JP5253716B2 - pH-responsive molecular assembly - Google Patents
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Description
本発明は、pH変化に応答して分子集合体に担持されている物質の放出挙動を制御することができるpH応答性分子集合体およびその用途などに関する。 The present invention relates to a pH-responsive molecular assembly capable of controlling the release behavior of a substance supported on the molecular assembly in response to a change in pH, its use, and the like.
従来、リポソームの内包物放出挙動を制御する方法として、pH応答性が汎用されている。特にホスファチジルエタノールアミン型リン脂質を用いたpH応答性リポソームがよく知られている。これは、ホスファチジルエタノールアミン型リン脂質の極性頭部の電荷がpHに応答して変化することによって、リポソーム二分子膜の分子充填状態が変化する原理を利用したものである。このため、放出される内包物は低分子に限られ、放出速度も低い点が課題であった。また、pH応答性リポソームとしては、アニオン性脂質とカチオン性脂質とを混合したリポソームが知られている（非特許文献１）。しかし、その物理化学的性質は不明瞭であり、さらにアニオン性脂質とカチオン性脂質とを組み合わせる必要があることからpH応答性の調整が難しいという問題があった。また、カチオン性脂質自体は血液適合性が低く、細胞毒性も高いという問題もあり、in vivoでの実用性は低い。
一方、本発明者らは先に、下記式
On the other hand, the present inventors first have the following formula:
上記のような状況に鑑み、低分子量だけでなく、薬剤または核酸などの高分子量の分子をも担持し、かつ、その放出挙動を制御することができるpH応答性分子集合体の開発が望まれている。特に生体適合性の高い安全なpH応答性分子集合体が求められている。 In view of the above situation, it is desired to develop a pH-responsive molecular assembly capable of supporting not only a low molecular weight but also a high molecular weight molecule such as a drug or nucleic acid and controlling its release behavior. ing. In particular, a safe pH-responsive molecular assembly with high biocompatibility is required.
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、上記特許文献１記載の両イオン性脂質からなるリポソームがpH応答性を示すことを見出した。その原理は、pH低下による両イオン性脂質の電荷バランスの変化によって二分子膜形態を取り得なくなり、リポソーム構造が破壊されることによる内包物の放出であるため、内包された高分子量の分子をドラスティックに放出することができるというものである。さらにこの挙動が共存する非pH応答性リポソームにも影響し、そのリポソームの内包物の放出をも促進することを見出した。そしてこれを利用すると、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれたpH応答性リポソームの構造がエンドソーム内の低pHによって大きく変化してエンドソームに影響を及ぼし、リポソームの内包物をエンドソームから細胞質側に放出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that liposomes composed of zwitterionic lipids described in
すなわち、本発明は、以下に示したpH応答性分子集合体、pH応答性分子集合体含有薬剤、試薬、核酸導入剤、pH応答性分子集合体組成物、pH応答性放出促進剤などを提供するものである。 That is, the present invention provides the following pH-responsive molecular assembly, drug containing pH-responsive molecular assembly, reagent, nucleic acid introduction agent, pH-responsive molecular assembly composition, pH-responsive release accelerator, etc. To do.
(1) 式（I）
で表される両イオン性脂質を含み、目的物質を担持している分子集合体であって、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に前記物質を放出するものである、pH応答性分子集合体。
(1) Formula (I)
A molecular assembly containing a zwitterionic lipid represented by and carrying a target substance, which releases the substance when the pH of the aqueous dispersion medium changes from a physiological value to an acidic value. A pH-responsive molecular assembly.
(2) 式（I）
で表される両イオン性脂質を含む分子集合体であって、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、別の分子集合体に担持されている目的物質の放出を促すものである、pH応答性分子集合体。
(2) Formula (I)
Release of the target substance carried by another molecular assembly when the pH of the aqueous dispersion medium changes from a physiological value to an acidic value. PH-responsive molecular assembly that promotes
(3) pHの生理的な値が7.0〜8.0であり、酸性の値が6.5以下である、(1)または(2)記載のpH応答性分子集合体。
(4) 式（I）中、mが3であり、nが3であり、末端カルボキシル炭素から数えて4番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRaがHである、(1)〜(3)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(5) 式（I）中、mが2であり、nが3であり、末端カルボキシル炭素から数えて3番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRがHである、(1)〜(3)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(6) 式（I）中、mが3であり、nが2であり、末端カルボキシル炭素から数えて4番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRaがHである、(1)〜(3)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(7) 式（I）中、mが2であり、nが2であり、末端カルボキシル炭素から数えて3番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRaがHである、(1)〜(3)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(3) The pH-responsive molecular assembly according to (1) or (2), wherein a physiological value of pH is 7.0 to 8.0 and an acidic value is 6.5 or less.
(4) In formula (I), m is 3, n is 3, Ra of the fourth carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and the other Ra is H. (1 The pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (3).
(5) In the formula (I), m is 2, n is 3, Ra of the third carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and the other R is H. (1 The pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (3).
(6) In the formula (I), m is 3, n is 2, Ra of the fourth carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and the other Ra is H. (1 The pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (3).
(7) In the formula (I), m is 2, n is 2, Ra of the third carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and the other Ra is H. (1 The pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (3).
(8) ステロイド類を式（I）で表される両イオン性脂質に対して20〜200モル％含むものである、(1)〜(7)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(9) 式（I）で表される両イオン性脂質以外の両イオン性脂質、カチオン性脂質、およびアニオン性脂質からなる群から選ばれる少なくとも１種を、式（I）で表される両イオン性脂質に対して合計で10〜300モル％含むものである、(1)〜(8)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(8) The pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (7), wherein the steroid is contained in an amount of 20 to 200 mol% based on the zwitterionic lipid represented by the formula (I).
(9) At least one selected from the group consisting of zwitterionic lipids other than zwitterionic lipids represented by formula (I), cationic lipids, and anionic lipids, The pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (8), comprising 10 to 300 mol% in total with respect to the ionic lipid.
(10) 別の分子集合体が、細胞膜または膜構造を有する細胞小器官である、(2)〜(9)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(11)分子集合体が、二分子膜小胞体である、(1)〜(10)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(12) 分子集合体に担持されている物質が、二分子膜小胞体の内水相に溶解または分散しているか、二分子膜内に局在するものか、あるいは二分子膜の外側表面に局在するものである、(11)記載のpH応答性分子集合体。
(10) The pH-responsive molecular assembly according to any one of (2) to (9), wherein the other molecular assembly is a cell membrane or an organelle having a membrane structure.
(11) The pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (10), wherein the molecular assembly is a bilayer vesicle.
(12) Whether the substance carried on the molecular assembly is dissolved or dispersed in the inner aqueous phase of the bilayer vesicle, is localized in the bilayer membrane, or on the outer surface of the bilayer membrane The pH-responsive molecular assembly according to (11), which is localized.
(13) 式（I）で表される両イオン性脂質を含む分子集合体が細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれた際に、エンドソーム内の酸性pHによって前記集合体が担持している物質をエンドソーム内に放出し、さらにエンドソーム内に放出された物質の細胞質への放出を促すものである、(1)〜(12)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(14) 式（I）で表される両イオン性脂質を含む分子集合体が目的物質を担持している別の分子集合体と共に細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれた際に、エンドソーム内の酸性pHによって前記別の分子集合体が担持している物質のエンドソーム内への放出を促し、さらにエンドソーム内に放出された物質の細胞質への放出を促すものである、(1)〜(12)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(15) pH応答性分子集合体または別の分子集合体が担持している物質が、薬物、プローブ、核酸、およびタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である、(1)〜(14)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体。
(13) When the molecular assembly containing the zwitterionic lipid represented by the formula (I) is taken up into the cell by endocytosis, the substance carried by the assembly is caused by the acidic pH in the endosome. The pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (12), which is released into an endosome and further promotes release of a substance released into the endosome into the cytoplasm.
(14) When the molecular assembly containing the zwitterionic lipid represented by the formula (I) is taken into the cell by endocytosis together with another molecular assembly carrying the target substance, The acidic pH promotes the release of the substance carried by the other molecular assembly into the endosome, and further promotes the release of the substance released into the endosome into the cytoplasm (1) to (12) The pH-responsive molecular assembly according to any one of the above.
(15) The substance carried by the pH-responsive molecular assembly or another molecular assembly is at least one selected from the group consisting of drugs, probes, nucleic acids, and proteins (1) to (14 The pH-responsive molecular assembly according to any one of (1).
(16) 薬物を担持した(1)〜(15)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体を含む薬剤。
(17) プローブを担持した(1)〜(15)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体を含む試薬。
(18) 核酸を担持した(1)〜(15)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体を含む核酸導入剤。
(19) タンパク質を担持した(1)〜(15)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体を含む酵素補充治療用タンパク質製剤。
(16) A drug comprising the pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (15), which carries a drug.
(17) A reagent comprising the pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (15), which carries a probe.
(18) A nucleic acid introduction agent comprising the pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (15), which carries a nucleic acid.
(19) A protein preparation for enzyme supplementation therapy comprising the pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (15), which carries a protein.
(20) (1)〜(15)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体と、目的物質を担持している別の分子集合体とを含むことを特徴とするpH応答性分子集合体組成物。
(21) (1)〜(15)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体と別の分子集合体とを含むpH応答性分子集合体組成物であって、前記別の分子集合体は目的物質を担持していてもよく、pH応答性分子集合体は別の分子集合体に担持されており、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、pH応答性分子集合体または別の集合体に担持されている物質を放出するものである、pH応答性分子集合体組成物。
(22) pH応答性分子集合体または別の分子集合体が担持している物質が、薬物、プローブ、核酸、およびタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である、(20)または(21)記載のpH応答性分子集合体組成物。
(20) A pH-responsive molecular assembly comprising the pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (15) and another molecular assembly carrying a target substance Body composition.
(21) A pH-responsive molecular assembly composition comprising the pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (15) and another molecular assembly, wherein the other molecular assembly May support the target substance, and the pH-responsive molecular assembly is supported by another molecular assembly. When the pH of the aqueous dispersion medium changes from a physiological value to an acidic value, the pH response A pH-responsive molecular assembly composition that releases a substance carried by a sex molecular assembly or another assembly.
(22) The substance carried by the pH-responsive molecular assembly or another molecular assembly is at least one selected from the group consisting of drugs, probes, nucleic acids, and proteins, (20) or (21 ) PH-responsive molecular assembly composition described above.
(23) (1)〜(15)のいずれか１項記載のpH応答性分子集合体を含み、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、別の分子集合体に担持されている物質の放出を促すものであるpH応答性放出促進剤。
(24) 別の分子集合体が細胞膜または膜構造を有する細胞小器官である、(23)記載のpH応答性放出促進剤。
(23) The pH-responsive molecular assembly according to any one of (1) to (15), wherein when the pH of the dispersed aqueous medium changes from a physiological value to an acidic value, another molecular assembly A pH-responsive release accelerator that promotes the release of a substance carried on the surface.
(24) The pH-responsive release promoting agent according to (23), wherein another molecular assembly is a cell organelle or a cell organelle having a membrane structure.
(25) 式（II）
で表される両イオン性脂質。
(25) Formula (II)
Zwitterionic lipid represented by
本発明によれば、生理条件よりも低pHになると分子集合体に担持されていた目的物質を放出する放出制御機能を分子集合体に付与することができる。これにより、例えば、分子集合体が細胞内に取り込まれた際にのみ効率良く薬物や蛋白質、核酸などを細胞質側に放出させることが可能となる。
また、本発明のpH応答性分子集合体は、安全性が高く、単独でpH応答性を示すことができる両イオン性脂質を用いるものであるので、生体適合性に優れており、目的に応じたpH応答性の調整も容易であることから、in vivoでの実用性にも優れている。この両イオン性脂質はアミノ酸と長鎖アルコールのみから簡便で大量に合成することができるので、pH応答性分子集合体の調製を低コストかつ簡便な方法で行うことができるといった利点もある。
本発明を利用することにより、高機能の薬物運搬体、核酸運搬体の創製に道筋を付けることができる。
According to the present invention, when the pH is lower than physiological conditions, the molecular assembly can be provided with a release control function for releasing the target substance supported on the molecular assembly. Thereby, for example, it becomes possible to efficiently release drugs, proteins, nucleic acids and the like to the cytoplasm side only when the molecular assembly is taken into the cell.
