized ultrapure water were added to the mixture to bring the volume to 50 μL. did. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号28及び配列番号29で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF1及びPR1の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号32で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域X’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF1 and PR1 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, and the following reaction conditions, whereby SEQ ID NO: 32 The methylated DNA in the target DNA region X ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF1:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3' (配列番号28)
PR1:5'- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3' (配列番号29)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF1: 5'-CTCAGCACCCAGGCGGCC-3 '(SEQ ID NO: 28)
PR1: 5′-CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3 ′ (SEQ ID NO: 29)

<目的とするDNA領域>
X’:5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (配列番号32)
<Target DNA region>
X ': 5'- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3' (SEQ ID NO: 32)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで61℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を34サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was performed under the conditions of 34 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 61 ° C. for 30 seconds, and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図13に示した。メチル化ヒトゲノムDNAの溶液MA、及びMBでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液MCでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないヒトゲノムDNAの溶液A、B、及びCでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。   The results are shown in FIG. Amplification was confirmed in the solutions MA and MB of methylated human genomic DNA. In the negative control solution MC, amplification was not confirmed and the amplification product was not obtained. In solutions A, B, and C of human genomic DNA that was not methylated, amplification was not confirmed and no amplification product was obtained.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例14
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 14
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計8本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

パン酵母酵母株X2180−1AをYPD培地(1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0)で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1x107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
Baker's yeast strain X2180-1A is cultured in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) until the turbidity is OD 600 0.6-1.0, and 10,000 g for 10 minutes Centrifugation was performed to prepare 1 × 10 7 yeast cells. The yeast genome was obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
The prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added, and the solution becomes clear. Incubated with stirring at 30 ° C for 1 hour until complete. Protoplasts were collected by centrifugation at 550 g for 10 minutes, suspended in buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then sodium dodecyl sulfate was added to 1% (w / v). Thereafter, it was incubated at 65 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 5M CH 3 COOK in a volume ratio of 2/5 was added and mixed, and after ice cooling for 30 minutes, the supernatant was recovered by centrifugation at 15,000 g for 30 minutes. Add 1/10 volume ratio of 3M CH 3 COONa and an equal amount of isopropanol to the collected supernatant, mix well, and centrifuge at 15,000g for 30 minutes at 4 ° C to rinse the precipitate with 70% ethanol. And recovered. The precipitate is dried, dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), RNase A (manufactured by Sigma) is added to a concentration of 40 μg / ml, and 1 at 37 ° C. After incubating for a time, proteinase K (manufactured by Sigma) was added to the mixture at 500 μg / ml and sodium dodecyl sulfate at 1% (w / v), and this was shaken at 55 ° C. for about 16 hours. That ’s it. After completion of the shaking, the mixture was extracted with phenol [saturated with 1M Tris-HCl (pH 8.0)] and chloroform. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added to this to 0.5 N, and then the resulting precipitate was recovered by ethanol precipitation. Genomic DNA was obtained by rinsing the collected precipitate with 70% ethanol.

得られた酵母ゲノムDNAの一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこの操作を3回繰り返し、メチル化酵母ゲノムDNAを得た。   Part of the obtained yeast genomic DNA was mixed with 1 μl of SssI methylase (manufactured by NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (manufactured by NEB), and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB). Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). Further, this operation was repeated three times to obtain methylated yeast genomic DNA.

得られた酵母ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:0.1ng/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
About the obtained yeast genomic DNA, the following solutions were prepared.
Solution A: 10 ng / 5 μL TE solution Solution B: 1 ng / 5 μL TE solution Solution C: 0.1 ng / 5 μL TE solution Solution D: TE solution (negative control solution)

得られたメチル化酵母ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:0.1ng/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
About the obtained methylated yeast genomic DNA, the following solutions were prepared.
Solution MA: 10 ng / 5 μL TE solution Solution MB: 1 ng / 5 μL TE solution Solution MC: 0.1 ng / 5 μL TE solution Solution MD: TE solution (negative control solution)

上記の酵母ゲノムDNAの溶液及びメチル化酵母ゲノムDNAの溶液の夫々について、以下の処理を施した。   The following treatment was applied to each of the above-described yeast genomic DNA solution and methylated yeast genomic DNA solution.

PCRチューブに、上記に調製したゲノムDNA溶液5μLと、制限酵素XspIを5Uと、XspIに最適な10x緩衝液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl)2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を20μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。 In a PCR tube, mix 5 μL of the genomic DNA solution prepared above, 5 U of restriction enzyme XspI, and 2 μl of 10 × buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM MgCl 2 , 10 mM Dithiothreitol, 1000 mM KCl) optimal for XspI. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 20 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 1 hour.

配列番号77で示される塩基配列からなるDNAフラグメントS”(Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271742-272080に相当する領域)の負鎖に相補性により結合可能な配列番号58〜配列番号67で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC16〜C25を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   SEQ ID NO: that can bind by complementarity to the negative strand of DNA fragment S ″ (the region corresponding to base numbers 271742-272080 of yeast chromosome VII shown in Genbank Accession No. NC_001139 etc.) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 77 Counter oligonucleotides C16 to C25 having a nucleotide sequence represented by 58 to SEQ ID NO: 67 were synthesized, and TE buffer solutions having respective concentrations of 0.01 μM were prepared.

<DNAフラグメント>
S:5'- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3'(配列番号77)
<DNA fragment>
S: 5'- TAGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCTGGATTGC -3 '(SEQ ID NO: 77)

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C16:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号58)
C17:5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3' (配列番号59)
C18:5'- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3' (配列番号60)
C19:5'- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3' (配列番号61)
C20:5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3' (配列番号62)
C21:5'- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3' (配列番号63)
C22:5'- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3' (配列番号64)
C23:5'- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3' (配列番号65)
C24:5'- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3' (配列番号66)
C25:5'- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3' (配列番号67)
<Counter oligonucleotide>
C16: 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 58)
C17: 5'- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA-3 '(SEQ ID NO: 59)
C18: 5'-CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC-3 '(SEQ ID NO: 60)
C19: 5'-ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT-3 '(SEQ ID NO: 61)
C20: 5'- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT-3 '(SEQ ID NO: 62)
C21: 5'-TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC-3 '(SEQ ID NO: 63)
C22: 5′-ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3 ′ (SEQ ID NO: 64)
C23: 5'-TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG-3 '(SEQ ID NO: 65)
C24: 5′-ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 66)
C25: 5'-CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 67)

前記の酵母ゲノムDNA及びメチル化酵母ゲノムDNAの夫々の反応液について、以下の処理を施した。   Each reaction solution of the yeast genomic DNA and methylated yeast genomic DNA was subjected to the following treatment.

