JP5258012B2 - Novel RANKL-glycosaminoglycan conjugate and the activity regulator. - Google Patents
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Description
本発明は、新規なＲＡＮＫＬ−グリコサミノグリカン結合体、ＲＡＮＫＬ活性調整剤及びグリコサミノグリカン活性調節剤に関する。 The present invention relates to a novel RANKL-glycosaminoglycan conjugate, a RANKL activity regulator and a glycosaminoglycan activity regulator.
まず、本出願書類において用いる略号を説明する。
ＣＨ：コンドロイチン
ＣＳ：コンドロイチン硫酸
ＣＳ−Ａ：コンドロイチン硫酸Ａ
ＤＳ：デルマタン硫酸（ＣＳ−Ｂ：コンドロイチン硫酸ともいう）
ＣＳ−Ｃ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−Ｄ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−Ｅ：コンドロイチン硫酸Ｅ
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＧＡＧは、細胞外マトリクスの構成成分の一つとして生体内に存在しており、その中のＣＳは、関節領域において、サプリメント、関節内治療薬として既に臨床応用されている。最近の研究においては、その動的な生体活性が注目されおり、ＤＳ、ＣＳ−Ｅ及びヘパラン硫酸は、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＣＤ４４に特異的に結合し生体活性を発現すること（非特許文献１）や硫酸化多糖類がＢＭＰと結合して、その生理活性を増強すること（非特許文献２）等の報告がある。また、骨質を溶かす酵素の破骨細胞による放出や骨表面の硫酸化を阻害することに基づく骨吸収の抑制作用を有する物質についての報告や、硫酸化ＧＡＧのカルシウム塩を含有する口腔用組成物が歯周病原性細菌の内毒素刺激による骨のカルシウム遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献１）や硫酸化ＧＡＧナトリウムとカルシウム化合物を併用する骨代謝改善剤が内毒素やヒト副甲状腺ホルモン等による骨のカルシウム遊離量に抑制効果を示すこと（特許文献２）及びインシュリン、プロタミン及びＧＡＧから選択される少なくとも１種を含む石灰化促進剤と骨補填剤からなる骨疾患治療剤（特許文献３）等の報告がある。
First, abbreviations used in the application documents will be described.
CH: Chondroitin CS: Chondroitin sulfate CS-A: Chondroitin sulfate A
DS: Dermatan sulfate (CS-B: also called chondroitin sulfate)
CS-C: Chondroitin sulfate C
CS-D: Chondroitin sulfate D
CS-E: Chondroitin sulfate E
GAG: Glycosaminoglycan GAG exists in vivo as one of the components of the extracellular matrix, and CS in it has already been clinically applied as a supplement or an intra-articular therapeutic agent in the joint region. . In recent studies, dynamic biological activity has attracted attention, and DS, CS-E and heparan sulfate specifically bind to L-selectin, P-selectin and CD44 and express biological activity (non-active). There are reports such as Patent Document 1) and sulfated polysaccharides binding to BMP to enhance their physiological activity (Non-Patent Document 2). In addition, a report on a substance having an action of suppressing bone resorption based on inhibiting release of an enzyme that dissolves bone quality by osteoclasts and inhibiting sulfation of the bone surface, and an oral composition containing a calcium salt of sulfated GAG Has an inhibitory effect on bone calcium release by endotoxin stimulation of periodontopathic bacteria (Patent Document 1) and bone metabolism improving agents using sulfated GAG sodium and calcium compounds in combination are endotoxin and human parathyroid hormone A bone disease treatment agent comprising a mineralization accelerator and a bone filling agent containing at least one selected from insulin, protamine and GAG (Patent Document 2) 3) etc. are reported.
一方、ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｌｉｇａｎｄ）は、ヤスダら及びPenningerらのグループによって破骨細胞の分化を制御する中心的なサイトカインであることが報告されたが（非特許文献３，４）、既にＴ細胞上に発現する樹状細胞活性化因子としてクローニングされていた分子であった。
On the other hand, RANKL (Receptor activator of NF-κB ligand) was reported to be a central cytokine that controls osteoclast differentiation by the group of Yasuda et al. And Penninger et al. (Non-patent
ＲＡＮＫＬは、骨生物学における不可欠なサイトカインであり、単球−マクロファージ前駆体からの破骨細胞への分化を媒介し、かつ成熟破骨細胞の生存及び機能を調節する（非特許文献５）。またＲＡＮＫＬは免疫生物学的にも重要な役割を果たし、Ｔ細胞、樹状細胞及びそれらの前駆体上で発現されることにより、Ｔ及びＢリンパ球の分化並びに免疫系における樹状細胞の生存を媒介する。 RANKL is an indispensable cytokine in bone biology, mediates the differentiation of monocyte-macrophage precursors into osteoclasts, and regulates the survival and function of mature osteoclasts (Non-Patent Document 5). RANKL also plays an important role in immunobiology and is expressed on T cells, dendritic cells and their precursors to differentiate T and B lymphocytes and the survival of dendritic cells in the immune system. Mediate.
またＲＡＮＫＬは、破骨細胞及びその前駆細胞の細胞表面に発現するＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｉｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ）と結合することによって、破骨細胞及びその前駆細胞を活性化し、それらの細胞の分化・成熟、寿命延長、骨吸収亢進を誘発することが知られている（非特許文献６）。 RANKL also activates osteoclasts and their progenitors by binding to RANK (Receptor activator of NF-κB) expressed on the cell surface of osteoclasts and their progenitors, and differentiation and maturation of those cells It is known to induce life extension and increased bone resorption (Non-patent Document 6).
しかしながら、特定の構造を持ったＧＡＧがＲＡＮＫＬと結合体を形成すること、及びその結合体の生物学的活性を制御する方法は知られていない。 However, it is not known how GAGs having a specific structure form a conjugate with RANKL and how to control the biological activity of the conjugate.
本発明は、ＲＡＮＫＬ分子とＤＳ又はＣＳ−Ｅとの新規な結合体並びにＲＡＮＫＬ，ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体、該担体を用いたＲＡＮＫＬ、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法、該担体を用いたキット、該結合体の生物学的活性の促進又は阻害方法、並びに該結合体を含有する医療用材料等を提供することを課題とする。 The present invention relates to a novel conjugate of a RANKL molecule and DS or CS-E, a carrier on which RANKL, DS, or CS-E is immobilized, separation, purification, and / or RANKL, DS, or CS-E using the carrier. Another object is to provide a detection method, a kit using the carrier, a method for promoting or inhibiting the biological activity of the conjugate, and a medical material containing the conjugate.
本発明の発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＲＡＮＫＬ分子がＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅと特異的に結合することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the inventors of the present invention have found that the RANKL molecule specifically binds to DS and / or CS-E, and have completed the present invention.
すなわち本発明は、ＤＳ及び／又はＣＳ−ＥとＲＡＮＫＬ分子とから構成される結合体（以下、「本発明結合体」という。）を提供する。 That is, the present invention provides a conjugate composed of DS and / or CS-E and a RANKL molecule (hereinafter referred to as “the conjugate of the present invention”).
