JP5253953B2

JP5253953B2 - Nucleic acid extraction efficiency improver, nucleic acid extraction method and nucleic acid extraction apparatus

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Publication number: JP5253953B2
Application number: JP2008255040A
Authority: JP
Inventors: 満藤岡; 智也桜井; 久美子服部
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2008-09-30
Filing date: 2008-09-30
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2028-09-30
Also published as: WO2010038778A1; JP2010081885A

Description

本発明は、核酸を含む試料からの核酸抽出技術に関する。例えば、核酸を含む全血、血漿などの生物試料等から核酸を抽出する技術に関する。 The present invention relates to a technique for extracting nucleic acid from a sample containing nucleic acid. For example, the present invention relates to a technique for extracting nucleic acid from biological samples such as whole blood and plasma containing nucleic acid.

核酸の分析により得られる遺伝子情報は、医療、臨床検査、医薬品産業及び食品産業等の様々な分野で活用されている。この核酸分析には、様々な生物試料からの核酸抽出が必須の前処理となっている。 Genetic information obtained by nucleic acid analysis is used in various fields such as medical care, clinical examination, pharmaceutical industry and food industry. In this nucleic acid analysis, nucleic acid extraction from various biological samples is an essential pretreatment.

近年の核酸抽出方法としては、有害な有機溶媒であるフェノールやクロロホルム等を使用する方法ではなく、非特許文献１〔B. Vogelstein and D. Gillespie, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76(2), 615-619(1979)〕に報告されるカオトロピック剤の存在下で核酸がシリカに結合する性質に基づいた方法、あるいは、〔特許文献１〕及び〔特許文献２〕に報告される有機溶媒の存在下で核酸がシリカに結合する性質に基づいた方法が一般的である。これらの方法を利用し、〔特許文献3〕を初めとするシリカ含有の固相を核酸捕捉用担体として内蔵する核酸捕捉用チップ用いた核酸抽出方法が報告されている。これは、核酸の核酸捕捉用担体への結合工程、捕捉物に含まれる不純物の洗浄工程、および核酸の核酸捕捉用担体からの溶離工程、の各工程が、各溶液が吸排される１つの核酸捕捉用チップにより行われ、自動化に適した核酸抽出方法である。 As a nucleic acid extraction method in recent years, not a method using a harmful organic solvent such as phenol or chloroform, but non-patent document 1 [B. Vogelstein and D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 ( 2), 615-619 (1979)] based on the property of nucleic acid binding to silica in the presence of a chaotropic agent, or organic methods reported in [Patent Literature 1] and [Patent Literature 2]. A method based on the property of nucleic acids binding to silica in the presence of a solvent is common. Utilizing these methods, a nucleic acid extraction method using a nucleic acid capturing chip incorporating a silica-containing solid phase as a nucleic acid capturing carrier, including [Patent Document 3], has been reported. This is because each step of the step of binding the nucleic acid to the nucleic acid capturing carrier, the step of washing impurities contained in the captured product, and the step of elution of the nucleic acid from the nucleic acid capturing carrier is one nucleic acid from which each solution is absorbed and discharged. This nucleic acid extraction method is carried out by a capture chip and is suitable for automation.

このように、固相を核酸捕捉用担体として核酸捕捉用チップもしくはカラムとして吸引吐出、遠心、真空減圧、加圧等により通液する方法として〔特許文献３〜５〕が報告されている。またシリカの他に結合部材として表面に水酸基を有する有機高分子を用いた方法（特許文献５〜６）がある。そのほかに、正電荷を有するタンパク質ならびにシクロデキストリン、クラウンエーテル、デンドリマーおよびポリアミンを結合部材に固定化し核酸を精製する方法がある（特許文献７）。 As described above, [Patent Documents 3 to 5] have been reported as a method of passing a solid phase as a nucleic acid capture carrier or a nucleic acid capture chip or column by suction and discharge, centrifugation, vacuum decompression, pressurization, or the like. In addition to silica, there is a method (Patent Documents 5 to 6) using an organic polymer having a hydroxyl group on the surface as a binding member. In addition, there is a method of purifying a nucleic acid by immobilizing a positively charged protein and cyclodextrin, crown ether, dendrimer and polyamine on a binding member (Patent Document 7).

一方、医療、臨床検査及び医薬品産業の分野では、タンパク質を検出・測定対象とする場合がある。この場合、タンパク質を含む試薬において、測定の再現性、正確性、精度を高めるためにタンパク質の安定性が求められてきた。安定性を増すために、凍結乾燥、緩衝液による制御（特許文献８）、タンパク質同士の会合を阻止するため、イオンによる分子間の静電相互作用の抑制があると考えられている技術（非特許文献２）がある。また、タンパク質を測定対象とする場合には、タンパク質凝集を防ぐために低分子化合物を添加することがあり、添加剤としてアルギニンが用いられる（非特許文献３〜４）。また、水溶性高分子化合物を用いて、ポリペプチド鎖の巻き戻しの際のタンパク蛋白質凝集を抑制（非特許文献４〜５）する技術も報告されている。水溶性高分子化合物としてはCHAPSやTween等の界面活性剤やポリエチレングリコールが用いられる。アミノ酸エステル及び／又はポリアミンを用いることによりタンパク質凝集抑制および安定化することにより、測定精度が高く、長期安定性に優れた方法が報告されている（特許文献９）。 On the other hand, in the fields of medical care, clinical testing, and pharmaceutical industry, there are cases where proteins are detected and measured. In this case, the stability of the protein has been required in order to improve the reproducibility, accuracy and precision of the measurement in the reagent containing the protein. In order to increase stability, lyophilization, control with a buffer solution (Patent Document 8), and technology that is considered to suppress electrostatic interactions between molecules due to ions in order to prevent protein association (non- There is a patent document 2). Moreover, when protein is used as a measurement target, a low molecular compound may be added to prevent protein aggregation, and arginine is used as an additive (Non-Patent Documents 3 to 4). In addition, a technique for suppressing protein-protein aggregation during unwinding of a polypeptide chain using a water-soluble polymer compound (Non-patent Documents 4 to 5) has also been reported. As the water-soluble polymer compound, a surfactant such as CHAPS and Tween and polyethylene glycol are used. There has been reported a method with high measurement accuracy and excellent long-term stability by suppressing and stabilizing protein aggregation by using amino acid ester and / or polyamine (Patent Document 9).

特開２００１−９５５７２号公報JP 2001-95572 A 特開２００２−３６０２４５号公報JP 2002-360245 A ＷＯ２００２／０７８８４６WO2002 / 078846 特開平７−２５０６８１号公報JP-A-7-250681 特開２００３−１２８６９１号公報JP 2003-128691 A 特開２００４−４９１０８号公報JP 2004-49108 A 特開２００６−２４６７３２号公報JP 2006-246732 A 特開平１１−２４０８９５号公報Japanese Patent Laid-Open No. 11-240895 特許公開２００４−１０８８５０号公報Japanese Patent Publication No. 2004-108850 B. Vogelstein and D. Gillespie, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76 (2), 615-619(1979)B. Vogelstein and D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (2), 615-619 (1979) Maeda Y, et.al.「Protein Eng.」1996年、19巻、p.461-465Maeda Y, et.al.``Protein Eng. '', 1996, Vol. 19, p.461-465 Tsumoto K, et.al. 「J. Immunol. Method」1998年、219巻、p.119-129Tsumoto K, et.al. "J. Immunol. Method" 1998, 219, p.119-129 Brinkmann U,et.al.「Proc.Natl.Acad.SciUSA」1992年、89巻、p.3075-3079Brinkmann U, et.al.``Proc.Natl.Acad.SciUSA '' 1992, 89, p.3075-3079 Cleland JL,et.al.「J.Biol.Chem.」1992年、267巻、p.13327-13334Cleland JL, et.al.``J.Biol.Chem. '' 1992, 267, p.13327-13334

