JP5252695B2 - Enzyme sensor - Google Patents
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Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
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Description
本発明は、酵素センサに関する。 The present invention relates to an enzyme sensor.
従来、酵素を利用して、試料中の検出対象物質を検出する酵素センサの研究・開発が盛んに行われている（例えば、特許文献１〜４参照）。
ところで、酵素センサにおいては、応答速度や感度を向上させるために、キノン系化合物やフェロセン系化合物などの電子伝達体を使用する場合が多い。
By the way, in an enzyme sensor, in order to improve a response speed and a sensitivity, electron carriers, such as a quinone type compound and a ferrocene type compound, are often used.
しかしながら、特に、酵素センサにおいて電極材料としてカーボンを使用した場合、電子伝達体としてはナフトキノンなどのキノン系化合物と相性が良いが、電子伝達体としてナフトキノンなどのキノン系化合物をそのまま使用すると、電子伝達体が酵素の活性中心に吸着して、酵素活性を低下させてしまう。また、フェロセン系化合物においても、例えば、ヒドロキシメチルフェロセンやジメチルアミノメチルフェロセンなどを使用すると酵素の活性低下を引き起こし、長期安定性は見込めない。したがって、このような電子伝達体を使用した酵素センサには、長期安定性に欠けるという問題がある。 However, in particular, when carbon is used as an electrode material in an enzyme sensor, the electron carrier is compatible with quinone compounds such as naphthoquinone. However, when a quinone compound such as naphthoquinone is used as an electron carrier, electron transfer The body adsorbs to the active center of the enzyme, reducing the enzyme activity. In addition, in ferrocene compounds, for example, when hydroxymethyl ferrocene, dimethylaminomethyl ferrocene, or the like is used, the activity of the enzyme is reduced, and long-term stability cannot be expected. Therefore, the enzyme sensor using such an electron carrier has a problem of lacking long-term stability.
本発明の課題は、電子伝達体を使用した場合であっても、優れた長期安定性を有する酵素センサを提供することにある。 An object of the present invention is to provide an enzyme sensor having excellent long-term stability even when an electron carrier is used.
上記課題を解決するために、本発明では、上記従来技術を鑑み、本発明者らの鋭意研究によって、電子伝達体として、特に、側鎖として４級アンモニウム塩基を有する構造を持つメタロセン骨格を有する化合物、或いは、側鎖としてカルボシキル基を有する構造を持つメタロセン骨格を有する化合物を利用することで、酵素の活性低下を抑制できることを見出した。
請求項１に記載の発明は、
酵素と、電子伝達体と、補酵素と、を含有する検出部を備え、
前記電子伝達体は、下記の一般式（１）で表される化合物、下記の一般式（２）で表される化合物及び下記の一般式（３）で表される化合物のうちの少なくとも１種類であり、
前記酵素及び前記電子伝達体は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で前記検出部に含有され、
前記検出部には、分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び電解質のうちの少なくとも１つが添加されていることを特徴とする。
The invention described in claim 1
A detection unit containing an enzyme, an electron carrier, and a coenzyme ;
The electron carrier is at least one of a compound represented by the following general formula (1), a compound represented by the following general formula (2), and a compound represented by the following general formula (3). der is,
The enzyme and the electron carrier are contained in the detection unit in a state of being fixed inside the pores of the silica-based mesoporous material,
At least one of a biopolymer having a molecular weight of 1000 or more, a synthetic polymer having a molecular weight of 1000 or more, and an electrolyte is added to the detection unit .
本発明によれば、酵素と、電子伝達体と、補酵素と、を含有する検出部を備え、その電子伝達体は、上記の一般式（１）で表される化合物、上記の一般式（２）で表される化合物及び上記の一般式（３）で表される化合物のうちの少なくとも１種類である。
したがって、側鎖として４級アンモニウム塩基を有する構造を持つメタロセン骨格を有する化合物（上記の一般式（１）で表される化合物）や、側鎖としてカルボシキル基を有する構造を持つメタロセン骨格を有する化合物（上記の一般式（２）で表される化合物、上記の一般式（３）で表される化合物）は、酵素の活性中心に吸着しにくいため、電子伝達体を使用した場合であっても、優れた長期安定性を有する酵素センサを提供することができる。
According to the present invention, a detection unit containing an enzyme, an electron carrier, and a coenzyme is provided, and the electron carrier is a compound represented by the above general formula (1), the above general formula ( It is at least one of the compound represented by 2) and the compound represented by the general formula (3).
Therefore, a compound having a metallocene skeleton having a structure having a quaternary ammonium base as a side chain (a compound represented by the above general formula (1)) or a compound having a metallocene skeleton having a structure having a carboxyl group as a side chain (The compound represented by the above general formula (2), the compound represented by the above general formula (3)) is difficult to adsorb on the active center of the enzyme, so even when an electron carrier is used. An enzyme sensor having excellent long-term stability can be provided.
また、本発明によれば、電子伝達体は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で検出部に含有されている。
したがって、電子伝達体をシリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定することによって、この電子伝達体が酵素の活性中心に吸着するのを抑制できるため、電子伝達体を使用した場合であっても、優れた長期安定性を有する酵素センサを提供することができる。
また、本発明によれば、酵素は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で検出部に含有され、検出部には、分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び電解質のうちの少なくとも１つが添加されている。
すなわち、酵素をシリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定することによって、外部環境の変化に伴う酵素の立体構造の変化を防止することができるため、酵素の活性の低下を抑制することができる。
さらに、補酵素をシリカ系メソ多孔体と共存させると、補酵素がシリカ系メソ多孔体の表面に吸着して酵素の活性の低下を引き起こすことが分かっているが、検出部に分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び電解質のうちの少なくとも１つを添加することによって、当該添加物がシリカ系メソ多孔体の表面に吸着し、補酵素のシリカ系メソ多孔体への吸着が抑制されるため、酵素の活性の低下を抑制することができる。したがって、優れた長期安定性を有する酵素センサを提供することができる。
Further, according to the present invention, electron mediator is contained in the detection unit in a state of being fixed inside the pores of the mesoporous silica material.
Therefore, by fixing the electron mediator inside the pores of the silica-based mesoporous material, it is possible to suppress the adsorption of the electron mediator to the active center of the enzyme. In addition, an enzyme sensor having excellent long-term stability can be provided.
According to the present invention, the enzyme is contained in the detection unit in a state of being fixed inside the pores of the silica-based mesoporous material, and the detection unit includes a biopolymer having a molecular weight of 1000 or more and a molecular weight of 1000 or more. At least one of a synthetic polymer and an electrolyte is added.
In other words, by fixing the enzyme inside the pores of the silica-based mesoporous material, it is possible to prevent a change in the three-dimensional structure of the enzyme that accompanies a change in the external environment. it can.
Further, it has been found that when a coenzyme coexists with a silica-based mesoporous material, the coenzyme is adsorbed on the surface of the silica-based mesoporous material and causes a decrease in the activity of the enzyme. By adding at least one of a biopolymer, a synthetic polymer having a molecular weight of 1000 or more, and an electrolyte, the additive is adsorbed on the surface of the silica-based mesoporous material, and the coenzyme is adsorbed onto the silica-based mesoporous material. Since adsorption is suppressed, a decrease in enzyme activity can be suppressed. Therefore, an enzyme sensor having excellent long-term stability can be provided.
以下、図を参照して、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。なお、発明の範囲は、図示例に限定されない。 Hereinafter, the best mode for carrying out the present invention will be described in detail with reference to the drawings. The scope of the invention is not limited to the illustrated example.
本発明の酵素センサ１は、例えば、気体試料又は液体試料中の検出対象物質を、その検出対象物質と選択的に反応する酵素１００を利用して、電極２０を用いて電気化学的計測法により検出するセンサである。
酵素センサ１は、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液からなる検出部１０を有しており、電極２０は検出部１０内に配置され、酵素１００は検出部１０に含有されている。
酵素センサ１においては、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液に気体試料や液体試料を溶解させることによって、当該気体試料や液体試料中の検出対象物質を検出するようになっている。
The enzyme sensor 1 of the present invention uses, for example, an electrochemical measurement method using an electrode 20 using an enzyme 100 that selectively reacts a detection target substance in a gas sample or a liquid sample with the detection target substance. It is a sensor to detect.
The enzyme sensor 1 includes, for example, a detection unit 10 made of a predetermined electrolyte introduced into the reactor 10a, the electrode 20 is disposed in the detection unit 10, and the enzyme 100 is contained in the detection unit 10. Yes.
In the enzyme sensor 1, for example, a detection target substance in the gas sample or liquid sample is detected by dissolving the gas sample or liquid sample in a predetermined electrolyte introduced into the reactor 10a. .
具体的には、酵素センサ１は、例えば、図１に示すように、検出部１０と、検出部１０内に配置された作用電極（電極２０）、対照電極３０及び参照電極４０と、作用電極（電極２０）において発生した電流値を測定するためのポテンショスタット５０と、などを備えて構成される。
検出部１０は、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液からなり、検出部１０には、例えば、酵素１００と、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０と、電子伝達体２００と、補酵素３００と、などが含有されている。
ポテンショスタット５０は、例えば、定電圧計５００ａと、電流計測器５００ｂと、などを有しており、作用電極（電極２０）、対照電極３０及び参照電極４０に接続されたリードと接続している。
Specifically, for example, as shown in FIG. 1, the enzyme sensor 1 includes a detection unit 10, a working electrode (electrode 20) disposed in the detection unit 10, a reference electrode 30 and a reference electrode 40, and a working electrode. A potentiostat 50 for measuring a current value generated in the (electrode 20), and the like.
The detection unit 10 is made of, for example, a predetermined electrolytic solution introduced into the reactor 10a. The detection unit 10 includes, for example, the enzyme 100, a silica-based mesoporous material 110 on which the enzyme 100 is fixed, and an electron carrier. 200, coenzyme 300, and the like.
The potentiostat 50 includes, for example, a constant voltmeter 500a, a current measuring instrument 500b, and the like, and is connected to leads connected to the working electrode (electrode 20), the reference electrode 30, and the reference electrode 40. .
（酵素）
酵素１００は、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された状態で検出部１０に含有されている。
なお、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００は、検出部１０に含有されていれば任意である。すなわち、例えば、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０を反応器１０ａに導入された所定の電解液に分散させることによって、検出部１０に含有させても良いし、例えば、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０を電極２０等に固定させることによって検出部１０に含有させても良いが、酵素センサ１の高感度化等の観点から、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０を電極２０に固定させることによって検出部１０に含有させるのが好ましい。
(enzyme)
For example, the enzyme 100 is contained in the detection unit 10 in a state of being fixed inside the pores of the silica-based mesoporous material 110.
The enzyme 100 fixed inside the pores of the silica-based mesoporous material 110 is optional as long as it is contained in the detection unit 10. That is, for example, the silica-based mesoporous material 110 on which the enzyme 100 is immobilized may be contained in the detection unit 10 by dispersing it in a predetermined electrolyte introduced into the reactor 10a. The fixed silica-based mesoporous material 110 may be included in the detection unit 10 by fixing it to the electrode 20 or the like. However, from the viewpoint of increasing the sensitivity of the enzyme sensor 1, the silica-based meso The porous body 110 is preferably contained in the detection unit 10 by being fixed to the electrode 20.
酵素１００をシリカ系メソ多孔体１１０に固定する方法としては、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０に酵素１００を含む溶液を滴下するディップ法、酵素１００を含む溶液にシリカ系メソ多孔体１１０を漬侵する漬侵法などが挙げられるが、特に限定されるものではない。これにより、高次構造と活性を保持したまま、酵素１００をシリカ系メソ多孔体１１０に固定化することができる。
さらに、必要に応じて、公知の酵素固定化法（例えば、導電性高分子、グルタルアルデヒド、光架橋性樹脂等を用いる固定化法等）と併用することもできる。
As a method for fixing the enzyme 100 to the silica-based mesoporous material 110, for example, a dipping method in which a solution containing the enzyme 100 is dropped into the silica-based mesoporous material 110, or the silica-based mesoporous material 110 is immersed in a solution containing the enzyme 100. Although the immersion method which invades is mentioned, it is not specifically limited. Thereby, the enzyme 100 can be fixed to the silica-based mesoporous material 110 while maintaining the higher-order structure and activity.
Furthermore, if necessary, it can be used in combination with a known enzyme immobilization method (for example, an immobilization method using a conductive polymer, glutaraldehyde, a photocrosslinkable resin or the like).
酵素１００は、検出対象物質と選択的に反応する酵素であれば任意であり、検出対象物質の種類によって適宜変更可能である。
具体的には、酵素１００は、例えば、酸化還元酵素、加水分解酵素、転移酵素、異性化酵素などの酵素（酵素タンパク質）である。
また、酵素１００は、例えば、生来の酵素分子であっても、活性部位を含む酵素の断片であっても良い。当該酵素分子又は当該活性部位を含む酵素の断片は、例えば、動植物や微生物から抽出したものであっても良いし、所望によりそれを切断したものであっても良いし、遺伝子工学的に又は化学的に合成したものであっても良い。
The enzyme 100 is arbitrary as long as it is an enzyme that selectively reacts with the detection target substance, and can be appropriately changed depending on the type of the detection target substance.
Specifically, the enzyme 100 is an enzyme (enzyme protein) such as an oxidoreductase, a hydrolase, a transferase, and an isomerase.