また本発明は、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体（以下、「本発明担体１」という。）を提供する。
The present invention also provides a carrier on which a RANKL molecule is immobilized (hereinafter referred to as “the
また本発明は、本発明結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出するための、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体（以下、「本発明担体２」という。）を提供する。
The present invention also provides a carrier on which DS or CS-E is immobilized (hereinafter referred to as “the
以下、本発明担体１及び２をあわせて単に「本発明担体」ともいう。
Hereinafter, the
また本発明は、本発明担体１を用いることを特徴とする、本発明結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法（以下、「本発明方法１」という。）を提供する。
Further, the present invention is a method for separating, purifying and / or detecting the conjugate of the present invention, DS or CS-E (hereinafter referred to as “
また本発明は、本発明担体２を用いることを特徴とする、本発明結合体又はＲＡＮＫＬ分子を、分離、精製及び／又は検出する方法（以下、「本発明方法２」という。）を提供する。
The present invention also provides a method for separating, purifying and / or detecting the conjugate or RANKL molecule of the present invention (hereinafter referred to as “
また本発明は、本発明担体１を含むキット（以下、「本発明キット１」という。）を提供する。
The present invention also provides a kit comprising the
また本発明は、本発明担体２を含むキット（以下、「本発明キット２」という。）を提供する。
The present invention also provides a kit comprising the
以下、本発明キット１及び２を単に「本発明キット」ともいう。
Hereinafter, the
また本発明は、ＤＳ又はＣＳ−ＥによりＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する方法（以下、「本発明方法３」という。）を提供する。
The present invention also provides a method for promoting or inhibiting the biological activity of a RANKL molecule by DS or CS-E (hereinafter referred to as “
また本発明は、ＲＡＮＫＬ分子により、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する方法（以下、「本発明方法４」という。）を提供する。 The present invention also provides a method of promoting or inhibiting the biological activity of DS or CS-E (hereinafter referred to as “method 4 of the present invention”) using a RANKL molecule.
以下、本発明方法１〜４をあわせて単に「本発明方法」ともいう。
Hereinafter, the
また本発明は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する組成物（以下、「本発明組成物１」という。）を提供する。
The present invention also provides a composition that promotes or inhibits the biological activity of a RANKL molecule (hereinafter referred to as “the
また本発明は、ＲＡＮＫＬ分子を含有するＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する組成物（以下、「本発明組成物２」という。）を提供する。
The present invention also provides a composition that promotes or inhibits the biological activity of DS or CS-E containing a RANKL molecule (hereinafter referred to as “the
また本発明は、本発明組成物１又は２を含有する医療用材料（以下、「本発明医療用材料２」という。）を提供する。
また本発明は、本発明結合体を含有する医療用材料（以下、「本発明医療用材料２」という。）を提供する。
The present invention also provides a medical material containing the
The present invention also provides a medical material containing the conjugate of the present invention (hereinafter referred to as “the present
本発明により、新規物質としての本発明結合体が提供されるとともに、本発明担体、本発明方法並びに本発明キットが提供される。 The present invention provides the conjugate of the present invention as a novel substance, as well as the carrier, the method and the kit of the present invention.
また、生体内におけるＲＡＮＫＬ分子の生理的機能を、外部から与えるＤＳ又はＣＳ−Ｅによって、正・負の方向に制御できる可能性があり、それらＲＡＮＫＬ分子結合性のＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅは医療への適用が期待され、ＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の活性調整剤並びに調整方法が提供される。 Moreover, there is a possibility that the physiological function of RANKL molecules in vivo can be controlled in the positive and negative directions by externally applied DS or CS-E, and these RANKL molecule-binding DS and / or CS-E are A RANKL molecule activity modulator and a method of preparation are provided that are expected to be applied to medicine and contain DS and / or CS-E.
また、実施例の結果からコンドロイチン硫酸の硫酸基の位置に活性に依存することから、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの活性を、ＲＡＮＫＬ分子によって制御できる可能性があり、ＲＡＮＫＬ分子を含有する、ＤＳ及び／又はＣＳ−Ｅの活性調整剤並びに調節方法が提供される。 Further, from the results of the examples, since the activity depends on the position of the sulfate group of chondroitin sulfate, there is a possibility that the activity of DS or CS-E can be controlled by the RANKL molecule, which contains RANKL molecule, DS and / or Alternatively, CS-E activity regulators and methods of regulation are provided.
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞本発明結合体
本発明結合体は、ＤＳ及び／又はＣＳ−ＥとＲＡＮＫＬ分子とから構成される結合体である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail by the best mode for carrying out the invention.
<1> Conjugate of the Present Invention The conjugate of the present invention is a conjugate composed of DS and / or CS-E and a RANKL molecule.
本発明結合体に使用される「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」は広く市販されているもの（例えば生化学工業（株）社製等）を用いることができる。またＤＳはウシ腎、ＣＳ−Ｅはイカ脊索等から公知の方法により調整することもでき、化学的に合成することもできる。また「ＲＡＮＫＬ分子」も同様に市販されているものを用いることができ、遺伝子工学的及び生化学的に常用される方法を用いて製造することもできる。また発明の実施例におけるＡｆｆｉｎｉｘＱを用いた相互作用実験によりＤＳとＲＡＮＫＬの結合性を示した。 As “DS” and “CS-E” used in the conjugate of the present invention, those commercially available (for example, manufactured by Seikagaku Corporation) can be used. Further, DS can be prepared from bovine kidney, CS-E can be prepared from squid notochord or the like by a known method, and can be chemically synthesized. Similarly, “RANKL molecule” may be commercially available, and can be produced by a method commonly used in genetic engineering and biochemistry. Moreover, the binding experiment of DS and RANKL was shown by the interaction experiment using AffinixQ in the Example of invention.
また、本発明結合体とは、ＲＡＮＫＬとＤＳ又はＲＡＮＫＬとＣＳ−Ｅとが結合しているものであればよく、上に記載されているようにＲＡＮＫＬ、ＤＳ及びＣＳ−Ｅの由来等も特に限定されない。また本発明結合体を製造するには、ＲＡＮＫＬ分子とＤＳ又はＣＳ−Ｅとを共存させればよく、その共存方法も特に限定されない。例えば、ＲＡＮＫＬ分子を有する細胞が含まれる培地にＤＳ又はＣＳ−Ｅを添加し共存することにより得ることもできる。
＜２＞本発明担体１
本発明担体１は、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体である。
Further, the conjugate of the present invention may be any one in which RANKL and DS or RANKL and CS-E are bound, and the origin of RANKL, DS, and CS-E is particularly described as described above. It is not limited. In order to produce the conjugate of the present invention, the RANKL molecule and DS or CS-E may coexist, and the coexistence method is not particularly limited. For example, it can also be obtained by adding DS or CS-E to a medium containing cells having RANKL molecules.
<2>
The
本発明担体１のＲＡＮＫＬ分子の担体への固定化は、代用的には組換えポリペプチドを少なくとも水不溶性担体に固定して行われる。固定化方法としては、（１）担体結合法、（２）包括法等、及びそれらを組み合わせた複合法が挙げられる。該固定化には、当該分野で汎用されている方法を用いることができる。
The immobilization of the
前記担体結合法としては、例えばイオン相互作用、疎水相互作用、物理的吸着などを利用する方法、共有結合などの化学的結合により行うことができる。 As the carrier binding method, for example, a method using ionic interaction, hydrophobic interaction, physical adsorption, or chemical bonding such as covalent bonding can be performed.
前記イオン相互作用を利用する担体結合方法では、デキストラン、セルロース、アガロース、デンプンなどの多糖類のイオン交換体、例えばＤＥＡＥ基、ＴＥＡＥ基、ＣＭ基、スルホン酸アルキル基などを持つ誘導体、イオン交換樹脂などを担体として用いることができる。 In the carrier binding method using the ionic interaction, polysaccharide ion exchangers such as dextran, cellulose, agarose and starch, for example, derivatives having DEAE group, TEAE group, CM group, alkyl sulfonate group, ion exchange resin, etc. Etc. can be used as a carrier.