特許文献１〜７で報告される方法によれば、生体試料（特に全血、血漿）等の核酸以外の物質、特にタンパク質を多く含む試料から核酸を抽出する場合、核酸結合固相を用いた核酸捕捉用チップ、カラム又はビーズなどに各液体を接触させる。従来、タンパク質を変性させることで、上記試料からタンパク質を除去していたが、試料によっては、核酸捕捉用担体に変性凝集したタンパク質などが吸着することがあった。タンパク質を凝集させると、例えば試料中の核酸を巻き込んでしまったり、液体と核酸捕捉用担体の接触可能な表面積を減少させるといった問題が生じる。また、タンパク質を凝集させると、通液抵抗の増大をもたらし、場合により目詰まりを起こすといった不都合もある。 According to the methods reported in Patent Documents 1 to 7, when nucleic acid is extracted from a substance other than nucleic acid such as a biological sample (especially whole blood or plasma), particularly a sample containing a lot of proteins, a nucleic acid-binding solid phase is used. Each liquid is brought into contact with a nucleic acid capture chip, column or bead. Conventionally, protein was denatured from the sample by denaturing the protein. However, depending on the sample, denatured and aggregated protein may be adsorbed on the nucleic acid capturing carrier. When proteins are aggregated, for example, the nucleic acid in the sample is entrained, and the surface area that can be contacted between the liquid and the nucleic acid capturing carrier is reduced. In addition, if the protein is aggregated, there is an inconvenience that liquid flow resistance is increased and clogging is caused in some cases.

以上のように、タンパク質及び核酸を含む試料から、核酸を抽出する際には、タンパク質の凝集等に起因して核酸回収率が低下したり、核酸回収に要する時間の遅延が引き起こされるといった問題があった。そこで、本発明は、上述の実情に鑑み、試料からの核酸回収率を向上させることができる核酸抽出安定化剤、核酸抽出法及び核酸抽出装置を提供することを目的とする。 As described above, when nucleic acid is extracted from a sample containing protein and nucleic acid, there is a problem that the nucleic acid recovery rate is reduced due to protein aggregation or the like, or the time required for nucleic acid recovery is delayed. there were. In view of the above circumstances, an object of the present invention is to provide a nucleic acid extraction stabilizer, a nucleic acid extraction method, and a nucleic acid extraction apparatus that can improve the nucleic acid recovery rate from a sample.

本発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意検討した結果、核酸を含む試料を核酸捕捉担体に接触させる際、及び/又は核酸を捕捉した核酸捕捉担体を溶離液と接触させる際にタンパク質凝集抑制効果のある化合物を存在させることによって、核酸の回収率が向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to achieve the above-described object, the present inventors have made contact with a nucleic acid capture carrier and / or when a nucleic acid capture carrier that has captured nucleic acid is brought into contact with an eluent. It has been found that the presence of a compound having a protein aggregation inhibitory effect improves the recovery rate of nucleic acids, and the present invention has been completed.

すなわち本発明に係る核酸抽出安定剤は、タンパク質凝集抑制能を有するアミノ酸、ポリアミン及びアミノ酸アルキルエステルからなる群から選ばれる少なくとも１種の成分を含有するものである。ここで、上記アミノ酸としては、アルギニン、グリシン、アラニン及びリシンからなる群から選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸を挙げることができる。また、上記ポリアミンとしては、スペルミン及び／又はスペルミジンを挙げることができる。さらに、上記アミノ酸エステルとしては、グリシンエチルエステル、アルギニンメチルエステル、ニトロアルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、アスパラギン酸ジメチルエステル、リジンメチルエステル、リジンエチルエステル、グリシンベンジルエステル及びグリシンt-ブチルエステルからなる群から選ばれる少なくとも１種類のアミノ酸エステル若しくはそれらの塩を挙げることができる。本発明に係る核酸抽出安定剤は、上記成分の濃度が1nmol/L〜2mol/Lであることが好ましい。 That is, the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention contains at least one component selected from the group consisting of amino acids, polyamines, and amino acid alkyl esters having the ability to suppress protein aggregation. Here, examples of the amino acid include at least one amino acid selected from the group consisting of arginine, glycine, alanine, and lysine. Moreover, spermine and / or spermidine can be mentioned as said polyamine. Further, the amino acid ester is a group consisting of glycine ethyl ester, arginine methyl ester, nitroarginine methyl ester, arginine ethyl ester, aspartic acid dimethyl ester, lysine methyl ester, lysine ethyl ester, glycine benzyl ester and glycine t-butyl ester. The at least 1 sort (s) of amino acid ester chosen from these, or those salts can be mentioned. In the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention, the concentration of the above components is preferably 1 nmol / L to 2 mol / L.

本発明に係る核酸抽出安定剤は、核酸を含む試料と核酸捕捉担体と混合する核酸捕捉工程と核酸捕捉担体に捕捉された核酸を溶離する核酸溶離工程とを含む核酸抽出方法において使用することができる。例えば、本発明に係る核酸抽出安定剤は、上記核酸捕捉工程及び/又は上記核酸溶離工程で使用することによって、核酸回収効率を向上させることができる。 The nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention can be used in a nucleic acid extraction method comprising a nucleic acid capture step of mixing a nucleic acid-containing sample and a nucleic acid capture carrier, and a nucleic acid elution step of eluting the nucleic acid captured by the nucleic acid capture carrier. it can. For example, the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention can improve nucleic acid recovery efficiency by being used in the nucleic acid capture step and / or the nucleic acid elution step.

なお、上記核酸捕捉工程は、カオトロピック剤を含む溶液で行うことができる。また、上記核酸捕捉担体はシリカ含有固相であり、核酸捕捉工程及び核酸溶離工程では、当該核酸捕捉担体を内部に配設したチップを用いてそれぞれ上記試料及び溶離液を通液することで核酸を核酸捕捉担体に捕捉し、捕捉した核酸を溶離して回収することができる。 In addition, the said nucleic acid capture | acquisition process can be performed with the solution containing a chaotropic agent. In addition, the nucleic acid capture carrier is a silica-containing solid phase, and in the nucleic acid capture step and the nucleic acid elution step, the sample and the eluent are passed through the chip using the chip in which the nucleic acid capture carrier is disposed, respectively. Can be captured by a nucleic acid capture carrier, and the captured nucleic acid can be eluted and recovered.

また、本発明に係る核酸抽出安定剤を試薬ラックに備える核酸抽出装置として使用することができる。すなわち、本発明に係る核酸抽出装置は、溶液に含まれる核酸を吸着することができる核酸捕捉担体と、核酸を含む溶液、核酸の上記核酸捕捉担体への吸着を促進する吸着促進剤、上記核酸捕捉担体に捕捉された核酸を溶離する溶離液及び本発明に係る核酸抽出安定化剤を備える試薬ラックとを有している。 The nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention can be used as a nucleic acid extraction apparatus provided in a reagent rack. That is, the nucleic acid extraction apparatus according to the present invention includes a nucleic acid capture carrier capable of adsorbing a nucleic acid contained in a solution, a solution containing the nucleic acid, an adsorption promoter that promotes adsorption of the nucleic acid onto the nucleic acid capture carrier, and the nucleic acid. An eluent that elutes the nucleic acid captured by the capture carrier, and a reagent rack that includes the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention.

なお、本発明に係る核酸抽出装置において、上記核酸捕捉担体としてシリカ含有固相を使用することができ、当該核酸捕捉担体を内部に配設したチップを用いてそれぞれ上記試料及び溶離液を通液することで核酸を核酸捕捉担体に捕捉し、捕捉した核酸を溶離して回収することができる。 In the nucleic acid extraction apparatus according to the present invention, a silica-containing solid phase can be used as the nucleic acid capture carrier, and the sample and the eluent are passed through each chip using the nucleic acid capture carrier disposed therein. Thus, the nucleic acid can be captured on the nucleic acid capture carrier, and the captured nucleic acid can be eluted and recovered.