The enzyme 100 may be, for example, a natural enzyme molecule or an enzyme fragment including an active site. The enzyme molecule or the enzyme fragment containing the active site may be, for example, extracted from animals or plants or microorganisms, may be cleaved if desired, or may be genetically engineered or chemically It may be a synthetically synthesized one.
酸化還元酵素としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ホルムアルデヒドオキシダーゼ、ソルビトールオキシダーゼ、フルクトースオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ等を用いることができる。この他に、コレステロールエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、さらにこれら酵素のミュータント等を用いることができる。 Examples of the oxidoreductase include glucose oxidase, lactate oxidase, cholesterol oxidase, alcohol oxidase, formaldehyde oxidase, sorbitol oxidase, fructose oxidase, sarcosine oxidase, fructosylamine oxidase, pyruvate oxidase, xanthine oxidase, ascorbate oxidase, sarcosine. Oxidase, choline oxidase, amine oxidase, glucose dehydrogenase, lactate dehydrogenase, cholesterol dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, formaldehyde dehydrogenase, sorbitol dehydrogenase, fructose dehydrogenase, hydroxybutyrate dehydrogenase, glycerol dehydrogenase Glutamate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, malate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, can be used catalase, peroxidase, uricase, and the like. In addition, cholesterol esterase, acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, creatininase, creatinase, DNA polymerase, mutants of these enzymes, and the like can be used.
加水分解酵素としては、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、インベルターゼ、マルターゼ、β−ガラクトシダーゼ、リゾチーム、ウレアーゼ、エステラーゼ、ヌクレアーゼ群、ホスファターゼ群等を用いることができる。 As the hydrolase, for example, protease, lipase, amylase, invertase, maltase, β-galactosidase, lysozyme, urease, esterase, nuclease group, phosphatase group and the like can be used.
転移酵素としては、例えば、各種アシル転移酵素、キナーゼ群、アミノトランスフェラーゼ群等を用いることができる。 As the transferase, for example, various acyltransferases, kinase groups, aminotransferase groups and the like can be used.
異性化酵素としては、例えば、ラセマーゼ群、ホスホグリセリン酸ホスホムターゼ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ等を用いることができる。 As the isomerase, for example, racemase group, phosphoglycerate phosphomutase, glucose 6-phosphate isomerase and the like can be used.
ここで、特に好ましい酵素１００としては、例えば、各種脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ）が挙げられる。 Here, as the particularly preferable enzyme 100, for example, various dehydrogenases can be mentioned.
検出部１０に含有される酵素１００は、１種類の酵素であっても、２種類以上の酵素であっても良い。
具体的には、検出部１０に含有される酵素１００は、例えば、１種類の酵素であっても、分子量及び／又はサイズ（径）が略同一の２種類以上の酵素であっても、分子量及び／又はサイズが異なる２種類以上の酵素であっても良い。また、検出部１０に含有される酵素１００が２種類以上である場合、酵素１００は、例えば、同種の特定物質（基質）に作用する２種類以上の酵素であっても、異種の特定物質に作用する２種類以上の酵素であっても、同種及び／又は異種の特定物質に作用する２種類以上の酵素であっても良い。
The enzyme 100 contained in the detection unit 10 may be one type of enzyme or two or more types of enzymes.
Specifically, the molecular weight of the enzyme 100 contained in the detection unit 10 may be, for example, one kind of enzyme or two or more kinds of enzymes having substantially the same molecular weight and / or size (diameter). And / or two or more enzymes having different sizes. In addition, when there are two or more types of enzymes 100 contained in the detection unit 10, the enzymes 100 may be different types of specific substances even if they are two or more types of enzymes that act on the same type of specific substance (substrate). It may be two or more kinds of enzymes that act, or two or more kinds of enzymes that act on the same kind and / or different kinds of specific substances.
また、検出部１０に含有される酵素１００が２種類以上である場合、その２種類以上の酵素は、シリカ系メソ多孔体１１０における別々の細孔の内部に固定されていても、同一の細孔の内部に固定されていても良い。
ここで、特に、検出部１０に含有される酵素１００が２種類以上であって、その２種類以上の酵素が異種の特定物質に作用する場合、酵素センサ１は、その異種の特定物質（２種類以上の特定物質）を同時に検出することができる。
Further, when there are two or more types of enzymes 100 contained in the detection unit 10, the two or more types of enzymes are the same even if they are fixed inside separate pores in the silica-based mesoporous material 110. It may be fixed inside the hole.
Here, in particular, when there are two or more types of enzymes 100 contained in the detection unit 10 and the two or more types of enzymes act on different types of specific substances, the enzyme sensor 1 may use the different types of specific substances (2 More than one type of specific substance) can be detected simultaneously.
（シリカ系メソ多孔体）
シリカ系メソ多孔体１１０は、例えば、ケイ酸やアルミナなどの各種金属酸化物、ケイ酸と他種の金属との複合酸化物等によって構成することができる。
例えば、ケイ酸により構成されるシリカ系メソ多孔体１１０の作製においては、例えば、カネマイトのような層状シリケート、アルコキシシラン、シリカゲル、水ガラス、ケイ酸ソーダ等を好ましく用いることができる。
(Silica-based mesoporous material)
The silica-based mesoporous material 110 can be composed of, for example, various metal oxides such as silicic acid and alumina, complex oxides of silicic acid and other types of metals, and the like.
For example, in the production of the silica-based mesoporous material 110 composed of silicic acid, for example, layered silicate such as kanemite, alkoxysilane, silica gel, water glass, sodium silicate, and the like can be preferably used.
具体的には、シリカ系メソ多孔体１１０は、例えば、無機材料を界面活性剤と混合反応させて、界面活性剤のミセルの周りに無機の骨格が形成された界面活性剤／無機複合体を形成させた後、例えば、４００℃〜６００℃で焼成したり有機溶剤で抽出したりする等して界面活性剤を除去することにより作製される。これにより、シリカ系メソ多孔体１１０は、無機骨格中に、界面活性剤のミセルと同じ形状のメソポア細孔を有するものとなる。 Specifically, the silica-based mesoporous material 110 includes, for example, a surfactant / inorganic composite in which an inorganic material is mixed with a surfactant to form an inorganic skeleton around the surfactant micelles. After the formation, the surfactant is removed by, for example, baking at 400 ° C. to 600 ° C. or extracting with an organic solvent. As a result, the silica-based mesoporous material 110 has mesopore pores having the same shape as the micelles of the surfactant in the inorganic skeleton.
シリカ系メソ多孔体１１０の作製において、ケイ酸等のケイ素含有化合物を出発材料とする場合には、例えば、カネマイトのような層状シリケートを形成して、この層間にミセルを挿入し、そして、ミセルが存在しない層間をシリケート分子でつなぎ、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。
また、シリカ系メソ多孔体１１０の作製において、水ガラス等のケイ素含有物質を出発材料とする場合には、例えば、ミセルの周囲にシリケート分子を集合させて重合させることによりシリカを形成し、その後、ミセルを除去することによって細孔を形成することができる。この場合、通常、ミセルの形状は柱状となり、その結果、シリカ系メソ多孔体１１０に、柱状の細孔が形成されることになる。
In the production of the silica-based mesoporous material 110, when a silicon-containing compound such as silicic acid is used as a starting material, for example, a layered silicate such as kanemite is formed, and micelles are inserted between the layers. The pores can be formed by connecting the silicate molecules between the layers in which no is present, and then removing the micelles.
Further, in the production of the silica-based mesoporous material 110, when a silicon-containing substance such as water glass is used as a starting material, for example, silica is formed by collecting and polymerizing silicate molecules around the micelle, and thereafter The pores can be formed by removing the micelles. In this case, the shape of the micelle is usually a columnar shape, and as a result, columnar pores are formed in the silica-based mesoporous material 110.
シリカ系メソ多孔体１１０は、作製段階で、界面活性剤のアルキル鎖の長さを変えてミセルの径を変化させることによって、細孔の内径を制御することができる。また、界面活性剤と併せて、トリメチルベンゼン、トリプロピルベンゼン等の比較的疎水性の分子を添加することによって、ミセルを膨潤させ、さらに大きな内径の細孔を形成することもできる。
シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズ（細孔の径）は、固定する酵素１００のサイズ（酵素１００の径）に応じて決定される。すなわち、例えば、ミセルのサイズ（ミセルの径）が、酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍となる界面活性剤を用いてシリカ系メソ多孔体１１０を作製することによって、細孔のサイズが、固定する酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍となるシリカ系メソ多孔体１１０を得ることができる。
In the silica-based mesoporous material 110, the inner diameter of the pores can be controlled by changing the micelle diameter by changing the length of the alkyl chain of the surfactant in the production stage. In addition, by adding relatively hydrophobic molecules such as trimethylbenzene and tripropylbenzene together with the surfactant, the micelles can be swollen to form pores with a larger inner diameter.
The pore size (pore diameter) of the silica-based mesoporous material 110 is determined according to the size of the enzyme 100 to be immobilized (diameter of the enzyme 100). That is, for example, by producing the silica-based mesoporous material 110 using a surfactant having a micelle size (micelle diameter) of 0.5 to 2.0 times the size of the enzyme 100, A silica-based mesoporous material 110 whose size is 0.5 to 2.0 times the size of the enzyme 100 to be immobilized can be obtained.
シリカ系メソ多孔体１１０の形状としては、例えば、粉末状、顆粒状、シート状、バルク状、膜状等がある。
また、シリカ系メソ多孔体１１０における細孔の配向は、ランダムであっても、一次元シリカナノチャンネルの集合体のように方向性が制御されたものであっても良い。
Examples of the shape of the silica-based mesoporous material 110 include powder, granule, sheet, bulk, and film.
In addition, the orientation of the pores in the silica-based mesoporous material 110 may be random or may have a controlled orientation, such as an aggregate of one-dimensional silica nanochannels.
シリカ系メソ多孔体１１０の種類としては、細孔のサイズが均一であり、且つ、大きな空隙率を持つという特徴を有する、例えば、ＫＳＷ、ＦＳＭ、ＳＢＡ、ＭＣＭ、ＨＯＭ等の公知の種類を採用することができる。
さらに、シリカ系メソ多孔体１１０の種類としては、細孔のサイズが均一であり、且つ、細孔（チャンネル）の方向が一方向に向いているという特徴を有する、例えば、ＣＴＡＢ−Ｍ、Ｐ１２３−Ｍ、Ｆ１２７-Ｍ等の公知の種類を採用することができる。具体的には、ＣＴＡＢ−Ｍ、Ｐ１２３−Ｍ、Ｆ１２７-Ｍ等は、例えば、円筒形のアルミナ細孔内に界面活性剤を鋳型として作製される、アルミナ細孔の方向と同一のチャンネル方向を有するメソポーラスシリカナノチャンネル集合体（一次元シリカナノチャンネルの集合体）が充填された膜状のシリカ系メソ多孔体１１０である。
As the type of the silica-based mesoporous material 110, a known type such as KSW, FSM, SBA, MCM, HOM, etc., which has the characteristics that the pore size is uniform and has a large porosity, is adopted. can do.
Further, as a kind of the silica-based mesoporous material 110, for example, CTAB-M, P123 has the characteristics that the pore size is uniform and the direction of the pore (channel) is in one direction. Known types such as -M and F127-M can be employed. Specifically, CTAB-M, P123-M, F127-M, etc., for example, have the same channel direction as the direction of the alumina pores produced using a surfactant as a template in cylindrical alumina pores. This is a membranous silica-based mesoporous material 110 filled with mesoporous silica nanochannel aggregates (one-dimensional silica nanochannel aggregates).
シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズは、固定された酵素１００の立体構造の変化を防止可能な程度に設定されている。これによって、固定された酵素１００の立体構造を維持することができ、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００を安定化することができる。
具体的には、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズは、例えば、固定される酵素１００（酵素分子又は活性部位を含む酵素の断片）のサイズの０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、固定される酵素１００のサイズの０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、固定される酵素１００のサイズとほぼ同等であることが最も好ましい。すなわち、シリカ系メソ多孔体１１０における細孔の直径（中心細孔直径）は、固定される酵素１００の直径の０．５〜２．０倍程度であることが好ましく、固定される酵素１００の直径の０．７〜１．４倍程度であることがより好ましく、固定される酵素１００の直径とほぼ同等であることが最も好ましい。なお、具体的な中心細孔直径の値は、酵素１００の直径との関係で決定されるので一律には規定できないが、例えば、１〜５０ｎｍ程度とすることができる。
ここで、酵素１００が多量体を形成する場合には、固定される酵素１００のサイズ（直径）は、多量体のサイズ（直径）とすることができる。ここで、多量体とは、２以上の酵素（タンパク質）が、直接に、又は水などの低分子を介して結合してなる化合物をいい、結合には、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合が含まれる。しかし、これらの結合の種類は、特に制限されない。
The size of the pores of the silica-based mesoporous material 110 is set to such an extent that a change in the three-dimensional structure of the immobilized enzyme 100 can be prevented. Accordingly, the three-dimensional structure of the immobilized enzyme 100 can be maintained, and the enzyme 100 immobilized in the pores of the silica-based mesoporous material 110 can be stabilized.