In addition, the pH-responsive molecular assembly of the present invention uses a zwitterionic lipid that is highly safe and can exhibit pH-responsiveness alone, and thus has excellent biocompatibility and can be used depending on the purpose. In addition, it is easy to adjust the pH responsiveness, so it is excellent in practical use in vivo. Since this zwitterionic lipid can be synthesized simply and in large quantities from only amino acids and long-chain alcohols, there is an advantage that a pH-responsive molecular assembly can be prepared by a low-cost and simple method.
By utilizing the present invention, it is possible to create a path for the creation of a highly functional drug carrier and nucleic acid carrier.
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］pH応答性分子集合体
本発明のpH応答性分子集合体は、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に分子集合体に担持されている物質を放出することができるものである。本発明のpH応答性分子集合体は、自己の分子集合体が担持している目的物質を放出する第１の態様と、別の分子集合体が担持している目的物質の放出を促す第２の態様に分けられる。以下、各態様について述べる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[1] pH-responsive molecular assembly The pH-responsive molecular assembly of the present invention releases a substance carried on the molecular assembly when the pH of the aqueous dispersion medium changes from a physiological value to an acidic value. It is something that can be done. The pH-responsive molecular assembly of the present invention has a first mode for releasing a target substance carried by its own molecular assembly and a second mode for promoting the release of the target substance carried by another molecular assembly. It is divided into the aspects. Each aspect will be described below.
（第１の態様）
まず、第１の態様について説明する。第１の態様のpH応答性分子集合体は、
式（I）
で表される両イオン性脂質を含み、目的物質を担持している分子集合体であって、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に前記分子集合体に担持されている物質を放出することができるものである。第１の態様におけるこのような目的物質の放出挙動は、分散水性媒体のpHに応答して上記式（I）で表される両イオン性脂質の極性頭部の電荷バランスが変化し、それが分子集合体の分子充填状態に影響して分子集合体の構造が破壊されることによって生じるものと考えられる。これによりpH応答性分子集合体が担持している物質を目的患部に効率良く送達することができる。
(First aspect)
First, the first aspect will be described. The pH-responsive molecular assembly of the first aspect is
Formula (I)
A molecular assembly that contains a zwitterionic lipid represented by the formula and supports the target substance, and is supported on the molecular assembly when the pH of the aqueous dispersion medium changes from a physiological value to an acidic value. It is possible to release the substances that are released. According to the release behavior of the target substance in the first embodiment, the charge balance of the polar head of the zwitterionic lipid represented by the above formula (I) changes in response to the pH of the dispersed aqueous medium. This is considered to be caused by the structure of the molecular assembly being destroyed by affecting the molecular packing state of the molecular assembly. Thereby, the substance carried by the pH-responsive molecular assembly can be efficiently delivered to the target affected area.
以下、図13を参照しながら第１の態様のpH応答性分子集合体についてより具体的に説明する。図13は、第１の態様のpH応答性分子集合体が、細胞内に取り込まれる際に担持している目的物質を放出する挙動を示した概念図である。まず、目的物質を担持したpH応答性分子集合体は、細胞膜内に取り込まれる前は、pH応答性分子集合体が分散している分散水性媒体の生理的なpH環境下で分子集合体の形状を安定に保持することができる（図中（a））。このpH応答性分子集合体は、生体内を循環しながら細胞膜に近づき、そこでエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる（図中（b））。こうしてエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれたpH応答性分子集合体は、エンドソーム内の酸性pH環境下で分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値に変化することによって分子集合体の形状が変化し、分子集合体構造が保持されなくなる。これによって担持していた目的物質を放出することができる（図中（c））。本発明の好ましい態様によれば、この放出挙動はエンドソームにも作用することができ、それによってエンドソーム膜を崩壊させ、目的物質を細胞質側に放出させることができる。そしてその結果目的物質を核内に効率良く送達することができる。
このように、第１の態様においては、pH応答性分子集合体の分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値に変化する際にpH応答性分子集合体に担持されている目的物質を放出することができる。一般に異物は、通常細胞内にエンドサイトーシスという経路を通って導入される際、ライソゾームという分解酵素を含むライソソームと融合して消化されてしまう。これに対し、本発明においては、目的物質を分子集合体に担持させてライソゾームによる分解を回避しながら、目的物質を細胞内、ないしは核内に効率良く送達することができるのである。なお、図13は本発明の第１の態様の一例を示したものであり、pH応答性分子集合体の形状、目的物質の担持方法、目的物質の放出挙動などは、図13に何ら制限されない。
Hereinafter, the pH-responsive molecular assembly of the first embodiment will be described more specifically with reference to FIG. FIG. 13 is a conceptual diagram showing a behavior in which the pH-responsive molecular assembly of the first embodiment releases a target substance carried when taken into a cell. First, the pH-responsive molecular assembly carrying the target substance is in the form of a molecular assembly under the physiological pH environment of a dispersed aqueous medium in which the pH-responsive molecular assembly is dispersed before being incorporated into the cell membrane. Can be held stably ((a) in the figure). This pH-responsive molecular assembly approaches the cell membrane while circulating in the living body, where it is taken up into the cell by endocytosis ((b) in the figure). The pH-responsive molecular assembly taken up into the cell by endocytosis in this way is obtained by changing the pH of the dispersed aqueous medium from a physiological value to an acidic value in an acidic pH environment within the endosome. The shape changes and the molecular assembly structure is not retained. As a result, the target substance carried can be released ((c) in the figure). According to a preferred embodiment of the present invention, this release behavior can also act on endosomes, thereby disrupting the endosomal membrane and releasing the target substance to the cytoplasm side. As a result, the target substance can be efficiently delivered into the nucleus.
Thus, in the first embodiment, the target substance carried on the pH-responsive molecular assembly when the pH of the aqueous dispersion medium of the pH-responsive molecular assembly changes from a physiological value to an acidic value. Can be released. In general, when a foreign substance is introduced into a cell through a pathway called endocytosis, it is fused with a lysosome containing a degrading enzyme called lysosome and digested. On the other hand, in the present invention, the target substance can be efficiently delivered into the cell or nucleus while supporting the target substance on the molecular assembly to avoid degradation by lysosomes. FIG. 13 shows an example of the first embodiment of the present invention. The shape of the pH-responsive molecular assembly, the loading method of the target substance, the release behavior of the target substance, and the like are not limited to those in FIG. .
本発明のpH応答性分子集合体において、「分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる」とは、pH応答性分子集合体が分散している水性媒体のpHが生理条件よりも低pHになることをいう。pHの生理的な値は、好ましくはpH 7.0〜8.0であり、より好ましくは7.2〜7.6であり、さらに好ましくは7.3〜7.5である。また、pHの酸性の値は、好ましくはpH 6.5以下であり、より好ましくは6.0以下であり、さらに好ましくは5.5以下である。 In the pH-responsive molecular assembly of the present invention, “the pH of the dispersed aqueous medium is changed from a physiological value to an acidic value” means that the pH of the aqueous medium in which the pH-responsive molecular assembly is dispersed is physiological conditions. Means a lower pH. The physiological value of pH is preferably pH 7.0 to 8.0, more preferably 7.2 to 7.6, and further preferably 7.3 to 7.5. The acidic value of pH is preferably pH 6.5 or less, more preferably 6.0 or less, and even more preferably 5.5 or less.
本発明のpH応答性分子集合体に用いられる両イオン性脂質は、式（I）
式（I）中、m、nはそれぞれ独立して2または3であることが好ましい。また、Raは一つがNH3 +であり、その他のRaは全て水素原子であるが、末端カルボキシル基から数えて3番目または4番目の炭素のRaがNH3 +であり、その他のRaが水素原子であることが好ましい。より具体的には、式（I）中、mが3であり、nが3であり、末端カルボキシル炭素から数えて4番目の炭素のRがNH3 +であり、その他のRがHであるpH応答性分子集合体；mが2あり、nが3であり、末端カルボキシル炭素から数えて3番目の炭素のRがNH3 +であり、その他のRがHであるpH応答性分子集合体；mが3であり、nが2であり、末端カルボキシル炭素から数えて4番目の炭素のRがNH3 +であり、その他のRがHであるpH応答性分子集合体；mが2であり、nが2であり、末端カルボキシル炭素から数えて3番目の炭素のRがNH3 +であり、その他のRがHであるpH応答性分子集合体が好ましく挙げられる。 In the formula (I), m and n are preferably each independently 2 or 3. One Ra is NH 3 + and the other Ra are all hydrogen atoms, but the third or fourth carbon Ra from the terminal carboxyl group is NH 3 + and the other Ra is hydrogen. An atom is preferred. More specifically, in the formula (I), m is 3, n is 3, R of the fourth carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and the other R is H. pH-responsive molecular assembly; pH-responsive molecular assembly in which m is 2, n is 3, R of the third carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and other R is H A pH-responsive molecular assembly in which m is 3, n is 2, the R of the fourth carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and the other R is H; Preferred is a pH-responsive molecular assembly in which n is 2, R of the third carbon counted from the terminal carboxyl carbon is NH 3 + , and other R is H.
RbおよびRcは、それぞれ独立して、炭素数8〜22の鎖状炭化水素基である。「鎖状炭化水素基」は共有結合にて導入できる疎水性の基であれば特に限定されない。鎖状炭化水素基は、直鎖または分岐鎖のいずれであってもよく、直鎖であることが好ましい。また、鎖状炭化水素基は、アルキル鎖、アルケニル鎖、アルキニル鎖、イソプレノイド鎖、ビニル基、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、およびメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。鎖状炭化水素基の炭素数は、好ましくは12〜20であり、より好ましくは14〜18である。また、鎖状炭化水素基は二重結合や三重結合などの不飽和結合を有していても良く、その場合にその数は1〜4であることが好ましい。これらの中でも、RbおよびRcとしては、直鎖または分岐鎖の炭素数12〜20のアルキル基であることが好ましく、直鎖の炭素数14〜18のアルキル基であることが特に好ましい。 Rb and Rc are each independently a chain hydrocarbon group having 8 to 22 carbon atoms. The “chain hydrocarbon group” is not particularly limited as long as it is a hydrophobic group that can be introduced by a covalent bond. The chain hydrocarbon group may be linear or branched, and is preferably linear. The chain hydrocarbon group may have a substituent selected from the group consisting of an alkyl chain, an alkenyl chain, an alkynyl chain, an isoprenoid chain, a vinyl group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, and a mercapto group. Good. The carbon number of the chain hydrocarbon group is preferably 12-20, more preferably 14-18. The chain hydrocarbon group may have an unsaturated bond such as a double bond or a triple bond, and in that case, the number is preferably 1 to 4. Among these, as Rb and Rc, a linear or branched alkyl group having 12 to 20 carbon atoms is preferable, and a linear alkyl group having 14 to 18 carbon atoms is particularly preferable.
また、本発明のpH応答性分子集合体に用いられる両イオン性脂質として、式（I）で表される両イオン性脂質の中でも特に式（II）
このような式（I）または（II）で表される化合物は、特開2003-64037号公報に記載の方法またはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、次のように製造することができる。
まず、式（A）で表されるアミノ酸と長鎖アルコール（Rb-OH、Rc-OH）とを反応させて式（B）で表されるアミノ酸の長鎖アルキルエステルを合成する。この反応は、酸触媒による脱水縮合、活性エステル法、酸無水物法、混合酸無水物法等を用いて行うことができる。中でも、酸触媒による脱水縮合が最も簡便であり、精製も容易であるので好ましい。脱水縮合反応は常法に従い行うことができる。但し、酸触媒による脱水縮合では加熱を必要とするため、原料が加熱に対して不安定な場合は、他の方法を選択することが望ましい。 First, the amino acid represented by the formula (A) is reacted with a long-chain alcohol (Rb-OH, Rc-OH) to synthesize a long-chain alkyl ester of the amino acid represented by the formula (B). This reaction can be performed using an acid catalyst dehydration condensation, an active ester method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, or the like. Among these, dehydration condensation using an acid catalyst is most convenient and is preferable because it can be easily purified. The dehydration condensation reaction can be performed according to a conventional method. However, since dehydration condensation with an acid catalyst requires heating, it is desirable to select another method when the raw material is unstable with respect to heating.