PCRチューブに、前記で調製したゲノムDNA反応液20μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 20 μL of the genomic DNA reaction solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 100 mM MgCl 2 solution (5 μL) and 1 mg / mL BSA solution (5 μL) were added, and sterilized ultrapure water was added to the mixture to make a volume of 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

上記の処理を施したビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)を5μLと、BSA(Bovine serum albumin 1mg/ml)を5μLと、メチル化感受性制限酵素HhaIを16Uを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとした各々の混合液を37℃で1時間インキュベーションした。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第二工程に相当する)。 A buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc2, 5 mM Dithiothreitol) and 5 μL of BSA (Bovine) were added to the PCR tube coated with streptavidin to which the biotin-labeled methylcytosine antibody subjected to the above treatment was immobilized. 5 μL of serum albumin (1 mg / ml) and 16 U of methylation sensitive restriction enzyme HhaI were added, and each mixture was further incubated at 37 ° C. for 1 hour by adding sterile ultrapure water to the mixture to a volume of 50 μL. . Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号53及び配列番号54で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF3及びPR3の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号57で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域S’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is carried out on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF3 and PR3 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 and the following reaction conditions, so that SEQ ID NO: 57 The methylated DNA in the target DNA region S ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF3:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3' (配列番号53)
PR3:5'- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3' (配列番号54)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF3: 5'-AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 53)
PR3: 5′-AGACATGTGCTCACGTACGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 54)

<目的とするDNA領域>
S’:5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (配列番号57)
<Target DNA region>
S ': 5'- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3' (SEQ ID NO: 57)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を31サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was carried out under the conditions of 31 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 58 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図14に示した。メチル化酵母ゲノムDNAの溶液MA、MB及びMCでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液MDでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液A、B、C及びDでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。   The results are shown in FIG. In the solutions of methylated yeast genomic DNA MA, MB and MC, amplification was confirmed and amplification products were obtained. In the negative control solution MD, amplification was not confirmed and the amplification product was not obtained. In the unmethylated yeast genomic DNA solutions A, B, C and D, amplification was not confirmed and no amplification product was obtained.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

実施例15
市販のメチルシトシン抗体(Aviva Systems Biology社製)を、市販ビオチン化キット(Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製)を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)溶液]として冷蔵保存した。
Example 15
A commercially available methylcytosine antibody (Aviva Systems Biology) was labeled with biotin using a commercially available biotinylation kit (Biotin Labeling Kit-NH 2 , manufactured by Dojindo Laboratories) according to the method described in the catalog. The obtained biotin-labeled methylcytosine antibody was refrigerated and stored as a solution [antibody about 0.25 μg / μL 0.1% BSA-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4) solution].

ストレプトアビジン被覆済みPCRチューブ(計8本)に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各50μLの割合で添加し、約1時間室温で放置してPCRチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する)。 50 µL each of 0.1 µg / 50 µL solution of biotin-labeled methylcytosine antibody obtained by synthesis was added to the streptavidin-coated PCR tubes (total of 8 tubes) and left at room temperature for about 1 hour. Immobilized to. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the preparation of the immobilized methylated DNA antibody used in the measurement method of the present invention).

パン酵母酵母株X2180−1AをYPD培地(1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0)で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1x107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーA(1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4)に懸濁し、2-メルカプトエタノール(終濃度14mM)及び100U zymolase(10 mg/ml)を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で1時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーB(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA)に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g 4℃で30分間遠心して得られた沈澱を70%エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、1ml のTEバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA)に溶解し、40μg/mlになるようにRNase A(Sigma社製)を加えて37℃で1時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K(Sigma社製)を500μg/ml及びドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH 8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスすることにより、ゲノムDNAを得た。
Baker's yeast strain X2180-1A is cultured in YPD medium (1% Yeast extract, 2% Peptone, 2% Glucose, pH 5.6-6.0) until the turbidity is OD 600 0.6-1.0, and 10,000 g for 10 minutes Centrifugation was performed to prepare 1 × 10 7 yeast cells. The yeast genome was obtained from the prepared yeast cells using a general yeast genome preparation method as described in Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory).
The prepared yeast cells are suspended in buffer A (1M sorbitol, 0.1M EDTA, pH 7.4), 2-mercaptoethanol (final concentration 14 mM) and 100 U zymolase (10 mg / ml) are added, and the solution becomes clear. Incubated with stirring at 30 ° C for 1 hour until complete. Protoplasts were collected by centrifugation at 550 g for 10 minutes, suspended in buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM EDTA), and then sodium dodecyl sulfate was added to 1% (w / v). Thereafter, it was incubated at 65 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 5M CH 3 COOK in a volume ratio of 2/5 was added and mixed, and after ice cooling for 30 minutes, the supernatant was recovered by centrifugation at 15,000 g for 30 minutes. Add 1/10 volume ratio of 3M CH 3 COONa and an equal amount of isopropanol to the collected supernatant, mix well, and centrifuge at 15,000g for 30 minutes at 4 ° C to rinse the precipitate with 70% ethanol. And recovered. The precipitate is dried, dissolved in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), RNase A (manufactured by Sigma) is added to a concentration of 40 μg / ml, and 1 at 37 ° C. After incubating for a time, proteinase K (manufactured by Sigma) was added to the mixture at 500 μg / ml and sodium dodecyl sulfate at 1% (w / v), and this was shaken at 55 ° C. for about 16 hours. That ’s it. After completion of the shaking, the mixture was extracted with phenol [saturated with 1M Tris-HCl (pH 8.0)] and chloroform. The aqueous layer was recovered, and NaCl was added to this to 0.5 N, and then the resulting precipitate was recovered by ethanol precipitation. Genomic DNA was obtained by rinsing the collected precipitate with 70% ethanol.