Specifically, the size of the pores of the silica-based mesoporous material 110 is, for example, about 0.5 to 2.0 times the size of the immobilized enzyme 100 (enzyme molecule or enzyme fragment containing an active site). It is preferable that the size is about 0.7 to 1.4 times the size of the enzyme 100 to be immobilized, and most preferably about the same as the size of the enzyme 100 to be immobilized. That is, the pore diameter (center pore diameter) in the silica-based mesoporous material 110 is preferably about 0.5 to 2.0 times the diameter of the enzyme 100 to be immobilized. The diameter is more preferably about 0.7 to 1.4 times the diameter, and most preferably about the same as the diameter of the enzyme 100 to be immobilized. In addition, since the specific value of the center pore diameter is determined in relation to the diameter of the enzyme 100 and cannot be defined uniformly, it can be set to about 1 to 50 nm, for example.
Here, when the enzyme 100 forms a multimer, the size (diameter) of the enzyme 100 to be immobilized can be the size (diameter) of the multimer. Here, the multimer refers to a compound in which two or more enzymes (proteins) are bonded directly or via a small molecule such as water, and the bond includes a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, Coordination bonds are included. However, the type of these bonds is not particularly limited.
シリカ系メソ多孔体１１０の比表面積は、例えば、２００〜１５００ｍ２程度である。
シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の深さは、２ｎｍ以上である。具体的には、好ましい深さの範囲は２０〜１０００μｍであり、より好ましい深さの範囲は５０〜５００ｎｍであり、最も好ましい深さの範囲は５０〜１５０ｎｍである。
シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のピッチは、細孔のピッチを細孔の中心間の距離と定義すると、好ましいピッチは２〜５００ｎｍであり、より好ましいピッチは２〜１００ｎｍであり、最も好ましいピッチは２〜５０ｎｍである。
The specific surface area of the silica-based mesoporous material 110 is, for example, about 200 to 1500 m 2 .
The pore depth of the silica-based mesoporous material 110 is 2 nm or more. Specifically, the preferable depth range is 20 to 1000 μm, the more preferable depth range is 50 to 500 nm, and the most preferable depth range is 50 to 150 nm.
As for the pitch of the pores of the silica-based mesoporous material 110, when the pitch of the pores is defined as the distance between the centers of the pores, the preferable pitch is 2 to 500 nm, the more preferable pitch is 2 to 100 nm, and the most preferable The pitch is 2 to 50 nm.
シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズを、固定する酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍程度（より好ましくは０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはほぼ同等）にすることによって、固定する酵素１００の立体構造の維持が容易となるため、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００を安定化することができる。 The size of the pores of the silica-based mesoporous material 110 is about 0.5 to 2.0 times (more preferably about 0.7 to 1.4 times, most preferably about the same) as the size of the enzyme 100 to be immobilized. By doing so, the three-dimensional structure of the enzyme 100 to be immobilized can be easily maintained, so that the enzyme 100 immobilized in the pores of the silica-based mesoporous material 110 can be stabilized.
具体的には、酵素１００として、例えば、ホルムアルデヒド脱水素酵素（直径：約８ｎｍ）を採用した場合、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズを、好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．５〜２．０倍程度、より好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径とほぼ同等に設定する。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素は、例えば、図２に示すように、立体構造が維持されたまま、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内壁に吸着して固定化されることになる。 Specifically, for example, when formaldehyde dehydrogenase (diameter: about 8 nm) is employed as the enzyme 100, the size of the pores of the silica-based mesoporous material 110 is preferably set to a diameter of 0. 0 of the diameter of the formaldehyde dehydrogenase. It is about 5-2.0 times, more preferably about 0.7-1.4 times the diameter of formaldehyde dehydrogenase, most preferably about the same as the diameter of formaldehyde dehydrogenase. Thereby, for example, as shown in FIG. 2, the formaldehyde dehydrogenase is adsorbed and immobilized on the inner walls of the pores of the silica-based mesoporous material 110 while maintaining the three-dimensional structure.
また、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０として、例えば、図３に示すような、一次元シリカナノチャンネルの集合体が充填された膜状のものを用いる場合にも、細孔のサイズは、好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．５〜２．０倍程度、より好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径の０．７〜１．４倍程度、最も好ましくはホルムアルデヒド脱水素酵素の直径とほぼ同等に設定する。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素は、立体構造が維持されたまま、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔（チャンネル）の内壁に吸着して固定化されることになる。 Also, for example, when using a membranous silica-based mesoporous material 110 as shown in FIG. 3 filled with a one-dimensional silica nanochannel aggregate, the pore size is preferably About 0.5 to 2.0 times the diameter of formaldehyde dehydrogenase, more preferably about 0.7 to 1.4 times the diameter of formaldehyde dehydrogenase, most preferably about the same as the diameter of formaldehyde dehydrogenase Set. Thereby, formaldehyde dehydrogenase is adsorbed and immobilized on the inner walls of the pores (channels) of the silica-based mesoporous material 110 while maintaining the three-dimensional structure.
（電子伝達体）
電子伝達体２００は、酵素１００と電極２０との間の電子の受け渡しを促進するためのものである。
なお、電子伝達体２００は、検出部１０に含有されていれば任意であり、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液に溶解した状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０（反応器１０ａに導入された所定の電解液に分散されたシリカ系メソ多孔体１１０、或いは、電極２０等に固定されたシリカ系メソ多孔体１１０）の細孔の内部に導入された状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、作用電極（電極２０）に直接固定された状態で検出部１０に含有されていても良い。
(Electronic carrier)
The electron carrier 200 is for facilitating the delivery of electrons between the enzyme 100 and the electrode 20.
Note that the electron carrier 200 is optional as long as it is contained in the detection unit 10, and may be contained in the detection unit 10 in a state of being dissolved in a predetermined electrolyte introduced into the reactor 10a, for example. For example, the details of the silica-based mesoporous material 110 (silica-based mesoporous material 110 dispersed in a predetermined electrolyte introduced into the reactor 10a, or the silica-based mesoporous material 110 fixed to the electrode 20, etc.) It may be contained in the detection unit 10 in a state of being introduced into the hole, or may be contained in the detection unit 10 in a state of being directly fixed to the working electrode (electrode 20), for example.
酵素１００は、細孔のサイズが酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍程度の、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に安定的に固定されているため、生成物が直接電極２０で酸化又は還元される場合を除き、酵素分子内の活性中心が電極２０と電子移動を行うことが難しい。また、酵素１００が、一次元シリカナノチャンネルの集合体のように方向性が制御されたアスペクト比の大きな細孔を有するシリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定されている場合には、生成物が直接電極２０で酸化又は還元される場合においても応答が非常に遅くなる。したがって、検出部１０に、電子伝達体２００を添加するのが好ましい。
また、電極２０として酸素電極、過酸化水素電極等を利用した場合、反応が溶存酸素濃度に律速されて低濃度の試料しか測定できない、アスコルビン酸等の酸化物質の影響を受けやすく選択性が悪い等の問題が生じる。この場合にも、検出範囲の拡大、選択性の向上を目的として酵素１００とともに電子伝達体２００を使用することが効果的である。
Since the enzyme 100 is stably fixed inside the pores of the silica-based mesoporous material 110 whose pore size is about 0.5 to 2.0 times the size of the enzyme 100, the product is directly Except when oxidized or reduced at the electrode 20, it is difficult for the active center in the enzyme molecule to transfer electrons with the electrode 20. Further, when the enzyme 100 is fixed inside the pores of the silica-based mesoporous material 110 having pores with a large aspect ratio whose directionality is controlled, such as an aggregate of one-dimensional silica nanochannels, Even when the product is directly oxidized or reduced at the electrode 20, the response is very slow. Therefore, it is preferable to add the electron carrier 200 to the detection unit 10.
In addition, when an oxygen electrode, a hydrogen peroxide electrode, or the like is used as the electrode 20, the reaction is limited by the dissolved oxygen concentration and only a low concentration sample can be measured. The selectivity is poor due to the influence of an oxidizing substance such as ascorbic acid. Such problems arise. Also in this case, it is effective to use the electron carrier 200 together with the enzyme 100 for the purpose of expanding the detection range and improving the selectivity.
ここで、ナフトキノンなどのキノン系化合物を電子伝達体として使用すると、酵素１００の活性が低下することが分かっている。これは、ナフトキノンなどのキノン系化合物が、酵素１００の活性中心に吸着するためであると考えられる。
そこで、電子伝達体２００は、例えば、ナフトキノンなどのキノン系化合物と比較して、酵素１００の活性中心に吸着しにくい、酵素１００の活性の低下を抑制することができる活性低下抑制型の電子伝達体であるのが好ましい。
活性低下抑制型の電子伝達体としては、具体的には、例えば、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体や、所定の多孔体に吸着された電子伝達体などが挙げられる。
Here, it is known that the activity of the enzyme 100 decreases when a quinone compound such as naphthoquinone is used as an electron carrier. This is considered to be because a quinone compound such as naphthoquinone adsorbs to the active center of the enzyme 100.
Therefore, for example, the electron carrier 200 is less likely to be adsorbed to the active center of the enzyme 100 than the quinone-based compound such as naphthoquinone, and can suppress the decrease in the activity of the enzyme 100. The body is preferred.
Specific examples of the activity lowering suppression electron carrier include a part of electron carriers having a metallocene skeleton and an electron carrier adsorbed on a predetermined porous body.
メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体としては、具体的には、例えば、上記の一般式（１）で表される化合物、上記の一般式（２）で表される化合物及び上記の一般式（３）で表される化合物が挙げられる。
以下、上記の一般式（１）で表される化合物、上記の一般式（２）で表される化合物及び上記の一般式（３）で表される化合物を、「メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体」と呼ぶ場合がある。また、メタロセン骨格を有する電子伝達体のうち、上記の一般式（１）で表される化合物、上記の一般式（２）で表される化合物及び上記の一般式（３）で表される化合物以外の化合物を、「メタロセン骨格を有するその他の電子伝達体」と呼ぶ場合がある。
Specific examples of the electron carrier having a metallocene skeleton include, for example, a compound represented by the above general formula (1), a compound represented by the above general formula (2), and the above general formula. The compound represented by (3) is mentioned.
Hereinafter, the compound represented by the above general formula (1), the compound represented by the above general formula (2), and the compound represented by the above general formula (3) are referred to as “a part of the metallocene skeleton. Sometimes called an "electron carrier". Of the electron carriers having a metallocene skeleton, the compound represented by the above general formula (1), the compound represented by the above general formula (2), and the compound represented by the above general formula (3) Other compounds may be referred to as “other electron carriers having a metallocene skeleton”.
ここで、特に好ましいメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体としては、例えば、上記の一般式（１）、（２）、（３）中ＭｅがＦｅのフェロセン系化合物が挙げられる。
上記の一般式（１）中ＭｅがＦｅのフェロセン系化合物としては、フェロセニルメチルドデシルジメチルアンモニウムブロミドやフェロセニルメチルドデシルジメチルアンモニウムヨージド、フェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミド、フェロセニルメチルトリメチルアンモニウムヨージドなどのフェロセニルメチルアンモニウム塩が挙げられる。
また、上記の一般式（２）中ＭｅがＦｅのフェロセン系化合物としては、フェロセンカルボン酸が挙げられる。
また、上記の一般式（３）中ＭｅがＦｅのフェロセン系化合物としては、１−１’フェロセンジカルボン酸が挙げられる。
Here, as a partly preferable electron carrier having a metallocene skeleton, for example, a ferrocene-based compound in which Me is Fe in the above general formulas (1), (2), and (3) can be given.
Ferrocene compounds in which Me in the general formula (1) is Fe include ferrocenylmethyldodecyldimethylammonium bromide, ferrocenylmethyldodecyldimethylammonium iodide, ferrocenylmethyltrimethylammonium bromide, ferrocenylmethyltrimethyl. And ferrocenylmethyl ammonium salts such as ammonium iodide.
In addition, examples of the ferrocene-based compound in which Me is Fe in the general formula (2) include ferrocenecarboxylic acid.
Moreover, 1-1 'ferrocene dicarboxylic acid is mentioned as a ferrocene type compound whose Me is Fe in said general formula (3).
すなわち、特に好ましいメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体としては、フェロセニルメチルドデシルジメチルアンモニウムブロミドやフェロセニルメチルドデシルジメチルアンモニウムヨージド、フェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミド、フェロセニルメチルトリメチルアンモニウムヨージドなどのフェロセニルメチルアンモニウム塩、フェロセンカルボン酸、１−１’フェロセンジカルボン酸等が挙げられる。 That is, some electron carriers having a particularly preferred metallocene skeleton include ferrocenylmethyldodecyldimethylammonium bromide, ferrocenylmethyldodecyldimethylammonium iodide, ferrocenylmethyltrimethylammonium bromide, ferrocenylmethyltrimethylammonium. Examples thereof include ferrocenylmethylammonium salts such as iodide, ferrocenecarboxylic acid, and 1-1 ′ ferrocenedicarboxylic acid.
また、所定の多孔体に吸着された電子伝達体は、具体的には、シリカ系多孔体やカーボン多孔体などの任意の多孔体に吸着された電子伝達体である。
ここで、所定の多孔体に吸着される電子伝達体は、電子伝達体であれば任意であり、具体的には、例えば、ポリアニリンなどの導電性高分子、キノンやキノン誘導体（ナフトキノンやベンゾキノンなど）などのキノン系化合物、フェロセンやフェロセン誘導体などのフェロセン系化合物、フェリシアン化カリウム、オスミウム錯体、などを用いることができる。
The electron carrier adsorbed on the predetermined porous body is specifically an electron carrier adsorbed on an arbitrary porous body such as a silica-based porous body or a carbon porous body.