前記疎水相互作用を利用する担体結合方法では、ポリスチレンビーズやガラスビーズ、さらに、ブチル基やフェニル基などの疎水性官能基が結合された一般的な担体などを担体として用いることができる。 In the carrier binding method using the hydrophobic interaction, polystyrene beads or glass beads, and a general carrier to which a hydrophobic functional group such as a butyl group or a phenyl group is bound can be used as the carrier.
前記物理的な吸着を利用する担体結合方法では、例えば活性炭、酸性白土、漂白土、カオリナイト、アルミナ、シリカゲル、ベントナイト、金属酸化物、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムなどの無機物質、デンプン、キチン、グルテン、セルロース、アガロース、タンニンなどの天然高分子、ポリスチレンなどの合成高分子、疎水性基を持ったアガロース誘導体などを担体として用いることができる。 In the carrier binding method using physical adsorption, for example, activated carbon, acid clay, bleached clay, kaolinite, alumina, silica gel, bentonite, metal oxide, hydroxyapatite, calcium phosphate and other inorganic substances, starch, chitin, gluten, Natural polymers such as cellulose, agarose, and tannin, synthetic polymers such as polystyrene, agarose derivatives having a hydrophobic group, and the like can be used as a carrier.
前記共有結合などの化学的結合による担体結合方法としては、ペプチド法、ジアゾ法、アルキル化法、臭化シアン活性化法、架橋試薬による結合法、ユギ（Ｕｇｉ）反応を利用した固定化法、チオール・ジスルフィド交換反応を利用した固定化法、シッフ塩基形成法、キレート結合法、トシルクロリド法、生化学的特異結合法などが挙げられる。好ましくは、共有結合などのより安定した結合には、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応等を利用して行うことができ、公知の方法或いは当該分野の当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾した方法の中から適宜選択して適用できる。好ましくは共有結合などのより安定した結合を形成できる化学的結合材・架橋剤などが使用される。 Examples of the carrier binding method by chemical bond such as the covalent bond include peptide method, diazo method, alkylation method, cyanogen bromide activation method, binding method by cross-linking reagent, immobilization method using Ugi reaction, Examples thereof include an immobilization method using a thiol-disulfide exchange reaction, a Schiff base formation method, a chelate binding method, a tosyl chloride method, and a biochemical specific binding method. Preferably, a more stable bond such as a covalent bond can be performed using a reaction between a thiol group and a maleimide group, a reaction between a pyridyl disulfide group and a thiol group, a reaction between an amino group and an aldehyde group, and the like. It can be applied by appropriately selecting from among methods, methods that can be easily carried out by those skilled in the art, and methods modified by them. Preferably, a chemical binding material / crosslinking agent or the like that can form a more stable bond such as a covalent bond is used.
前記化学的結合材剤・架橋剤としては、カルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、ベンゾキノン、アルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド化合物、ピリジルスルフィド化合物などが挙げられる。好ましい試薬としては、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ‘−ポリメチレンビスヨードアセトアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビスマレイミド、エチレングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビスジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル４−（１−マレイミドフェニル）ブチレート、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハクサンイミド（ＥＭＣＳ）、イミノチオラン、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４’−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカプトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。 Examples of the chemical binder / crosslinking agent include carbodiimide, isocyanate, diazo compound, benzoquinone, aldehyde, periodic acid, maleimide compound, pyridyl sulfide compound and the like. Preferred reagents include, for example, formaldehyde, glutaraldehyde, hexamethylene diisocyanate, hexamethylene diisothiocyanate, N, N′-polymethylene bisiodoacetamide, N, N′-ethylene bismaleimide, ethylene glycol bissuccinimidyl succinate. Bisdiazobenzidine, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, succinimidyl 3- (2-pyridylthio) propionate (SPDP), N-succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), N-sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate N-succinimidyl 4- (1-maleimidophenyl) butyrate, N- (ε-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS), iminothiolane, S-acetylmercaptosuccinic anhydride, methyl-3- (4′-dithio Pyridyl) propionimidate, methyl-4-mercaptobutyrylimidate, methyl-3-mercaptopropionimidate, N-succinimidyl-S-acetylmercaptoacetate and the like.
前記ペプチド法では担体と所要のポリペプチドの間にペプチド結合を形成させて固定化される。例えばカルボキシル基を持つ担体をアジド、クロリド、イソシアネートなどの誘導体とし、当該ポリペプチド中の遊離アミノ基との間でペプチド結合を形成させる。ペプチド合成に用いられる試薬、例えばカルボジイミド試薬、ウッドワード試薬Ｋ（Ｎ−エチル−５−フェニルイソキサリウム−３’−スルホナート）などが用いられる。担体のアミノ基及びカルボキシル基と所要のポリペプチド中のアミノ基及びカルボキシル基との間でペプチド結合を形成させることもできる。 In the peptide method, a peptide bond is formed between a carrier and a required polypeptide to be immobilized. For example, a carrier having a carboxyl group is a derivative such as azide, chloride, or isocyanate, and a peptide bond is formed with a free amino group in the polypeptide. Reagents used for peptide synthesis, such as carbodiimide reagent, Woodward reagent K (N-ethyl-5-phenylisoxarium-3'-sulfonate) and the like are used. Peptide bonds can also be formed between the amino and carboxyl groups of the carrier and the amino and carboxyl groups in the required polypeptide.
前記ジアゾ法は、芳香族アミノ基を持つ担体をジアゾニウム化合物とし、これと所要のポリペプチドとをジアゾカップリングさせて固定化するものである。遊離アミノ基、ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのフェノール性水酸基などを持つ当該ポリペプチドに好適に適用できる。担体としては、多糖類、アミノ酸共重合物、ポリアクリルアミド、スチレン系樹脂、エチレン・マレイン酸共重合物、多孔性ガラス、芳香族アミド誘導体などが挙げられる。 In the diazo method, a carrier having an aromatic amino group is a diazonium compound, and this and a required polypeptide are immobilized by diazo coupling. It can be suitably applied to the polypeptide having a free amino group, an imidazole group of histidine, a phenolic hydroxyl group of tyrosine, and the like. Examples of the carrier include polysaccharides, amino acid copolymers, polyacrylamides, styrene resins, ethylene / maleic acid copolymers, porous glass, and aromatic amide derivatives.
前記アルキル化法は、当該ポリペプチド中の遊離アミノ基、フェノール性水酸基、スルフヒドリル基をハロゲンの様な反応性官能基を持つ担体によりアルキル化して固定化する方法である。担体としては、ハロゲン化アセチル誘導体、トリアジニル誘導体、ハロゲン化メタクリル誘導体などが挙げられる。 The alkylation method is a method in which a free amino group, a phenolic hydroxyl group, and a sulfhydryl group in the polypeptide are alkylated and immobilized with a carrier having a reactive functional group such as a halogen. Examples of the carrier include halogenated acetyl derivatives, triazinyl derivatives, halogenated methacrylic derivatives and the like.
前記臭化シアン活性化法は、デキストラン、セルロース、アガロース、デンプンなどの多糖類、多孔性ガラスなどを臭化シアンで活性化した後、当該ポリペプチドを固定化するものである。架橋試薬による結合法のうち、特にグルタルアルデヒドなどの二官能性試薬を用いた場合、セルロース、アガロース、アルブミン、ゼラチン、キトサンなどのアミノ基を導入されたあるいは有する天然高分子、合成高分子、多孔性ガラス、多孔性セラミックスなどの無機担体のアミノシラン誘導体などが挙げられる。 In the cyanogen bromide activation method, dextran, cellulose, agarose, starch and other polysaccharides, porous glass and the like are activated with cyanogen bromide, and then the polypeptide is immobilized. Among the binding methods using a crosslinking reagent, especially when a bifunctional reagent such as glutaraldehyde is used, a natural polymer, synthetic polymer, porous material in which an amino group such as cellulose, agarose, albumin, gelatin or chitosan is introduced or has an amino group is introduced. And aminosilane derivatives of inorganic carriers such as porous glass and porous ceramics.