次に、式（C）で表されるアミノ酸のアミノ基と一方のカルボキシル基を常法により保護し、これを式（B）で表されるアミノ酸の長鎖アルキルエステルと反応（アミド結合生成反応）させる。そして、得られた化合物のアミノ基およびカルボキシル基の保護基を除去することによって、式（I）で示される両イオン性脂質を得ることができる。この反応は、活性エステル法、酸無水物法、混合酸無水物法等を用いて行うことができる。また、通常のペプチド合成と同様の方法で固相合成を行うこともできる。 Next, the amino group and one carboxyl group of the amino acid represented by the formula (C) are protected by a conventional method, and this is reacted with the long-chain alkyl ester of the amino acid represented by the formula (B) (amide bond formation reaction). ) And the zwitterionic lipid shown by Formula (I) can be obtained by removing the protecting group of the amino group and carboxyl group of the obtained compound. This reaction can be performed using an active ester method, an acid anhydride method, a mixed acid anhydride method, or the like. Solid phase synthesis can also be performed by the same method as ordinary peptide synthesis.
なお、RbとRcが異なる鎖状炭化水素である場合は、アミノ酸の側鎖のカルボキシル基をt-ブチルエステル基で保護した化合物（E）と長鎖アルコール(Rb-OH)とを反応させ脱水縮合反応により化合物（F）を得ることができる。この化合物をTFA(トリフルオロ酢酸)に溶解させ、化合物（G）を得る。化合物（G）と長鎖アルコール(Rc-OH)を脱水縮合反応により結合し、アルキル鎖長の異なる化合物（H）を得ることができる。次に化合物（H）からは、RbとRcが同じである場合と同様に化合物（C）を結合し、脱保護後に、RbとRcが異なる式（I）で表される化合物（すなわち、式（II）で表される化合物）を得ることができる。
なお、合成された両イオン性脂質の精製方法は特に限定されない。本発明においては溶媒に対する溶解度の差を利用して行うことができるが、さらに必要に応じてカラム精製を行ってもよい。 The method for purifying the synthesized zwitterionic lipid is not particularly limited. In the present invention, it can be carried out utilizing the difference in solubility in a solvent, but further column purification may be carried out if necessary.
本発明のpH応答性分子集合体に含有される式（I）で表される両イオン性脂質は1種単独でも2種以上を組み合わせて使用することもできる。式（I）で表される両イオン性脂質の含有量は、pH応答性分子集合体の構成成分の合計モル数に対して、10〜100モル％であることが好ましく、より好ましくは20〜80％、さらに好ましくは30〜60％である。式（I）で表される両イオン性脂質の含有量が高いほど、pH応答性分子集合体が担持している物質の放出速度および放出率を高めることができる。式（I）で表される両イオン性脂質の含有量は、薬物などの目的物質を導入したい部位や所望の放出率または放出速度などに応じて適宜調整することができる。 The zwitterionic lipid represented by the formula (I) contained in the pH-responsive molecular assembly of the present invention can be used singly or in combination of two or more. The content of the zwitterionic lipid represented by the formula (I) is preferably 10 to 100 mol%, more preferably 20 to 100 mol%, based on the total number of moles of the components of the pH-responsive molecular assembly. 80%, more preferably 30-60%. The higher the content of the zwitterionic lipid represented by the formula (I), the higher the release rate and release rate of the substance carried by the pH-responsive molecular assembly. The content of the zwitterionic lipid represented by the formula (I) can be appropriately adjusted according to a site where a target substance such as a drug is to be introduced, a desired release rate or a release rate.
また本発明のpH応答性分子集合体は、構成成分としてステロイド類を含むことができる。ステロイド類としては、ステロール、胆汁酸、プロビタミンＤ、ステロイドホルモンなど、ペルヒドロシクロペンタノフェナントレンを有する全てのステロイドが挙げられる。中でもステロール類を用いることが好ましい。ステロール類としては、例えば、エルゴステロール、コレステロール等が挙げられる。中でもコレステロールを用いることが好ましい。
ステロイド類の含有量に制限はないが、式（I）で表される両イオン性脂質に対して合計で20〜200モル%であることが好ましく、より好ましくは40〜100モル%である。ステロイド類は、分子集合体の安定化剤として作用することができ、目的の放出速度および放出率などに応じて適宜調整することができる。これらのステロイド類は1種単独でも2種以上を組み合わせて使用することもできる。
The pH-responsive molecular assembly of the present invention can contain steroids as a constituent component. Examples of steroids include all steroids having perhydrocyclopentanophenanthrene such as sterols, bile acids, provitamin D, steroid hormones and the like. Of these, sterols are preferably used. Examples of sterols include ergosterol and cholesterol. Of these, cholesterol is preferably used.
Although there is no restriction | limiting in content of steroids, it is preferable that it is 20-200 mol% in total with respect to zwitterionic lipid represented by Formula (I), More preferably, it is 40-100 mol%. Steroids can act as a stabilizer for molecular aggregates, and can be appropriately adjusted according to the desired release rate and release rate. These steroids can be used alone or in combination of two or more.
さらに本発明のpH応答性分子集合体は、構成成分として式（I）で表される両イオン性脂質以外の両イオン性脂質、カチオン性脂質、およびアニオン性脂質からなる群から選ばれる少なくとも１種を含むことができる。これらの脂質成分の含有量は特に制限されるものではないが、式（I）で表される両イオン性脂質に対して合計で10〜300モル％であることが好ましく、より好ましくは10〜100モル％である。
式（I）で表される両イオン性脂質以外の両イオン性脂質としては、両親媒性のブロック共重合体または多糖類などの親水性の主鎖に疎水性の置換基を持つくし型高分子、あるいは両親媒性の膜タンパク質などが挙げられる。両イオン性脂質を含有させることにより、脂質二分子膜などの分子集合体構造を安定に保たせ、生理pH下でこの集合体の表面電荷を中性にすることができる。
また、カチオン性脂質としては、DOTAP、DMRIEなどが挙げられる。カチオン性脂質を含有させることにより、核酸（任意のDNAおよびRNA）などの目的物質の核内への送達能、つまり核酸導入能を付与することができる。例えば遺伝子などの目的物質を担持している場合には、遺伝子導入能を付与することができる。
アニオン性脂質としては、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、脂肪酸、カルボン酸型脂質、アニオン性アミノ酸型脂質などが挙げられる。アニオン性脂質を含有させることにより分子集合体の凝集が抑制され、目的物質の内包効率を増大させることができる。
これらの脂質は1種単独でも2種以上を組み合わせて使用することもできる。
Furthermore, the pH-responsive molecular assembly of the present invention is at least one selected from the group consisting of zwitterionic lipids other than zwitterionic lipids represented by formula (I), cationic lipids, and anionic lipids as a constituent component. Species can be included. The content of these lipid components is not particularly limited, but is preferably 10 to 300 mol% in total with respect to the zwitterionic lipid represented by the formula (I), more preferably 10 to 100 mol%.
Examples of zwitterionic lipids other than the zwitterionic lipid represented by the formula (I) include an amphiphilic block copolymer or a comb-type polymer having a hydrophobic substituent in a hydrophilic main chain such as a polysaccharide. Examples include molecules or amphiphilic membrane proteins. By containing the zwitterionic lipid, the molecular assembly structure such as a lipid bilayer can be kept stable, and the surface charge of this assembly can be neutralized at physiological pH.
Examples of cationic lipids include DOTAP and DMRIE. By containing a cationic lipid, the ability to deliver a target substance such as a nucleic acid (arbitrary DNA and RNA) into the nucleus, that is, the ability to introduce a nucleic acid can be imparted. For example, when a target substance such as a gene is carried, gene introduction ability can be imparted.
Examples of the anionic lipid include diacylphosphatidylglycerol, diacylphosphatidic acid, diacylphosphatidylinositol, diacylphosphatidylserine, fatty acid, carboxylic acid type lipid, anionic amino acid type lipid and the like. By containing the anionic lipid, aggregation of the molecular assembly is suppressed, and the encapsulation efficiency of the target substance can be increased.
These lipids can be used alone or in combination of two or more.
さらに本発明のpH応答性分子集合体には、ポリエチレングリコール型脂質を含有することもできる。ポリエチレングリコール型脂質を構成成分として用いることにより、分子集合体の凝集が抑制され、生体内に投与された後の血中滞留時間を増大させることができる。ポリエチレングリコール型脂質は1種単独でも2種以上を組み合わせて使用することもできる。
その他、本発明のpH応答性分子集合体は、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、多種の糖脂質など分子集合体の構成成分として知られているリン脂質を1種または2種以上含有することができる。
Furthermore, the pH-responsive molecular assembly of the present invention may contain a polyethylene glycol type lipid. By using a polyethylene glycol type lipid as a constituent component, aggregation of the molecular assembly is suppressed, and the residence time in blood after administration into the living body can be increased. Polyethylene glycol type lipids can be used singly or in combination of two or more.
In addition, the pH-responsive molecular assembly of the present invention comprises egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated egg yolk lecithin, hydrogenated soybean lecithin, diacylphosphatidylcholine, diacylphosphatidylethanolamine, sphingomyelin, and various glycolipids. One or more phospholipids known as components can be contained.
第１の態様において、pH応答性分子集合体は目的物質を担持している。ここで「分子集合体が目的物質を担持している」とは、分子集合体内部の親水領域あるいは脂質二分子膜内または分子膜の外側表面に目的物質が相互作用している状態のことをいう。例えば、(i)水溶性の目的物質、(ii)水溶性もしくは疎水性の目的物質が親水性分子により包括されている分子集合体、または (iii) 水溶性もしくは疎水性の目的物質が親水性高分子により包括されている複合体が二分子膜内部にある内水相に局在する場合、あるいは疎水性の目的物質が二分子膜内の疎水領域に局在する場合または二分子膜の外側表面に局在する場合などが挙げられる。
目的物質としては、本発明のpH応答性分子集合体に担持することができるものであれば特に限定されないが、少なくとも標的となる臓器または組織の一つに作用するものであることが好ましい。例えば、薬物、プローブ、核酸（任意のDNA、RNA、siRNA などを含む）、およびタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。本態様においてpH応答性分子集合体に担持されていたこれらの物質は、細胞内のエンドソーム内に放出され、さらには細胞質内に放出され、これにより、目的物質を効率良く細胞内に送達することができる。本発明のpH応答性分子集合体に担持させる目的物質の分子量は、通常100〜1,000,000であり、200〜500,000が好ましく、300〜100,000がより好ましい。
In the first embodiment, the pH-responsive molecular assembly carries a target substance. Here, “the molecular assembly carries the target substance” means a state in which the target substance interacts with the hydrophilic region inside the molecular assembly, the lipid bilayer membrane or the outer surface of the molecular membrane. Say. For example, (i) a water-soluble target substance, (ii) a molecular assembly in which the water-soluble or hydrophobic target substance is covered by hydrophilic molecules, or (iii) a water-soluble or hydrophobic target substance is hydrophilic. When the complex encapsulated by the polymer is localized in the inner aqueous phase inside the bilayer membrane, or when the hydrophobic target substance is localized in the hydrophobic region in the bilayer membrane or outside the bilayer membrane The case where it localizes on the surface etc. is mentioned.
The target substance is not particularly limited as long as it can be supported on the pH-responsive molecular assembly of the present invention, but it is preferable that it acts on at least one target organ or tissue. For example, it is preferably at least one selected from the group consisting of drugs, probes, nucleic acids (including any DNA, RNA, siRNA, etc.), and proteins. In this embodiment, these substances carried on the pH-responsive molecular assembly are released into endosomes in the cells and further into the cytoplasm, thereby efficiently delivering the target substance into the cells. Can do. The molecular weight of the target substance carried on the pH-responsive molecular assembly of the present invention is usually 100 to 1,000,000, preferably 200 to 500,000, more preferably 300 to 100,000.