Here, the electron carrier to be adsorbed to the predetermined porous body is arbitrary as long as it is an electron carrier. Specifically, for example, conductive polymers such as polyaniline, quinone and quinone derivatives (naphthoquinone, benzoquinone, etc.) ), Ferrocene compounds such as ferrocene and ferrocene derivatives, potassium ferricyanide, osmium complexes, and the like.
なお、検出部１０には、電子伝達体２００として、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（上記の一般式（１）で表される化合物や、上記の一般式（２）で表される化合物、上記の一般式（３）で表される化合物など）及び／又は所定の多孔体に吸着された電子伝達体が添加されていれば良い。
また、検出部１０に添加されるメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。検出部１０に添加される所定の多孔体に吸着された電子伝達体の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。
In addition, in the detection part 10, as the electron mediator 200, some electron mediators having a metallocene skeleton (a compound represented by the above general formula (1) or the above general formula (2) are represented. A compound, a compound represented by the above general formula (3), etc.) and / or an electron carrier adsorbed on a predetermined porous body may be added.
In addition, the type of some of the electron carriers having a metallocene skeleton added to the detection unit 10 may be one type or a plurality of types. The type of the electron carrier adsorbed on the predetermined porous body added to the detection unit 10 may be one type or plural types.
（補酵素）
補酵素３００は、酵素１００の活性の発現を触媒するためのものである。
なお、補酵素３００は、検出部１０に含有されていれば任意であり、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液に溶解した状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０（反応器１０ａに導入された所定の電解液に分散されたシリカ系メソ多孔体１１０、或いは、電極２０等に固定されたシリカ系メソ多孔体１１０）の細孔の内部に導入された状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、作用電極（電極２０）に直接固定された状態で検出部１０に含有されていても良い。
また、補酵素３００は、例えば、補因子としての各種金属原子や金属イオン、金属錯体、各種色素など（例えば、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ３＋等）とともに検出部１０に含有されていても良い。
(Coenzyme)
The coenzyme 300 is for catalyzing the expression of the activity of the enzyme 100.
The coenzyme 300 is optional as long as it is contained in the detection unit 10, for example, it may be contained in the detection unit 10 in a state dissolved in a predetermined electrolytic solution introduced into the reactor 10a. For example, the pores of the silica-based mesoporous material 110 (the silica-based mesoporous material 110 dispersed in a predetermined electrolyte introduced into the reactor 10a, or the silica-based mesoporous material 110 fixed to the electrode 20, etc.) May be contained in the detection unit 10 in a state of being introduced into the inside of the electrode, or may be contained in the detection unit 10 in a state of being directly fixed to the working electrode (electrode 20), for example.
In addition, the coenzyme 300 is included in the detection unit 10 together with, for example, various metal atoms, metal ions, metal complexes, various dyes and the like (eg, Fe 2+ , Mn 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Co 3+, etc.) as cofactors. It may be contained.
例えば、不安的中間体を経由する反応等、酵素１００のアミノ酸側鎖の触媒作用では容易に進まない反応の場合、適当な構造を有し、酵素反応の発現に関与する低分子量の有機小分子や金属イオン、金属錯体などを補因子（cofactor）として使用することが多い。補因子の中でも有機小分子や金属錯体を補酵素と呼ぶ。特に、酵素１００として、補酵素依存型酵素を用いた場合、検出部１０に補酵素３００を導入することによって、酵素反応を効率よく行わせることができる。 For example, in the case of a reaction that does not proceed easily by the catalysis of the amino acid side chain of enzyme 100, such as a reaction via an anxious intermediate, a low molecular weight organic small molecule that has an appropriate structure and is involved in the expression of the enzyme reaction And metal ions and metal complexes are often used as cofactors. Among the cofactors, small organic molecules and metal complexes are called coenzymes. In particular, when a coenzyme-dependent enzyme is used as the enzyme 100, the enzyme reaction can be efficiently performed by introducing the coenzyme 300 into the detection unit 10.
補酵素３００は、酵素１００（補酵素依存型酵素）の種類に応じて、適宜選択することができる。具体的には、補酵素３００としては、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、補酵素Ｉ、補酵素ＩＩ、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、リポ酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）、ピリドキサルリン酸（ＰＡＬＰ）、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ,Coenzyme F）、ＵＤＰグルコース（ＵＤＰＧ）、補酵素Ａ、補酵素Ｑ、ビオチン、補酵素Ｂ12(コバラミン)、Ｓ−アデノシルメチオニン等の１種又は２種以上の組み合わせが挙げられる。 The coenzyme 300 can be appropriately selected depending on the type of the enzyme 100 (coenzyme-dependent enzyme). Specifically, examples of the coenzyme 300 include nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + ), nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + ), coenzyme I, coenzyme II, flavin mononucleotide (FMN), Flavin adenine dinucleotide (FAD), lipoic acid, adenosine triphosphate (ATP), thiamine pyrophosphate (TPP), pyridoxal phosphate (PALP), tetrahydrofolate (THF, Coenzyme F), UDP glucose (UDPG), coenzyme A , coenzyme Q, biotin, coenzyme B 12 (cobalamin), one or more combinations of such S- adenosyl methionine.
ここで、ＮＡＤ＋などの補酵素３００を使用すると、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性が低下することが分かっている。これは、ＮＡＤ＋などの補酵素３００が、シリカ系メソ多孔体１１０表面のシラノール基と反応して、酵素１００の活性に影響を与えるためであると考えられる。
そこで、検出部１０に、補酵素３００を使用した際に生じる酵素１００の活性の低下を抑制するための補酵素用活性低下抑制物質を添加するのが好ましい。
補酵素用活性低下抑制物質としては、例えば、生体高分子や、合成高分子、電解質などが挙げられる。
なお、補酵素用活性低下抑制物質は、検出部１０に含有されていれば任意であり、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液に溶解した状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に導入された状態で検出部１０に含有されていても良い。
Here, it is known that when a coenzyme 300 such as NAD + is used, the activity of the enzyme 100 immobilized in the pores of the silica-based mesoporous material 110 is reduced. This is presumably because the coenzyme 300 such as NAD + reacts with the silanol group on the surface of the silica-based mesoporous material 110 and affects the activity of the enzyme 100.
Therefore, it is preferable to add to the detection unit 10 a coenzyme activity decrease inhibiting substance for suppressing a decrease in the activity of the enzyme 100 that occurs when the coenzyme 300 is used.
Examples of the coenzyme activity decrease inhibitor include biopolymers, synthetic polymers, electrolytes, and the like.
Note that the coenzyme activity decrease inhibiting substance is optional as long as it is contained in the detection unit 10, for example, it is contained in the detection unit 10 in a state dissolved in a predetermined electrolytic solution introduced into the reactor 10a. Alternatively, for example, it may be contained in the detection unit 10 in a state of being introduced into the pores of the silica-based mesoporous material 110.
生体高分子は、分子量１０００以上の生体高分子であれば任意であり、具体的には、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、セルロース、デンプンなどである。 The biopolymer may be any biopolymer having a molecular weight of 1000 or more, and specifically, for example, serum albumin, gelatin, cellulose, starch and the like.
また、合成高分子は、分子量１０００以上の合成高分子であれば任意であり、具体的には、例えば、ポリエチレングリコール、デキストランなどである。 The synthetic polymer is arbitrary as long as it is a synthetic polymer having a molecular weight of 1000 or more, and specifically, for example, polyethylene glycol and dextran.
また、電解質は、反応器１０ａに導入された所定の電解液に溶解して、陽イオンと陰イオンとに電離する物質であれば任意であり、具体的には、例えば、塩化カリウムなどである。 The electrolyte may be any material as long as it dissolves in a predetermined electrolytic solution introduced into the reactor 10a and ionizes into a cation and an anion, and specifically, for example, potassium chloride. .
なお、検出部１０には、補酵素用活性低下抑制物質として、分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び／又は電解質が添加されていれば良い。
また、検出部１０に添加される分子量１０００以上の生体高分子の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。検出部１０に添加される分子量１０００以上の合成高分子の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。検出部１０に添加される電解質の種類は、１種類であっても複数種類であっても良い。
The detection unit 10 may be added with a biopolymer having a molecular weight of 1000 or more, a synthetic polymer having a molecular weight of 1000 or more, and / or an electrolyte as a coenzyme activity decrease inhibitor.
Moreover, the kind of biopolymer having a molecular weight of 1000 or more added to the detection unit 10 may be one kind or plural kinds. The type of synthetic polymer having a molecular weight of 1000 or more added to the detection unit 10 may be one type or plural types. The type of electrolyte added to the detection unit 10 may be one type or a plurality of types.
（電極）
酵素センサ１の電極方式は、作用電極と対照電極との二極方式、作用電極と対照電極と参照電極との三極方式の何れを採用しても良い。
作用電極である電極２０としては、例えば、金、白金、銅、アルミニウム等の貴金属や、ＳｎＯ２、Ｉｎ２Ｏ３、ＷＯ３、ＴｉＯ２、グラファイト、グラッシカーボンなどを用いることができる。
対照電極３０としては、例えば、二極方式の場合は銀、三極方式の場合は銀やその他の金属を用いることができる。
参照電極４０としては、例えば、カロメル電極、銀/塩化銀等を用いることができる。
(electrode)
The electrode system of the enzyme sensor 1 may employ either a bipolar system with a working electrode and a reference electrode or a tripolar system with a working electrode, a control electrode, and a reference electrode.
As the electrode 20 that is a working electrode, for example, a noble metal such as gold, platinum, copper, and aluminum, SnO 2 , In 2 O 3 , WO 3 , TiO 2 , graphite, glassy carbon, or the like can be used.
As the reference electrode 30, for example, silver can be used in the case of the bipolar system, and silver or other metals can be used in the case of the tripolar system.
As the reference electrode 40, for example, a calomel electrode, silver / silver chloride, or the like can be used.
作用電極（電極２０）、対照電極３０及び参照電極４０の一例として、例えば、図１に示すように、電解セルで使用する電極を挙げることができるが、これらの電極は、その大きさ、形状、構成に特に制限されるものではない。
具体的には、例えば、これらの電極は、市販の電解セル、測定セル等で使用する大きな電極であっても良いし、ディスク電極、回転リングディスク電極、ファイバー電極等であっても良いし、例えば、フォトリソグラフィー等の公知の微細加工技術により作製した微小電極（円盤電極、円筒電極、帯状電極、配列帯状電極、配列円盤電極、リング電極、球状電極、櫛型電極、ペア電極等）であっても良い。
Examples of the working electrode (electrode 20), the reference electrode 30, and the reference electrode 40 include, for example, electrodes used in an electrolysis cell as shown in FIG. 1, but these electrodes have a size and a shape. The configuration is not particularly limited.
Specifically, for example, these electrodes may be large electrodes used in commercially available electrolytic cells, measurement cells, etc., or may be disk electrodes, rotating ring disk electrodes, fiber electrodes, etc. For example, microelectrodes (disc electrodes, cylindrical electrodes, strip electrodes, array strip electrodes, array disc electrodes, ring electrodes, spherical electrodes, comb electrodes, pair electrodes, etc.) produced by known microfabrication techniques such as photolithography. May be.
また、これらの電極は、所定の絶縁性基板上に設けることもできる。
具体的には、絶縁性基板上に、各電極を、公知の方法、例えば、スクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法等によって形成することができる。なお、各電極は、全て同一基板上に形成して一体型の酵素センサ１として作製しても良いし、複数の基板上に形成して酵素センサ１を構成しても良いし、別々の電極として作製して酵素センサ１を構成しても良い。
絶縁性基板としては、例えば、セラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料（例えば、微生物生産ポリエステル等）等を用いることができる。
Further, these electrodes can be provided on a predetermined insulating substrate.
Specifically, each electrode can be formed on an insulating substrate by a known method, for example, a screen printing method, a vapor deposition method, a sputtering method, or the like. In addition, all the electrodes may be formed on the same substrate and manufactured as an integrated enzyme sensor 1, or may be formed on a plurality of substrates to constitute the enzyme sensor 1, or separate electrodes. And the enzyme sensor 1 may be configured.
As the insulating substrate, for example, ceramics, glass, plastic, paper, biodegradable material (for example, microorganism-produced polyester) and the like can be used.
（センシング方法）
酵素センサ１によるセンシング方法としては、例えば、電気化学的計測法を用いることができる。すなわち、酸化電流又は還元電流を測定するクロノアンペロメトリー法、クーロメトリー法、サイクリックボルタンメトリー法等の公知の計測法を適用することが可能である。測定方式としては、デスポーザブル方式、バッチ方式、フローインジェクション方式等、何れあっても良い。
(Sensing method)
As a sensing method using the enzyme sensor 1, for example, an electrochemical measurement method can be used. That is, a known measurement method such as a chronoamperometry method, a coulometry method, or a cyclic voltammetry method for measuring an oxidation current or a reduction current can be applied. As a measurement method, any of a disposable method, a batch method, a flow injection method, and the like may be used.