前記ユギ反応とは、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、イソニトリル基が共存していて反応させると縮合反応が起こることを利用するものである。カルボキシル基又はアミノ基を持つ担体と当該ポリペプチドとを混合した中にアセトアルデヒド及び３−ジメチルアミノプロピルイソシアニドを加えることで反応させるものが挙げられる。担体としては、多糖類、ポリアクリルアミドのアミノ誘導体、ナイロンのイソニトリル誘導体などが挙げられる。 The Yugi reaction utilizes the fact that a condensation reaction occurs when a carboxyl group, an amino group, an aldehyde group, and an isonitrile group coexist. What reacts by adding acetaldehyde and 3-dimethylamino propyl isocyanide in the carrier and the polypeptide which have a carboxyl group or an amino group are mixed. Examples of the carrier include polysaccharides, amino derivatives of polyacrylamide, isonitrile derivatives of nylon, and the like.
前記生化学的特異結合法においては、特異的結合反応ペア同志の生化学的特異結合反応を利用するもので、例えば抗原とそれに対する抗体、抗体とハプテン、エフェクターとレセプター、酵素と酵素インヒビター、酵素基質、補酵素類、複合蛋白質における補欠分子団、レクチンと糖鎖含有物質、酵素と酵素基質、核酸とその相補的な核酸などが挙げられ、それらは公知のものの中から選んでよい。 The biochemical specific binding method uses a biochemical specific binding reaction between specific binding reaction pairs. For example, an antigen and an antibody thereto, an antibody and a hapten, an effector and a receptor, an enzyme and an enzyme inhibitor, an enzyme Substrates, coenzymes, prosthetic groups in complex proteins, lectin and sugar chain-containing substances, enzymes and enzyme substrates, nucleic acids and their complementary nucleic acids, and the like, may be selected from known ones.
前記包括法とは、多糖類や蛋白質などの天然高分子や合成高分子の細いゲル・マトリックスの中に当該ポリペプチドを閉じ込めることによる高分子ゲルを用いる方法と、膜で区切られた空間に当該ポリペプチドを閉じ込める方法とに大別できる。膜包括法には、半透性の固体膜に包み込むマイクロカプセル型膜包括法、半透膜性のホロー・ファイバーや限外濾過膜による空間に包み込む方法、液体状の膜に包み込むリポソーム型などの方法が挙げられる。 The inclusion method includes a method of using a polymer gel by confining the polypeptide in a thin gel matrix of natural polymers or synthetic polymers such as polysaccharides and proteins, and a space separated by a membrane. It can be broadly divided into methods for confining polypeptides. Membrane inclusion methods include microcapsule type membrane inclusion method encapsulated in a semipermeable solid membrane, method of encapsulating in a space with semipermeable hollow fiber or ultrafiltration membrane, liposome type encapsulated in a liquid membrane, etc. A method is mentioned.
前記高分子ゲルを用いる方法は、網目構造を持つ高分子ゲルのマトリックスの中に当該ポリペプチドを閉じ込めて固定化するもので、固定時にゲルを球状、フィルム状、チューブ状、膜状に自由に成形できる。当該ゲルの調製法としては、モノマーと架橋剤を重合させて高分子ゲルを形成させる方法、プレポリマーあるいはオリゴマーを重合させる方法、高分子を可溶性の状態から不溶の状態に変化させることによりゲルを形成させる方法などが挙げられる。当該ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂、ウレタンポリマーなどの合成高分子、κ−カラギーナン、アルギン酸、ペクチン、キトサン、デンプン、コラーゲンなどの天然高分子などが挙げられる。 In the method using the polymer gel, the polypeptide is trapped and fixed in a matrix of a polymer gel having a network structure, and the gel can be freely formed into a spherical shape, a film shape, a tube shape, or a membrane shape at the time of fixation. Can be molded. The gel can be prepared by polymerizing a monomer and a crosslinking agent to form a polymer gel, by polymerizing a prepolymer or oligomer, or by changing the polymer from a soluble state to an insoluble state. The method of forming is mentioned. Examples of the polymer include synthetic polymers such as polyacrylamide, polyvinyl alcohol, photocurable resin, and urethane polymer, and natural polymers such as κ-carrageenan, alginic acid, pectin, chitosan, starch, and collagen.
前記ポリアクリルアミドを用いる場合、アクリルアミドモノマー、架橋剤Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、重合促進剤Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、重合開始剤過硫酸カリウムを用いてゲル化させたり、γ線又はＸ線のような放射線を用いたりできる。アルギン酸カルシウムを利用する場合、アルギン酸ナトリウムは水に可溶であるが、そのカルシウム塩やアルミニウム塩は水に不溶であることを利用している。まずアルギン酸ナトリウム水溶液と当該ポリペプチドとを混合し、塩化カルシウム水溶液と接触させる。 When the polyacrylamide is used, it is gelled using an acrylamide monomer, a crosslinking agent N, N′-methylenebisacrylamide, a polymerization accelerator N, N, N ′, N′-tetramethylethylenediamine, and a polymerization initiator potassium persulfate. Or radiation such as gamma rays or X-rays. When calcium alginate is used, sodium alginate is soluble in water, but the calcium salt and aluminum salt are insoluble in water. First, an aqueous sodium alginate solution and the polypeptide are mixed and brought into contact with an aqueous calcium chloride solution.
前記κ−カラギーナンを用いる場合、κ−カラギーナンは加熱すると水に溶解するが、アンモニウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、脂肪族アミンなどが存在するとゲル化するので、こうして得られたゲルをグルタルアルデヒドやヘキサメチレンジアミンなどで架橋して安定化させる。 When the κ-carrageenan is used, κ-carrageenan dissolves in water when heated, but gels in the presence of ammonium ions, potassium ions, calcium ions, aliphatic amines, and the like. It is stabilized by crosslinking with hexamethylenediamine.
前記光硬化性樹脂を用いる場合、適度な重合度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）あるいはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）を主鎖とし、その末端にアクリロイル基、メタクリロイル基、シンナモイル基などの光感応性基を組み込んだプレポリマーを用いることができる。該プレポリマーは光増感剤ベンゾインエチルエーテル又はベンゾインイソブチルエーテル存在下、当該ポリペプチドを含む溶液と混合し、紫外線を照射してゲル化させることができる。ウレタンプレポリマーは当該ポリペプチドを含む水溶液と混合するだけでゲル化させることができる。 When using the photo-curable resin, polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol (PPG) having an appropriate degree of polymerization is used as a main chain, and a photo-sensitive group such as an acryloyl group, a methacryloyl group, or a cinnamoyl group is incorporated at the terminal. A prepolymer can be used. The prepolymer can be mixed with a solution containing the polypeptide in the presence of a photosensitizer benzoin ethyl ether or benzoin isobutyl ether and gelled by irradiation with ultraviolet rays. The urethane prepolymer can be gelled only by mixing with an aqueous solution containing the polypeptide.