得られた酵母ゲノムDNAの一部について、SssI methylase (NEB社製)を1μlと、10xNEBuffer2(NEB社製)を10μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を100μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて15-30分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を1μlを追加して37℃にて15-30分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit(PROMEGA社)により精製した。さらにこの操作を3回繰り返し、メチル化酵母ゲノムDNAを得た。   Part of the obtained yeast genomic DNA was mixed with 1 μl of SssI methylase (manufactured by NEB), 10 μl of 10 × NEBuffer2 (manufactured by NEB), and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB). Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 100 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes, and 1 μl of S-adenosyl methionine (3.2 mM, manufactured by NEB) was further added and incubated at 37 ° C. for 15-30 minutes. This was purified by Wizard SV Gel / PCR Kit (PROMEGA). Further, this operation was repeated three times to obtain methylated yeast genomic DNA.

得られた酵母ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液A:10ng/5μL TE溶液
溶液B:1ng/5μL TE溶液
溶液C:0.1ng/5μL TE溶液
溶液D:TE溶液(ネガティブコントロール液)
About the obtained yeast genomic DNA, the following solutions were prepared.
Solution A: 10 ng / 5 μL TE solution Solution B: 1 ng / 5 μL TE solution Solution C: 0.1 ng / 5 μL TE solution Solution D: TE solution (negative control solution)

得られたメチル化酵母ゲノムDNAについて、以下の溶液を調製した。
溶液MA:10ng/5μL TE溶液
溶液MB:1ng/5μL TE溶液
溶液MC:0.1ng/5μL TE溶液
溶液MD:TE溶液(ネガティブコントロール液)
About the obtained methylated yeast genomic DNA, the following solutions were prepared.
Solution MA: 10 ng / 5 μL TE solution Solution MB: 1 ng / 5 μL TE solution Solution MC: 0.1 ng / 5 μL TE solution Solution MD: TE solution (negative control solution)

上記の酵母ゲノムDNAの溶液及びメチル化酵母ゲノムDNAの溶液の夫々について、以下の処理を施した。   The following treatment was applied to each of the above-described yeast genomic DNA solution and methylated yeast genomic DNA solution.

PCRチューブに、上記に調製したゲノムDNA溶液5μLと、制限酵素XspIを5Uと、XspIに最適な10x緩衝液(200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl)2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を20μlとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。 In a PCR tube, mix 5 μL of the genomic DNA solution prepared above, 5 U of restriction enzyme XspI, and 2 μl of 10 × buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM MgCl 2 , 10 mM Dithiothreitol, 1000 mM KCl) optimal for XspI. Then, sterilized ultrapure water was added thereto to prepare a liquid volume of 20 μl. The reaction solution was incubated at 37 ° C. for 1 hour.

配列番号78で示される塩基配列からなるDNAフラグメントT”(Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域)の負鎖に相補性により結合可能な配列番号73〜配列番号76及び配列番号79〜配列番号82で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドC26〜C33を合成し、夫々の濃度が0.01μMであるTEバッファー溶液を調製した。   SEQ ID NO: that can bind by complementarity to the negative strand of DNA fragment T ″ (the region corresponding to base numbers 384523-384766 of yeast chromosome VII shown in Genbank Accession No. NC — 001139 etc.) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 78 Counter oligonucleotides C26 to C33 consisting of the nucleotide sequences represented by 73 to SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 79 to SEQ ID NO: 82 were synthesized, and TE buffer solutions each having a concentration of 0.01 μM were prepared.

<DNAフラグメント>
T:5'- TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3'(配列番号78)
<DNA fragment>
T: 5'-TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGCATGTGTGTTGCGCGCTG

<カウンターオリゴヌクレオチド>
C26:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号73)
C27:5'- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3' (配列番号74)
C28:5'- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3' (配列番号75)
C29:5'- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3' (配列番号76)
C30:5'- AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3' (配列番号79)
C31:5'- GCGATCGCACACGAGGAGACA -3' (配列番号80)
C32:5'- AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3' (配列番号81)
C33:5'- AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3' (配列番号82)
<Counter oligonucleotide>
C26: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 73)
C27: 5'-AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT-3 '(SEQ ID NO: 74)
C28: 5'-ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT-3 '(SEQ ID NO: 75)
C29: 5'-CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 76)
C30: 5′-AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3 ′ (SEQ ID NO: 79)
C31: 5′-GCGATCGCACACGAGGAGACA -3 ′ (SEQ ID NO: 80)
C32: 5'-AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC-3 '(SEQ ID NO: 81)
C33: 5'-AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC-3 '(SEQ ID NO: 82)

前記の酵母ゲノムDNA及びメチル化酵母ゲノムDNAの夫々の反応液について、以下の処理を施した。   Each reaction solution of the yeast genomic DNA and methylated yeast genomic DNA was subjected to the following treatment.

PCRチューブに、前記で調製したゲノムDNAの反応液20μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液10μLと、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)5μLと、100mMのMgCl溶液5μLと、1mg/mLのBSA溶液5μLを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとし、混合した。その後、本PCRチューブを95℃で10分間加熱し、70℃まで速やかに冷却し、その温度で10分間保温した。次いで、50℃まで冷却し10分間保温し、さらに37℃で10分間保温した後、室温に戻した(以上、本発明測定方法の第一(A)工程に相当する)。 In a PCR tube, 20 μL of the genomic DNA reaction solution prepared above, 10 μL of the counter oligonucleotide solution prepared above, 5 μL of a buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc 2 , 5 mM Dithiothreitol), 5 μL of 100 mM MgCl 2 solution and 5 μL of 1 mg / mL BSA solution were added, and further sterilized ultrapure water was added to the mixture to adjust the volume to 50 μL and mixed. Thereafter, the PCR tube was heated at 95 ° C. for 10 minutes, quickly cooled to 70 ° C., and kept at that temperature for 10 minutes. Next, the mixture was cooled to 50 ° C., kept for 10 minutes, further kept at 37 ° C. for 10 minutes, and then returned to room temperature (this corresponds to the first step (A) of the measurement method of the present invention).

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、前記で調製したDNAフラグメントの反応液50μLを加え、室温で30分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第一(B)工程に相当する)。 50 μL of the DNA fragment reaction solution prepared above was added to the streptavidin-coated PCR tube on which the biotin-labeled methylcytosine antibody was immobilized, and left at room temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was further repeated twice (this corresponds to the first step (B) of the measurement method of the present invention).