本発明に係る核酸抽出安定化剤は、核酸を含む試料に対して事前添加しても良いし、当該試料に対して添加する溶解試薬とともに添加しても良いし、当該試料に対して添加する結合促進試薬とともに添加しても良いし、核酸捕捉担体に捕捉された核酸を溶離する溶離試薬とともに添加しても良い。 The nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention may be added in advance to a sample containing nucleic acid, may be added together with a lysis reagent added to the sample, or added to the sample. It may be added together with a binding promoting reagent or may be added together with an elution reagent that elutes the nucleic acid captured by the nucleic acid capturing carrier.

本発明によれば、タンパク質凝集抑制能を有するアミノ酸、ポリアミン及びアミノ酸アルキルエステルからなる群から選ばれる少なくとも１種の成分を使用することによって、核酸抽出における核酸回収率の向上を達成することが可能となる。 According to the present invention, the use of at least one component selected from the group consisting of amino acids, polyamines and amino acid alkyl esters having protein aggregation-inhibiting ability can improve the nucleic acid recovery rate in nucleic acid extraction. It becomes.

以下、本発明に係る核酸抽出安定剤、核酸抽出方法及び核酸抽出装置を、図面を参照して詳細に説明する。
本発明に係る核酸抽出安定剤は、タンパク質凝集抑制能を有するアミノ酸、ポリアミン及びアミノ酸アルキルエステルからなる群から選ばれる少なくとも１種の成分を含有している。ここで、タンパク質凝集抑制能とは、タンパク質間の相互作用を低減させることを意味する。例えば、アミノ酸であるアルギニンでは、その分子中のグアニジウム基がタンパク質間の疎水的相互作用を防いでいるものと考えられる。ポリアミンでは、タンパク質の表面に結合することにより見かけのネットチャージをプラスに増加させ、タンパク質間の衝突を抑制していると考えられる。アミノ酸エステルでは、修飾された非極性カルボニル末端がタンパク質と疎水性相互作用し、アミド末端の静電的反発をタンパク質表面に生じさせてタンパク質間の会合を抑制していると考えられる。 Hereinafter, a nucleic acid extraction stabilizer, a nucleic acid extraction method, and a nucleic acid extraction apparatus according to the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
The nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention contains at least one component selected from the group consisting of amino acids, polyamines and amino acid alkyl esters having protein aggregation-inhibiting ability. Here, the protein aggregation inhibiting ability means reducing the interaction between proteins. For example, in arginine, which is an amino acid, it is considered that the guanidinium group in the molecule prevents the hydrophobic interaction between proteins. Polyamines are thought to bind to the surface of the protein to increase the apparent net charge positively and suppress collisions between proteins. In amino acid esters, it is considered that the modified nonpolar carbonyl terminus has a hydrophobic interaction with the protein, causing electrostatic repulsion of the amide terminus on the protein surface to suppress association between proteins.

ここで、タンパク質凝集抑制能を有するアミノ酸としては、例えば、アルギニン、グリシン、アラニン及びリシンを挙げることができる。これらアミノ酸のうち一種又は複数種を核酸抽出安定剤として使用することができる。また、タンパク質凝集抑制能を有するポリアミンとしては、スペルミン及びスペルミジンを挙げることができる。これらポリアミンの一方又は両方を核酸抽出安定剤として使用することができる。さらに、タンパク質凝集抑制能を有するアミノ酸エステルとしては、グリシンエチルエステル、アルギニンメチルエステル、ニトロアルギニンメチルエステル、アルギニンエチルエステル、アスパラギン酸ジメチルエステル、リジンメチルエステル、リジンエチルエステル、グリシンベンジルエステル及びグリシンt-ブチルエステルを挙げることができる。これらアミノ酸エステルのうち一種又は複数種を核酸抽出安定剤として使用することができる。これらアミノ酸エステルの塩を、核酸抽出安定剤として使用することができる。 Here, examples of amino acids having the ability to suppress protein aggregation include arginine, glycine, alanine, and lysine. One or more of these amino acids can be used as a nucleic acid extraction stabilizer. Moreover, spermine and spermidine can be mentioned as polyamine which has protein aggregation inhibitory ability. One or both of these polyamines can be used as a nucleic acid extraction stabilizer. Furthermore, the amino acid esters having protein aggregation inhibiting ability include glycine ethyl ester, arginine methyl ester, nitroarginine methyl ester, arginine ethyl ester, aspartic acid dimethyl ester, lysine methyl ester, lysine ethyl ester, glycine benzyl ester and glycine t- Mention may be made of butyl esters. One or more of these amino acid esters can be used as a nucleic acid extraction stabilizer. These amino acid ester salts can be used as a nucleic acid extraction stabilizer.

本発明に係る核酸抽出安定剤は、核酸を含有する試料から核酸捕捉担体を用いて核酸を抽出する際に使用することで、核酸抽出効率を向上させるものである。本発明に係る核酸抽出安定剤は、例えば、図１に示すフローチャートの核酸抽出方法に適用することができる。なお、図１に示すフローチャートにおいて、工程２が核酸捕捉工程であり、工程４が核酸溶離工程である。本発明に係る核酸抽出安定剤は、これら工程２及び工程４に使用しても良いし、工程２及び工程４のいずれか一方にのみ使用しても良い。 The nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention is used when nucleic acid is extracted from a sample containing nucleic acid using a nucleic acid capture carrier, thereby improving nucleic acid extraction efficiency. The nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention can be applied to, for example, the nucleic acid extraction method of the flowchart shown in FIG. In the flowchart shown in FIG. 1, step 2 is a nucleic acid capture step, and step 4 is a nucleic acid elution step. The nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention may be used in Step 2 and Step 4, or may be used only in either Step 2 or Step 4.

本核酸抽出方法は、先ず、工程１で核酸を含む試料を調整するための溶解試薬、核酸結合担体に核酸を結合させるための結合試薬を準備し、動物細胞等の生体サンプルに溶解試薬及び結合試薬をそれぞれ添加する。なお、溶解試薬及び結合試薬は一液として準備してこれを生体サンプルに添加しても良い。工程１によれば、生体サンプルに含まれる核酸が溶液中に溶解した状態となり、核酸を含有する試料を準備することができる。ここで核酸とは、２本鎖又は１本鎖若しくは部分的に２本鎖又は１本鎖構造を有するデオキシリボ核酸及びリボ核酸を含む意味である。本核酸抽出方法において、生体サンプルとしては動物細胞に限定されず、細菌や真菌等の微生物細胞、植物細胞又はウイルスを用いても良いが、特に、生体試料として全血、血漿、血清、喀痰、尿等や培養細胞、培養細菌等の生物学的な試料が望ましい。 In this nucleic acid extraction method, first, a lysis reagent for preparing a sample containing nucleic acid in Step 1 and a binding reagent for binding a nucleic acid to a nucleic acid binding carrier are prepared, and the lysis reagent and binding to a biological sample such as an animal cell are prepared. Add each reagent. The lysis reagent and the binding reagent may be prepared as one solution and added to the biological sample. According to step 1, the nucleic acid contained in the biological sample is dissolved in the solution, and a sample containing the nucleic acid can be prepared. Here, the nucleic acid is meant to include deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid having a double-stranded or single-stranded or partially double-stranded or single-stranded structure. In the present nucleic acid extraction method, the biological sample is not limited to animal cells, and microbial cells such as bacteria and fungi, plant cells, or viruses may be used. In particular, whole blood, plasma, serum, sputum, Biological samples such as urine, cultured cells, and cultured bacteria are desirable.

なお、工程１では、生体サンプルの溶解を促進するために加温、撹拌等の手技を適宜適用することができる。また、生体サンプルを溶解試薬によって溶解した後、遠心分離操作によって固形分を除去しても良い。 In step 1, techniques such as heating and stirring can be applied as appropriate to promote dissolution of the biological sample. In addition, after the biological sample is dissolved with a lysis reagent, the solid content may be removed by centrifugation.