また、電気化学的計測法において、色源体を酸化又は還元した色変化を検出する光検出測定法を適用することも可能である。
具体的には、例えば、グルコースセンサでは、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼの２種類の酵素を固定して、酵素反応（“グルコース＋Ｏ２ ―(グルコースオキシダーゼ)→ グルコン酸＋Ｈ２Ｏ２”、“Ｈ２Ｏ２＋色源体 ―(ペルオキシダーゼ)→ 赤紫色素”）により生成又は消費される過酸化水素と色源体（例えば、４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）−ｍ−トルイジンとの混合物）がペルオキシダーゼを触媒として赤紫色になる色変化を検出することによって、グルコース濃度を測定することができる。
In the electrochemical measurement method, it is also possible to apply a light detection measurement method that detects a color change obtained by oxidizing or reducing a color source.
Specifically, for example, in a glucose sensor, two types of enzymes, glucose oxidase and peroxidase, are immobilized, and an enzyme reaction (“glucose + O 2- (glucose oxidase) → gluconic acid + H 2 O 2 ”, “H 2 O”). 2 + color source-(peroxidase-> magenta dye)) and the hydrogen source and color source (for example, 4-aminoantipyrine and N-ethyl-N (2-hydroxy-3-sulfo). Glucose concentration can be measured by detecting a color change in which a mixture of propyl) -m-toluidine) becomes reddish purple with peroxidase as a catalyst.
測定の際に酵素センサ１を取り付ける測定器本体は、例えば、データをパソコンに有線又は無線で送信できる機能を有し、リアルタイムで測定値を確認できることが好ましい。また、複数種類の酵素センサ１を取り付け可能に構成され、複数種類の酵素センサ１による検出結果を同時に計測して、データを相互比較したり検討したりできる機能を有することが望ましい。 The measuring instrument main body to which the enzyme sensor 1 is attached at the time of measurement preferably has a function capable of transmitting data to a personal computer by wire or wireless, and preferably can confirm the measured value in real time. In addition, it is desirable that a plurality of types of enzyme sensors 1 can be attached, and that the detection results of the plurality of types of enzyme sensors 1 can be simultaneously measured, and data can be compared and examined.
以下、具体的な実施例によって本発明を説明するが、発明はこれらに限定されるものではない。実施例１では、酵素１００の活性を評価するための実験を行った。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to specific examples, but the present invention is not limited thereto. In Example 1, an experiment for evaluating the activity of the enzyme 100 was performed.
（１）シリカ系メソ多孔体１１０の合成
まず、シリカ系メソ多孔体１１０の合成を行った。
具体的には、水ガラス１号２７１．５９ｇを水８２８．４１ｇと混合した後、８０℃に加熱した。別途、ドコシルトリメチルアンモニウムクロライド（ＤＴＭＡ−Ｃｌ）８０ｇを７０℃の水１Ｌに添加し、完全透明液になってから、トリイソピルベンゼン７０ｍＬを更に添加し、ホモミキサーで３０分間激しく攪拌した。この乳化液を水ガラス溶液に瞬時に添加して、更に５分間攪拌した。これに２規定塩酸を約１時間かけて添加し、ｐＨ８．５の状態で約３時間攪拌した。これを吸引濾過した後、７０℃の熱水に再分散・濾過を繰り返した。これを４５℃で３日間乾燥した後、５５０℃の電気炉で６時間焼成することにより、白色粉末状のシリカ系メソ多孔体１１０を得た。
この白色粉末の構造を粉末Ｘ線回折装置（理学ＲＡＤ−Ｂ装置）を用いて測定し、細孔径や表面積及び細孔総容積を窒素吸着装置を用いて測定した結果、白色粉末が平均細孔直径約８．２ｎｍの２次元ヘキサゴナルの細孔配列構造を有するメソポーラスシリカ多孔体の粉末であることを確認した。得られたシリカ系メソ多孔体１１０を、以下「大口径ＦＳＭ」という場合もある。
(1) Synthesis of silica-based mesoporous material 110 First, the silica-based mesoporous material 110 was synthesized.
Specifically, 271.59 g of water glass 1 was mixed with 828.41 g of water, and then heated to 80 ° C. Separately, 80 g of docosyltrimethylammonium chloride (DTMA-Cl) was added to 1 L of water at 70 ° C., and after becoming a completely transparent liquid, 70 mL of triisopyrbenzene was further added and vigorously stirred with a homomixer for 30 minutes. This emulsion was immediately added to the water glass solution and further stirred for 5 minutes. To this was added 2N hydrochloric acid over about 1 hour, and the mixture was stirred at pH 8.5 for about 3 hours. This was subjected to suction filtration, and then redispersed and filtered in hot water at 70 ° C. repeatedly. This was dried at 45 ° C. for 3 days, and then fired in an electric furnace at 550 ° C. for 6 hours to obtain a white powdery silica-based mesoporous material 110.
The structure of this white powder was measured using a powder X-ray diffractometer (Science RAD-B apparatus), and the pore diameter, surface area, and total pore volume were measured using a nitrogen adsorption device. The powder was confirmed to be a porous mesoporous silica material having a two-dimensional hexagonal pore arrangement structure with a diameter of about 8.2 nm. The obtained silica-based mesoporous material 110 may be hereinafter referred to as “large-diameter FSM”.
（２）酵素１００の固定化
次に、シリカ系メソ多孔体１１０に酵素１００を固定した。ここで、酵素１００として、ホルムアルデヒド脱水素酵素を用いた。
具体的には、大口径ＦＳＭの粉末５０ｍｇと、ホルムアルデヒド脱水素酵素の濃度が４．２ｍｇ／ｍＬのホルムアルデヒド脱水素酵素の水溶液（リン酸バッファｐＨ６．９）５ｍＬと、を混合し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で２４時間緩やかに攪拌した。その後、この混合液を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離して固形分を回収して、脱イオン水５ｍＬによる洗浄と、同上の条件での遠心分離とを３回繰り返した。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素を大口径ＦＳＭに固定化した。得られた物質、すなわち、ホルムアルデヒド脱水素酵素が固定された大口径ＦＳＭを、以下「ＦＤＨ固定化ＦＳＭ」という場合もある。
さらに、上記遠心分離で得られた上澄みを用いて大口径ＦＳＭに対するホルムアルデヒド脱水素酵素の吸着量を測定したところ、大口径ＦＳＭに対する吸着量は１３２ｍｇ／ｇであった。
(2) Immobilization of enzyme 100 Next, the enzyme 100 was immobilized on the silica-based mesoporous material 110. Here, formaldehyde dehydrogenase was used as the enzyme 100.
Specifically, 50 mg of large-diameter FSM powder and 5 mL of an aqueous solution of formaldehyde dehydrogenase (phosphate buffer pH 6.9) having a concentration of formaldehyde dehydrogenase of 4.2 mg / mL were mixed, and a rotating device ( The mixture was gently stirred at 4 ° C. for 24 hours. Then, this liquid mixture was centrifuged at 7000 rpm for 3 minutes, solid content was collect | recovered, and washing | cleaning by 5 mL of deionized water, and the centrifugation on the same conditions were repeated 3 times. As a result, formaldehyde dehydrogenase was immobilized on the large-diameter FSM. The obtained substance, that is, the large-diameter FSM on which formaldehyde dehydrogenase is immobilized may be hereinafter referred to as “FDH-immobilized FSM”.
Furthermore, when the amount of formaldehyde dehydrogenase adsorbed on the large-diameter FSM was measured using the supernatant obtained by the above centrifugation, the amount adsorbed on the large-diameter FSM was 132 mg / g.
（３）酵素１００の活性試験
次に、酵素１００の活性を測定した。
ここで、ホルムアルデヒド脱水素酵素が、補酵素（ＮＡＤ＋）の存在下で、基質であるホルムアルデヒドをギ酸に酸化する反応（ＨＣＨＯ ＋ ＮＡＤ＋ ＋ ３Ｈ２Ｏ ―（ホルムアルデヒド脱水素酵素）→ ＨＣＯＯ− ＋ ＮＡＤＨ ＋ ２Ｈ３Ｏ＋）を利用して、酵素１００の活性を測定した。すなわち、ＮＡＤ＋（酸化型）の還元により生じるＮＡＤＨ（還元型）に特徴的な波長３４０ｎｍ（ε340＝６２２２Ｍ−１ｃｍ−１）を選び、その吸光度の変化から、生成したＮＡＤＨ濃度を求めることによって、酵素１００の活性を測定した。
(3) Activity test of enzyme 100 Next, the activity of the enzyme 100 was measured.
Here, a reaction in which formaldehyde dehydrogenase oxidizes formaldehyde as a substrate to formic acid in the presence of a coenzyme (NAD + ) (HCHO + NAD + + 3H 2 O − (formaldehyde dehydrogenase) → HCOO − + NADH + 2H 3 O + ) was used to measure the activity of enzyme 100. That is, a wavelength 340 nm (ε 340 = 6222 M −1 cm −1 ) characteristic of NADH (reduced type) generated by reduction of NAD + (oxidized type) is selected, and the generated NADH concentration is obtained from the change in absorbance. Was used to measure the activity of enzyme 100.
（３−１）固定化酵素の活性
まず、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性を測定した。
具体的には、リン酸緩衝液２．５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを０．６４ｍｇ加えて分散させ、１．２ｍｇの補酵素（ＮＡＤ＋）と、３００μＬの基質水溶液（ホルムアルデヒドの濃度が０．３％のホルムアルデヒド水溶液）と、を加え、３０℃で反応させた。そして、補酵素及び基質水溶液を添加してから反応が平衡に達するまでの間、３４０ｎｍの吸光度を測定した。比較のために、遊離酵素（遊離ホルムアルデヒド脱水素酵素）に対しても同様の測定を行った。なお、測定に使用した、大口径ＦＳＭに固定された酵素１００と、遊離酵素と、の酵素量は同一に設定した。その結果を図４に示す。
(3-1) Activity of Immobilized Enzyme First, the activity of the enzyme 100 immobilized inside the pores of the silica-based mesoporous material 110 was measured.
Specifically, 0.64 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above was added and dispersed in 2.5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), and 1.2 mg of coenzyme (NAD + ) and 300 μL. A substrate aqueous solution (formaldehyde aqueous solution having a formaldehyde concentration of 0.3%) was added and reacted at 30 ° C. Then, the absorbance at 340 nm was measured from when the coenzyme and the aqueous substrate solution were added until the reaction reached equilibrium. For comparison, the same measurement was performed for free enzyme (free formaldehyde dehydrogenase). The enzyme amounts of the enzyme 100 fixed to the large-diameter FSM used for the measurement and the free enzyme were set to be the same. The result is shown in FIG.
図４においては、横軸に反応時間、縦軸に３４０ｎｍの吸光度を示す。実線は大口径ＦＳＭに固定された酵素１００（固定化酵素）、破線は遊離酵素を示す。 In FIG. 4, the horizontal axis represents the reaction time, and the vertical axis represents the absorbance at 340 nm. The solid line indicates the enzyme 100 (immobilized enzyme) immobilized on the large-diameter FSM, and the broken line indicates the free enzyme.
図４によれば、大口径ＦＳＭに固定された酵素１００は、遊離酵素と同程度に反応が進行することが分かった。
これにより、大口径ＦＳＭの細孔の内部に固定された酵素１００が変性せずに活性を維持していることが分かった。
According to FIG. 4, it was found that the enzyme 100 fixed to the large-diameter FSM proceeds to the same extent as the free enzyme.
Thereby, it was found that the enzyme 100 fixed inside the pores of the large-diameter FSM maintained the activity without being denatured.
（３−２）固定化酵素の活性の経時変化
次に、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性の経時変化を測定した。
(3-2) Time-dependent change in activity of immobilized enzyme Next, the time-dependent change in activity of the enzyme 100 immobilized in the pores of the silica-based mesoporous material 110 was measured.
具体的には、まず、試料[１]〜[４]を作成した。 Specifically, first, samples [1] to [4] were prepared.
試料[１]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [1] was dispersed in 5 mL of phosphate buffer solution (pH = 7.41) by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above and gently applied to a rotating device (about 100 rpm) at 4 ° C. for 1 hour. Created by stirring.
試料[２]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [2] was dispersed by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), adding 1.8 mg of NAD + , and rotating the apparatus (about 100 rpm) and gently stirred at 4 ° C. for 1 hour.
試料[３]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．３ｍｇのナフトキノンを添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [3] was dispersed by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), adding 1.3 mg of naphthoquinone, and rotating the apparatus (about 100 rpm). ) And gently stirring at 4 ° C. for 1 hour.
試料[４]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋と１．３ｍｇのナフトキノンとを添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [4] was prepared by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41) and dispersing 1.8 mg of NAD + and 1.3 mg of naphthoquinone. It was made by adding and gently stirring at 4 ° C. for 1 hour on a rotating device (about 100 rpm).
次いで、上記作成した試料のそれぞれに、１．２ｍｇの補酵素（ＮＡＤ＋）と、３００μＬの基質水溶液（ホルムアルデヒドの濃度が０．３％のホルムアルデヒド水溶液）と、を加え、３０℃で反応させた。そして、補酵素及び基質水溶液を添加してから反応が平衡に達するまでの間、３４０ｎｍの吸光度を測定した。その後、吸光度測定に使用した試料のそれぞれを３０℃で保存し、３日後、７日後、９日後、１３日後、１６日後及び２２日後に同様の測定を行った。その結果を図５に示す。 Next, 1.2 mg of coenzyme (NAD + ) and 300 μL of a substrate aqueous solution (formaldehyde aqueous solution having a formaldehyde concentration of 0.3%) were added to each of the prepared samples and reacted at 30 ° C. . Then, the absorbance at 340 nm was measured from when the coenzyme and the aqueous substrate solution were added until the reaction reached equilibrium. Thereafter, each of the samples used for the absorbance measurement was stored at 30 ° C., and the same measurement was performed after 3, 7, 9, 13, 16, and 22 days. The result is shown in FIG.