上記の処理を施したビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みPCRチューブに、緩衝液(330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol)を5μLと、BSA(Bovine serum albumin 1mg/ml)を5μLと、メチル化感受性制限酵素HhaIを16Uを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を50μLとした各々の混合液を37℃で1時間インキュベーションした。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、100μLの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー(1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4)]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに2回繰り返した(以上、本発明測定方法の第二工程に相当する)。 A buffer solution (330 mM Tris-Acetate pH 7.9, 660 mM KOAc, 100 mM MgOAc2, 5 mM Dithiothreitol) and 5 μL of BSA (Bovine) were added to the PCR tube coated with streptavidin to which the biotin-labeled methylcytosine antibody subjected to the above treatment was immobilized. 5 μL of serum albumin (1 mg / ml) and 16 U of methylation sensitive restriction enzyme HhaI were added, and each mixture was further incubated at 37 ° C. for 1 hour by adding sterile ultrapure water to the mixture to a volume of 50 μL. . Thereafter, the solution was removed by pipetting, and 100 μL of a washing buffer [0.05% Tween20-containing phosphate buffer (1 mM KH 2 PO 4 , 3 mM Na 2 HPO 7H 2 O, 154 mM NaCl pH 7.4)] was added, and then the buffer was pipetted. Removed. This operation was repeated twice more (this corresponds to the second step of the measurement method of the present invention).

次に、上記のPCRチューブに、配列番号68及び配列番号69で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーPF4及びPR4の各溶液及び、下記の反応条件を用いてPCRを行うことにより、配列番号72で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域T’におけるメチル化されたDNAを増幅した。   Next, PCR is performed on the above PCR tube using each solution of oligonucleotide primers PF4 and PR4 consisting of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 69, and the following reaction conditions, whereby SEQ ID NO: 72 The methylated DNA in the target DNA region T ′ consisting of the base sequence shown in FIG.

<PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー>
PF4:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3' (配列番号68)
PR4:5'- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3' (配列番号69)
<Oligonucleotide primers designed for PCR>
PF4: 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 68)
PR4: 5'-AGTACAGATCTGGCGTTCTCG-3 '(SEQ ID NO: 69)

<目的とするDNA領域>
T’:5'- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3' (配列番号72)
<Target DNA region>
T ': 5'-GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT-3' (SEQ ID NO: 72)

PCRの反応液としては、鋳型とするDNAに、5μMに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各3μLと、each 2mM dNTPを5μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01% Gelatin)を5μLと、耐熱性DNAポリメラーゼ(AmpliTaq Gold、ABI社製)5U/μLを0.25μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を50μLとしたものを用いた。当該反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて20秒間次いで58℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を1サイクルとする保温を31サイクル行う条件でPCRを行った。
PCRを行った後、1.5%アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった(以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。)。
As a PCR reaction solution, 3 μL each of oligonucleotide primer solution prepared to 5 μM, 5 μL each 2 mM dNTP, and buffer solution (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 0.01% Gelatin) is mixed with 5 μL of heat-resistant DNA polymerase (AmpliTaq Gold, manufactured by ABI) 5 U / μL with 0.25 μL, and sterilized ultrapure water is added to make the volume 50 μL. It was. The reaction solution was incubated at 95 ° C. for 10 minutes, and then PCR was carried out under the conditions of 31 cycles of incubation at 95 ° C. for 20 seconds, then at 58 ° C. for 30 seconds and further at 72 ° C. for 30 seconds. It was.
After PCR, amplification was confirmed by 1.5% agarose gel electrophoresis. The results were as follows (corresponding to the third step of the measurement method of the present invention).

その結果を図15に示した。メチル化酵母ゲノムDNAの溶液MA、MB及びMCでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液MDでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液A、B、C及びDでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。   The results are shown in FIG. In the solutions of methylated yeast genomic DNA MA, MB and MC, amplification was confirmed and amplification products were obtained. In the negative control solution MD, amplification was not confirmed and the amplification product was not obtained. In the unmethylated yeast genomic DNA solutions A, B, C and D, amplification was not confirmed and no amplification product was obtained.

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするDNA領域を含むDNAを選択することが可能であること、また、メチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAをより高感度に検出できることが確認された。   From the above, it is possible to select a DNA containing a target DNA region that has been methylated with an immobilized methylcytosine antibody, and to amplify the methylated DNA to a detectable amount. It was confirmed that the amplified DNA can be detected with higher sensitivity.

本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。   According to the present invention, it is possible to provide a method for simply measuring the content of methylated DNA in a target DNA region possessed by genomic DNA contained in a biological specimen.