上述した結合試薬に含まれる、核酸の核酸結合固相への結合を促進する物質としては、ＮａＩ（ヨウ化ナトリウム）、ＫＩ（ヨウ化カリウム）、ＮａＣｌＯ_４（過塩素酸ナトリウム）、ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ＧｕＳＣＮ（チオシアン酸グアニジン）、ＧｕＨＣｌ（塩酸グアニジン）などのカオトロピック剤を挙げることができる。 Substances that promote the binding of nucleic acids to the nucleic acid binding solid phase included in the above-described binding reagents include NaI (sodium iodide), KI (potassium iodide), NaClO ₄ (sodium perchlorate), NaSCN (thiocyanate). And sodium chloride), GuSCN (guanidine thiocyanate), and GuHCl (guanidine hydrochloride).

次に、本核酸抽出方法は、工程２として工程１で調整した核酸を含有する試料に核酸捕捉担体を接触させ、当該核酸結合担体に核酸を結合させる。核酸結合担体としては、核酸捕捉用担体としては、ガラス粒子、シリカ粒子、シリカコートされた磁性粒子、石英濾紙、石英ウール又はそれらの破砕物、若しくはケイソウ土等を挙げることができる。換言すれば、核酸捕捉担体としては、酸化ケイ素を含有する物質又は表面に水酸基を有する有機高分子であれば使用することができる。 Next, in this nucleic acid extraction method, a nucleic acid capture carrier is brought into contact with the sample containing the nucleic acid prepared in step 1 as step 2, and the nucleic acid is bound to the nucleic acid binding carrier. As the nucleic acid binding carrier, examples of the nucleic acid capturing carrier include glass particles, silica particles, silica-coated magnetic particles, quartz filter paper, quartz wool, crushed materials thereof, and diatomaceous earth. In other words, as the nucleic acid capturing carrier, any substance containing silicon oxide or an organic polymer having a hydroxyl group on the surface can be used.

また、核酸結合担体は、図２に示すように、チップ内部に配設した核酸捕捉用チップ１０として使用することが好ましい。核酸捕捉チップ１０は、頭部１1が可動ノズル等の先端に気密に装着される内径を有しており、下方が先端部に向けて徐々に内径が小となるように形成される。核酸捕捉用チップ１０は、例えば、透明もしくは半透明な合成樹脂から形成される。先端である通液口１２側には、核酸捕捉担体１３が流出することを防止するための円板状の阻止部材１４を挿入し、頭部１１の側にも円板状の阻止部材１４を設ける。これらの阻止部材１４は、液体及び気体が容易に通過し得る多数の孔を有するが、その孔は核酸捕捉担体１３の流出を阻止できる大きさである。 Further, the nucleic acid binding carrier is preferably used as a nucleic acid capturing chip 10 disposed inside the chip as shown in FIG. The nucleic acid capture chip 10 has an inner diameter in which the head 11 is air-tightly attached to the tip of a movable nozzle or the like, and is formed so that the inner diameter gradually decreases toward the tip. The nucleic acid capturing chip 10 is formed of, for example, a transparent or translucent synthetic resin. A disc-shaped blocking member 14 for preventing the nucleic acid capture carrier 13 from flowing out is inserted on the liquid passage port 12 side which is the tip, and a disc-shaped blocking member 14 is also installed on the head 11 side. Provide. These blocking members 14 have a large number of holes through which liquid and gas can easily pass, and the holes are sized to prevent the nucleic acid capture carrier 13 from flowing out.

この核酸捕捉用チップ１０は、頭部１１にピペッター、シリンジ、ポンプ等を直接又は間接的に気密状態で装着し、溶液を吸引吐出、真空減圧、加圧もしくは遠心等することで溶液と核酸結合固相１３とを接触させることができる。或いは、核酸を含有する試料を頭部１１より添加して、核酸捕捉用チップ１０内部を加圧することによって当該試料を通液させても良い。このようにして、工程２においては、核酸を含有する試料に核酸捕捉担体を接触させ、当該核酸結合担体に核酸を結合させることができる。 The nucleic acid capturing chip 10 is attached to a head 11 with a pipetter, a syringe, a pump or the like directly or indirectly in an airtight state, and the solution is aspirated and discharged, vacuum decompressed, pressurized, or centrifuged to bind the solution to the nucleic acid. The solid phase 13 can be brought into contact. Alternatively, a sample containing nucleic acid may be added from the head 11 and the sample may be passed by pressurizing the inside of the nucleic acid capturing chip 10. Thus, in step 2, the nucleic acid-containing carrier can be brought into contact with the sample containing the nucleic acid, and the nucleic acid can be bound to the nucleic acid-binding carrier.

なお、核酸捕捉担体は、図２に示すような核酸捕捉用チップに限定されず、カラムやプレート、またビーズやシリカコーティングされた磁性粒子等のビーズ形状として使用することもできる。例えば、核酸捕捉担体を充填した核酸捕捉用カラムを使用する場合、カラム上部に核酸を含有する試料を添加し、加圧、遠心、真空減圧等により当該試料を通液し、核酸捕捉用担体と試料とを接触させることができる。 The nucleic acid capture carrier is not limited to the nucleic acid capture chip as shown in FIG. 2, but can be used in the form of beads such as columns, plates, beads, or silica-coated magnetic particles. For example, when using a nucleic acid capture column packed with a nucleic acid capture carrier, a sample containing nucleic acid is added to the top of the column, and the sample is passed through by pressurization, centrifugation, vacuum decompression, etc. The sample can be brought into contact.

工程２において本発明に係る核酸抽出安定剤を使用することができる。すなわち、工程１で調整した試料に核酸抽出安定剤を添加した後に核酸捕捉担体と接触させることによって、核酸捕捉担体に対する核酸の結合量を大幅に向上させることができる。ここで、核酸抽出安定剤は、タンパク質凝集抑制能を有するアミノ酸、ポリアミン又はアミノ酸アルキルエステルがいずれの場合も濃度が好ましくは１nmol/L〜２mol/L、より好ましくは１nmol/L〜６００mmol/L、さらに好ましくは１nmol/L〜３５０mmol/Lとなるように添加される。これら成分の濃度が１nmol/L未満では、核酸抽出安定化剤の効果が不十分となる虞がある。逆に、これら成分の濃度が２mol/Lを超える場合には、核酸の溶解性が悪くなる虞がある。 In step 2, the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention can be used. That is, by adding a nucleic acid extraction stabilizer to the sample prepared in step 1 and bringing it into contact with the nucleic acid capture carrier, the amount of nucleic acid bound to the nucleic acid capture carrier can be greatly improved. Here, the concentration of the nucleic acid extraction stabilizer is preferably 1 nmol / L to 2 mol / L, more preferably 1 nmol / L to 600 mmol / L in any case of amino acid, polyamine or amino acid alkyl ester having protein aggregation inhibitory ability. More preferably, it is added so as to be 1 nmol / L to 350 mmol / L. If the concentration of these components is less than 1 nmol / L, the effect of the nucleic acid extraction stabilizer may be insufficient. On the contrary, when the concentration of these components exceeds 2 mol / L, the solubility of the nucleic acid may be deteriorated.

次に、本核酸抽出方法では工程３として、核酸が結合した核酸捕捉担体を洗浄し、非特異的結合物を核酸捕捉担体から除去する。洗浄用の試薬としては、特に限定されないが、例えば、核酸捕捉担体に対する核酸の結合を維持しつつ、工程１で添加した試薬を核酸捕捉用担体から除去できるものであればよい。洗浄用の試薬としては、低級アルコールや低分子ケトンなどの有機化合物を用いることができる。洗浄用の試薬としては、例えば、エタノール及びイソプロパノール等を使用することができ、特に70％以上の濃度のエタノールを使用することが好ましい。 Next, in this nucleic acid extraction method, as step 3, the nucleic acid capture carrier to which the nucleic acid is bound is washed, and non-specific binding substances are removed from the nucleic acid capture carrier. The washing reagent is not particularly limited, and may be any reagent that can remove the reagent added in step 1 from the nucleic acid capturing carrier while maintaining the binding of the nucleic acid to the nucleic acid capturing carrier. As the cleaning reagent, organic compounds such as lower alcohols and low molecular ketones can be used. As the reagent for washing, for example, ethanol and isopropanol can be used, and it is particularly preferable to use ethanol having a concentration of 70% or more.