本発明のpH応答性分子集合体に担持することができる物質としては、例えば、酵素、ペプチドまたはタンパク質、各種抗生物質、各種ペプチド性ホルモン、DNA、RNA、siRNA、プラスミド、プローブ、各種抗がん剤、中枢神経系用薬、末梢神経用剤、感覚器官用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官および肛門用薬、外皮用薬、歯科口腔用剤、ビタミン剤、滋養強壮薬、血液および体液用薬、人工透析用薬、その他の代謝性医薬品、細胞賦活用剤、腫瘍用薬、放射性医薬品、アレルギー用薬、生薬および漢方処方に基づく医薬品、抗生物質製剤、化学療法剤、生物学的製剤、診断用薬などがある。ペプチドまたはタンパク質の一例としては、インターロイキン等の各種サイトカイン、細胞伝達因子、細胞成長因子、フィブリノーゲン、コラーゲン、ケラチン、プロテオグルカン等細胞外マトリックス剤としてのポリペプチドまたはその構造の一部としてのオリゴ体、あるいはオキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の機能性ポリペプチドが挙げられる。酵素としては、カタラーゼ、キモトリプシン、チトクローム、アミラーゼなどが挙げられるが、これらに何ら限定されるものではない。プローブの一例としては、抗体、抗原、色素、あるいは蛍光色素など諸種の標識体や活性物質が挙げられる。これらの物質は、1種単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いることもできる。 Examples of substances that can be carried on the pH-responsive molecular assembly of the present invention include enzymes, peptides or proteins, various antibiotics, various peptide hormones, DNA, RNA, siRNA, plasmids, probes, and various anti-cancers. Drugs, drugs for central nervous system, drugs for peripheral nerves, drugs for sensory organs, drugs for cardiovascular organs, drugs for respiratory organs, drugs for digestive organs, hormonal drugs, urogenital and anal drugs, drugs for skin, dental and oral cavity Drugs, vitamins, nourishing tonics, blood and body fluids, artificial dialysis drugs, other metabolic drugs, cell stimulants, oncology drugs, radiopharmaceuticals, allergic drugs, herbal medicines and medicines based on Kampo prescriptions , Antibiotics, chemotherapeutics, biologicals, diagnostics. Examples of peptides or proteins include various cytokines such as interleukins, cell transmission factors, cell growth factors, fibrinogen, collagen, keratin, proteoglucan, etc., polypeptides as extracellular matrix agents or oligo bodies as part of their structures Or functional polypeptides such as oxytocin, bradykinin, thyrotropin releasing factor, enkephalin, and the like. Examples of the enzyme include catalase, chymotrypsin, cytochrome, amylase and the like, but are not limited thereto. Examples of probes include various types of labels and active substances such as antibodies, antigens, dyes, and fluorescent dyes. These substances may be used alone or in combination of two or more.
本発明のpH応答性分子集合体に担持される目的物質の含有量は、目的物質の種類または目的等に応じて適宜決定することができるが、pH応答性分子集合体の構成成分の全重量に対して0.001〜1000重量％が好ましく、0.01〜200重量％がより好ましく、0.1〜50重量％がさらに好ましい。 The content of the target substance supported on the pH-responsive molecular assembly of the present invention can be appropriately determined according to the type or purpose of the target substance, but the total weight of the components of the pH-responsive molecular assembly 0.001 to 1000% by weight is preferable, 0.01 to 200% by weight is more preferable, and 0.1 to 50% by weight is more preferable.
本発明のpH応答性分子集合体の形状は、例えば、高分子集合体、高分子ミセル、エマルジョン、リピドマイクロフィア、二分子膜小胞体（リポソーム）、その他の分子集合体（チューブ、ファイバー、リボン、シート等）などが挙げられる。中でも、二分子膜小胞体であることが好ましい。
本発明のpH応答性分子集合体が二分子膜小胞体である場合、二分子膜小胞体を水性媒体中に分散させると、二分子膜小胞体は内水相を含むことができる。このとき、分子集合体に担持されている物質は二分子膜小胞体の内水相に溶解または分散しているものであることが好ましい。あるいは、二分子膜の疎水性領域内に目的物質を担持させるなど、担持されている物質が二分子膜内に局在したものであることが好ましい。
なお、pH応答性分子集合体の構成成分の含有量を規定する場合、内水相は考慮しないこととする。
The shape of the pH-responsive molecular assembly of the present invention is, for example, a polymer assembly, polymer micelle, emulsion, lipid microsphere, bilayer vesicle (liposome), or other molecular assembly (tube, fiber, ribbon) , Sheet, etc.). Among these, a bilayer vesicle is preferable.
When the pH-responsive molecular assembly of the present invention is a bilayer vesicle, when the bilayer vesicle is dispersed in an aqueous medium, the bilayer vesicle can include an inner aqueous phase. At this time, it is preferable that the substance supported on the molecular assembly is dissolved or dispersed in the inner aqueous phase of the bilayer vesicle. Alternatively, it is preferable that the supported substance is localized in the bilayer membrane, for example, by supporting the target substance in the hydrophobic region of the bilayer membrane.
Note that the internal aqueous phase is not considered when the content of the constituent components of the pH-responsive molecular assembly is specified.
本発明のpH応答性分子集合体の粒径は、50〜1000 nmが好ましく、100〜500 nmがより好ましく、150〜300 nmがさらに好ましい。 The particle size of the pH-responsive molecular assembly of the present invention is preferably 50 to 1000 nm, more preferably 100 to 500 nm, and even more preferably 150 to 300 nm.
分子集合体の製造方法は特に限定されるものではなく、公知の方法に準じて製造することができる。例えば、リポソームの製造の手法としては、単独または混合脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、高圧押出し（エクストルージョン）法、超音波照射法、撹拌（ボルテックスミキシング、ホモジナイザー）法、高速攪拌法、フレンチプレス法、凍結融解法、マイクロフルイダイザー法などで製造する方法、単独または混合脂質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、エタノールまたはエーテルなどの有機溶媒を減圧または透析で除去して形成する方法、あるいは、単独または混合脂質をコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、Triton X、オクチルグリコシドまたはラウリルエーテルなどの非イオン性界面活性剤と共に水相に分散させてエマルジョンを形成させ、透析によって除去して形成する方法、その他、逆相蒸発法、インキュベーション法などを採用することができる。 The method for producing the molecular assembly is not particularly limited, and can be produced according to a known method. For example, liposome production methods include hydration and dispersion of single or mixed lipid powders or thin films, followed by high-pressure extrusion (extrusion), ultrasonic irradiation, stirring (vortex mixing, homogenizer), high speed A method of manufacturing by a stirring method, a French press method, a freeze-thaw method, a microfluidizer method, or a solution obtained by dissolving a single or mixed lipid in an organic solvent is injected into an aqueous phase, and then an organic solvent such as ethanol or ether is reduced in pressure. Or by dialysis removal or by dispersing a single or mixed lipid in an aqueous phase with a nonionic surfactant such as sodium cholate, sodium dodecyl sulfate, Triton X, octyl glycoside or lauryl ether. Forming and removing by dialysis, the other way around Evaporation, can be employed as the incubation method.
分子集合体に目的物質を担持させる方法は、担持させようとする物質の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば目的物質が水溶性薬物の場合には、分子集合体製造時に薬物を水相に溶解させて調製することができる。内包されなかった水溶性薬物はゲルろ過、超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離できる。脂溶性薬物の場合には、単独または混合脂質が有機溶媒に溶けている状態で薬物を混合して、上述した方法で分子集合体を形成させることにより、例えば二分子膜小胞体の疎水部に目的物質を担持させることができる。プローブ、核酸、タンパク質などの場合は同様の方法で分子集合体に目的物質を担持させるか、あるいは二分子膜小胞体の外側表面上に目的物質を局在させることができる。 The method for supporting the target substance on the molecular assembly may be appropriately selected according to the type of the substance to be supported. For example, when the target substance is a water-soluble drug, it can be prepared by dissolving the drug in the aqueous phase when the molecular assembly is produced. The water-soluble drug not encapsulated can be separated from the encapsulated endoplasmic reticulum by gel filtration, ultracentrifugation or ultrafiltration membrane treatment. In the case of a fat-soluble drug, the drug is mixed in a state where a single or mixed lipid is dissolved in an organic solvent, and a molecular assembly is formed by the above-described method, for example, in the hydrophobic part of the bilayer vesicle. The target substance can be supported. In the case of a probe, nucleic acid, protein, etc., the target substance can be supported on the molecular assembly by the same method, or the target substance can be localized on the outer surface of the bilayer vesicle.
第１の態様の好ましい例によれば、pH応答性分子集合体は、細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれた際に、エンドソーム内の酸性pHによって前記集合体が担持している物質をエンドソーム内に放出し、さらにエンドソーム内に放出された物質の細胞質への放出を促すことができる。 According to a preferred example of the first aspect, when the pH-responsive molecular assembly is taken up into the cell by endocytosis, the substance carried by the assembly in the endosome due to the acidic pH in the endosome is contained in the endosome. In addition, the release of the substance released into the endosome into the cytoplasm can be promoted.
なお、第１の態様のpH応答性分子集合体は、自己の放出挙動によって別の分子集合体が担持している物質の放出を促すこともできる。「別の分子集合体」については、後述する第２の態様において詳しく述べる。 The pH-responsive molecular assembly of the first aspect can also promote the release of a substance carried by another molecular assembly by its own release behavior. “Another molecular assembly” will be described in detail in the second embodiment to be described later.
（第２の態様）
次に、第２の態様のpH応答性分子集合体について述べる。
第２の態様のpH応答性分子集合体は、
式（I）
で表される両イオン性脂質を含む分子集合体であって、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、別の分子集合体に担持されている目的物質の放出を促すことができるものである。
(Second aspect)
Next, the pH-responsive molecular assembly of the second embodiment will be described.
The pH-responsive molecular assembly of the second aspect is
Formula (I)
Release of the target substance carried by another molecular assembly when the pH of the aqueous dispersion medium changes from a physiological value to an acidic value. Can be encouraged.
第２の態様のpH応答性分子集合体について図１４を参照しながらより具体的に説明する。図14は、第２の態様のpH応答性分子集合体が細胞内に取り込まれる際に、別の分子集合体が担持している目的物質を放出する挙動を示した概念図である。まず、第２の態様において、本発明のpH応答性分子集合体は、目的物質を担持している別の分子集合体と共に生体内に投与される（図中（a））。pH応答性分子集合体は細胞内に取り込まれる前は分散水性媒体の生理的なpH環境下で分子集合体の形状を安定に保持することができる。次に、pH応答性分子集合体と目的物質を担持している別の分子集合体は、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる（図中（b））。エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれたpH応答性分子集合体は、次にエンドソーム内の酸性pH環境下で分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値に変化することによって、分子集合体の形状が変化する。そしてpH応答性分子集合体のこの挙動が別の分子集合体に作用し、別の分子集合体に担持されていた目的物質がエンドソーム内に放出される（図中（c））。本発明の好ましい態様によれば、このpH応答性分子集合体の挙動はエンドソームにも作用することができ、それによってエンドソーム膜を崩壊させ目的物質を細胞質側に放出させることができる。そしてその結果、目的物質を核内に効率良く送達することができる。
このように、第２の態様においては、pH応答性分子集合体が分散している分散水性媒体のpH変化に応答して分子集合体の形状が変化し、それによって別の分子集合体に作用し、別の分子集合体が担持している物質の放出を促すことができる。
なお、図14は本発明の第２の態様の一例を示したものであり、pH応答性分子集合体の形状、目的物質の担持方法、目的物質の放出挙動などは、図14に何ら制限されない。例えば、本態様に用いられるpH応答性分子集合体は、物質を担持していても、担持していなくてもよい。また、本態様において、pH応答性分子集合体は別の分子集合体に作用できる程度に別の分子集合体と共存していればよく、例えば、pH応答性分子集合体が別の分子集合体に担持されていてもよい。例えば、別の分子集合体が小胞体構造を有する場合に、pH応答性分子集合体は、別の分子集合体に内包されていてもよい。別の分子集合体に内包されたpH応答性分子集合体は、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれ、エンドソーム内の酸性pH環境下においてその形状が変化する。そしてその挙動が別の分子集合体に作用し、別の分子集合体に担持されていた目的物質の放出を促すことができる。さらにpH応答性分子集合体はエンドソームにも作用することができ、エンドソームの形状が変化することによって、目的物質を細胞質側に放出することを促すこともできる。
The pH-responsive molecular assembly according to the second embodiment will be described more specifically with reference to FIG. FIG. 14 is a conceptual diagram showing the behavior of releasing a target substance carried by another molecular assembly when the pH-responsive molecular assembly of the second embodiment is taken into a cell. First, in the second embodiment, the pH-responsive molecular assembly of the present invention is administered in vivo together with another molecular assembly carrying a target substance ((a) in the figure). The pH-responsive molecular assembly can stably maintain the shape of the molecular assembly in the physiological pH environment of the dispersed aqueous medium before being taken up into cells. Next, the pH-responsive molecular assembly and another molecular assembly carrying the target substance are taken into the cell by endocytosis ((b) in the figure). The pH-responsive molecular assembly taken up into the cell by endocytosis then undergoes molecular assembly by changing the pH of the dispersed aqueous medium from a physiological value to an acidic value in an acidic pH environment within the endosome. The shape of the body changes. This behavior of the pH-responsive molecular assembly acts on another molecular assembly, and the target substance carried on the other molecular assembly is released into the endosome ((c) in the figure). According to a preferred embodiment of the present invention, the behavior of this pH-responsive molecular assembly can also act on endosomes, thereby disrupting the endosomal membrane and releasing the target substance to the cytoplasm side. As a result, the target substance can be efficiently delivered into the nucleus.