図1は、実施例1において、調製されたサンプルから配列番号21で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動に供した結果を示した図である。 図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、UBC−Mの溶液Dから調製されたサンプル「D」、UBC−Mの溶液Cから調製されたサンプル「C」、UBC−Mの溶液Bから調製されたサンプル「B」、UBC−Mの溶液Aから調製されたサンプル「A」、DNAフラグメントY2の「A」、UBC−Uの溶液Dから調製されたサンプル「D」、UBC−Uの溶液Cから調製されたサンプル「C」、UBC−Uの溶液Bから調製されたサンプル「B」、UBC−Uの溶液Aから調製されたサンプル「A」での結果を示している。FIG. 1 shows that in Example 1, methylated DNA in a region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 was amplified from a prepared sample by PCR, and the obtained amplification product was converted to 1.5% agarose. It is the figure which showed the result used for gel electrophoresis. From the leftmost lane of the figure, DNA marker “MK”, sample “D” prepared from UBC-M solution D, sample “C” prepared from UBC-M solution C, UBC-M Sample “B” prepared from solution B, sample “A” prepared from solution A of UBC-M, “A” of DNA fragment Y2, sample “D” prepared from solution D of UBC-U, UBC -Shows results for sample "C" prepared from solution C of U, sample "B" prepared from solution B of UBC-U, sample "A" prepared from solution A of UBC-U . 図2は、実施例2において、調製されたサンプルに、「A(無処理)」又は「B(HhaI処理)」のいずれかの処理を施し、配列番号27で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動に供した結果を示した図である。 図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)溶液の「A」処理が施されたサンプル「M」、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)溶液の「A」処理が施されたサンプル「HM」、アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UM溶液の「A」処理が施されたサンプル「U」、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)溶液の「B」処理が施されたサンプル「M」、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)溶液の「B」処理が施されたサンプル「HM」、アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UM溶液の「B」処理が施されたサンプル「U」、での結果を示している。FIG. 2 shows a region consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 27 after the sample prepared in Example 2 was subjected to either “A (no treatment)” or “B (HhaI treatment)” treatment. It is the figure which showed the result of having amplified the methylated DNA in <1> by PCR and having used the obtained amplified product for 1.5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, sample “M” treated with “A” treatment of partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) solution not digested with HhaI “A” -treated sample “HM” of partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-HM (5) digested with HhaI, unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer -Sample "U" treated with "A" treatment of UM solution, "B" treatment of partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) solution not digested with HhaI " M ", partially methylated oligonucleotide GPR7-2079- digested with HhaI Sample “HM” treated with “B” treatment of 2176 / 98mer-HM (5) solution, sample “U” treated with “B” treatment of unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-UM solution , Shows the results. 図3は、実施例3において、あらかじめ「A(無処理)」又は「B(HhaI処理)」のいずれかの処理を施されたサンプルについてメチルシトシン抗体での処理を施したサンプルにつき、配列番号27で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動に供した結果を示した図である。 図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)溶液の「A」処理が施されたサンプル「M」、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)溶液の「A」処理が施されたサンプル「HM」、アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UM溶液の「A」処理が施されたサンプル「U」、HhaIで消化されない部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−M(7)溶液の「B」処理が施されたサンプル「M」、HhaIで消化される部分メチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−HM(5)溶液の「B」処理が施されたサンプル「HM」、アンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7−2079−2176/98mer−UM溶液の「B」処理が施されたサンプル「U」、での結果を示している。FIG. 3 shows the sequence number of the sample treated with methylcytosine antibody in Example 3 for a sample that has been previously treated with either “A (no treatment)” or “B (HhaI treatment)”. It is the figure which showed the result of having amplified the methylated DNA in the area | region which consists of a base sequence shown by 27 by PCR, and having used the obtained amplified product for 1.5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, sample “M” treated with “A” treatment of partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) solution not digested with HhaI “A” -treated sample “HM” of partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-HM (5) digested with HhaI, unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer -Sample "U" treated with "A" treatment of UM solution, "B" treatment of partially methylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-M (7) solution not digested with HhaI " M ", partially methylated oligonucleotide GPR7-2079- digested with HhaI Sample “HM” treated with “B” treatment of 2176 / 98mer-HM (5) solution, sample “U” treated with “B” treatment of unmethylated oligonucleotide GPR7-2079-2176 / 98mer-UM solution , Shows the results. 図4は、実施例4において、調製されたサンプルから配列番号32で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化されたDNAフラグメントMXの溶液「MD」(ネガティブコントロール)、メチル化されていないDNAフラグメントXの溶液「D」(ネガティブコントロール)、メチル化されたDNAフラグメントMXの溶液「MC」、メチル化されていないDNAフラグメントXの溶液「C」、メチル化されたDNAフラグメントMXの溶液「MB」、メチル化されていないDNAフラグメントXの溶液「B」、メチル化されたDNAフラグメントMXの溶液「MA」、メチル化されていないDNAフラグメントXの溶液「A」、での結果を示している。4 shows, in Example 4, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 was amplified from the prepared sample by PCR, and the obtained amplification product was 1. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated DNA fragment MX solution “MD” (negative control), unmethylated DNA fragment X solution “D” (negative control) , A solution “MC” of a methylated DNA fragment MX, a solution “C” of an unmethylated DNA fragment X, a solution “MB” of a methylated DNA fragment MX, a solution of an unmethylated DNA fragment X The results for solution “B”, solution “MA” of methylated DNA fragment MX, and solution “A” of unmethylated DNA fragment X are shown.

図5は、実施例5において、調製されたサンプルから配列番号49で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化されたDNAフラグメントMYの溶液「MD」(ネガティブコントロール)、メチル化されていないDNAフラグメントYの溶液「D」(ネガティブコントロール)、メチル化されたDNAフラグメントMYの溶液「MC」、メチル化されていないDNAフラグメントYの溶液「C」、メチル化されたDNAフラグメントMYの溶液「MB」、メチル化されていないDNAフラグメントYの溶液「B」、メチル化されたDNAフラグメントMYの溶液「MA」、メチル化されていないDNAフラグメントYの溶液「A」、での結果を示している。5 shows, in Example 5, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 49 was amplified from the prepared sample by PCR. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated DNA fragment MY solution “MD” (negative control), unmethylated DNA fragment Y solution “D” (negative control) , Solution “MC” of methylated DNA fragment MY, solution “C” of unmethylated DNA fragment Y, solution “MB” of methylated DNA fragment MY, solution of unmethylated DNA fragment Y The results are shown for solution “B”, solution “MA” of methylated DNA fragment MY, and solution “A” of unmethylated DNA fragment Y.

図6は、実施例6において、調製されたサンプルから配列番号57で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化されたDNAフラグメントMSの溶液「MC」(ネガティブコントロール)、メチル化されていないDNAフラグメントSの溶液「C」(ネガティブコントロール)、メチル化されたDNAフラグメントMSの溶液「MB」、メチル化されていないDNAフラグメントSの溶液「B」、メチル化されたDNAフラグメントMSの溶液「MA」、メチル化されていないDNAフラグメントSの溶液「A」、での結果を示している。6 shows, in Example 6, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 was amplified from the prepared sample by PCR. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated DNA fragment MS solution “MC” (negative control), unmethylated DNA fragment S solution “C” (negative control) , Solution “MB” of methylated DNA fragment MS, solution “B” of unmethylated DNA fragment S, solution “MA” of methylated DNA fragment MS, solution of unmethylated DNA fragment S The results with solution “A” are shown.

図7は、実施例7において、調製されたサンプルから配列番号72で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化されたDNAフラグメントMTの溶液「MC」(ネガティブコントロール)、メチル化されていないDNAフラグメントTの溶液「C」(ネガティブコントロール)、メチル化されたDNAフラグメントMTの溶液「MB」、メチル化されていないDNAフラグメントTの溶液「B」、メチル化されたDNAフラグメントMTの溶液「MA」、メチル化されていないDNAフラグメントTの溶液「A」、での結果を示している。7 shows, in Example 7, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 was amplified from the prepared sample by PCR, and the obtained amplification product was 1. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated DNA fragment MT solution “MC” (negative control), unmethylated DNA fragment T solution “C” (negative control) A solution “MB” of a methylated DNA fragment MT, a solution “B” of an unmethylated DNA fragment T, a solution “MA” of a methylated DNA fragment MT, a solution of an unmethylated DNA fragment T The results with solution “A” are shown.