なお、洗浄用の試薬を核酸捕捉担体に接触させる手技としては、特に限定されないが、上述した核酸を含有する試料を核酸捕捉担体に接触させる際に適用した手技を適宜適用することができる。 The technique for bringing the washing reagent into contact with the nucleic acid capture carrier is not particularly limited, but the technique applied when the sample containing the nucleic acid is brought into contact with the nucleic acid capture carrier can be appropriately applied.

次に、本核酸抽出方法では工程４として、核酸捕捉担体に結合した核酸を、核酸捕捉担体から溶離する。具体的には、核酸を結合した核酸捕捉担体に溶離液を接触させることで、核酸を溶離液中に回収する。溶離液を核酸捕捉担体に接触させる手技としては、特に限定されないが、上述した核酸を含有する試料を核酸捕捉担体に接触させる際に適用した手技を適宜適用することができる。 Next, in the nucleic acid extraction method, as step 4, the nucleic acid bound to the nucleic acid capture carrier is eluted from the nucleic acid capture carrier. Specifically, the nucleic acid is recovered in the eluent by bringing the eluent into contact with the nucleic acid capture carrier to which the nucleic acid is bound. The technique for bringing the eluent into contact with the nucleic acid capture carrier is not particularly limited, and the technique applied when the sample containing the nucleic acid is brought into contact with the nucleic acid capture carrier can be appropriately applied.

工程４により、核酸は核酸捕捉担体から水相へと移行する。溶離液としては、核酸捕捉担体から核酸を溶離する作用を有する限り特に限定されず、従来公知の溶離液を使用することができる。溶離液としては、例えば、低塩濃度の水溶液や純水を使用することができる。特に、溶離液としては、１０mmol/L トリス(pH8.5)及び０．１mmol/L EDTAからなる溶液を使用することが好ましい。 In step 4, the nucleic acid is transferred from the nucleic acid capture carrier to the aqueous phase. The eluent is not particularly limited as long as it has an action of eluting nucleic acid from the nucleic acid capture carrier, and a conventionally known eluent can be used. As the eluent, for example, a low salt concentration aqueous solution or pure water can be used. In particular, it is preferable to use a solution consisting of 10 mmol / L Tris (pH 8.5) and 0.1 mmol / L EDTA as the eluent.

工程４において本発明に係る核酸抽出安定剤を使用することができる。すなわち、溶離液に核酸抽出安定剤を添加し、核酸を結合した核酸捕捉担体と当該溶離液とを接触させることによって、核酸捕捉担体に結合した核酸の回収量を大幅に向上させることができる。一般に、溶離工程において溶離液により核酸を核酸捕捉担体から溶離させるが、溶離液に含まれるタンパク質が凝集することで溶離した核酸を取り込み、核酸の回収率が低下する場合がある。しかしながら、本発明に係る核酸抽出安定剤の存在下で溶離工程を行うことによって、このような核酸の取り込みを防止することができ、その結果、核酸の回収率が向上することとなる。 In step 4, the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention can be used. That is, by adding a nucleic acid extraction stabilizer to the eluent and bringing the nucleic acid capture carrier to which the nucleic acid is bound into contact with the eluate, the recovery amount of the nucleic acid bound to the nucleic acid capture carrier can be greatly improved. In general, in the elution step, nucleic acid is eluted from the nucleic acid capture carrier by an eluent, but the protein contained in the eluent aggregates to take in the eluted nucleic acid, which may reduce the nucleic acid recovery rate. However, by performing the elution step in the presence of the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention, such nucleic acid uptake can be prevented, and as a result, the nucleic acid recovery rate is improved.

ここで、核酸抽出安定剤は、タンパク質凝集抑制能を有するアミノ酸、ポリアミン又はアミノ酸アルキルエステルがいずれの場合も濃度が好ましくは１nmol/L〜２mol/L、より好ましくは１nmol/L〜６００mmol/L、さらに好ましくは１nmol/L〜３５０mmol/Lとなるように溶離液に添加される。これら成分の濃度が１nmol/L未満では、核酸抽出安定化剤の効果が不十分となる虞がある。逆に、これら成分の濃度が２mol/Lを超える場合には、核酸の溶解性が悪くなる虞がある。 Here, the concentration of the nucleic acid extraction stabilizer is preferably 1 nmol / L to 2 mol / L, more preferably 1 nmol / L to 600 mmol / L in any case of amino acid, polyamine or amino acid alkyl ester having protein aggregation inhibitory ability. More preferably, it is added to the eluent so as to be 1 nmol / L to 350 mmol / L. If the concentration of these components is less than 1 nmol / L, the effect of the nucleic acid extraction stabilizer may be insufficient. On the contrary, when the concentration of these components exceeds 2 mol / L, the solubility of the nucleic acid may be deteriorated.

以上で説明したように、本発明に係る核酸抽出安定剤を核酸捕捉工程及び/又は核酸溶離工程に使用することによって、生体サンプル若しくは核酸を含有する試料からの核酸の回収効率を向上させることができる。また、本発明に係る核酸抽出安定剤を使用することによって、溶液に含まれるタンパク質の凝集が抑制されるため、核酸を含有する試料、洗浄液及び溶離液等を核酸捕捉担体に通液させる際の抵抗を低減させることができる。これにより、これら溶液の通液速度の低下を防止することができ、上述した各工程に要する時間を短縮することができる。 As described above, by using the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention in the nucleic acid capture step and / or the nucleic acid elution step, it is possible to improve the recovery efficiency of nucleic acid from a biological sample or a sample containing nucleic acid. it can. Moreover, since the aggregation of the protein contained in the solution is suppressed by using the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention, a sample containing nucleic acid, a washing solution, an eluent, and the like are passed through the nucleic acid capture carrier. Resistance can be reduced. Thereby, the fall of the liquid passing rate of these solutions can be prevented, and the time required for each process mentioned above can be shortened.

なお、本発明に係る核酸抽出安定剤は、上記工程３、すなわち核酸を結合した核酸捕捉担体を洗浄する工程においては排除されていることが望ましい。核酸を結合した核酸捕捉担体を洗浄する工程を核酸抽出安定剤の非存在下で行うことによって、核酸回収効率を更に向上させることができる。 In addition, it is desirable that the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention is excluded in the above step 3, that is, the step of washing the nucleic acid capture carrier bound with the nucleic acid. By performing the step of washing the nucleic acid capture carrier to which the nucleic acid is bound in the absence of a nucleic acid extraction stabilizer, the efficiency of nucleic acid recovery can be further improved.

なお、本発明に係る核酸抽出安定剤は、核酸捕捉担体と試薬ラックとを備える核酸抽出装置に適用することができる。本核酸抽出装置において、核酸捕捉担体は、上述したように核酸捕捉用チップ又は核酸捕捉用カラムとすることができる。本核酸抽出装置において、試薬ラックには、少なくとも、上述した結合試薬、溶離液及び本発明に係る核酸抽出安定剤を備える。なお、本発明に係る核酸抽出安定剤は、結合試薬及び/又は溶離液に混合されていても良い。 In addition, the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention can be applied to a nucleic acid extraction apparatus including a nucleic acid capture carrier and a reagent rack. In this nucleic acid extraction apparatus, the nucleic acid capture carrier can be a nucleic acid capture chip or a nucleic acid capture column as described above. In the nucleic acid extraction apparatus, the reagent rack includes at least the binding reagent, the eluent, and the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention. The nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention may be mixed in a binding reagent and / or an eluent.