As described above, in the second aspect, the shape of the molecular assembly changes in response to the pH change of the dispersed aqueous medium in which the pH-responsive molecular assembly is dispersed, thereby acting on another molecular assembly. In addition, release of a substance carried by another molecular assembly can be promoted.
FIG. 14 shows an example of the second aspect of the present invention, and the shape of the pH-responsive molecular assembly, the loading method of the target substance, the release behavior of the target substance, etc. are not limited to those in FIG. . For example, the pH-responsive molecular assembly used in this embodiment may or may not carry a substance. In this embodiment, the pH-responsive molecular assembly may coexist with another molecular assembly to the extent that it can act on another molecular assembly. For example, the pH-responsive molecular assembly is different from another molecular assembly. It may be carried on. For example, when another molecular assembly has an endoplasmic reticulum structure, the pH-responsive molecular assembly may be included in another molecular assembly. The pH-responsive molecular assembly encapsulated in another molecular assembly is taken up into the cell by endocytosis, and its shape changes in an acidic pH environment within the endosome. Then, the behavior acts on another molecular assembly, and the release of the target substance carried on the other molecular assembly can be promoted. Furthermore, the pH-responsive molecular assembly can also act on endosomes, and the release of the target substance to the cytoplasm side can be promoted by changing the shape of the endosomes.
なお、本明細書でいう「別の分子集合体」とは、式（I）で表される両イオン性脂質を含まない分子集合体のことをいい、細胞膜または膜構造を有する細胞小器官であってもよい。すなわち、本態様において、pH応答性分子集合体は、あらかじめ細胞内に存在する別の分子集合体に作用することもできる。細胞小器官としては、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ体、分泌顆粒、分泌小胞、リソソーム、ファゴソーム、エンドソーム、ペルオキシソームなどが挙げられる。別の分子集合体に担持されている物質は、第１の態様においてpH応答性分子集合体に担持されている物質として例示したものと同じものが挙げられる。分子集合体に目的物質を担持させる方法も、第１の態様のpH応答性分子集合体において述べたものと同様である。 As used herein, “another molecular assembly” refers to a molecular assembly that does not contain the zwitterionic lipid represented by formula (I), and is a cell membrane or a cell organelle having a membrane structure. There may be. That is, in this embodiment, the pH-responsive molecular assembly can act on another molecular assembly that exists in the cell in advance. Examples of organelles include endoplasmic reticulum, mitochondria, Golgi apparatus, secretory granules, secretory vesicles, lysosomes, phagosomes, endosomes, peroxisomes and the like. Examples of the substance carried on another molecular assembly include the same substances as those exemplified as the substance carried on the pH-responsive molecular assembly in the first embodiment. The method for supporting the target substance on the molecular assembly is the same as that described in the pH-responsive molecular assembly of the first embodiment.
第２の態様に用いられる式（I）で表される両イオン性脂質は、第１の態様で述べたとおりであり、その他の構成成分や各成分の含有量も第１の態様で述べたものと同じである。また、第２の態様のpH応答性分子集合体がpH応答性を示すことができる分散水性媒体のpHの生理的な値、酸性の値も第１の態様で述べたものと同じ範囲であり、目的患部または所望の放出率、放出速度などに応じて適宜調整することができる。 The zwitterionic lipid represented by the formula (I) used in the second aspect is as described in the first aspect, and the contents of other components and components are also described in the first aspect. Is the same. In addition, the physiological and acidic values of the pH of the aqueous dispersion medium in which the pH-responsive molecular assembly of the second aspect can exhibit pH responsiveness are in the same range as described in the first aspect. Depending on the target affected area or the desired release rate, release rate, etc.
第２の態様の好ましい例によれば、pH応答性分子集合体は、目的物質を担持している別の分子集合体と共に細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれた際に、エンドソーム内の酸性pHによって別の分子集合体が担持している物質のエンドソーム内への放出を促し、さらにエンドソーム内に放出された物質の細胞質への放出を促すことができる。 According to a preferred example of the second aspect, when the pH-responsive molecular assembly is taken up into the cell by endocytosis together with another molecular assembly carrying the target substance, the acidic pH in the endosome. Thus, it is possible to promote the release of a substance carried by another molecular assembly into the endosome, and further promote the release of the substance released into the endosome into the cytoplasm.
［２］pH応答性分子集合体組成物
次に本発明のpH応答性分子集合体組成物について説明する。
本発明のpH応答性分子集合体組成物は、前述したpH応答性分子集合体を含むものであれば特に限定されない。
例えば、本発明のpH応答性分子集合体組成物は、本発明のpH応答性分子集合体と、目的物質を担持している別の分子集合体とを含むものであることが好ましい。ここで、本発明のpH応答性分子集合体は、薬物等の物質を担持していてもよく、担持していなくてもよい。また、別の分子集合体とは、式（I）で表される両イオン性脂質を含まない分子集合体であって、この分子集合体に薬物などの物質を担持したものであれば特に限定されない。
このようなpH応答性分子集合体組成物は、例えば生体内に投与された場合に、目的患部に到達するまでは別の分子集合体によって薬物などの目的物質が安定に保持されている。そして、目的患部に到達した際に組成物はエンドサイトーシスによって細胞内のエンドソーム内に取り込まれる。取り込まれた組成物はエンドソーム内の酸性pH環境下で組成物中のpH応答性分子集合体の形状が変化する。そして、それが別の分子集合体に作用し、別の分子集合体が担持している物質を放出させることができる。こうして本発明の組成物は、薬物等の目的物質を目的の患部に効率的に送達することができる。
[2] pH-responsive molecular assembly composition Next, the pH-responsive molecular assembly composition of the present invention will be described.
The pH-responsive molecular assembly composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains the aforementioned pH-responsive molecular assembly.
For example, the pH-responsive molecular assembly composition of the present invention preferably includes the pH-responsive molecular assembly of the present invention and another molecular assembly carrying a target substance. Here, the pH-responsive molecular assembly of the present invention may or may not carry a substance such as a drug. Another molecular assembly is a molecular assembly that does not contain the zwitterionic lipid represented by the formula (I), and is particularly limited as long as the molecular assembly carries a substance such as a drug. Not.
In such a pH-responsive molecular assembly composition, for example, when administered in vivo, a target substance such as a drug is stably held by another molecular assembly until the target affected area is reached. When the target affected area is reached, the composition is taken up into endosomes in the cells by endocytosis. The incorporated composition changes the shape of the pH-responsive molecular assembly in the composition under an acidic pH environment within the endosome. Then, it acts on another molecular assembly, and the substance carried by the other molecular assembly can be released. Thus, the composition of the present invention can efficiently deliver a target substance such as a drug to a target affected area.
さらに、本発明のpH応答性分子集合体が別の分子集合体に担持されており、pH応答性分子集合体の分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、pH応答性分子集合体または別の集合体に担持されている物質を放出するものであることも好ましい。例えばpH応答性分子集合体が別の分子集合体である二分子膜小胞体の内水相に内包されたものであり、当該内水相には目的物質も内包されており、当該内水相のpHが低下した際にpH応答性分子集合体がそれを包み込んでいる小胞体の二分子膜に作用し、内水相に内包されていた目的物質を放出させることができる。これにより、当該物質を目的患部まで効率良く送達することができる。 Furthermore, when the pH-responsive molecular assembly of the present invention is supported on another molecular assembly, and the pH of the aqueous dispersion medium of the pH-responsive molecular assembly is changed from a physiological value to an acidic value, the pH It is also preferable to release the substance carried on the responsive molecular assembly or another assembly. For example, a pH-responsive molecular assembly is encapsulated in an inner aqueous phase of a bilayer vesicle that is another molecular assembly, and the target substance is also included in the inner aqueous phase. When the pH decreases, the pH-responsive molecular assembly acts on the bilayer membrane of the endoplasmic reticulum enclosing it, and the target substance encapsulated in the inner aqueous phase can be released. Thereby, the said substance can be efficiently delivered to the target affected part.
本発明のpH応答性分子集合体組成物において、本発明のpH応答性分子集合体の含有量は、特に制限されるものではないが、別の分子集合体の全重量に対し、5〜500重量％が好ましく、20〜300重量％がより好ましく、50〜150重量％がさらに好ましい。
本発明のpH応答性分子集合体組成物は、さらに水性媒体を含有させて分子集合体の分散液とすることもできる。分散液中のpH応答性分子集合体および別の分子集合体の濃度は、これらの分子集合体の構成脂質成分の合計含有量が、分散液の全重量に対し、0.01〜20重量％の範囲であることが好ましく、0.05〜15重量％がより好ましく、0.1〜10重量％がさらに好ましい。分散液中のpH応答性分子集合体と別の分子集合体の含有量比は、pH応答性分子集合体の含有量が、別の分子集合体の含有量に対し、5〜500重量％の範囲になるように調整されることが好ましく、20〜300重量％がより好ましく、50〜150重量％がさらに好ましい。なお、この分散液は凍結乾燥状態にして保存することもできる。
In the pH-responsive molecular assembly composition of the present invention, the content of the pH-responsive molecular assembly of the present invention is not particularly limited, but is 5 to 500 based on the total weight of another molecular assembly. % By weight is preferred, 20 to 300% by weight is more preferred, and 50 to 150% by weight is even more preferred.
The pH-responsive molecular assembly composition of the present invention may further contain an aqueous medium to form a molecular assembly dispersion. The concentration of the pH-responsive molecular assembly and another molecular assembly in the dispersion is such that the total content of the constituent lipid components of these molecular assemblies is in the range of 0.01 to 20% by weight with respect to the total weight of the dispersion. It is preferably 0.05 to 15% by weight, more preferably 0.1 to 10% by weight. The content ratio of the pH-responsive molecular assembly to another molecular assembly in the dispersion is such that the content of the pH-responsive molecular assembly is 5 to 500% by weight with respect to the content of the other molecular assembly. It is preferable to adjust so that it may become a range, 20 to 300 weight% is more preferable, and 50 to 150 weight% is further more preferable. This dispersion can be stored in a freeze-dried state.
その他、本発明の組成物は、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルエタノールアミン類、ステロイド類、PEG脂質類を含むことができる。ホスファチジルコリン類、ホスファチジルグリセロール類、ホスファチジルエタノールアミン類、ステロイド類、PEG脂質類の含有量は特に制限されるものではないが、pH応答性分子集合体に対し、0〜90重量％が好ましく、0〜70重量％がより好ましく、0〜50重量％がさらに好ましい。 In addition, the composition of the present invention may contain phosphatidylcholines, phosphatidylglycerols, phosphatidylethanolamines, steroids, and PEG lipids. The content of phosphatidylcholines, phosphatidylglycerols, phosphatidylethanolamines, steroids, and PEG lipids is not particularly limited, but is preferably 0 to 90% by weight based on the pH-responsive molecular assembly, 70% by weight is more preferable, and 0 to 50% by weight is more preferable.
［３］pH応答性分子集合体の用途
本発明のpH応答性分子集合体は、低毒性とされるアミノ酸型脂質を膜構成成分としているので生体適合性が高く、生体内の目的患部に目的物質を効率良く送達することができる。
[3] Use of pH-responsive molecular assembly The pH-responsive molecular assembly of the present invention has a high biocompatibility because it uses an amino acid-type lipid, which is considered to be low toxicity, as a membrane component, and can be used as a target affected part in vivo. The substance can be delivered efficiently.