前記マイクロカプセル型膜包括法は、例えば親水性モノマーと疎水性モノマーとをその界面で重合させる際、当該ポリペプチドを被覆して固定化したり、液中乾燥法で例えばベンゼン、ヘキサン、クロロホルムなどの揮発性の高い有機溶媒にポリマーを溶解し、その中に当該ポリペプチドを含む水溶液を分散させ一次乳化液とし、次にこの一次乳化液をゼラチン、ポリビニル又は界面活性剤などの保護コロイド物質を含む水溶液中に分散させ、得られた二次乳化液から有機溶媒を除去することによりカプセルを形成させるものである。 The microcapsule membrane entrapment method is, for example, when a hydrophilic monomer and a hydrophobic monomer are polymerized at the interface, and the polypeptide is coated and immobilized, or a submerged drying method such as benzene, hexane, chloroform, etc. A polymer is dissolved in a highly volatile organic solvent, an aqueous solution containing the polypeptide is dispersed therein to form a primary emulsion, and this primary emulsion then contains a protective colloid material such as gelatin, polyvinyl, or a surfactant. The capsule is formed by dispersing in an aqueous solution and removing the organic solvent from the obtained secondary emulsion.
前記ホロー・ファイバーや限外濾過膜に当該ポリペプチドを固定化する方法では、複数の当該ポリペプチドを固定化することも可能で、さらに膜に結合すること無く遊離状態で固定化することができる。 In the method of immobilizing the polypeptide on the hollow fiber or ultrafiltration membrane, it is possible to immobilize a plurality of the polypeptides, and further immobilize them in a free state without binding to the membrane. .
参考となる文献としては、例えば文献〔米国特許第４，００３，９８８号；Ｂ． Ｋ． Ｖａｎ Ｗｅｅｍｅｎ 及び Ａ． Ｈ． Ａ． Ｓｃｈｕｕｒｓ， Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ． １５， Ｎｏ． １５：２３２−２３５（１９７１）；Ｐ． Ｌｅｉｎｉｋｋ
ｉ；Ｓｕｖｉ Ｐａｓｓｉｌａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ．， ２９：１１６−１２０（１９７６）；Ｂ． Ｒ． Ｂｒｏｄｅｕｒ， Ｆ． Ｅ． Ａｓｈｔｏｎ及び Ｂ．Ｂ． Ｄｉｅｎａ， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １５， Ｎｏ． １：１−９（１９８１）；Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈ．， ２９：１５０−１５３（１９７６）；石川栄治、他編「酵素免疫測定法」株式会社医学書院、１９７８年〕などを挙げることができる。
Reference literature includes, for example, literature [US Pat. No. 4,003,988; K. Van Wemen and A.A. H. A. Schuurs, Febs Letters, Vol. 15, no. 15: 232-235 (1971); Leinikk
i; Suvi Passila, J. et al. Clin. Path. 29: 116-120 (1976); R. Brodeur, F.M. E. Ashton and B.H. B. Diena, The Journal of Medical Microbiology, Vol. 15, no. 1: 1-9 (1981); Clin. Path. 29: 150-153 (1976); Eiji Ishikawa, et al., “Enzyme Immunoassay”, Medical School, 1978].
前記水不溶性担体とは、固定化、保存、測定などにおいて用いられる液体媒質に実質的に不溶性である担体を指す。当該担体としては、特異的結合反応に使用されるものが種々知られており、本発明においてもこれらの公知のものの中から選んで使用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えば架橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、架橋アガロース、セルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテート、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などのポリエステル、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレタン、ポリエポキシ樹脂などの有機高分子物質を乳化重合して得られたものなどの有機高分子物質、ガラス、例えば活性化ガラス、シリカゲル、シリカ−アルミナ、アルミナなどの無機材料などからなるもので、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導入してあるものが挙げられる。 The water-insoluble carrier refers to a carrier that is substantially insoluble in a liquid medium used in immobilization, storage, measurement and the like. Various carriers used for specific binding reactions are known, and in the present invention, these carriers can be selected and used. Particularly preferably used are cross-linked albumin, collagen, gelatin, agarose, cross-linked agarose, cellulose, microcrystalline cellulose, carboxymethyl cellulose, cellulose acetate, cross-linked dextran, polyacrylamide, cross-linked polyacrylamide, polyethylene, polypropylene, Polyvinyl chloride, polyvinyl acetate, polyacrylamide, polymethacrylate, polystyrene, styrene-butadiene copolymer, styrene-methacrylate copolymer, polyglycidyl methacrylate, polyester such as acrolein-ethylene glycol dimethacrylate copolymer, nylon, etc. Organic polymer materials such as those obtained by emulsion polymerization of organic polymer materials such as polyamide, polyurethane and polyepoxy resin, glass Such as activated glass, silica gel, silica - alumina, made of an inorganic material such as alumina, optionally, include those which had been introduced the functional group with a silane coupling agent.
本発明担体１は、本発明結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを、分離精製及び／又は検出するために、用いることができる。
The
また、本発明担体１で用いる「ＲＡＮＫＬ」、「ＤＳ」及び「ＣＳ−Ｅ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜３＞本発明担体２
本発明担体２は、本発明結合体又はＲＡＮＫＬを、分離、精製及び／又は検出するための、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体である。
Further, “RANKL”, “DS”, “CS-E” and the like used in the
<3>
The
本発明担体２におけるＤＳ又はＣＳ−Ｅの担体への固定化は本発明担体１で例示された方法で固定化することができる。
In the
また、本発明担体２で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜４＞ 本発明方法１
本発明方法１は、本発明担体１を用いることを特徴とする、本発明結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出する方法である。
Further, “DS”, “CS-E”, “RANKL” and the like used in the
<4>
The
本発明方法１は、ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体をカラムなどに詰めて、被検試料を該カラムに通すことによって、該結合体、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの分離、精製及び／又は検出することができる。
The
前記ＲＡＮＫＬ分子を固定化した担体に、ＲＡＮＫＬ分子を介して結合したＤＳ又はＣＳ−Ｅ並びに形成されたＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体又はＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体の検出は、該ＤＳ又は該ＣＳ−Ｅに特異的に結合する物質を用いて行うことが好ましい。当該物質としては、例えば該ＤＳ又はＣＳ−Ｅに対する抗体等が親和性の強さから好ましい。 The detection of the DS or CS-E bound to the carrier on which the RANKL molecule is immobilized via the RANKL molecule and the RANKL-DS conjugate or RANKL-CS-E conjugate formed is performed using the DS or the CS-E. It is preferable to carry out using a substance that specifically binds to. As the substance, for example, an antibody against the DS or CS-E is preferable because of its strong affinity.
前記抗体としてはポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることが可能であり特に限定はされない。前記検出において、上記ＤＳ又はＣＳ−Ｅに対する抗体を用いる場合は、当該抗体又は当該抗体に対する二次抗体を標識物質により標識することが、より正確なＤＳ又はＣＳ−Ｅの検出が可能となるため好ましい。 As the antibody, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used and is not particularly limited. In the detection, when an antibody against the DS or CS-E is used, it is possible to detect the DS or CS-E more accurately by labeling the antibody or a secondary antibody against the antibody with a labeling substance. preferable.