図５においては、横軸に日数、縦軸に初日（０日目）における酵素活性を１００％とした場合の相対活性、すなわち、初日における平衡状態での３４０ｎｍの吸光度を１００％とした場合の相対吸光度を示す。丸プロット（○）は試料[１]の結果、三角プロット（△）は試料[２]の結果、四角プロット（□）は試料[３]の結果、菱型プロット（◇）は試料[４]の結果を示す。 In FIG. 5, the horizontal axis represents the number of days, and the vertical axis represents the relative activity when the enzyme activity on the first day (day 0) is 100%, that is, the absorbance at 340 nm in the equilibrium state on the first day is 100%. Relative absorbance is shown. Circle plot (○) shows the result of sample [1], triangle plot (△) shows the result of sample [2], square plot (□) shows the result of sample [3], diamond plot (◇) shows the sample [4] The results are shown.
図５によれば、試料[１]、すなわち、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００は、２０日後も８０％以上の酵素活性を保つことが分かった。
これにより、酵素１００をシリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定することによって、酵素１００の活性の低下を抑制できることが分かった。
According to FIG. 5, it was found that the sample [1], that is, the enzyme 100 immobilized inside the pores of the silica-based mesoporous material 110, maintained an enzyme activity of 80% or more even after 20 days.
Thereby, it turned out that the fall of the activity of the enzyme 100 can be suppressed by fixing the enzyme 100 inside the pore of the silica-type mesoporous material 110. FIG.
また、図５によれば、ＮＡＤ＋を添加した試料（試料[２]）は、ＮＡＤ＋を添加していない試料（試料[１]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが大きいことが分かった。
これは、ＮＡＤ＋が、大口径ＦＳＭ表面のシラノール基と反応して、酵素活性に影響を与えているためと考えられる。
Further, according to FIG. 5, the sample with the NAD + added (sample [2]) has a greater degree of decrease in enzyme activity than the sample without the NAD + added (sample [1]). I understood.
This is presumably because NAD + reacts with silanol groups on the surface of the large-diameter FSM to affect the enzyme activity.
また、図５によれば、ナフトキノンを添加した試料（試料[３]）は、ナフトキノンを添加していない試料（試料[１]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが大きいことが分かった。さらに、ナフトキノンを添加した試料（試料[３]）は、ＮＡＤ＋を添加した試料（試料[２]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが大きいことが分かった。
これは、ナフトキノンが、ＦＤＨ固定化ＦＳＭ中の酵素１００の活性中心に吸着して、活性を阻害しているためと考えられる。
Further, according to FIG. 5, it is found that the sample (sample [3]) to which naphthoquinone is added has a greater degree of decrease in enzyme activity than the sample to which naphthoquinone is not added (sample [1]). It was. Furthermore, the sample (sample [3]) to which naphthoquinone was added was found to have a greater degree of decrease in enzyme activity than the sample to which NAD + was added (sample [2]).
This is probably because naphthoquinone is adsorbed on the active center of the enzyme 100 in the FDH-immobilized FSM to inhibit the activity.
また、図５によれば、ＮＡＤ＋及びナフトキノンを添加した試料（試料[４]）は、ＮＡＤ＋及びナフトキノンを添加していない試料（試料[１]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが大きいことが分かった。さらに、ＮＡＤ＋及びナフトキノンを添加した試料（試料[４]）は、ＮＡＤ＋のみを添加した試料（試料[２]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが大きく、ナフトキノンのみを添加した試料（試料[３]）と比較して、酵素活性の低下の度合いが小さいことが分かった。
これは、酵素１００の活性中心付近のＮＡＤ＋の存在によって、酵素１００の活性中心へのナフトキノンの吸着が抑制されたためと考えられる。
In addition, according to FIG. 5, the samples with added NAD + and naphthoquinone (Sample [4]), as compared to the sample without the addition of NAD + and naphthoquinone (Sample [1]), the decrease in enzyme activity It turns out that the degree is large. In addition, the sample to which NAD + and naphthoquinone were added (sample [4]) had a greater degree of decrease in enzyme activity than the sample to which only NAD + was added (sample [2]), and only naphthoquinone was added. It was found that the degree of decrease in enzyme activity was small compared to the sample (Sample [3]).
This is considered to be because the adsorption of naphthoquinone to the active center of the enzyme 100 was suppressed by the presence of NAD + near the active center of the enzyme 100.
（３−３）ＮＡＤ＋及び補酵素用活性低下抑制物質の添加に伴う固定化酵素の活性の経時変化
次に、ＮＡＤ＋及び補酵素用活性低下抑制物質（電解質、分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子）の添加に伴う、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定化された酵素１００の活性の経時変化を測定した。
(3-3) NAD + and time course of the activity of the immobilized enzyme with the addition of coenzyme for activity reduction inhibitor Then, NAD + and the coenzyme for activity reduction suppressing agent (electrolyte, a molecular weight of 1,000 or more biopolymers The time course of the activity of the enzyme 100 immobilized in the pores of the silica-based mesoporous material 110 with the addition of a synthetic polymer having a molecular weight of 1000 or more was measured.
具体的には、まず、試料[５]〜[７]を作成した。また、比較のために試料[８]を作成した。 Specifically, first, samples [5] to [7] were prepared. Sample [8] was prepared for comparison.
試料[５]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、電解質（１２ｍｇの塩化カリウム）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [5] was dispersed by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), adding 1.8 mg of NAD + and electrolyte (12 mg). Of potassium chloride) was added, and the mixture was gently stirred for 1 hour at 4 ° C. on a rotating apparatus (about 100 rpm).
試料[６]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の生体高分子（２０ｍｇのウシ血清アルブミン）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [6] was dispersed by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), adding 1.8 mg of NAD +, and having a molecular weight of 1000 or more. The biopolymer (20 mg of bovine serum albumin) was added, and the mixture was gently stirred at 4 ° C. for 1 hour on a rotating device (about 100 rpm).
試料[７]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の合成高分子（２０ｍｇのデキストラン）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [7] was dispersed by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above in 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), adding 1.8 mg of NAD +, and having a molecular weight of 1000 or more. The synthetic polymer (20 mg of dextran) was added, and the mixture was gently stirred at 4 ° C. for 1 hour on a rotating device (about 100 rpm).
試料[８]は、ホルムアルデヒド脱水素酵素が固定されたアミノ基修飾ＦＳＭを作成し、そして、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、作成したアミノ基修飾ＦＳＭを加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。
具体的には、上記作成した大口径ＦＳＭ５０ｍｇに、３−ＡＰＴＥＳを２ｍＬ、エタノールを１８ｍＬ添加して緩やかに３時間攪拌し、大口径ＦＳＭ表面のシラノール基にアミノ基を修飾した。次いで、脱水エタノールで洗浄し、４５℃で一晩乾燥させ、アミノ基修飾ＦＳＭを作成した。そして、作成したアミノ基修飾ＦＳＭの粉末と、ホルムアルデヒド脱水素酵素の濃度が４．２ｍｇ／ｍＬのホルムアルデヒド脱水素酵素の水溶液（リン酸バッファｐＨ６．９）５ｍＬと、を混合し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で２４時間緩やかに攪拌した。その後、この混合液を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離して固形分を回収して、脱イオン水５ｍＬによる洗浄と、同上の条件での遠心分離とを３回繰り返した。これにより、ホルムアルデヒド脱水素酵素が固定されたアミノ基修飾ＦＳＭを作成した。
For sample [8], an amino group-modified FSM in which formaldehyde dehydrogenase was immobilized was prepared, and the prepared amino group-modified FSM was added to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41) and dispersed. It was prepared by adding 1.8 mg of NAD + and gently stirring at 4 ° C. for 1 hour on a rotator (about 100 rpm).
Specifically, 2 mL of 3-APTES and 18 mL of ethanol were added to 50 mg of the large-diameter FSM prepared above and gently stirred for 3 hours to modify the amino group on the silanol group on the surface of the large-diameter FSM. Subsequently, it was washed with dehydrated ethanol and dried overnight at 45 ° C. to prepare an amino group-modified FSM. Then, the prepared amino group-modified FSM powder was mixed with 5 mL of an aqueous formaldehyde dehydrogenase solution (phosphate buffer pH 6.9) having a concentration of formaldehyde dehydrogenase of 4.2 mg / mL, and a rotating device (about The mixture was gently stirred at 4 ° C. for 24 hours. Then, this liquid mixture was centrifuged at 7000 rpm for 3 minutes, solid content was collect | recovered, and washing | cleaning by 5 mL of deionized water, and the centrifugation on the same conditions were repeated 3 times. As a result, an amino group-modified FSM in which formaldehyde dehydrogenase was immobilized was prepared.
次いで、上記作成した試料のそれぞれに、１．２ｍｇの補酵素（ＮＡＤ＋）と、３００μＬの基質水溶液（ホルムアルデヒドの濃度が０．３％のホルムアルデヒド水溶液）と、を加え、３０℃で反応させた。そして、補酵素及び基質水溶液を添加してから反応が平衡に達するまでの間、３４０ｎｍの吸光度を測定した。その後、吸光度測定に使用した試料のそれぞれを３０℃で保存し、１日後、２日後、３日後、７日後、１０日後、２１日後及び３４日後に同様の測定を行った。その結果を図６に示す。 Next, 1.2 mg of coenzyme (NAD + ) and 300 μL of a substrate aqueous solution (formaldehyde aqueous solution having a formaldehyde concentration of 0.3%) were added to each of the prepared samples and reacted at 30 ° C. . Then, the absorbance at 340 nm was measured from when the coenzyme and the aqueous substrate solution were added until the reaction reached equilibrium. Then, each sample used for absorbance measurement was stored at 30 ° C., and the same measurement was performed after 1 day, 2 days, 3 days, 7 days, 10 days, 21 days, and 34 days. The result is shown in FIG.
図６においては、横軸に日数、縦軸に初日（０日目）における酵素活性を１００％とした場合の相対活性、すなわち、初日における平衡状態での３４０ｎｍの吸光度を１００％とした場合の相対吸光度を示す。丸プロット（○）は試料[５]の結果、三角プロット（△）は試料[６]の結果、四角プロット（□）は試料[７]の結果、菱型プロット（◇）は試料[８]の結果を示す。 In FIG. 6, the horizontal axis represents the number of days, the vertical axis represents the relative activity when the enzyme activity on the first day (day 0) is 100%, that is, the absorbance at 340 nm in the equilibrium state on the first day is 100%. Relative absorbance is shown. Circle plot (○) shows the result of sample [5], triangle plot (△) shows the result of sample [6], square plot (□) shows the result of sample [7], diamond plot (◇) shows the sample [8] The results are shown.
図６によれば、分子量１０００以上の生体高分子（ウシ血清アルブミン）を添加した試料（試料[６]）では、測定の期間中、ＮＡＤ＋の添加に伴う酵素活性の低下が生じないことが分かった。
また、図６によれば、電解質（塩化カリウム）を添加した試料（試料[５]）や分子量１０００以上の合成高分子（デキストラン）を添加した試料（試料[７]）では、ＮＡＤ＋の添加に伴う酵素活性の低下が抑制されることが分かった。
これにより、電解質の電離により生じる陽イオンや分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子が、大口径ＦＳＭ表面に吸着して、ＮＡＤ＋が大口径ＦＳＭ表面のシラノール基と反応するのを抑制し、ＮＡＤ＋の添加に伴う酵素活性の低下が抑制されることが分かった。中でも、分子量１０００以上の生体高分子（ウシ血清アルブミン）は、ＮＡＤ＋が大口径ＦＳＭ表面のシラノール基と反応するのを好適に抑制できることが分かった。
According to FIG. 6, in the sample (sample [6]) to which a biopolymer (bovine serum albumin) having a molecular weight of 1000 or more is added, the enzyme activity does not decrease with the addition of NAD + during the measurement period. I understood.
Further, according to FIG. 6, NAD + is added to the sample (sample [5]) to which the electrolyte (potassium chloride) is added and the sample to which the synthetic polymer (dextran) having a molecular weight of 1000 or more (sample [7]) is added. It was found that the decrease in enzyme activity associated with was suppressed.
As a result, cations generated by ionization of the electrolyte, biopolymers having a molecular weight of 1000 or more, and synthetic polymers having a molecular weight of 1000 or more are adsorbed on the surface of the large-diameter FSM, and NAD + reacts with silanol groups on the surface of the large-diameter FSM. It was found that the decrease in enzyme activity accompanying the addition of NAD + is suppressed. Among them, it was found that a biopolymer (bovine serum albumin) having a molecular weight of 1000 or more can suitably suppress NAD + from reacting with a silanol group on the surface of a large-diameter FSM.