例えば、本発明のpH応答性分子集合体に薬物を担持させた場合、本発明のpH応答性分子集合体は薬剤として使用することができる。薬物の含有量は薬物の種類または目的に応じて適宜決定することができるが、pH応答性分子集合体の構成成分の全重量に対して0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜100重量%がより好ましく、0.1〜10重量%がさらに好ましい。本発明の薬剤の投与方法は特に限定されない。本発明の薬剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由さらには疾患部位に対して直接投与することができる。薬剤の投与量は、有効量の範囲内であれば良く、対象疾患、投与対象、投与方法、症状などによっても異なるが、通常、体重1 kg当たり、1日につき、約0.001〜約1400 mg（脂質重量）である。 For example, when a drug is supported on the pH-responsive molecular assembly of the present invention, the pH-responsive molecular assembly of the present invention can be used as a drug. The content of the drug can be appropriately determined according to the type or purpose of the drug, but is preferably 0.001 to 1000% by weight, preferably 0.01 to 100% by weight based on the total weight of the components of the pH-responsive molecular assembly. More preferred is 0.1 to 10% by weight. The method for administering the drug of the present invention is not particularly limited. The agents of the present invention can be administered, for example, orally, parenterally, intravenously, buccally, rectally, vaginally, transdermally, via the nasal route or via inhalation and directly to the diseased site. The dose of the drug may be within the range of the effective dose, and it varies depending on the target disease, administration subject, administration method, symptoms, etc., but is usually about 0.001 to about 1400 mg per kg body weight per day ( Lipid weight).
また、本発明のpH応答性分子集合体にプローブを担持させた場合、本発明のpH応答性分子集合体は試薬として使用することができる。プローブの一例としては、諸種の標識体または活性物質が挙げられる。このうち、生理活性物質（生体に対して作用する物質）は、例えば核酸、タンパク質、その他小分子も含む。例えば、プローブとして蛍光色素を担持させた場合、本発明の試薬は生体内でのリポソームの局在部位を検出する際などに使用することができる。本発明の試薬は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由さらには疾患部位に対して直接生体内に投与することができる。
プローブの含有量は種類または目的に応じて適宜決定することができるが、pH応答性分子集合体の構成成分の全重量に対して0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜100重量%がより好ましく、0.1〜10重量%がさらに好ましい。例えば、本発明のpH応答性分子集合体を含む試薬は、siRNAによる特定遺伝子のノックダウンを促すRNA干渉用試薬等に有用である。
Further, when a probe is supported on the pH-responsive molecular assembly of the present invention, the pH-responsive molecular assembly of the present invention can be used as a reagent. Examples of probes include various types of labeled substances or active substances. Among these, physiologically active substances (substances that act on the living body) include, for example, nucleic acids, proteins, and other small molecules. For example, when a fluorescent dye is supported as a probe, the reagent of the present invention can be used for detecting a localized site of a liposome in a living body. The reagent of the present invention can be administered in vivo directly, for example, orally, parenterally, intravenously, buccally, rectally, vaginally, transdermally, via the nasal route or via inhalation, or directly to the disease site.
The probe content can be appropriately determined according to the type or purpose, but is preferably 0.001 to 1000% by weight, more preferably 0.01 to 100% by weight, based on the total weight of the components of the pH-responsive molecular assembly. 0.1 to 10% by weight is more preferable. For example, the reagent containing the pH-responsive molecular assembly of the present invention is useful as an RNA interference reagent that promotes knockdown of a specific gene by siRNA.
さらに本発明のpH応答性分子集合体に任意の核酸（DNA、RNAなど）を担持させた場合、本発明のpH応答性分子集合体は核酸導入剤として使用することができる。核酸の含有量は、目的に応じて適宜決定することができるが、pH応答性分子集合体の構成成分の全重量に対して0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜100重量%がより好ましく、0.1〜10重量%がさらに好ましい。本発明のpH応答性分子集合体を含む核酸導入剤は、ライソソームによって消化されることなく、細胞内に効率良く目的遺伝子を送達することができるので、例えば遺伝子治療等に有用である。本発明の核酸導入剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由さらには疾患部位に対して直接生体内に投与することができる。 Furthermore, when any nucleic acid (DNA, RNA, etc.) is supported on the pH-responsive molecular assembly of the present invention, the pH-responsive molecular assembly of the present invention can be used as a nucleic acid introduction agent. The content of the nucleic acid can be appropriately determined according to the purpose, but is preferably 0.001 to 1000% by weight, more preferably 0.01 to 100% by weight, based on the total weight of the components of the pH-responsive molecular assembly, 0.1 to 10% by weight is more preferable. Since the nucleic acid introduction agent containing the pH-responsive molecular assembly of the present invention can efficiently deliver a target gene into cells without being digested by lysosomes, it is useful for gene therapy, for example. The nucleic acid transfer agent of the present invention can be administered, for example, orally, parenterally, intravenously, buccally, rectally, vaginally, transdermally, via the nasal route or via inhalation, or directly to the diseased site in vivo.
また、本発明のpH応答性分子集合体にタンパク質を担持させた場合、本発明のpH応答性分子集合体は酵素補充治療用製剤として使用することができる。タンパク質としては、α-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼなどが挙げられる。本発明の酵素補充治療用製剤は、例えば、特定酵素の発現が全くあるいは十分に行われない患者に対して用いることができる。タンパク質の含有量は、種類または目的に応じて適宜決定することができるが、pH応答性分子集合体の構成成分の全重量に対して0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜200重量%がより好ましく、0.1〜50重量%がさらに好ましい。本製剤の投与方法は、特に限定されない。本製剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由で投与することができる。製剤の使用量は、有効量の範囲内であれば良く、対象疾患、投与対象、投与方法、症状などによっても異なるが、通常、体重1 kg当たり、1日につき、約0.001〜約1400 mg（脂質重量）である。 In addition, when a protein is supported on the pH-responsive molecular assembly of the present invention, the pH-responsive molecular assembly of the present invention can be used as a preparation for enzyme replacement therapy. Examples of the protein include α-galactosidase and β-glucosidase. The enzyme-supplemented therapeutic preparation of the present invention can be used, for example, for patients whose specific enzyme is not or not fully expressed. The protein content can be appropriately determined according to the type or purpose, but is preferably 0.001 to 1000% by weight, more preferably 0.01 to 200% by weight, based on the total weight of the components of the pH-responsive molecular assembly. Preferably, 0.1 to 50% by weight is more preferable. The administration method of this formulation is not specifically limited. The formulation can be administered, for example, orally, parenterally, intravenously, buccally, rectally, vaginally, transdermally, via the nasal route or via inhalation. The use amount of the preparation may be within the range of the effective amount, and it varies depending on the target disease, administration subject, administration method, symptoms, etc., but is usually about 0.001 to about 1400 mg per kg body weight per day ( Lipid weight).
さらに、本発明のpH応答性分子集合体は、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、別の分子集合体に担持されている物質の放出を促すpH応答性放出促進剤として用いることもできる。この場合、別の分子集合体は、本発明のpH応答性分子集合体以外の分子集合体であればよく、例えば、細胞膜または膜構造を有する細胞小器官であってもよい。
例えば、本発明のpH応答性放出促進剤は、目的物質を担持している別の分子集合体と共に生体内に投与することによって、あるいは、目的物質を担持している細胞膜または膜構造を有する細胞小器官に投与することによって、分散水性媒体のpH変化によって別の集合体に作用し、その集合体が担持している物質の放出を促すことができる。
本発明のpH応答性放出促進剤の使用量は、目的物質を担持している別の分子集合体の合計量に対して、0.001〜1000重量%が好ましく、0.01〜200重量%がより好ましく、0.1〜50重量%がさらに好ましい。本発明のpH応答性放出促進剤は、例えば、経口、非経口、静脈、口内、直腸、膣、経皮、鼻腔経路経由または吸入経由さらには疾患部位に対して直接生体内に投与することができる。
Furthermore, the pH-responsive molecular assembly of the present invention has a pH-responsive property that promotes the release of a substance carried on another molecular assembly when the pH of the dispersed aqueous medium changes from a physiological value to an acidic value. It can also be used as a release accelerator. In this case, the other molecular assembly may be a molecular assembly other than the pH-responsive molecular assembly of the present invention, and may be, for example, a cell membrane or a cell organelle having a membrane structure.
For example, the pH-responsive release promoter of the present invention is administered to a living body together with another molecular assembly carrying a target substance, or a cell membrane or a membrane structure carrying a target substance. By administering to an organelle, it is possible to act on another assembly by changing the pH of the dispersed aqueous medium and to promote the release of the substance carried by the assembly.
The use amount of the pH-responsive release accelerator of the present invention is preferably 0.001 to 1000% by weight, more preferably 0.01 to 200% by weight, based on the total amount of another molecular assembly carrying the target substance. More preferably, it is 0.1 to 50% by weight. The pH-responsive release enhancer of the present invention can be administered in vivo directly, for example, orally, parenterally, intravenously, buccally, rectally, vaginally, transdermally, via the nasal route or via inhalation, or directly to the disease site. it can.
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited by these.
pH応答性脂質の物理化学的性質 Physicochemical properties of pH-responsive lipids
（参考例）
両イオン性脂質(1)の合成
Synthesis of zwitterionic lipid (1)
L-グルタミン酸(280 mg、1.9 mmol)、p-トルエンスルホン酸一水和物(430 mg、2.4 mmol)を溶媒ベンゼン40 mLに溶解させ、Dean-Stark装置を用いて105℃で生成水を除去しながら1時間還流した。ヘキサデシルアルコール(1.01 g、4.2 mmol)を加え、105℃で生成水を除去しながらさらに14時間還流させた。溶媒を減圧除去した後、残分をクロロホルム30 mLに溶解させ炭酸ナトリウム飽和水溶液30 mLで2回、水30 mLで2回洗浄した。クロロホルム層を回収し、硫酸ナトリウム3 gで脱水後、溶媒を減圧除去した。残分を60℃でメタノール40 mLに溶解させ不溶成分があれば濾過し、4℃で再結晶、濾過後乾燥して白色粉末Glu2C16(A')(674 mg、収率55%)として得た。
さらにアミノ基をブトキシカルボニル(Boc)基にてカルボキシル基をブチルエステル(OBut)基で保護したグルタミン酸Boc-Glu(OtBu)-OH(200 mg、0.66 mmol)をジクロロメタンに溶解し、トリエチルアミン(80.7 mg、0.79 mmol)とジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(162 mg、0.79 mg)を溶解し、4℃で1時間撹拌した後、(A')を470 mg(0.79 mmol)混合し12時間撹拌し、メタノールにて再結晶し(B')を得た。次に(B')をトリフルオロ酢酸30 mLに溶解させ脱保護(4℃、2時間撹拌)後、クロロホルム100 mLを加え炭酸ナトリウム飽和水溶液100 mLで2回、水100 mLで1回洗浄した。クロロホルム層を回収し、硫酸ナトリウム3 gで脱水後、溶媒を減圧除去した。残分を60℃でメタノール40 mLに溶解させ不溶成分があれば濾過し、4℃で再結晶、濾過後乾燥して白色粉末(1)(352 mg、収率72%)として得た。
L-glutamic acid (280 mg, 1.9 mmol) and p-toluenesulfonic acid monohydrate (430 mg, 2.4 mmol) are dissolved in 40 mL of the solvent benzene, and the generated water is removed at 105 ° C using a Dean-Stark apparatus. The mixture was refluxed for 1 hour. Hexadecyl alcohol (1.01 g, 4.2 mmol) was added, and the mixture was further refluxed at 105 ° C. for 14 hours while removing generated water. After removing the solvent under reduced pressure, the residue was dissolved in 30 mL of chloroform and washed twice with 30 mL of a saturated aqueous solution of sodium carbonate and twice with 30 mL of water. The chloroform layer was collected, dehydrated with 3 g of sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure. Dissolve the residue in 40 mL of methanol at 60 ° C, filter if there are any insoluble components, recrystallize at 4 ° C, filter and dry to obtain white powder Glu2C 16 (A ') (674 mg, 55% yield). It was.