前記標識物質としては、例えば特異的結合対（例えばビオチンとストレプトアビジン等のアビジン類、又はレクチンとそのレクチンが認識する糖鎖等）の一方の物質；ＦＩＴＣ、フィコエリトン、ユーロピウム、フィコシアニン、ローダミン、テキサスレッド、ウンベリフェロン、トリカラー、シアニン又は７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）等の蛍光物質；ルミノール、アクリジニウム又はルシゲニン等の発光物質類、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼ等の酵素類；ジニトロフルオロベンゼン、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）又は２，４−ジニトロアニリン等のハプテン類；及び１２５Ｉ、１３１Ｉ、３Ｈ等のラジオアイソトープ類を用いることができる。 Examples of the labeling substance include one substance of a specific binding pair (for example, avidin such as biotin and streptavidin, or a sugar chain recognized by lectin and its lectin); FITC, phycoeryton, europium, phycocyanin, rhodamine, Texas Fluorescent substances such as red, umbelliferone, tricolor, cyanine or 7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid (AMCA); luminescent substances such as luminol, acridinium or lucigenin, alkaline phosphatase, β-galactosidase, peroxidase Or enzymes such as glucose oxidase; haptens such as dinitrofluorobenzene, AMP (adenosine monophosphate) or 2,4-dinitroaniline; and radioisotopes such as 125 I, 131 I and 3 H can be used. Yes.
前記標識物質の検出は、使用する標識物質に適した通常実施される方法により行うことが可能である。例えば、標識物質として上記酵素に分類されるペルオキシダーゼを用いた場合は、テトラメチルベンゼン（ＴＭＢ）等の酸素受容体と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの酸素供与体を反応させることにより、溶液の着色により検出することが可能である。 The labeling substance can be detected by a commonly practiced method suitable for the labeling substance used. For example, when a peroxidase classified as the above enzyme is used as a labeling substance, an oxygen acceptor such as tetramethylbenzene (TMB) is reacted with an oxygen donor such as hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), It can be detected by coloring the solution.
また、本発明方法１で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
Further, “DS”, “CS-E”, “RANKL” and the like used in the
また本発明方法１は、例えば後述する本発明キット１に応用することができる。
＜５＞本発明方法２
本発明方法２は、本発明担体２を用いることを特徴とする、本発明結合体又はＲＡＮＫＬ分子を分離、精製及び／又は検出する方法である。
Moreover, this
<5>
The
本発明方法２は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体はカラムなどに詰めて被検試料を該カラムに通すことによって、該結合体又はＲＡＮＫＬ分子の分離、精製及び／又は検出することができる。
The
前記ＤＳ又はＣＳ−Ｅを固定化した担体にＤＳ又はＣＳ−Ｅを介して結合したＲＡＮＫＬ分子又は形成されたＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体又はＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体の検出は、該ＲＡＮＫＬ分子に特異的に結合する物質を用いて行うことが好ましい。当該物質としては、例えばＲＡＮＫＬ分子に対する抗体等が親和性の強さから好ましい。 Detection of a RANKL molecule or a formed RANKL-DS conjugate or RANKL-CS-E conjugate bound to the carrier on which the DS or CS-E is immobilized via the DS or CS-E is specific to the RANKL molecule. It is preferable to use a substance that binds to the target. As the substance, for example, an antibody against a RANKL molecule is preferable because of its strong affinity.
前記抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることが可能であり特に限定されない。前記検出において、上記ＲＡＮＫＬ分子に対する抗体を用いる場合は、当該抗体又は当該抗体に対する二次抗体を標識物質により標識することが、より正確なＲＡＮＫＬ分子の検出が可能となるため好ましい。 As the antibody, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used and is not particularly limited. In the detection, when an antibody against the RANKL molecule is used, it is preferable to label the antibody or a secondary antibody against the antibody with a labeling substance because it enables more accurate detection of the RANKL molecule.
前記標識物質及び標識物質の検出方法等としては、本発明方法１に例示したものが例示される。
Examples of the labeling substance and the method for detecting the labeling substance include those exemplified in
また、本発明方法２で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
Further, “DS”, “CS-E”, “RANKL” and the like used in the
また本発明方法２は、例えば後述する本発明キット２に応用できる。
＜６＞本発明キット１
本発明キット１は、本発明担体１を含むキットであり、本発明方法１によりＤＳ又はＣＳ−Ｅを分離、精製及び／又は検出することができる。
Moreover, this
<6>
The
本発明キット１で好ましい標識物質や検出方法は前記本発明方法１のものと同じである。
＜７＞本発明キット２
本発明キット２は、本発明担体２を含むキットであり、本発明方法２によりＲＡＮＫＬ分子を分離、精製及び／又は検出することができる。
Preferred labeling substances and detection methods for the
<7>
The
本発明キットで好ましい標識物質や検出方法等は前記本発明方法２のものと同じである。
＜８＞本発明方法３
本発明方法３は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅにより、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する方法である。
Preferred labeling substances and detection methods for the kit of the present invention are the same as those of the
<8>
The
本明細書の実施例によるとＲＡＮＫＬ分子はＤＳ又はＣＳ−Ｅと結合することにより破骨細胞の分化誘導が阻害されていることがわかる。また、その阻害効果はＤＳ又はＣＳ−Ｅの濃度に依存することがわかる。このことからＲＡＮＫＬ分子の機能は、外部から加えたＤＳ又はＣＳ−Ｅにより促進又は阻害することができる。 According to the examples of the present specification, it can be seen that the RANKL molecule is inhibited from inducing osteoclast differentiation by binding to DS or CS-E. Moreover, it turns out that the inhibitory effect is dependent on the density | concentration of DS or CS-E. From this, the function of the RANKL molecule can be promoted or inhibited by externally added DS or CS-E.
また、本発明方法３で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜９＞本発明方法４
本発明方法４は、ＲＡＮＫＬ分子により、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を抑制又は阻害する方法である。
Further, “DS”, “CS-E”, “RANKL” and the like used in the
<9> Method 4 of the present invention
The method 4 of the present invention is a method for suppressing or inhibiting the biological activity of DS or CS-E with RANKL molecules.
本明細書の実施例によると、ＧＡＧの種類により（硫酸基の位置により）ＲＡＮＫＬとの結合能が異なることから、硫酸基の位置に依存してＲＡＮＫＬ分子が結合していることがわかる。また、ＧＡＧはその硫酸基の位置及びその割合により薬理活性等が異なることが知られている。このことからＤＳ又はＣＳ−Ｅの機能はＲＡＮＫＬ分子を添加することにより促進又は阻害することができる。 According to the examples of the present specification, since the binding ability to RANKL varies depending on the type of GAG (depending on the position of the sulfate group), it is understood that the RANKL molecule is bound depending on the position of the sulfate group. GAG is known to have different pharmacological activities depending on the position and ratio of the sulfate group. From this, the function of DS or CS-E can be promoted or inhibited by adding RANKL molecules.
また、本発明方法４で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜１０＞本発明組成物１
本発明組成物１は、ＤＳ又はＣＳ−Ｅを含有する、ＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性を促進又は阻害する組成物である。
Further, “DS”, “CS-E”, “RANKL” and the like used in the method 4 of the present invention are used in the same meaning as those used in the conjugate of the present invention.
<10>
The
本明細書の実施例によると、ＲＡＮＫＬ分子による破骨細胞の分化誘導はＤＳ又はＣＳ−Ｅの濃度依存的に阻害されていることがわかる。このことからＲＡＮＫＬ分子の生物学的活性は該結合体の組成により異なることがわかる。 According to the examples of the present specification, it can be seen that osteoclast differentiation induction by the RANKL molecule is inhibited depending on the concentration of DS or CS-E. This indicates that the biological activity of the RANKL molecule depends on the composition of the conjugate.