また、本核酸抽出装置において抽出された核酸は、そのまま又は精製した後に、例えば核酸増幅反応の鋳型として使用することができる。すなわち、上述した核酸抽出装置の構成に、核酸増幅反応に使用する試薬類や温度調節装置を更に備えることによって、本発明に係る核酸抽出安定剤を核酸増幅装置に適用することもできる。 Moreover, the nucleic acid extracted in this nucleic acid extraction apparatus can be used as it is or after purification, for example, as a template for a nucleic acid amplification reaction. That is, the nucleic acid extraction stabilizer according to the present invention can be applied to the nucleic acid amplification device by further providing reagents and a temperature control device used for the nucleic acid amplification reaction in the configuration of the nucleic acid extraction device described above.

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）溶解試薬への核酸抽出安定化剤添加による効果
本実施例では、L(+)-アルギニン（和光純薬製）を核酸抽出安定化剤として用い、図１の核酸回収工程のフローチャートに従って核酸を回収し、核酸抽出安定剤の濃度と核酸回収率との関係を検討した。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.
Example 1 Effect of Adding Nucleic Acid Extraction Stabilizer to Lysis Reagent In this example, L (+)-arginine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used as a nucleic acid extraction stabilizer, and the nucleic acid recovery step of FIG. Nucleic acids were collected according to the flowchart, and the relationship between the concentration of the nucleic acid extraction stabilizer and the nucleic acid recovery rate was examined.

本実施例では、試料として標準血清であるAutonorm^TMを用い、Autonorm^TM 195μlに対して市販精製品のプラスミドDNAであるpBR322を20ng/μlとなるようにＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）により希釈した溶液5μlを加えることで、核酸を含有する試料を調整した。なお、本実施例では、当該試料200μlとして用いた。また、本実施例で使用した他の試薬組成を下記に示した。
溶解試薬：5mol/L チオシアン酸グアニジン塩
5％(w/v) TritonX-100
20mmol/L EDTA・２Na
125mmol/L Tris-HCl
100mmol/L DTT
結合試薬：3 mol/L チオシアン酸グアニジン塩
35％(w/v) TritonX-100
30mmol/L EDTA・２Na
100mmol/L MES
第一洗浄液：2.5mol/L チオシアン酸グアニジン塩
5％ TritonX-100
25mmol/L EDTA・２Na
100mmol/L MES
第二洗浄液：15mmol/L 酢酸カリウム
70％(v/v) エタノール水溶液
溶離液：10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)
0.1mmol/L EDTA・２Na In this example, Autonorm ^™ as a standard serum was used as a sample, and pBR322, which is a plasmid DNA of a commercially available product, was diluted with TE buffer (pH 8.0) so as to be 20 ng / µl with respect to 195 µl of Autonorm ^™ . A sample containing nucleic acid was prepared by adding 5 μl of the solution. In this example, the sample was used as 200 μl. In addition, other reagent compositions used in this example are shown below.
Dissolution reagent: 5 mol / L guanidine thiocyanate
5% (w / v) TritonX-100
20mmol / L EDTA ・ 2Na
125mmol / L Tris-HCl
100mmol / L DTT
Binding reagent: 3 mol / L guanidine thiocyanate
35% (w / v) TritonX-100
30mmol / L EDTA ・ 2Na
100mmol / L MES
First cleaning solution: 2.5 mol / L guanidine thiocyanate
5% TritonX-100
25mmol / L EDTA ・ 2Na
100mmol / L MES
Second washing solution: 15mmol / L potassium acetate
70% (v / v) ethanol aqueous solution eluent: 10mmol / L Tris-HCl (pH8.0)
0.1mmol / L EDTA ・ 2Na

先ず、1.5ｍｌ容量の反応容器内で、試料200μlに対して溶解試薬にL(+)-アルギニンを添加したもの400μlを加え、ボルテクスミキサーにより攪拌し、80℃、5分間加熱した後、冷却し、結合液400μlを添加し、ボルテクスミキサーにより攪拌した。ここではアルギニンの添加量を0〜333mmol/Lとした。 First, in a reaction container with a volume of 1.5 ml, add 400 μl of L (+)-arginine added to the lysis reagent to 200 μl of the sample, stir with a vortex mixer, heat at 80 ° C. for 5 minutes, and then cool. Then, 400 μl of a binding solution was added and stirred with a vortex mixer. Here, the amount of arginine added was 0 to 333 mmol / L.

次に、上記のように調整した溶液を、核酸捕捉担体を有する核酸捕捉用チップに通液した。なお、本実施例では、核酸捕捉用チップとして（図２参照）、ポリプロピレン製のチップを用い、核酸捕捉担体としてガラス繊維濾紙を用い、ポリプロピレンにより成形した阻止部材で核酸捕捉担体の上下を挟んだ。この核酸捕捉用チップを30mL用シリンジに装着し、プランジャを30ｍLから10ｍL〔加圧速度15（ｍＬ/sec）〕まで押し、加圧により溶液の通液を行った。本工程により、溶液に含まれる核酸を核酸捕捉担体に結合させることとなる。 Next, the solution prepared as described above was passed through a nucleic acid capture chip having a nucleic acid capture carrier. In this example, a polypropylene chip was used as the nucleic acid capturing chip (see FIG. 2), a glass fiber filter paper was used as the nucleic acid capturing carrier, and the nucleic acid capturing carrier was sandwiched between blocking members formed of polypropylene. . The nucleic acid capturing chip was attached to a 30 mL syringe, the plunger was pushed from 30 mL to 10 mL (pressurization speed: 15 (mL / sec)), and the solution was passed through by pressurization. By this step, the nucleic acid contained in the solution is bound to the nucleic acid capture carrier.

次に、第一洗浄溶液 1,200μlを充填した30mL用シリンジに核酸捕捉用チップを装着し、プランジャを30ｍLから10ｍL〔加圧速度15（ｍＬ/sec）〕まで押し加圧により溶液の通液を行った。これに続いて、第二洗浄液を1,400μl用いて同様に通液を行った。本工程により、核酸捕捉担体を洗浄することとなる。 Next, attach a nucleic acid capture chip to a 30 mL syringe filled with 1,200 μl of the first washing solution, press the plunger from 30 mL to 10 mL (pressurization speed 15 (mL / sec)), and pressurize the solution through went. Subsequently, 1400 μl of the second washing solution was used for the same flow. By this step, the nucleic acid capture carrier is washed.

次に、溶離液としてＴＥ緩衝液（pH8.0）30μlを充填した30mL用シリンジに核酸捕捉用チップを装着し、上述のように加圧することで溶離液を核酸捕捉担体に通水した。本工程によって核酸捕捉担体から核酸を溶離して回収した。そして、回収された溶離液に含まれるプラスミドDNApBR322をインビトロジェン社製、「Quant-iT^TM RiboGreen RNA Reagent and Kit」により定量し、核酸回収率を算出した。 Next, a nucleic acid capture chip was attached to a 30 mL syringe filled with 30 μl of TE buffer (pH 8.0) as an eluent, and the eluate was passed through the nucleic acid capture carrier by applying pressure as described above. In this step, the nucleic acid was eluted from the nucleic acid capture carrier and recovered. Then, plasmid DNApBR322 contained in the recovered eluate was quantified by “Quant-iT ^™ RiboGreen RNA Reagent and Kit” manufactured by Invitrogen, and the nucleic acid recovery rate was calculated.

その結果を図３に示した。図３に示した結果からL(+)-アルギニンを添加することにより核酸回収効率が向上し、また、核酸回収効率の向上度合いはL(+)-アルギニン濃度に正に相関していることが判った。 The results are shown in FIG. From the results shown in FIG. 3, it can be seen that the addition of L (+)-arginine improves the nucleic acid recovery efficiency, and that the degree of improvement in the nucleic acid recovery efficiency is positively correlated with the L (+)-arginine concentration. understood.