Furthermore, glutamic acid Boc-Glu (O t Bu) -OH (200 mg, 0.66 mmol) in which the amino group is protected with a butoxycarbonyl (Boc) group and the carboxyl group is protected with a butyl ester (OBu t ) group is dissolved in dichloromethane, and triethylamine is dissolved. (80.7 mg, 0.79 mmol) and dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (162 mg, 0.79 mg) were dissolved, stirred at 4 ° C for 1 hour, then mixed with 470 mg (0.79 mmol) of (A ') and stirred for 12 hours. And recrystallized from methanol to obtain (B ′). Next, (B ′) was dissolved in 30 mL of trifluoroacetic acid and deprotected (stirred at 4 ° C. for 2 hours), and then added with 100 mL of chloroform and washed twice with 100 mL of saturated aqueous sodium carbonate and once with 100 mL of water . The chloroform layer was collected, dehydrated with 3 g of sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure. The residue was dissolved in 40 mL of methanol at 60 ° C. and filtered if there were any insoluble components, recrystallized at 4 ° C., filtered and dried to give a white powder (1) (352 mg, yield 72%).
[1] 分子集合体のpH測定
(1) 実験方法
両イオン性脂質(1)10 mgを純水1 mLで2 時間水和し、高圧押出法にて粒径約250 nmの分子集合体を調製した。その小胞体分散液に0.1N-HClで滴下し分散液のpHを測定した。測定結果を図1に示す。
(2) 結果
両イオン性脂質(1)は、pH 9以上で親水部のアミノ基が脱プロトン化(-NH3 +→ -NH2)しカルボキシイオンだけが残りアニオン性脂質になった。一方、約pH 4.5以下で親水部のカルボキシル基がプロトン化(COO- → COOH)するためカチオン性の分子集合体になった。
[1] pH measurement of molecular assembly
(1)
(2) Results In the zwitterionic lipid (1), the amino group in the hydrophilic part was deprotonated (-NH 3 + → -NH 2 ) at pH 9 or higher, and only the carboxy ion remained to become an anionic lipid. On the other hand, the carboxyl group of the hydrophilic portion is protonated at about pH 4.5 or less - becomes (COO → COOH) cation to of molecular assembly.
[2] 分子集合体のζ電位測定
(1) 実験方法
調製した両イオン性脂質分散液（脂質濃度1 mg/mL）のζ電位測定を行った。測定結果を図2に示す。
(2) 結果
両イオン性脂質(1)単独での分子集合体は、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値となる際に、その集合体のζ電位が変化した。pH応答性リポソームは、親水部の電荷の変化により小胞体表面の電位も同様に変化していることが確認できた。pH 7.4で電位がマイナスであるのは、親水部のγ位グルタミン酸がアミノ基よりも表面に突出しているためと思われる。
[2] Zeta potential measurement of molecular assembly
(1) Experimental method The zeta potential of the prepared zwitterionic lipid dispersion (
(2) Results In the molecular assembly of the zwitterionic lipid (1) alone, the ζ potential of the aggregate changed when the pH of the aqueous dispersion medium changed from a physiological value to an acidic value. It was confirmed that the pH-responsive liposome also changed the potential of the endoplasmic reticulum surface due to the change in the charge of the hydrophilic part. The reason why the potential is negative at pH 7.4 seems to be because the γ-position glutamic acid in the hydrophilic portion protrudes from the surface of the amino group.
[3] 分子集合体の粒径測定
(1) 実験方法
両イオン性脂質分散液のpHによる分子集合体の粒径測定を行った。結果を図3に示す。さらには電子顕微鏡よりその分子集合形態の観察を行った。透過型電子顕微鏡は、脂質分散液を銅メッシュグリッドに滴下（脂質濃度1 mg/mL）し、2分静置後に余分な水滴をろ紙で吸い取り、さらにリンタングステン酸ナトリウム水溶液(pH 7.4)を滴下、2分静置後水滴をろ紙で吸い取り、デシケーター中で12時間乾燥させ観察した。走査型電子顕微鏡は、脂質分散液（脂質濃度1 mg/mL）をニトロセルロースフィルター上に滴下後、凍結乾燥し、スパッタコーティングし観察した。図4に分子集合体の電顕写真を示す。
(2) 結果
調製した両イオン性脂質(1)単独の分子集合体(粒径約250 nm)をpHの異なるリン酸緩衝液に添加すると、pHの低下に伴いその粒子径が増大した。
電子顕微鏡観察により両イオン性脂質(1)単独では、図4 (a)のように二分子膜小胞体構造をとっているがpHの低下に伴い図4 (b)のような凝集体が観察された。両イオン性脂質(1)単独の分子集合体は、pH変化に伴う集合形態変化が観察された。
[3] Particle size measurement of molecular assembly
(1) Experimental method The particle size of the molecular assembly was measured by the pH of the amphoteric lipid dispersion. The results are shown in Figure 3. Furthermore, the molecular assembly form was observed with an electron microscope. For the transmission electron microscope, drop the lipid dispersion onto a copper mesh grid (
(2) Results When the prepared zwitterionic lipid (1) single molecular aggregate (particle size: about 250 nm) was added to a phosphate buffer having a different pH, the particle size increased with decreasing pH.
Electron microscopic observation shows that the zwitterionic lipid (1) alone has a bilayer vesicle structure as shown in Fig. 4 (a), but aggregates as shown in Fig. 4 (b) are observed as pH decreases. It was done. In the molecular assembly of the zwitterionic lipid (1) alone, a change in the aggregated form accompanying a change in pH was observed.
両イオン性脂質(1)を膜成分としたリポソームの特性
[1] カルセイン内包リポソームの調製
両イオン性脂質(1) (126 mg、0.173 mmol)、Cholesterol (67 mg、0.173 mmol)、PEG-Glu2C18 (6 mg、1μmol)をt-ブチルアルコールに溶解させ、凍結乾燥し混合脂質を調製した。この混合脂質20 mgを100 mMカルセイン(Mw:622)溶液1 mLで2時間水和し、高圧押出法により粒子径259±96 nmのカルセイン内包リポソームを調製した。未内包カルセインはゲルカラム(sephadex G-75)にて除去した。
両イオン性脂質(1)単独では内水相に低分子化合物を内包することが困難であったが、コレステロール等と混合することで可能となった。但し、高分子量化合物では、両イオン性脂質(1)単独でも内水相に内包させることができる。
Characteristics of liposomes with zwitterionic lipid (1) as membrane components
[1] Preparation of calcein-encapsulated liposomes Zwitterionic lipid (1) (126 mg, 0.173 mmol), Cholesterol (67 mg, 0.173 mmol), PEG-Glu2C 18 (6 mg, 1 μmol) were dissolved in t-butyl alcohol. The mixed lipid was prepared by lyophilization. 20 mg of this mixed lipid was hydrated with 1 mL of a 100 mM calcein (Mw: 622) solution for 2 hours, and calcein-encapsulated liposomes having a particle size of 259 ± 96 nm were prepared by high-pressure extrusion. Unencapsulated calcein was removed with a gel column (sephadex G-75).
The amphoteric lipid (1) alone was difficult to encapsulate the low molecular weight compound in the inner aqueous phase, but it became possible by mixing with cholesterol and the like. However, in the high molecular weight compound, the zwitterionic lipid (1) alone can be included in the inner aqueous phase.
[2] カルセイン放出挙動および放出率
(1) 実験方法
上記[1]で調製したカルセイン内包リポソームをpHの異なる酢酸バッファーに添加しカルセインの放出を測定した。調製したリポソームをpH 3.5、4.5、5.5、6.5、7.4の酢酸緩衝液に添加し、10分後にそれぞれpH 7.4に戻し蛍光測定を行った。リポソームからカルセインの放出率は以下の式を用いて算出した。リポソームからの測定結果を図5に示す。
(1) Experimental Method Calcein-encapsulated liposomes prepared in [1] above were added to acetate buffers having different pHs, and calcein release was measured. The prepared liposomes were added to an acetate buffer solution of pH 3.5, 4.5, 5.5, 6.5, and 7.4, and after 10 minutes, the pH was returned to pH 7.4 for fluorescence measurement. The release rate of calcein from the liposome was calculated using the following formula. The measurement results from the liposome are shown in FIG.
(2) 結果
リポソーム膜成分として両イオン性脂質(1)の他にステロイド類が50 mol%含まれても両イオン性脂質のpH応答性は維持され、低pHにおいて内包物を放出することができた。生理的pH 7.4では内包カルセインのリポソームからの放出はないが、酸性pHではカルセイン放出がドラスチックに起こることが示された。
(2) Results Even when 50 mol% of steroids are contained in the liposome membrane component in addition to zwitterionic lipid (1), the pH responsiveness of zwitterionic lipid is maintained, and inclusions can be released at low pH. did it. At physiological pH 7.4, no encapsulated calcein was released from the liposomes, but at acidic pH it was shown that calcein release occurs drastically.
[3] コレステロールを含む小胞体の調製および小胞体のζ電位測定
(1) 実験方法
両イオン性脂質(1) (126 mg、0.173 mmol)、cholesterol (67 mg、0.173 mmol)、PEG-Glu2C18 (6 mg、1μmol)の混合脂質を酢酸緩衝液(pH7.4)で2時間水和し、その後高圧押出法にて粒径249±87 nmの小胞体を調製した。調製した小胞体（脂質濃度1 mg/mL）の各pHにおけるζ電位を測定した。測定結果を図6に示す。
(2) 結果
両イオン性脂質単独の電位変化は膜成分にコレステロールを混合した小胞体の形態にしても維持されていた。このことによりこの小胞体は両イオン性脂質のpH応答性を保持したまま内水相に薬物等を内包し、低pHで内包物を放出することが可能な運搬体であることが明らかとなった。
[3] Preparation of endoplasmic reticulum containing cholesterol and measurement of zeta potential of endoplasmic reticulum
(1) Experimental method A mixed lipid of zwitterionic lipid (1) (126 mg, 0.173 mmol), cholesterol (67 mg, 0.173 mmol), PEG-Glu2C 18 (6 mg, 1 μmol) was mixed with acetate buffer (pH 7.4). ) For 2 hours, and then vesicles with a particle size of 249 ± 87 nm were prepared by high pressure extrusion. The zeta potential at each pH of the prepared endoplasmic reticulum (
(2) Results The potential change of the zwitterionic lipid alone was maintained even in the form of endoplasmic reticulum in which cholesterol was mixed with membrane components. This reveals that this endoplasmic reticulum is a carrier capable of encapsulating drugs in the inner aqueous phase while maintaining the pH responsiveness of zwitterionic lipids and releasing the inclusions at a low pH. It was.
[4] カルセイン内包リポソームの調製およびカルセイン放出挙動
両イオン性脂質(1)(178 mg、0.245 mmol)、DPPC(180 mg、0.245 mmol)、Cholesterol(127 mg、0.328 mmol)、PEG-Glu2C18(14 mg、2.4μmol)をt-ブチルアルコールに溶解させ、凍結乾燥し混合脂質を調製した。この混合脂質20 mgを100 mMカルセイン溶液1 mLで2時間水和し、高圧押出法により粒子径305±134 nmのカルセイン内包リポソームを調製した。未内包カルセインはゲルカラム(sephadex G-75)にて除去した。調製したカルセイン内包リポソームをpHの異なる酢酸バッファーに添加しカルセインの放出を測定した。結果を図7に示す。
DPPCなどのリン脂質を混合しても両イオン性脂質(1)のpH応答性は維持され、pHの低下に伴い分子集合体の粒径が大きくなると共に、リポソームに内包されたカルセインの放出量が増大した。
[4] Preparation and calcein release behavior of calcein-encapsulated liposomes Zwitterionic lipid (1) (178 mg, 0.245 mmol), DPPC (180 mg, 0.245 mmol), Cholesterol (127 mg, 0.328 mmol), PEG-Glu2C 18 ( 14 mg, 2.4 μmol) was dissolved in t-butyl alcohol and lyophilized to prepare a mixed lipid. 20 mg of this mixed lipid was hydrated with 1 mL of a 100 mM calcein solution for 2 hours, and calcein-encapsulated liposomes having a particle size of 305 ± 134 nm were prepared by high pressure extrusion. Unencapsulated calcein was removed with a gel column (sephadex G-75). The prepared calcein-encapsulating liposomes were added to acetate buffers having different pHs, and calcein release was measured. The results are shown in FIG.