また、本発明組成物１で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜１１＞本発明組成物２
本発明組成物２は、ＲＡＮＫＬ分子を含有する、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの生物学的活性を促進又は阻害する組成物である。
Further, “DS”, “CS-E”, “RANKL” and the like used in the
<11>
また、本発明組成物２で用いる「ＤＳ」、「ＣＳ−Ｅ」及び「ＲＡＮＫＬ」等は本発明結合体で用いられるものと同じ意味で用いられる。
＜１２＞本発明医療用材料１
本発明医療用材料１は、本発明組成物１又は本発明組成物２を含有する医療用材料である。当該組成物は、各種疾病の予防及び／又は治療の為の種々の医療用材料として用いることが可能である。
＜１３＞本発明医療用材料２
本発明医療材料２は、本発明結合体を含有する医療材料である。本発明に係るＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体及びＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体は、各種疾病の予防及び／又は治療のための種々の医療用材料として用いることが可能である。
Further, “DS”, “CS-E”, “RANKL” and the like used in the
<12>
The
<13>
The
以下、本発明を実施例により更に具体的に詳説するが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。
実施例１
各ＧＡＧ（ＣＨ、ＣＳ、ＣＳ−Ａ，ＤＳ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ）を１０μｇ/ｍＬ、３００μｇ/ｍＬとなるように調製し、それぞれ２４穴細胞培養用プレートに添加した。１０−６ＭプロスタグランジンＥ２（以下、ＰＥＧ２という。ＳＩＧＭＡ社製）をさらに添加し、ＣＯ２（５％）、３７℃で３時間静置した。その後、ｄｄＹマウス（６週齢雌）の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は２４穴細胞培養用プレートに５×１０６細胞/穴となる様に播種し、１０％牛胎児血清（ベーリンガー社製、以下ＦＣＳという。）含有Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製、以下αＭＥＭという。）培地にて８日間３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。８日間の培養の後、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（以下、ＴＲＡＰという。）をナフトールＡＳ−ＢＩフォスフェート及びfast garnet GBC saltを含有するアゾ色素法を用いた染色測定キット「Acid Phosphatase Leukocyte」（SIGMA社製）を用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following specific examples.
Example 1
Each GAG (CH, CS, CS-A, DS, CS-C, CS-D, CS-E) was prepared to 10 μg / mL and 300 μg / mL, and each was added to a 24-well cell culture plate. . 10 −6 M prostaglandin E 2 (hereinafter referred to as PEG 2 ; manufactured by SIGMA) was further added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 3 hours at CO 2 (5%). Thereafter, the ribs and femurs of ddY mice (6 weeks old female) were removed, and bone marrow cells were collected from the distal ends of both bones. Bone marrow cells were seeded on a 24-well cell culture plate at 5 × 10 6 cells / well, and 10% fetal bovine serum (manufactured by Boehringer, hereinafter referred to as FCS) containing Minimum Essential Medium Alpha Medium (manufactured by GIBCO, (Hereinafter referred to as αMEM)) The cells were cultured in a medium at 37 ° C. for 8 days in a CO 2 incubator. After 8 days of culture, a staining measurement kit using an azo dye method containing tartrate-resistant acid phosphatase (hereinafter referred to as TRAP), which is a marker for osteoclasts, containing naphthol AS-BI phosphate and fast garnet GBC salt Staining was performed using “Acid Phosphatase Leukocyte” (manufactured by SIGMA), and the number of osteoclasts formed was counted under a microscope.
結果を図１〜３に示す。図１の写真は各ＧＡＧの濃度は３００μｇ/ｍＬである。図１〜３より、マウス骨髄細胞を用いたＰＥＧ２刺激下における破骨細胞形成実験系において、ＤＳ及びＣＳ−Ｅは容量依存的に破骨細胞の形成を有意に抑制することが判明した。
実施例２
破骨細胞の骨破壊・吸収活性はピットアッセイにて測定した。ｄｄＹマウス（六週齢雌）の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞はOsteologicTMプレートに４×１０６細胞／穴となるように播種した。１０−６Ｍ ＰＥＧ２刺激下において３００μｇ/ｍLのＤＳ及びＣＳ−Ｅを各プレートへ添加した。１０日間の培養の後、プレート上の細胞を除去し顕微鏡にてピットを計測した。
図４及び５からわかるように、ＰＥＧ２刺激下においてＤＳ及びＣＳ−Ｅは骨吸収を顕著に減少させることがわかる。
実施例３
破骨細胞の前駆細胞であるＲＡＮＫＬ誘導性の単核細胞ＲＡＷ−２６４．７（以下「ＲＡＷ細胞」という）及び破骨細胞支持細胞であるＳＴ−２細胞を９６ウェルプレートに２×１０４個となるように播種した。その後ＤＳ及びＣＳ−Ｅを０〜３００μｇ/ｍL（０、０．２９、１．１７、４．６８、１８．８、７５、３００μｇ/ｍL）をそれぞれ各プレートへ添加した。ＧＡＧを添加した後、１，３，６日目に５４０〜６２０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し、それぞれの細胞の生細胞の指標とした。
The results are shown in FIGS. In the photograph of FIG. 1, the concentration of each GAG is 300 μg / mL. 1 to 3, it was found that DS and CS-E significantly suppressed osteoclast formation in a dose-dependent manner in an osteoclast formation experimental system under PEG 2 stimulation using mouse bone marrow cells.
Example 2
Osteoclast destruction and resorption activity was measured by pit assay. The ribs and femurs of ddY mice (6 weeks old female) were removed, and bone marrow cells were collected from the distal ends of both bones. Bone marrow cells were seeded on Osteologic ™ plates at 4 × 10 6 cells / well. Under 10 −6 M PEG 2 stimulation, 300 μg / mL DS and CS-E were added to each plate. After 10 days of culture, cells on the plate were removed and pits were counted with a microscope.
As can be seen from FIGS. 4 and 5, it can be seen that DS and CS-E significantly reduce bone resorption under PEG 2 stimulation.
Example 3
2 × 10 4 RANKL-inducible mononuclear cells RAW-264.7 (hereinafter referred to as “RAW cells”), which are progenitor cells of osteoclasts, and ST-2 cells, which are osteoclast-supporting cells, in a 96-well plate So as to be. Thereafter, 0 to 300 μg / mL (0, 0.29, 1.17, 4.68, 18.8, 75, 300 μg / mL) of DS and CS-E were added to each plate. After the addition of GAG, the absorbance at 540 to 620 nm was measured with a microplate reader on the first, third and sixth days, and used as an index of the living cells of each cell.
図６〜９からわかるようにＤＳ及びＣＳ−Ｅの破骨細胞分化誘導抑制の効果は破骨細胞支持細胞及び前駆細胞の細胞増殖活性には影響を及ぼさないことがわかる。 As can be seen from FIGS. 6 to 9, it can be seen that the effect of suppressing the induction of osteoclast differentiation by DS and CS-E does not affect the cell proliferation activity of osteoclast-supporting cells and progenitor cells.
続いて、上記ＲＡＷ細胞にＲＡＮＫＬを添加する際に高発現Ｐ−ｐ３８及びＰ−ＥＲＫについて、ＤＳ添加による変化をウエスタンブロッティングにより確認した。ＲＡＮＫＬにＤＳ又はＣＨを加え、α−ＭＥＭ中にて、３７℃、５％ＣＯ２下で３時間インキュベートした後、ＲＡＷ細胞に作用させた。１５、３０及び６０分後のサンプルを回収し、常法に従いウエスタンブロッティングを行った。 Subsequently, when RANKL was added to the RAW cells, changes in the high expression P-p38 and P-ERK due to the addition of DS were confirmed by Western blotting. DS or CH was added to RANKL and incubated in α-MEM at 37 ° C. under 5% CO 2 for 3 hours, and then allowed to act on RAW cells. Samples after 15, 30 and 60 minutes were collected and subjected to Western blotting according to a conventional method.