（３−４）活性低下抑制型の電子伝達体の添加に伴う固定化酵素の活性の経時変化
次に、活性低下抑制型の電子伝達体（メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（上記の一般式（１）で表される化合物や、上記の一般式（２）で表される化合物、上記の一般式（３）で表される化合物など）、所定の多孔体に吸着された電子伝達体）の添加に伴う、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性の経時変化を測定した。
(3-4) Time-dependent change in the activity of the immobilized enzyme accompanying the addition of the activity-reduction-suppressing electron carrier Next, the activity-reduction-suppressing electron carrier (some electron carriers having a metallocene skeleton (above-mentioned) A compound represented by the general formula (1), a compound represented by the above general formula (2), a compound represented by the above general formula (3), and the like. The time course of the activity of the enzyme 100 immobilized inside the pores of the silica-based mesoporous material 110 was measured.
具体的には、まず、試料[９]〜[１３]、[１５]、[１６]を作成した。また、比較のために試料[１４]、[１７]、[１８]を作成した。 Specifically, first, samples [9] to [13], [15], and [16] were prepared. Samples [14], [17], and [18] were prepared for comparison.
試料[９]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（１．２ｍｇのフェロセンカルボン酸）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [9] was prepared by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41) and dispersing the sample to disperse some electron carriers having a metallocene skeleton (1.2 mg). Of ferrocenecarboxylic acid) was added, and the mixture was gently stirred at 4 ° C. for 1 hour on a rotating apparatus (about 100 rpm).
試料[１０]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、メタロセン骨格を有するその他の電子伝達体（１．１ｍｇのヒドロキシメチルフェロセン）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [10] was prepared by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41) and dispersing it, and then transferring another electron carrier (1.1 mg of metallocene skeleton). Hydroxymethylferrocene) was added, and the mixture was gently stirred for 1 hour at 4 ° C. on a rotating apparatus (about 100 rpm).
試料[１１]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、メタロセン骨格を有するその他の電子伝達体（１．２ｍｇのジメチルアミノメチルフェロセン）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [11] was prepared by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of a phosphate buffer (pH = 7.41) and dispersing it, and dispersing another electron carrier (1.2 mg of metallocene skeleton). Dimethylaminomethylferrocene) was added and the mixture was gently stirred for 1 hour at 4 ° C. on a rotating device (about 100 rpm).
試料[１２]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、メタロセン骨格を有するその他の電子伝達体（１．７ｍｇのη-ベンゼンヘキサフルオロフォスファート）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [12] was prepared by dispersing 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above in 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), and dispersing the other electron carrier (1.7 mg of metallocene skeleton). (η-benzenehexafluorophosphate) was added and the mixture was gently stirred for 1 hour at 4 ° C. on a rotating apparatus (about 100 rpm).
試料[１３]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（１．７ｍｇのフェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミド）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [13] was prepared by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41) and dispersing the sample, and transferring a part of the electron carrier (1.7 mg) having a metallocene skeleton. Of ferrocenylmethyltrimethylammonium bromide) was added to the rotator (about 100 rpm) and gently stirred at 4 ° C. for 1 hour.
試料[１４]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、電子伝達体として金属錯体（３．５ｍｇのルテニウムレッド）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [14] was prepared by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of a phosphate buffer (pH = 7.41) and dispersing it, and using a metal complex (3.5 mg of ruthenium red) as an electron carrier. Was added to the rotator (about 100 rpm) and stirred gently at 4 ° C. for 1 hour.
試料[１５]は、所定の多孔体（１０ｍｇのモレキュラーシーブ（孔径：１ｎｍ））に、電子伝達体としてキノン系化合物（１．３ｍｇのナフトキノン）を吸着させ、遠心分離によりキノンで着色された残留物を抽出することによって、ナフトキノン吸着モレキュラーシーブを作成した。そして、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加え、作成したナフトキノン吸着モレキュラーシーブを全て添加して分散させ、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [15] is a residue obtained by adsorbing a quinone compound (1.3 mg of naphthoquinone) as an electron carrier to a predetermined porous body (10 mg of molecular sieve (pore diameter: 1 nm)) and coloring with quinone by centrifugation. By extracting the product, a naphthoquinone adsorption molecular sieve was prepared. Then, 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above is added to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), and all of the prepared naphthoquinone adsorption molecular sieve is added and dispersed, and then applied to a rotating device (about 100 rpm). It was prepared by gently stirring at 4 ° C. for 1 hour.
試料[１６]は、所定の多孔体（８．０ｍｇのカーボン多孔体）に、電子伝達体として導電性高分子（２．０ｍｇのポリアニリン）を吸着させることによって、ポリアリニン吸着カーボン多孔体を作成した。そして、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加え、作成したポリアリニン吸着カーボン多孔体を全て添加して分散させ、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [16] was prepared by adsorbing a conductive polymer (2.0 mg of polyaniline) as an electron carrier to a predetermined porous body (8.0 mg of carbon porous body), thereby preparing a polyarinin-adsorbing carbon porous body. . Then, 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above was added to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), and all of the prepared polyarinin-adsorbed carbon porous material was added and dispersed, and a rotating device (about 100 rpm) And then gently stirring at 4 ° C. for 1 hour.
試料[１７]は、試料[８]と同様にしてホルムアルデヒド脱水素酵素が固定されたアミノ基修飾ＦＳＭを作成し、そして、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、作成したアミノ基修飾ＦＳＭを加えて分散させ、１．３ｍｇのナフトキノンを添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [17] was prepared in the same manner as Sample [8] to prepare an amino group-modified FSM in which formaldehyde dehydrogenase was immobilized, and the prepared amino group was added to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41). The modified FSM was added and dispersed, and 1.3 mg of naphthoquinone was added, and the mixture was gently stirred at 4 ° C. for 1 hour on a rotating device (about 100 rpm).
試料[１８]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．３ｍｇのナフトキノンを添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [18] was dispersed by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), adding 1.3 mg of naphthoquinone, and rotating the apparatus (about 100 rpm). ) And gently stirring at 4 ° C. for 1 hour.
次いで、上記作成した試料のそれぞれに、１．２ｍｇの補酵素（ＮＡＤ＋）と、３００μＬの基質水溶液（ホルムアルデヒドの濃度が０．３％のホルムアルデヒド水溶液）と、を加え、３０℃で反応させた。そして、補酵素及び基質水溶液を添加してから反応が平衡に達するまでの間、３４０ｎｍの吸光度を測定した。その後、吸光度測定に使用した試料のそれぞれを３０℃で保存し、１日後、２日後、３日後、７日後、１０日後、２１日後及び３４日後に同様の測定を行った。その結果を図７に示す。 Next, 1.2 mg of coenzyme (NAD + ) and 300 μL of a substrate aqueous solution (formaldehyde aqueous solution having a formaldehyde concentration of 0.3%) were added to each of the prepared samples and reacted at 30 ° C. . Then, the absorbance at 340 nm was measured from when the coenzyme and the aqueous substrate solution were added until the reaction reached equilibrium. Then, each sample used for absorbance measurement was stored at 30 ° C., and the same measurement was performed after 1 day, 2 days, 3 days, 7 days, 10 days, 21 days, and 34 days. The result is shown in FIG.
図７においては、横軸に日数、縦軸に初日（０日目）における酵素活性を１００％とした場合の相対活性、すなわち、初日における平衡状態での３４０ｎｍの吸光度を１００％とした場合の相対吸光度を示す。白丸プロット（○）は試料[９]の結果、白三角プロット（△）は試料[１０]の結果、白四角プロット（□）は試料[１１]の結果、白菱型プロット（◇）は試料[１２]の結果、白逆三角プロット（▽）は試料[１３]の結果、黒丸プロット（●）は試料[１４]の結果、黒三角プロット（▲）は試料[１５]の結果、黒四角プロット（■）は試料[１６]の結果、黒菱型プロット（◆）は試料[１７]の結果、黒逆三角プロット（▼）は試料[１８]の結果を示す。 In FIG. 7, the horizontal axis represents the number of days and the vertical axis represents the relative activity when the enzyme activity on the first day (day 0) is 100%, that is, the absorbance at 340 nm in the equilibrium state on the first day is 100%. Relative absorbance is shown. The white circle plot (◯) is the result of sample [9], the white triangle plot (Δ) is the result of sample [10], the white square plot (□) is the result of sample [11], and the white diamond plot (◇) is the sample [9]. 12] As a result, the white inverted triangle plot (▽) is the result of sample [13], the black circle plot (●) is the result of sample [14], the black triangle plot (▲) is the result of sample [15], and the black square plot (■) shows the result of sample [16], black diamond-shaped plot (♦) shows the result of sample [17], and black inverted triangle plot (▼) shows the result of sample [18].
図７によれば、電子伝達体２００として所定の多孔体に吸着された電子伝達体（キノン系化合物）を添加した試料、すなわち、ナフトキノン吸着モレキュラーシーブを添加した試料（試料[１５]）や、電子伝達体２００として所定の多孔体に吸着された電子伝達体（導電性高分子）を添加した試料、すなわち、ポリアリニン吸着カーボン多孔体を添加した試料（試料[１６]）では、酵素活性の低下が抑制され、試料[１６]は、３０日後も９０％程度の酵素活性が保たれ、試料[１５]は、３０日後も８０％程度の酵素活性が保たれることが分かった。
これにより、キノン系化合物や導電性高分子などの電子伝達体を所定の多孔体に吸着させることによって、キノン系化合物や導電性高分子などの電子伝達体が酵素１００の活性中心に吸着しにくくなり、酵素活性の低下が抑制されることが分かった。
According to FIG. 7, a sample to which an electron carrier (quinone compound) adsorbed on a predetermined porous body is added as the electron carrier 200, that is, a sample to which a naphthoquinone adsorption molecular sieve is added (sample [15]), In a sample to which an electron carrier (conductive polymer) adsorbed on a predetermined porous body is added as the electron carrier 200, that is, a sample to which a polyarinin-adsorbed carbon porous body is added (sample [16]), the enzyme activity decreases. It was found that the sample [16] maintained about 90% of the enzyme activity even after 30 days, and the sample [15] maintained about 80% of the enzyme activity after 30 days.
Thus, an electron carrier such as a quinone compound or a conductive polymer is adsorbed to a predetermined porous body, so that an electron carrier such as a quinone compound or a conductive polymer is difficult to adsorb on the active center of the enzyme 100. Thus, it was found that the decrease in enzyme activity was suppressed.
また、図７によれば、フェロセン系化合物の中でも、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体を添加した試料（すなわち、フェロセンカルボン酸を添加した試料（試料[９]）、フェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミドを添加した試料（試料[１３]））では、酵素活性の低下が抑制されることが分かった。特に、試料[１３]は、２０日後も７０％程度の酵素活性が保たれ、試料[９]は、２０日後も５０％程度の酵素活性が保たれることが分かった。
これにより、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体は、ナフサキノンなどのキノン系化合物と比較して、酵素１００の活性中心に吸着しにくく、酵素活性の低下を引き起こしにくいことが分かった。
一方、フェロセン系化合物の中でも、メタロセン骨格を有するその他の電子伝達体を添加した試料（すなわち、ヒドロキシメチルフェロセンを添加した試料（試料[１０]）、ジメチルアミノメチルフェロセンを添加した試料（試料[１１]）、η-ベンゼンヘキサフルオロフォスファートを添加した試料（試料[１２]））では、酵素活性の低下を引き起こし、長期安定性は見込めないことが分かった。
Further, according to FIG. 7, among ferrocene compounds, a sample to which a part of an electron carrier having a metallocene skeleton was added (that is, a sample to which ferrocenecarboxylic acid was added (sample [9]), ferrocenylmethyltrimethyl, In the sample to which ammonium bromide was added (sample [13]), it was found that the decrease in enzyme activity was suppressed. In particular, it was found that sample [13] retained about 70% enzyme activity even after 20 days, and sample [9] retained about 50% enzyme activity after 20 days.
Accordingly, it was found that some electron carriers having a metallocene skeleton are less likely to be adsorbed to the active center of the enzyme 100 and less likely to cause a decrease in enzyme activity than quinone compounds such as naphthaquinone.
On the other hand, among ferrocene compounds, a sample to which another electron carrier having a metallocene skeleton is added (that is, a sample to which hydroxymethylferrocene is added (sample [10]), a sample to which dimethylaminomethylferrocene is added (sample [11] ]), A sample to which η-benzenehexafluorophosphate was added (sample [12])) was found to cause a decrease in enzyme activity and long-term stability was not expected.
（３−５）ＮＡＤ＋、補酵素用活性低下抑制物質及び活性低下抑制型の電子伝達体の添加に伴う固定化酵素の活性の経時変化
次に、ＮＡＤ＋、補酵素用活性低下抑制物質（分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子）及び活性低下抑制型の電子伝達体（メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体、所定の多孔体に吸着された電子伝達体）の添加に伴う、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性の経時変化を測定した。
(3-5) NAD + , Coenzyme Activity Decrease Inhibitor, and Change in Activity of Immobilized Enzyme Accompanying Addition of Activity Decrease Inhibition Type Electron Carrier Next, NAD + , Coenzyme Activity Decrease Inhibitor ( A biopolymer having a molecular weight of 1000 or more, a synthetic polymer having a molecular weight of 1000 or more) and an activity-reduction-suppressing electron carrier (some electron carriers having a metallocene skeleton, an electron carrier adsorbed on a predetermined porous body) The change over time of the activity of the enzyme 100 immobilized inside the pores of the silica-based mesoporous material 110 accompanying the addition was measured.