図8は、実施例8において、調製されたサンプルから配列番号57で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MD」(ネガティブコントロール)、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「D」(ネガティブコントロール)、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MC」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「C」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MB」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「B」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MA」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「A」、での結果を示している。8 shows, in Example 8, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 was amplified from the prepared sample by PCR, and the obtained amplification product was 1. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated yeast genomic DNA solution “MD” (negative control), unmethylated yeast genomic DNA solution “D” (negative control), methyl Yeast genomic DNA solution “MC”, Unmethylated yeast genomic DNA solution “C”, Methylated yeast genomic DNA solution “MB”, Unmethylated yeast genomic DNA solution “B”, Methyl The results are shown for the solution “MA” of the yeast yeast genomic DNA and the solution “A” of the unmethylated yeast genomic DNA.

図9は、実施例9において、調製されたサンプルから配列番号72で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MD」(ネガティブコントロール)、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「D」(ネガティブコントロール)、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MC」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「C」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MB」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「B」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MA」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「A」、での結果を示している。9 shows, in Example 9, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 from the prepared sample was amplified by PCR, and the obtained amplification product was 1. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated yeast genomic DNA solution “MD” (negative control), unmethylated yeast genomic DNA solution “D” (negative control), methyl Yeast genomic DNA solution “MC”, Unmethylated yeast genomic DNA solution “C”, Methylated yeast genomic DNA solution “MB”, Unmethylated yeast genomic DNA solution “B”, Methyl The results are shown for the solution “MA” of the yeast yeast genomic DNA and the solution “A” of the unmethylated yeast genomic DNA.

図10は、実施例10において、調製されたサンプルから配列番号32で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化されたDNAフラグメントMXの溶液「MD」(ネガティブコントロール)、メチル化されていないDNAフラグメントXの溶液「D」(ネガティブコントロール)、メチル化されたDNAフラグメントMXの溶液「MC」、メチル化されていないDNAフラグメントXの溶液「C」、メチル化されたDNAフラグメントMXの溶液「MB」、メチル化されていないDNAフラグメントXの溶液「B」、メチル化されたDNAフラグメントMXの溶液「MA」、メチル化されていないDNAフラグメントXの溶液「A」、での結果を示している。10 shows, in Example 10, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 was amplified from the prepared sample by PCR, and the obtained amplification product was 1. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated DNA fragment MX solution “MD” (negative control), unmethylated DNA fragment X solution “D” (negative control) , A solution “MC” of a methylated DNA fragment MX, a solution “C” of an unmethylated DNA fragment X, a solution “MB” of a methylated DNA fragment MX, a solution of an unmethylated DNA fragment X The results for solution “B”, solution “MA” of methylated DNA fragment MX, and solution “A” of unmethylated DNA fragment X are shown.

図11は、実施例11において、調製されたサンプルから配列番号57で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化されたDNAフラグメントMSの溶液「MD」(ネガティブコントロール)、メチル化されていないDNAフラグメントSの溶液「D」(ネガティブコントロール)、メチル化されたDNAフラグメントMSの溶液「MC」、メチル化されていないDNAフラグメントSの溶液「C」、メチル化されたDNAフラグメントMSの溶液「MB」、メチル化されていないDNAフラグメントSの溶液「B」、メチル化されたDNAフラグメントMSの溶液「MA」、メチル化されていないDNAフラグメントSの溶液「A」、での結果を示している。11 shows, in Example 11, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 was amplified from the prepared sample by PCR. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated DNA fragment MS solution “MD” (negative control), unmethylated DNA fragment S solution “D” (negative control) A solution “MC” of a methylated DNA fragment MS, a solution “C” of an unmethylated DNA fragment S, a solution “MB” of a methylated DNA fragment MS, a solution of an unmethylated DNA fragment S The results for solution “B”, solution “MA” of methylated DNA fragment MS and solution “A” of unmethylated DNA fragment S are shown.

図12は、実施例12において、調製されたサンプルから配列番号72で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化されたDNAフラグメントMTの溶液「MD」(ネガティブコントロール)、メチル化されていないDNAフラグメントTの溶液「D」(ネガティブコントロール)、メチル化されたDNAフラグメントMTの溶液「MC」、メチル化されていないDNAフラグメントTの溶液「C」、メチル化されたDNAフラグメントMTの溶液「MB」、メチル化されていないDNAフラグメントTの溶液「B」、メチル化されたDNAフラグメントMTの溶液「MA」、メチル化されていないDNAフラグメントTの溶液「A」、での結果を示している。FIG. 12 shows, in Example 12, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 from the prepared sample was amplified by PCR, and the obtained amplification product was 1. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated DNA fragment MT solution “MD” (negative control), unmethylated DNA fragment T solution “D” (negative control) A solution “MC” of a methylated DNA fragment MT, a solution “C” of an unmethylated DNA fragment T, a solution “MB” of a methylated DNA fragment MT, a solution of an unmethylated DNA fragment T The results for solution “B”, solution “MA” of methylated DNA fragment MT, and solution “A” of unmethylated DNA fragment T are shown.

図13は、実施例13において、調製されたサンプルから配列番号32で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化ヒトゲノムDNAの溶液「MC」(ネガティブコントロール)、メチル化されていないヒトゲノムDNAの溶液「C」(ネガティブコントロール)、メチル化ヒトゲノムDNAの溶液「MB」、メチル化されていないヒトゲノムDNAの溶液「B」、メチル化ヒトゲノムDNAの溶液「MA」、メチル化されていないヒトゲノムDNAの溶液「A」、での結果を示している。FIG. 13 shows, in Example 13, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 32 from the prepared sample was amplified by PCR. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated human genomic DNA solution “MC” (negative control), unmethylated human genomic DNA solution “C” (negative control), methylated human genome Results are shown for DNA solution “MB”, unmethylated human genomic DNA solution “B”, methylated human genomic DNA solution “MA”, and unmethylated human genomic DNA solution “A”. .