その結果を図１０，１１に示す。図中の各レーンの条件としては、レーン１はそれぞれコントロール、レーン２はＲＡＮＫＬ（40 ng/mL）、レーン３はＲＡＮＫＬ（40 ng/mL）及びＤＳ（300 μg/mL）、レーン４はＲＡＮＫＬ（40 ng/mL）及びＣＨ（300 μg/mL）である。これらの結果からＤＳを共存させることによって、Ｐ−Ｐ３８やＰ−ＥＲＫの発現を抑制することがわかった。
実施例４
ＤＳ及びＣＳ−Ｅ３００μｇ/ｍＬをそれぞれ２４穴細胞培養用プレートに添加した。ＲＡＮＫＬ（４０μｇ/ｍL）及びＭ−ＣＳＦ（５０μｇ/ｍL）をさらに添加し、ＣＯ２（５％）、３７℃で３三時間静置した。その後、ｄｄＹマウス（６週齢雌）の腓骨、大腿骨を摘出し、両骨の遠心端より骨髄細胞を採取した。骨髄細胞は２４穴細胞培養用プレートに５×１０６細胞/穴となる様に播種し、１０％ＦＣＳ含有αＭＥＭ培地にて８日間３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。コントロールとしては骨髄細胞のみを培養したもの及びＲＡＮＫＬ（４０μｇ/ｍL）及びＭ−ＣＳＦ（５０μｇ/ｍL）のみを骨髄細胞に添加したものを用いた。８日間の培養の後、ＴＲＡＰをAcid Phosphatase Leukocyteを用いて染色し、形成された破骨細胞の数を顕微鏡下で計測した。
The results are shown in FIGS. The conditions for each lane in the figure are as follows:
Example 4
DS and CS-
図１２より、ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＦＳ刺激下においてＤＳ及びＣＳ−Ｅ添加群においては顕著な破骨細胞分化誘導抑制効果が見られた。その効果はＤＳの方がより顕著であった。 From FIG. 12, a remarkable osteoclast differentiation induction inhibitory effect was seen in the DS and CS-E addition groups under RANKL and M-CFS stimulation. The effect was more pronounced with DS.
そこで、ＤＳについて ０〜５０μｇ/ｍＬにおける濃度の依存性を調べ、その結果図１３に示す。図からわかるように、ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＦＳ刺激下においてもＤＳの濃度の上昇に伴い抑制効果も上昇することがわかる。
実施例５
次にウエスタンブロッティングによりＤＳ及びＣＳ−ＥのＲＡＮＫの抑制効果を調べた。
Therefore, the dependence of DS on the concentration of 0 to 50 μg / mL was examined, and the result is shown in FIG. As can be seen from the figure, the suppression effect increases with increasing DS concentration even under RANKL and M-CFS stimulation.
Example 5
Next, the inhibitory effect of DS and CS-E on RANK was examined by Western blotting.
１０ｃｍシャーレ上にＲＡＮＫＬ（４０μｇ/ｍL）及びＤＳ（３００μｇ/ｍL）をα−ＭＥＭ中に添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下、３時間静置した。ＲＡＷ細胞をシャーレに１×１０５個ずつ播種し、２４時間後及び４８時間後にサンプルを回収した。各サンプルを１０％ゲル上で電気泳動し、転写膜に転写した。コントロールとしてはＤＳ未添加のものを用いた。１次抗体として、抗ＲＡＮＫ抗体及び抗βアクチン抗体（タンパク質の標準化）を反応させた後、二次抗体として抗マウス抗体を添加した。なお、バンドの検出はEnhanced chemiluminescence (ＥＣＬ plus：アマシャム・ファーマシア・バイオテック社製)を用いてフイルムに感光させ行った。 RANKL (40 μg / mL) and DS (300 μg / mL) were added to α-MEM on a 10 cm petri dish, and allowed to stand for 3 hours under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. 1 × 10 5 RAW cells were seeded in a petri dish, and samples were collected after 24 and 48 hours. Each sample was electrophoresed on a 10% gel and transferred to a transfer film. As a control, one without DS added was used. After reacting anti-RANK antibody and anti-β-actin antibody (protein standardization) as the primary antibody, anti-mouse antibody was added as the secondary antibody. Band detection was performed by exposing the film to light using Enhanced chemiluminescence (ECL plus: manufactured by Amersham Pharmacia Biotech).
その結果を図１４に示す。図より、培養時間に依存してＲＡＮＫの発現が低下すること及びＤＳの存在下でＲＡＮＫの発現が抑制されることがわかる。
実施例６
ＡｆｆｉｎｉｘＱ（イニシャム社製）のセンサーセルを用いて相互作用実験を行った。まず、センサーチップ上にＲＡＮＫＬ（１０μｇ／ｍＬ）を２μｇ乗せ、４時間乾燥させ固着した。チャンバーにブロッキング剤として０．１％ＢＳＡを添加し、１％ＰＢＳを１０ｍＬ注入後、センサーチップをＰＢＳ中に浸漬し、水晶の振動数が安定するまで静置した。水晶の振動数の安定後、ＰＢＳ中にＤＳを１００μｇ／ｍＬ又は３００μｇ/ｍLとなるように添加し、振動数を測定した。ＰＢＳ及びＲＡＮＫ（モル比でＲＡＮＫＬ：ＲＡＮＫ＝２：１）をコントロールとして用いた。
The result is shown in FIG. It can be seen from the figure that the expression of RANK decreases depending on the culture time and that the expression of RANK is suppressed in the presence of DS.
Example 6
An interaction experiment was performed using a sensor cell of AffinixQ (manufactured by Inishham). First, 2 μg of RANKL (10 μg / mL) was placed on the sensor chip and dried and fixed for 4 hours. 0.1% BSA was added to the chamber as a blocking agent, and 10 mL of 1% PBS was injected. Then, the sensor chip was immersed in PBS and allowed to stand until the crystal frequency was stabilized. After stabilization of the crystal frequency, DS was added to PBS so as to be 100 μg / mL or 300 μg / mL, and the frequency was measured. PBS and RANK (RANKL: RANK = 2: 1 in molar ratio) were used as controls.
その結果、図１５に見られるようにＲＡＮＫＬがＤＳに結合することがＡｆｆｉｎｉｘＱによる実験で明らかになった。また、図からわかるようにＲＡＮＫＬに飽和するまでの時間（グラフがプラトーになるまでの時間）がＲＡＮＫに比べ早いこともわかる。 As a result, as shown in FIG. 15, it was revealed by an experiment using AffinixQ that RANKL binds to DS. Also, as can be seen from the figure, the time until saturation with RANKL (the time until the graph becomes plateau) is earlier than that of RANK.
これらの実施例よりＤＳ及びＣＳ−ＥがＲＡＮＫＬと高いアフィニティーを示すことが示唆される。 These examples suggest that DS and CS-E show high affinity with RANKL.
上記に述べたように、本発明により新規物質としてＲＡＮＫＬ−ＤＳ結合体又はＲＡＮＫＬ−ＣＳ−Ｅ結合体が提供されるとともに、ＲＡＮＫＬ分子、ＤＳ又はＣＳ−Ｅの分離、精製、検出ツールが提供される。また、ＲＡＮＫＬ分子結合性のＤＳ及びＣＳ−Ｅは生体内における該ＲＡＮＫＬ分子の生理的機能の調節に利用できる可能性があり、医療への適用が期待される。 As described above, the present invention provides a RANKL-DS conjugate or RANKL-CS-E conjugate as a novel substance, and also provides a separation, purification, and detection tool for RANKL molecules, DS or CS-E. The In addition, RANKL molecule-binding DS and CS-E may be used for regulation of the physiological function of the RANKL molecule in vivo, and application to medicine is expected.
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