また、上述した核酸捕捉担体の洗浄に際して、第一洗浄溶液及び第二洗浄溶液の通液時間を測定した結果をそれぞれ表１及び表２に示した。 Tables 1 and 2 show the results of measuring the flow time of the first washing solution and the second washing solution when washing the nucleic acid capture carrier described above.

表１及び表２に示したように、添加したL(+)-アルギニン濃度の増加と共に通液時間が短縮されることが確認された。これは、溶液に含まれるタンパク質又は核酸捕捉担体に吸着したタンパク質の凝集が阻害され、その結果、核酸捕捉担体への通液における抵抗が低減したことを示している。この結果から、核酸抽出安定剤を使用することによって、核酸捕捉担体の通液速度を向上させることができ、より短時間で核酸を回収できることが示された。 As shown in Tables 1 and 2, it was confirmed that the liquid passing time was shortened with the increase of the added L (+)-arginine concentration. This indicates that the aggregation of the protein contained in the solution or the protein adsorbed on the nucleic acid capture carrier is inhibited, and as a result, the resistance in passing through the nucleic acid capture carrier is reduced. From this result, it was shown that the use of a nucleic acid extraction stabilizer can improve the flow rate of the nucleic acid capture carrier and can recover the nucleic acid in a shorter time.

（実施例２）第一洗浄試薬への核酸抽出安定化剤添加による効果
本実施例では、L(+)-アルギニンを核酸抽出安定化剤として用い、第一洗浄試薬にL(+)-アルギニンを添加した以外は実施例１と同様にして核酸抽出を行い、核酸回収率を算出した。その結果を図４に示す。図４に示すように、洗浄時に核酸抽出安定化剤の混入を防ぐことにより、核酸回収率が向上することが明らかとなった。 (Example 2) Effect of adding nucleic acid extraction stabilizer to the first washing reagent In this example, L (+)-arginine was used as the nucleic acid extraction stabilizer, and L (+)-arginine was used as the first washing reagent. Nucleic acid extraction was performed in the same manner as in Example 1 except that was added, and the nucleic acid recovery rate was calculated. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 4, it was revealed that the nucleic acid recovery rate was improved by preventing the nucleic acid extraction stabilizer from being mixed during washing.

（実施例３）溶離試薬への核酸抽出安定化剤添加による効果
本実施例では、L(+)-アルギニンを核酸抽出安定化剤として用い、溶離試薬にL(+)-アルギニンを添加した以外は実施例１と同様にして核酸抽出を行い、核酸回収率を算出した。その結果を図５に示す。図５に示すように、溶離試薬にL(+)-アルギニンを添加することにより核酸回収効率が向上することが明らかとなった。また、本実施例においては、溶解試薬に核酸抽出安定化剤を添加した場合（実施例１）と比較して、洗浄後の核酸捕捉担体上のタンパク量が少なく、結合溶液に添加されている様々な成分が除かれた状態であるため、タンパク質の凝集抑制効果がより効果的に作用していると判断された。 (Example 3) Effect of adding nucleic acid extraction stabilizer to elution reagent In this example, L (+)-arginine was used as a nucleic acid extraction stabilizer and L (+)-arginine was added to the elution reagent. Was extracted in the same manner as in Example 1 and the nucleic acid recovery rate was calculated. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 5, it was revealed that nucleic acid recovery efficiency was improved by adding L (+)-arginine to the elution reagent. Further, in this example, the amount of protein on the nucleic acid capture carrier after washing is small and added to the binding solution compared to the case where the nucleic acid extraction stabilizer is added to the lysis reagent (Example 1). Since various components were removed, it was determined that the protein aggregation inhibitory effect was acting more effectively.

（実施例４）各種核酸抽出安定化剤の添加による効果
本実施例では、核酸抽出安定化剤として、D-アルギニン、グリシン、スペルミン、スペルミジン、グリシンエチルエステル塩酸塩或いはL-リシン（いずれも和光純薬製）用いた以外は実施例３と同様にして同様にして核酸抽出を行い、核酸回収率を算出した。核酸抽出安定化剤としてD-アルギニンを用いた場合の結果を図６、核酸抽出安定化剤としてグリシンを用いた場合の結果を図７、核酸抽出安定化剤としてスペルミンを用いた場合の結果を図８、核酸抽出安定化剤としてスペルミジンを用いた場合の結果を図９、核酸抽出安定化剤としてグリシンエチルエステル塩酸塩を用いた場合の結果を図１０、核酸抽出安定化剤としてL-リシンを用いた場合の結果を図１１に示した。 (Example 4) Effect of adding various nucleic acid extraction stabilizers In this example, as nucleic acid extraction stabilizers, D-arginine, glycine, spermine, spermidine, glycine ethyl ester hydrochloride or L-lysine (all of which are sums) Nucleic acid extraction was performed in the same manner as in Example 3 except that it was used, and the nucleic acid recovery rate was calculated. Fig. 6 shows the results when D-arginine is used as the nucleic acid extraction stabilizer, Fig. 7 shows the results when glycine is used as the nucleic acid extraction stabilizer, and Fig. 7 shows the results when spermine is used as the nucleic acid extraction stabilizer. FIG. 8 shows the results when spermidine is used as the nucleic acid extraction stabilizer, FIG. 9 shows the results when glycine ethyl ester hydrochloride is used as the nucleic acid extraction stabilizer, and L-lysine as the nucleic acid extraction stabilizer. FIG. 11 shows the result obtained when using.

図６〜１１に示すように、核酸抽出安定化剤としてD-アルギニン、グリシン、スペルミン、スペルミジン、グリシンエチルエステル塩酸塩或いはL-リシンを用いた場合であっても核酸回収率が向上することが明らかとなった。特に、核酸回収率の向上効果としては、ポリアミン及びアミノ酸エステルに比べ、アミノ酸の方がより優れた効果を示し、その中でも塩基性であるアルギニンやリシンを核酸抽出安定化剤として使用した場合には最も優れた効果が見られた。これは、アミノ酸、ポリアミン、アミノ酸エステルにおける各々の作用機構の違いによるものと考えられた。 As shown in FIGS. 6 to 11, even when D-arginine, glycine, spermine, spermidine, glycine ethyl ester hydrochloride or L-lysine is used as the nucleic acid extraction stabilizer, the nucleic acid recovery rate can be improved. It became clear. In particular, as an effect of improving the recovery rate of nucleic acids, amino acids show a better effect than polyamines and amino acid esters. Among them, when basic arginine or lysine is used as a nucleic acid extraction stabilizer. The most excellent effect was seen. This was thought to be due to the difference in the mechanism of action among amino acids, polyamines and amino acid esters.

（実施例５）遠心法における核酸抽出安定化剤添加による効果
本実施例では、溶解試薬等の通液を遠心操作(1,100×g、一分の条件)で行った以外は実施例１と同様にして核酸抽出を行い、核酸回収率を算出した。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、L(+)-アルギニンを添加した溶解試薬を核酸捕捉担体に遠心操作により通液した場合であっても核酸回収率が向上することが明らかとなった。 (Example 5) Effect of adding nucleic acid extraction stabilizer in centrifugation method In this example, the same procedure as in Example 1 was carried out except that lysis reagent and the like were passed through centrifugation (1,100 xg, conditions for one minute). Then, nucleic acid extraction was performed, and the nucleic acid recovery rate was calculated. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 12, it was revealed that the nucleic acid recovery rate was improved even when the lysis reagent to which L (+)-arginine was added was passed through the nucleic acid capture carrier by centrifugation.