図14は、実施例14において、調製されたサンプルから配列番号57で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MD」(ネガティブコントロール)、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「D」(ネガティブコントロール)、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MC」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「C」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MB」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「B」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MA」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「A」、での結果を示している。14 shows, in Example 14, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 57 was amplified from the prepared sample by PCR, and the obtained amplification product was 1. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated yeast genomic DNA solution “MD” (negative control), unmethylated yeast genomic DNA solution “D” (negative control), methyl Yeast genomic DNA solution “MC”, Unmethylated yeast genomic DNA solution “C”, Methylated yeast genomic DNA solution “MB”, Unmethylated yeast genomic DNA solution “B”, Methyl The results are shown for the solution “MA” of the yeast yeast genomic DNA and the solution “A” of the unmethylated yeast genomic DNA.

図15は、実施例15において、調製されたサンプルから配列番号72で示される塩基配列からなる目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAをPCRにて増幅し、得られた増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、DNAマーカー「MK」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MD」(ネガティブコントロール)、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「D」(ネガティブコントロール)、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MC」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「C」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MB」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「B」、メチル化酵母ゲノムDNAの溶液「MA」、メチル化されていない酵母ゲノムDNAの溶液「A」、での結果を示している。15 shows, in Example 15, the methylated DNA in the target DNA region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 72 from the prepared sample was amplified by PCR. It is the figure which showed the result of 5% agarose gel electrophoresis. From the leftmost lane in the figure, DNA marker “MK”, methylated yeast genomic DNA solution “MD” (negative control), unmethylated yeast genomic DNA solution “D” (negative control), methyl Yeast genomic DNA solution “MC”, Unmethylated yeast genomic DNA solution “C”, Methylated yeast genomic DNA solution “MB”, Unmethylated yeast genomic DNA solution “B”, Methyl The results are shown for the solution “MA” of the yeast yeast genomic DNA and the solution “A” of the unmethylated yeast genomic DNA.

配列番号17
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号18
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号19
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号20
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号21
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号22
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号23
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号24
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号25
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号26
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号27
実験のために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号28
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号29
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号30
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号31
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号32
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号33
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号34
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号35
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号36
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号37
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号38
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号39
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号40
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号41
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号42
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号43
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号44
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号45
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号46
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号47
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号48
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号49
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号50
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号51
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号52
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号53
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号54
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号55
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号56
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号57
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号58
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号59
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号60
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号61
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号62
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号63
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号64
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号65
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号66
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号67
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号68
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号69
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号70
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号71
実験のために設計されたメチル化DNAフラグメント
配列番号72
目的とするDNA領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号73
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号74 実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号75 実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号76
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号77
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号78
実験のために設計されたDNAフラグメント
配列番号79
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号80
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号81
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号82
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号83
実験のために設計されたDNAフラグメント
SEQ ID NO: 17
Oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 18
Oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 19
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 20
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 21
Oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 22
Oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 23
Oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 24
Oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 25
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 26
Oligonucleotide primer designed for PCR SEQ ID NO: 27
Oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 28
Oligonucleotide primer designed for experiment SEQ ID NO: 29
Oligonucleotide primer designed for experiment SEQ ID NO: 30
DNA fragment SEQ ID NO: 31 designed for the experiment
Methylated DNA fragment designed for experiment SEQ ID NO: 32
Oligonucleotide SEQ ID NO: 33 consisting of the desired DNA region
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 34 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 35 designed for experiment
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 36 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 37 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 38 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 39 designed for experiment
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 40 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 41 designed for experiment
Counter oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 42
Counter oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 43
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 44 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 45 designed for experiments
Oligonucleotide primer designed for experiment SEQ ID NO: 46
Oligonucleotide primer designed for experiment SEQ ID NO: 47
DNA fragment designed for experiment SEQ ID NO: 48
Methylated DNA fragment designed for experiment SEQ ID NO: 49
Oligonucleotide SEQ ID NO: 50 consisting of the desired DNA region
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 51 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 52 designed for experiments
Counter oligonucleotide designed for experiments SEQ ID NO: 53
Oligonucleotide primer designed for experiment SEQ ID NO: 54
Oligonucleotide primer designed for experiment SEQ ID NO: 55
DNA fragment designed for experiment SEQ ID NO: 56
Methylated DNA fragment designed for experiment SEQ ID NO: 57
Oligonucleotide SEQ ID NO: 58 consisting of the desired DNA region
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 59 designed for experiment
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 60 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 61 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 62 designed for experiment
Counter oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 63
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 64 designed for experiment
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 65 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 66 designed for experiment
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 67 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 68 designed for experiments
Oligonucleotide primer designed for experiment SEQ ID NO: 69
Oligonucleotide primer designed for experiment SEQ ID NO: 70
DNA fragment designed for experiments SEQ ID NO: 71
Methylated DNA fragment designed for experiment SEQ ID NO: 72
Oligonucleotide SEQ ID NO: 73 consisting of the desired DNA region
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 74 designed for experiments Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 75 designed for experiments Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 76 designed for experiments
Counter oligonucleotide designed for experiment SEQ ID NO: 77
DNA fragment designed for experiment SEQ ID NO: 78
DNA fragment designed for experiment SEQ ID NO: 79
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 80 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 81 designed for experiment
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 82 designed for experiments
Counter oligonucleotide SEQ ID NO: 83 designed for experiments
DNA fragments designed for experiments

Claims (11)