Even when DPPC or other phospholipids are mixed, the pH responsiveness of the zwitterionic lipid (1) is maintained, the particle size of the molecular assembly increases with decreasing pH, and the amount of calcein encapsulated in the liposomes is released. Increased.
両イオン性脂質(1)の別の集合体の担持物質放出の促進
(1) 実験方法
DPPC (69 mg、0.094 mmol)、DOPC (74 mg、0.094 mmol)、Cholesterol (36 mg、0.094 mmol)、DPPG (20 mg、0.028 mmol)をt-ブチルアルコールに溶解させ、凍結乾燥し混合脂質を調製した。この混合脂質20 mgを100 mMカルセイン溶液1 mLで2時間水和し、高圧押出法により粒子径426±174 nmのカルセイン内包リポソームを調製した。未内包カルセインはゲルカラム(sephadex G-75)にて除去した。調製したカルセイン内包リポソーム分散液（脂質濃度1 mg/mL）に両イオン性脂質単独の分散液（脂質濃度1 mg/mL）を混合し、各pHにおけるカルセインの放出挙動を測定した。その結果を図8に示す。
Enhancement of carrier release of another assembly of zwitterionic lipid (1)
(1) Experimental method
DPPC (69 mg, 0.094 mmol), DOPC (74 mg, 0.094 mmol), Cholesterol (36 mg, 0.094 mmol), DPPG (20 mg, 0.028 mmol) are dissolved in t-butyl alcohol, lyophilized and mixed lipids are added. Prepared. 20 mg of this mixed lipid was hydrated with 1 mL of a 100 mM calcein solution for 2 hours, and calcein-encapsulated liposomes having a particle size of 426 ± 174 nm were prepared by a high pressure extrusion method. Unencapsulated calcein was removed with a gel column (sephadex G-75). The prepared calcein-encapsulated liposome dispersion (
(2) 結果
両イオン性脂質(1)の分子集合体を混合した系でのみカルセインを内包したリポソームからの内包物の放出が見られた。これは、低pHでは両イオン性脂質(1)からなる分子集合体がカチオン性となるために、カルセイン内包アニオン性リポソームと静電的な相互作用を及ぼし、その際にカルセインがリポソームから放出されたものと考察される。よって両イオン性脂質(1)を含むpH応答性分子集合体は、別の分子集合体に担持されている物質の放出を促す作用を持つことが認められた。
さらにこのことは、エンドソーム内の低pH環境下でカチオン化したリポソームが、エンドソーム膜に何らかの影響を及ぼし、その際にリポソームの内包物がエンドソーム内から細胞質へ放出されたことを示している。
(2) Results The inclusion was released from the liposome encapsulating calcein only in the system in which the molecular assembly of the zwitterionic lipid (1) was mixed. This is because the molecular assembly consisting of zwitterionic lipids (1) becomes cationic at low pH, so that it interacts electrostatically with calcein-containing anionic liposomes, in which case calcein is released from the liposomes. Is considered. Therefore, it was confirmed that the pH-responsive molecular assembly containing the zwitterionic lipid (1) has an action of promoting the release of the substance carried by another molecular assembly.
Furthermore, this indicates that liposomes cationized under a low pH environment in endosomes had some influence on the endosomal membrane, and at that time, the liposome inclusions were released from the endosome into the cytoplasm.
高分子量内包物（タンパク質）の放出挙動
(1) 実験方法
FITC-rHSA(FITC:rHSA=20:1) 10 g/dL 2 mLにDPPC/Cholesterol/両イオン性脂質(1)/PEG-Glu2C18、両イオン性脂質(1)/Cholesterol/PEG-Glu2C18の2種類の混合脂質をそれぞれ20 mgを混合し6時間水和後、高圧押出法にてアルブミン(Mw : 64500)内包リポソームを調製した。このリポソームからのFITC-rHSAの放出を測定した。測定結果を図9に示す。
(2) 結果
DPPC/Cholesterol/両イオン性脂質(1)/PEG-Glu2C18も、両イオン性脂質(1)/Cholesterol/PEG-Glu2C18も内包させたアルブミンの放出が低pHで促進されることを確認した。但し、放出量は両イオン性脂質の含量が高い後者の方が大きかった。また、後者の方が、低pHでの粒子径の増大が顕著であった。イオン性脂質(1)を膜成分としたリポソームは、低pHで低分子化合物だけではなく高分子量内包物であるアルブミンも放出できることがわかった。
Release behavior of high molecular weight inclusion (protein)
(1) Experimental method
FITC-rHSA (FITC: rHSA = 20: 1) 10 g /
(2) Results
It was confirmed that the release of albumin encapsulating DPPC / Cholesterol / Zwitterionic lipid (1) / PEG-Glu2C 18 and zwitterionic lipid (1) / Cholesterol / PEG-Glu2C 18 was promoted at low pH. . However, the release amount of the latter, which has a high content of zwitterionic lipids, was larger. In the latter case, the increase in particle diameter at a low pH was more remarkable. It was found that liposomes containing ionic lipid (1) as a membrane component can release not only low molecular weight compounds but also high molecular weight inclusion albumin at low pH.
pH応答性リポソームの細胞内動態
[1] カルセイン内包リポソーム
コントロールとしてDPPC/chol/PEG-Glu2C18、pH応答性リポソームDPPC/Cholesterol/両イオン性脂質(1)/PEG-Glu2C18、両イオン性脂質(1)/Cholesterol/PEG-Glu2C18の3種類の混合脂質それぞれ30 mgに2mL 100 mMカルセイン溶液を混合し水和し、高圧押出法によりカルセイン内包リポソームを調製した。
COS-7(サル腎臓由来細胞)を2×104 cellsガラスディッシュに播種し、24時間後にリポソームを脂質濃度2μg/mL 1mL添加した。2時間インキュベート後、PBSにて洗浄し共焦点顕微鏡にて観察した。観察結果を図10に示す。
両イオン性脂質(1)が主成分であるpH応答性リポソーム添加時にのみ細胞質内にカルセインの拡散が見られた。よって両イオン性脂質(1)を膜成分とすることで内包物を細胞質へ放出できる。
Intracellular dynamics of pH-responsive liposomes
[1] Calcein-encapsulated liposomes DPPC / chol / PEG-Glu2C 18 as control, pH-responsive liposome DPPC / Cholesterol / Zwitterionic lipid (1) / PEG-Glu2C18, Zwitterionic lipid (1) / Cholesterol / PEG-Glu2C18 Each of the three types of mixed lipids (30 mg) was mixed with 2 mL of 100 mM calcein solution and hydrated, and calcein-encapsulated liposomes were prepared by high-pressure extrusion.
COS-7 (monkey kidney-derived cells) was seeded on a 2 × 104 cells glass dish, and 24 hours later, liposomes were added with a lipid concentration of 2 μg /
Calcein diffusion was observed in the cytoplasm only when the pH-responsive liposomes composed mainly of zwitterionic lipid (1) were added. Therefore, inclusion can be released into the cytoplasm by using zwitterionic lipid (1) as a membrane component.
[2] アルブミン内包リポソーム
TetramethylrhodamIne-5(and -6)-Isothiocyanate(5(6))-TRITC 2 mgを0.1N-NaOH aqに溶解しpHを7.4に調製した。その水溶液を25 g/dL rHSA 1 mLと混合し6時間撹拌後、ゲルカラム(sephadex G-25)にて未結合ローダミンを除去し、ローダミン標識アルブミンを調製した。DPPC/Cholesterol/DHSG/PEG-DSPE、DPPC/Cholesterol/両イオン性脂質(1)/PEG-Glu2C18、両イオン性脂質(1)/Cholesterol/PEG-Glu2C18からなる3種類の混合脂質をそれぞれ30 mgに1 mLの3 g/dLのローダミン標識アルブミンを混合し6時間水和後、高圧押出法にてアルブミン内包リポソームを調製した。調製結果を表１に示す。
TetramethylrhodamIne-5 (and -6) -Isothiocyanate (5 (6))-
次に、ローダミン標識アルブミン内包リポソームをCOS-7またはCCD-32SKに添加し、細胞内でのリポソーム挙動解析を行った。
COS-7をガラスディッシュに播種し24時間インキュベート(37℃、5%CO2)した。その後血清入り培地で各リポソームを希釈し脂質濃度2μg/mL 1 mL添加し、2時間インキュベートし、PBSにて洗浄後FM-43にてエンドソームを染色し、共焦点顕微鏡にて観察した。CCD-32SKは添加したリポソームの脂質濃度を100μg/mLとした。観察結果を図11に示す。
両イオン性脂質(1)が主成分であるpH応答性リポソーム添加時にのみ細胞質全体にアルブミンの拡散が見られた。さらにFM1-43にて染色したエンドソームとローダミン標識したアルブミンの細胞内での位置が異なることから、アルブミンがエンドソームから脱出し、細胞質へ拡散していることがわかる。よって両イオン性脂質(1)を膜成分とするリポソームは内包物をエンドソーム外へ放出する運搬体として有用であることが示された。
Next, rhodamine-labeled albumin-encapsulated liposomes were added to COS-7 or CCD-32SK, and the behavior of liposomes in the cells was analyzed.
COS-7 was seeded on a glass dish and incubated for 24 hours (37 ° C., 5% CO 2 ). Thereafter, each liposome was diluted with a serum-containing medium, added with 1 mL of
Diffusion of albumin was observed throughout the cytoplasm only when the pH-responsive liposomes, mainly composed of zwitterionic lipid (1), were added. Furthermore, the position of endosomes stained with FM1-43 and rhodamine-labeled albumin in the cells is different, indicating that albumin has escaped from the endosome and diffused into the cytoplasm. Thus, liposomes with zwitterionic lipid (1) as a membrane component were shown to be useful as carriers for releasing inclusions out of endosomes.
pH応答性脂質の毒性評価
(1) 実験方法
両イオン性脂質(1)の細胞毒性評価を行った。96 wellプレートにCOS-7を1×104 cells/well播種し24時間後に各脂質濃度のリポソームを添加した。リポソーム添加し24時間にMTT assayを行った。測定結果を図12に示す。
(2) 結果
両イオン性脂質(1)を膜成分としたリポソームは、5μgを添加しても細胞毒性は見られなかった。よって両イオン性脂質(1)は低毒性のpH応答性脂質であり、リポソーム膜成分として有用であることが示された。
Toxicity evaluation of pH-responsive lipids
(1) Experimental method The cytotoxicity of the zwitterionic lipid (1) was evaluated. COS-7 was seeded at 1 × 10 4 cells / well in a 96-well plate, and liposomes with various lipid concentrations were added 24 hours later. MTT assay was performed 24 hours after adding liposomes. The measurement results are shown in FIG.
(2) Results Liposomes containing zwitterionic lipid (1) as membrane components did not show cytotoxicity even when 5 μg was added. Therefore, it was shown that the zwitterionic lipid (1) is a low-toxic pH-responsive lipid and useful as a liposome membrane component.
本発明は、分子集合体が細胞内に取り込まれた際に効率良く薬物や蛋白質、核酸などを細胞質側に放出させることができるので、各種疾患の予防・治療用の製剤として有用である。また、遺伝子導入剤として用いることにより遺伝子治療のみならず細胞質への導入が必要とされるRNA干渉用試薬など多領域の用途に応用することができる。 Since the present invention can efficiently release drugs, proteins, nucleic acids, and the like to the cytoplasm side when the molecular assembly is taken into cells, it is useful as a preparation for prevention / treatment of various diseases. Moreover, by using it as a gene introduction agent, it can be applied not only to gene therapy but also to multi-regional applications such as RNA interference reagents that need to be introduced into the cytoplasm.
Claims (15)
ある］
で表される両イオン性脂質を含む分子集合体であって、分散水性媒体のpHが生理的な値から酸性の値になる際に、別の分子集合体に担持されている目的物質の放出を促すものである、pH応答性分子集合体と、目的物質を担持している別の分子集合体とを含む、pH応答性分子集合体組成物。 Formula (I)
Release of the target substance carried by another molecular assembly when the pH of the aqueous dispersion medium changes from a physiological value to an acidic value. A pH-responsive molecular assembly composition comprising a pH-responsive molecular assembly and another molecular assembly supporting a target substance .
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