（実施例６）磁性ビーズを用いた場合における核酸抽出安定化剤添加による効果
本実施例では、核酸捕捉担体として磁性ビーズ（「MagExtractor-Viral RNA-」TOYOBO社製）を用いた以外は実施例１と同様にして核酸抽出を行い、核酸回収率を算出した。その結果を図１３に示す。図１３に示すように、核酸捕捉担体として磁性ビーズを用いた場合であってもL(+)-アルギニンを添加した溶解試薬を使用することによって核酸回収率が向上することが明らかとなった。 (Example 6) Effect of adding nucleic acid extraction stabilizer when magnetic beads are used In this example, magnetic beads ("MagExtractor-Viral RNA-" manufactured by TOYOBO) were used as a nucleic acid capture carrier. Nucleic acid extraction was performed in the same manner as in 1, and the nucleic acid recovery rate was calculated. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 13, even when magnetic beads were used as the nucleic acid capture carrier, it was revealed that the nucleic acid recovery rate was improved by using a lysis reagent to which L (+)-arginine was added.

本発明に係る核酸抽出安定剤を適用した核酸抽出方法の一例を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows an example of the nucleic acid extraction method to which the nucleic acid extraction stabilizer which concerns on this invention is applied. 核酸抽出方法に使用する核酸捕捉用チップの構造を示す断面図である。It is sectional drawing which shows the structure of the chip | tip for nucleic acid capture used for a nucleic acid extraction method. 核酸抽出安定剤としてL(+)アルギンを使用した場合の核酸抽出安定剤の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。FIG. 3 is a characteristic diagram showing the relationship between the concentration of nucleic acid extraction stabilizer added and the amount of nucleic acid recovered when L (+) algin is used as the nucleic acid extraction stabilizer. 核酸抽出安定剤としてL(+)アルギンを使用し、核酸抽出安定剤を洗浄液に添加した場合の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。FIG. 6 is a characteristic diagram showing the relationship between the concentration of nucleic acid and the amount of nucleic acid recovered when L (+) algin is used as the nucleic acid extraction stabilizer and the nucleic acid extraction stabilizer is added to the washing solution. 核酸抽出安定剤としてL(+)アルギンを使用し、核酸抽出安定剤を溶離液に添加した場合の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。FIG. 4 is a characteristic diagram showing the relationship between the concentration of nucleic acid and the amount of nucleic acid recovered when L (+) algin is used as the nucleic acid extraction stabilizer and the nucleic acid extraction stabilizer is added to the eluent. 核酸抽出安定剤としてD-アルギンを使用し、核酸抽出安定剤を溶離液に添加した場合の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。FIG. 5 is a characteristic diagram showing the relationship between the concentration of nucleic acid and the amount of nucleic acid recovered when D-algin is used as the nucleic acid extraction stabilizer and the nucleic acid extraction stabilizer is added to the eluent. 核酸抽出安定剤としてグリシンを使用し、核酸抽出安定剤を溶離液に添加した場合の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。It is a characteristic view which shows the relationship between the addition density | concentration at the time of using glycine as a nucleic acid extraction stabilizer and adding a nucleic acid extraction stabilizer to an eluent, and a nucleic acid collection amount. 核酸抽出安定剤としてスペルミンを使用し、核酸抽出安定剤を溶離液に添加した場合の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。It is a characteristic view which shows the relationship between the addition density | concentration at the time of using spermine as a nucleic acid extraction stabilizer, and adding a nucleic acid extraction stabilizer to an eluent, and a nucleic acid collection amount. 核酸抽出安定剤としてスペルミジンを使用し、核酸抽出安定剤を溶離液に添加した場合の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。It is a characteristic view which shows the relationship between the addition density | concentration at the time of using spermidine as a nucleic acid extraction stabilizer, and adding a nucleic acid extraction stabilizer to an eluent, and a nucleic acid collection amount. 核酸抽出安定剤としてグリシンエチルエステル塩酸塩を使用し、核酸抽出安定剤を溶離液に添加した場合の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。It is a characteristic view which shows the relationship between the addition density | concentration at the time of using glycine ethyl ester hydrochloride as a nucleic acid extraction stabilizer, and adding a nucleic acid extraction stabilizer to an eluent, and a nucleic acid collection amount. 核酸抽出安定剤としてL-リシンを使用し、核酸抽出安定剤を溶離液に添加した場合の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。FIG. 5 is a characteristic diagram showing the relationship between the concentration of nucleic acid and the amount of nucleic acid recovered when L-lysine is used as the nucleic acid extraction stabilizer and the nucleic acid extraction stabilizer is added to the eluent. 核酸抽出安定剤としてL(+)アルギンを使用し、核酸抽出安定剤を溶解試薬に添加し、遠心操作によって通液した場合の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。FIG. 5 is a characteristic diagram showing the relationship between the added concentration and the amount of recovered nucleic acid when L (+) algin is used as the nucleic acid extraction stabilizer, the nucleic acid extraction stabilizer is added to the lysis reagent, and the solution is passed by centrifugation. 核酸抽出安定剤としてL(+)アルギンを使用し、核酸抽出安定剤を溶解試薬に添加し、核酸捕捉担体として磁性ビーズを使用した場合の添加濃度と核酸回収量との関係を示す特性図である。A characteristic diagram showing the relationship between the concentration and nucleic acid recovery when L (+) algin is used as the nucleic acid extraction stabilizer, the nucleic acid extraction stabilizer is added to the lysis reagent, and magnetic beads are used as the nucleic acid capture carrier. is there.

Explanation of symbols

10…核酸捕捉用チップ、11…頭部、12…通液口、13…核酸捕捉担体、14…阻止部材 10 ... Nucleic acid capture chip, 11 ... head, 12 ... fluid opening, 13 ... nucleic acid capture carrier, 14 ... blocking member

Claims

A nucleic acid extraction efficiency improving agent comprising an amino acid or amino acid alkyl ester having protein aggregation inhibiting ability.

The nucleic acid extraction efficiency improver according to claim 1, wherein the amino acid is at least one amino acid selected from the group consisting of arginine, glycine, alanine and lysine.

The amino acid ester is selected from the group consisting of glycine ethyl ester, arginine methyl ester, nitroarginine methyl ester, arginine ethyl ester, aspartic acid dimethyl ester, lysine methyl ester, lysine ethyl ester, glycine benzyl ester and glycine t-butyl ester. The nucleic acid extraction efficiency improving agent according to claim 1, wherein the nucleic acid extraction efficiency improving agent is at least one kind of amino acid ester or a salt thereof.

The nucleic acid extraction efficiency improving agent according to claim 1, wherein the concentration of the amino acid or amino acid alkyl ester is 1 nmol / L to 2 mol / L.

In a nucleic acid extraction method comprising a nucleic acid capture step of mixing a sample containing nucleic acid with a nucleic acid capture carrier, and a nucleic acid elution step of eluting nucleic acid captured by the nucleic acid capture carrier.
The nucleic acid extraction method characterized by performing the said nucleic acid capture process and / or the said nucleic acid elution process in presence of the nucleic acid extraction efficiency improving agent as described in any one of Claims 1 thru | or 4 .

The nucleic acid extraction method according to claim 5 , wherein the nucleic acid capturing step is performed in a solution containing a chaotropic agent.

The nucleic acid capture carrier is a silica-containing solid phase, and in the nucleic acid capture step and the nucleic acid elution step, the sample and the eluent are passed through a chip in which the nucleic acid capture carrier is disposed, respectively. The nucleic acid extraction method according to claim 5 .

A nucleic acid capture carrier capable of adsorbing nucleic acids contained in the solution;
The nucleic acid extraction efficiency as described in any one of Claims 1 thru | or 4 which contains the solution containing a nucleic acid, the adsorption promoter which accelerates | stimulates adsorption | suction to the said nucleic acid capture | acquisition support | carrier of a nucleic acid, the eluent which elutes the nucleic acid captured by the said nucleic acid capture | acquisition support | carrier A nucleic acid extraction apparatus having a reagent rack with an improver .

9. The nucleic acid extraction apparatus according to claim 8 , wherein the adsorption accelerator is a solution containing a chaotropic agent.

9. The nucleic acid extraction apparatus according to claim 8 , wherein the nucleic acid capture carrier is a silica-containing solid phase, and the sample and the eluent are passed through a chip in which the nucleic acid capture carrier is disposed.