生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法であって、
(1)生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料からメチル化された一本鎖DNAを取得し、該一本鎖DNAと、固定化メチル化DNA抗体とを結合させて一本鎖DNAを選択する第一工程、
(2)第一工程で選択された一本鎖DNAを少なくとも1種類の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素で消化処理する第二工程、及び、
(3)下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖DNA(前記の一本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のCpGを含まない一本鎖DNA)を、前記の固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるDNA(正鎖)にする工程(第三(前A)工程)と、
第三(前A)工程で分離された一本鎖状態であるDNA(正鎖)を鋳型として、当該一本鎖状態であるDNA(正鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(正鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)の3’末端よりさらに3’末端側に位置する部分塩基配列(正鎖)に対して相補的である塩基配列(負鎖)を有する伸長プライマー(フォワード用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるDNA(正鎖)を二本鎖DNAとして伸長形成させる工程(第三(前B)工程)と、
第三(前B)工程で伸長形成された二本鎖DNAを、目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)と目的とするDNA領域に対して相補的である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)に一旦分離する工程(第三(前C)工程)を有し、且つ、本工程として
(a)生成した目的とするDNA領域を含む一本鎖DNA(正鎖)を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−Aと、
(b)生成した目的とするDNA領域に対して相補的である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)を鋳型として、前記の目的とするDNA領域に対して相補的である塩基配列を含む一本鎖DNA(負鎖)が有する塩基配列の部分塩基配列(負鎖)であって、且つ、前記の目的とするDNA領域の塩基配列(正鎖)に対して相補的である塩基配列(負鎖)の3’末端よりさらに3’末端端側に位置する部分塩基配列(負鎖)、に対して相補的である塩基配列(正鎖)を有する伸長プライマー(リバース用プライマー)を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを1回伸長させることにより、前記の目的とするDNA領域を含む一本鎖DNAを二本鎖DNAとして伸長形成させる本工程−B工程とを有し、さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖DNAを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたDNAの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。
A method for measuring the content of methylated DNA in a target DNA region possessed by genomic DNA contained in a biological specimen,
(1) Obtaining methylated single-stranded DNA from a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological specimen, and binding the single-stranded DNA with an immobilized methylated DNA antibody A first step of selecting DNA,
(2) a second step of digesting the single-stranded DNA selected in the first step with a methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA; and
(3) As a pre-process of each of the following steps, single-stranded DNA that is an undigested product obtained in the second step (the methylation state is present at the recognition site of the methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting the single-stranded DNA). A single-stranded DNA not containing CpG) is separated from the immobilized methylated DNA antibody into a single-stranded DNA (positive strand) (third (pre-A) step);
Using the DNA (positive strand) in the single-stranded state separated in the third (previous A) step as a template, the partial base sequence (positive strand) of the base sequence of the DNA (positive strand) in the single-stranded state And a base sequence (complementary to the partial base sequence (positive strand) located further 3 ′ end than the 3 ′ end of the base sequence (positive strand) of the target DNA region ( as the extension primer an extension primer (primer for full O word over de) having a negative strand), by extending the extended primer once, a single-stranded state of the DNA (plus strand) of the double-stranded DNA And a step of forming an extension (third (previous B) step),
The double-stranded DNA extended and formed in the third (previous B) step includes a single-stranded DNA (positive strand) including the target DNA region and a base sequence that is complementary to the target DNA region. A single-stranded DNA (positive strand) having a step (third (previous C) step) of once separating into single-stranded DNA (negative strand) and including (a) the generated target DNA region as this step ) As a template, the forward primer as an extension primer, and the extension primer is extended once, thereby extending the single-stranded DNA containing the target DNA region as a double-stranded DNA. A and
(B) a single-stranded DNA containing a base sequence Ru complementary der against DNA region of the generated object (minus strand) as a template, which is complementary to a DNA region of the target base A partial base sequence (negative strand) of the base sequence of a single-stranded DNA (negative strand) containing the sequence, and complementary to the base sequence (positive strand) of the target DNA region Extension primer (primer for reverse) having a base sequence (positive strand) that is complementary to a partial base sequence (negative strand) located further 3 'end than the 3' end of the base sequence (negative strand) And a step B of extending the single-stranded DNA containing the target DNA region as a double-stranded DNA by extending the extended primer once. Each main process is changed to each main work. The elongated double-stranded DNA obtained in step 1 is once separated into a single-stranded state and then repeated to amplify the methylated DNA in the target DNA region to a detectable amount. And a third step of quantifying the amount of amplified DNA.
請求項1記載の第三工程のメチル化DNA抗体がメチルシトシン抗体である、請求項1記載の、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域におけるメチル化されたDNAの含量を測定する方法。   The content of methylated DNA in the target DNA region of the genomic DNA contained in the biological specimen according to claim 1, wherein the methylated DNA antibody in the third step according to claim 1 is a methylcytosine antibody. How to measure. 生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the biological specimen is mammalian serum or plasma. 生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法。   3. The method according to claim 1, wherein the biological specimen is mammalian blood or body fluid. 生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項1〜2のいずれかの請求項記載の方法。   The method according to claim 1, wherein the biological specimen is a cell lysate or a tissue lysate. 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、当該ゲノムDNAが有する目的とするDNA領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかの請求項記載の方法。   A DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological sample is a DNA sample that has been previously digested with a restriction enzyme that does not use the target DNA region of the genomic DNA as a recognition cleavage site. The method according to any one of claims 1 to 5. 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、少なくとも1種類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜6のいずれかの請求項記載の方法。   The DNA sample derived from genomic DNA contained in a biological specimen is a DNA sample obtained by digestion with at least one methylation sensitive restriction enzyme. The method described. 生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料が、予め精製されてなるDNA試料であることを特徴とする請求項1〜7のいずれかの請求項記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the DNA sample derived from genomic DNA contained in the biological specimen is a DNA sample purified in advance. 少なくとも1種類の1本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムDNAが有する目的とするDNA領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする請求項1〜8のいずれかの請求項記載の方法。   The methylation-sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA is a restriction enzyme having a recognition cleavage site in a target DNA region of genomic DNA contained in a biological sample. The method according to any one of claims 1 to 8. 少なくとも1種類の1本鎖DNAを消化できるメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHhaIであることを特徴とする請求項1〜9のいずれかの請求項記載の方法。   The method according to any one of claims 1 to 9, wherein the methylation sensitive restriction enzyme capable of digesting at least one kind of single-stranded DNA is HhaI which is a methylation sensitive restriction enzyme. 第一工程が、
生物由来検体中に含まれるゲノムDNA由来のDNA試料から、メチル化された一本鎖DNAを分離する第一(A)工程と、
第一(A)工程で分離された一本鎖DNAと固定化メチル化DNA抗体とを結合させる第一(B)工程と、からなり、
第一(A)工程でメチル化された一本鎖DNAを分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項1〜1のいずれかの請求項記載の方法。
The first step is
A first (A) step of separating methylated single-stranded DNA from a genomic DNA-derived DNA sample contained in a biological specimen;
The first (B) step of binding the single-stranded DNA separated in the first (A) step and the immobilized methylated DNA antibody,
The method according to any one of claims 1 to 10 , wherein a counter oligonucleotide is added when the single-stranded DNA methylated in the first step (A) is separated.
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