具体的には、まず、試料[１９]〜[２２]を作成した。また、比較のために試料[２３]を作成した。 Specifically, first, samples [19] to [22] were prepared. A sample [23] was prepared for comparison.
試料[１９]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の生体高分子（２０ｍｇのウシ血清アルブミン）及びメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（１．２ｍｇのフェロセンカルボン酸）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [19] was dispersed by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), adding 1.8 mg of NAD +, and having a molecular weight of 1000 or more. Of a biopolymer (20 mg bovine serum albumin) and a part of an electron carrier having a metallocene skeleton (1.2 mg of ferrocenecarboxylic acid) were added and gently stirred at 4 ° C. for 1 hour on a rotating device (about 100 rpm). Created by.
試料[２０]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の生体高分子（２０ｍｇのウシ血清アルブミン）及びメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（１．７ｍｇのフェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミド）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [20] was dispersed by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), adding 1.8 mg of NAD +, and having a molecular weight of 1000 or more. Of biopolymer (20 mg bovine serum albumin) and a part of electron carrier with metallocene skeleton (1.7 mg ferrocenylmethyltrimethylammonium bromide) are added to a rotating device (about 100 rpm) at 4 ° C. It was created by stirring gently for a time.
試料[２１]は、所定の多孔体（８．０ｍｇのカーボン多孔体）に、電子伝達体として導電性高分子（２．０ｍｇのポリアニリン）を吸着させることによって、ポリアリニン吸着カーボン多孔体を作成した。そして、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加え、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の生体高分子（２０ｍｇのウシ血清アルブミン）と作成したポリアリニン吸着カーボン多孔体の全てとを添加して分散させ、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [21] was prepared by adsorbing a conductive polymer (2.0 mg of polyaniline) as an electron carrier to a predetermined porous body (8.0 mg of carbon porous body), thereby preparing a polyarinin-adsorbing carbon porous body. . Then, 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above was added to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), 1.8 mg of NAD + was added, and a biopolymer having a molecular weight of 1000 or more (20 mg of 20 mg Bovine serum albumin) and all of the prepared polyarinin-adsorbed carbon porous material were added and dispersed, and the mixture was prepared by gently stirring at 4 ° C. for 1 hour on a rotating device (about 100 rpm).
試料[２２]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、分子量１０００以上の合成高分子（２０ｍｇのポリエチレングリコール）及びメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（１．８ｍｇのフェロセニルメチルトリメチルアンモニウムブロミド）を添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [22] was dispersed by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above to 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), adding 1.8 mg of NAD +, and having a molecular weight of 1000 or more. Of a synthetic polymer (20 mg of polyethylene glycol) and a part of an electron carrier having a metallocene skeleton (1.8 mg of ferrocenylmethyltrimethylammonium bromide) were added to a rotating apparatus (about 100 rpm) at 4 ° C. for 1 hour. It was created by gently stirring.
試料[２３]は、リン酸緩衝液５ｍＬ（ｐＨ＝７．４１）に、上記作成したＦＤＨ固定化ＦＳＭを５６．６ｍｇ加えて分散させ、１．８ｍｇのＮＡＤ＋を添加するとともに、１．３ｍｇのナフトキノンを添加し、回転装置（約１００ｒｐｍ）にかけて４℃で１時間緩やかに攪拌することにより作成した。 Sample [23] was dispersed by adding 56.6 mg of the FDH-immobilized FSM prepared above in 5 mL of phosphate buffer (pH = 7.41), adding 1.8 mg of NAD + and 1.3 mg Of naphthoquinone was added, and the mixture was gently stirred for 1 hour at 4 ° C. on a rotating device (about 100 rpm).
次いで、上記作成した試料のそれぞれに、１．２ｍｇの補酵素（ＮＡＤ＋）と、３００μＬの基質水溶液（ホルムアルデヒドの濃度が０．３％のホルムアルデヒド水溶液）と、を加え、３０℃で反応させた。そして、補酵素及び基質水溶液を添加してから反応が平衡に達するまでの間、３４０ｎｍの吸光度を測定した。その後、吸光度測定に使用した試料のそれぞれを３０℃で保存し、１日後、２日後、３日後、６日後、１５日後、２２日後及び２８日後に同様の測定を行った。その結果を図８に示す。 Next, 1.2 mg of coenzyme (NAD + ) and 300 μL of a substrate aqueous solution (formaldehyde aqueous solution having a formaldehyde concentration of 0.3%) were added to each of the prepared samples and reacted at 30 ° C. . Then, the absorbance at 340 nm was measured from when the coenzyme and the aqueous substrate solution were added until the reaction reached equilibrium. Thereafter, each sample used for absorbance measurement was stored at 30 ° C., and the same measurement was performed after 1 day, 2 days, 3 days, 6 days, 15 days, 22 days and 28 days. The result is shown in FIG.
図８においては、横軸に日数、縦軸に初日（０日目）における酵素活性を１００％とした場合の相対活性、すなわち、初日における平衡状態での３４０ｎｍの吸光度を１００％とした場合の相対吸光度を示す。丸プロット（○）は試料[１９]の結果、三角プロット（△）は試料[２０]の結果、四角プロット（□）は試料[２１]の結果、菱型プロット（◇）は試料[２２]の結果、逆三角プロット（▽）は試料[２３]の結果を示す。 In FIG. 8, the horizontal axis represents the number of days, the vertical axis represents the relative activity when the enzyme activity on the first day (day 0) is 100%, that is, the absorbance at 340 nm in the equilibrium state on the first day is 100%. Relative absorbance is shown. Circle plot (◯) shows the result of sample [19], triangle plot (△) shows the result of sample [20], square plot (□) shows the result of sample [21], diamond plot (◇) shows the sample [22] As a result, the inverted triangle plot (▽) shows the result of the sample [23].
図８によれば、補酵素用活性低下抑制物質及び活性低下抑制型の電子伝達体を添加していない試料（試料[２３]）と比較して、補酵素用活性低下抑制物質（分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子）及び活性低下抑制型の電子伝達体（メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体、所定の多孔体に吸着された電子伝達体）の添加した試料、すなわち、分子量１０００以上の生体高分子及びメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体を添加した試料（試料[１９]、[２０]）、分子量１０００以上の生体高分子及び所定の多孔体に吸着された電子伝達体を添加した試料（試料[２１]）、分子量１０００以上の合成高分子及びメタロセン骨格を有する一部の電子伝達体を添加した試料（試料[２２]）では、酵素活性の低下が抑制され、２０日後も９０％以上の酵素活性が保たれることが分かった。 According to FIG. 8, the coenzyme activity decrease inhibitory substance (molecular weight 1000 or more) compared to the sample not added with the coenzyme activity decrease inhibitory substance and the activity decrease inhibitory electron carrier (sample [23]) Of biopolymers, synthetic polymers having a molecular weight of 1000 or more) and activity-suppressing electron carriers (some electron carriers having a metallocene skeleton, electron carriers adsorbed on a predetermined porous body) That is, adsorbed to samples (samples [19] and [20]) to which a part of an electron carrier having a molecular weight of 1000 or more and a metallocene skeleton is added, a biopolymer having a molecular weight of 1000 or more, and a predetermined porous body In the sample (sample [21]) with the added electron carrier added, the sample with the synthetic polymer having a molecular weight of 1000 or more and a part of the electron carrier having the metallocene skeleton (sample [22]), the enzyme activity decreased. Is depressed It was found that 90% or more of the enzyme activity was maintained after 20 days.
以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、酵素１００と、電子伝達体２００と、を含有する検出部１０を備え、検出部１０内には、作用電極（電極２０）が配置され、電子伝達体２００は、所定の多孔体に吸着された電子伝達体である。
したがって、電子伝達体を所定の多孔体に吸着させることによって、この電子伝達体が酵素１００の活性中心に吸着するのを抑制できるため、電子伝達体２００を使用した場合であっても、また、電子伝達体２００が溶解する緩衝液中で保存した場合であっても、優れた長期安定性を有する酵素センサ１を提供することができる。
ここで、所定の多孔体に吸着された電子伝達体は、酵素センサ１の高感度化等の観点から、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０とともに電極２０近傍に固定させることによって、検出部１０に含有させるのが好ましい。具体的には、例えば、電子伝達体が吸着している多孔体と、酵素１００が固定されたシリカ系メソ多孔体１１０と、を混合したり積層したりして、電極２０に固定するのが好ましい。固定化の方法は任意であり、例えば、ナイロンメッシュ及びＯリングを用いてこれらを電極２０上に密着固定する方法であっても良いし、公知の固定化方法であっても良い。
According to the enzyme sensor 1 of the present invention described above, the detection unit 10 containing the enzyme 100 and the electron carrier 200 is provided, and the working electrode (electrode 20) is arranged in the detection unit 10 to provide an electron. The transmission body 200 is an electron transmission body adsorbed on a predetermined porous body.
Therefore, by adsorbing the electron carrier to a predetermined porous body, it is possible to suppress the adsorption of the electron carrier to the active center of the enzyme 100. Therefore, even when the electron carrier 200 is used, Even when stored in a buffer solution in which the electron carrier 200 is dissolved, the enzyme sensor 1 having excellent long-term stability can be provided.
Here, the electron carrier adsorbed by the predetermined porous body is fixed in the vicinity of the electrode 20 together with the silica-based mesoporous body 110 to which the enzyme 100 is fixed, from the viewpoint of increasing the sensitivity of the enzyme sensor 1 and the like. It is preferable to contain in the detection part 10. Specifically, for example, the porous body on which the electron carrier is adsorbed and the silica-based mesoporous body 110 on which the enzyme 100 is fixed are mixed or stacked to be fixed to the electrode 20. preferable. Any immobilization method may be used. For example, a nylon mesh and an O-ring may be used to tightly fix them on the electrode 20, or a known immobilization method may be used.
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、酵素１００と、電子伝達体２００と、を含有する検出部１０を備え、検出部１０内には、作用電極（電極２０）が配置され、電子伝達体２００は、メタロセン骨格を有する一部の電子伝達体（上記の一般式（１）で表される化合物、上記の一般式（２）で表される化合物、上記の一般式（３）で表される化合物）である。
したがって、側鎖として４級アンモニウム塩基を有する構造を持つメタロセン骨格を有する化合物（上記の一般式（１）で表される化合物）や、側鎖としてカルボシキル基を有する構造を持つメタロセン骨格を有する化合物（上記の一般式（２）で表される化合物、上記の一般式（３）で表される化合物）は、キノン系化合物などの電子伝達体と比較して、酵素１００の活性中心に吸着しにくいため、電子伝達体２００を使用した場合であっても、また、電子伝達体２００が溶解する緩衝液中で保存した場合であっても、優れた長期安定性を有する酵素センサ１を提供することができる。
Moreover, according to the enzyme sensor 1 of the present invention described above, the detection unit 10 including the enzyme 100 and the electron carrier 200 is provided, and the working electrode (electrode 20) is disposed in the detection unit 10. The electron carrier 200 is a part of an electron carrier having a metallocene skeleton (a compound represented by the above general formula (1), a compound represented by the above general formula (2), the above general formula (3 ).
Therefore, a compound having a metallocene skeleton having a structure having a quaternary ammonium base as a side chain (a compound represented by the above general formula (1)) or a compound having a metallocene skeleton having a structure having a carboxyl group as a side chain (Compound represented by the above general formula (2), compound represented by the above general formula (3)) adsorbs to the active center of the enzyme 100 as compared with an electron carrier such as a quinone compound. Even if it is a case where the electron carrier 200 is used and it is the case where it preserve | saves in the buffer solution in which the electron carrier 200 melt | dissolves, the enzyme sensor 1 which has the outstanding long-term stability is provided. be able to.
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、酵素１００と、補酵素３００と、を含有する検出部１０を備え、酵素１００は、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された状態で検出部１０に含有され、検出部１０には、分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び／又は電解質が添加されている。
すなわち、酵素１００をシリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定することによって、外部環境の変化に伴う酵素１００の立体構造の変化を防止することができるため、酵素１００の活性の低下を抑制することができる。
さらに、補酵素３００をシリカ系メソ多孔体１１０と共存させると、補酵素３００がシリカ系メソ多孔体１１０の表面に吸着して酵素１００の活性の低下を引き起こすことが分かっているが、検出部１０に補酵素用活性低下抑制物質（分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び／又は電解質）を添加することによって、検出部１０に分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び／又は電解質が電離して生じるイオンがシリカ系メソ多孔体１１０の表面に吸着し、補酵素３００のシリカ系メソ多孔体１１０の表面への吸着が抑制されるため、補酵素用活性低下抑制物質を添加することによって、補酵素３００を使用した場合であっても、また、補酵素３００が溶解する緩衝液中で保存した場合であっても、酵素１００の活性の低下を抑制することができる。
したがって、優れた長期安定性を有する酵素センサ１を提供することができる。
なお、補酵素用活性低下抑制物質をシリカ系メソ多孔体１１０の表面に吸着させることによって、補酵素３００のシリカ系メソ多孔体１１０の表面への吸着を抑制したが、例えば、適切な官能基等でシリカ系メソ多孔体１１０の表面を修飾する等して、補酵素３００のシリカ系メソ多孔体１１０の表面への吸着を抑制するようにしても良い。
In addition, according to the enzyme sensor 1 of the present invention described above, the detection unit 10 containing the enzyme 100 and the coenzyme 300 is provided, and the enzyme 100 is fixed inside the pores of the silica-based mesoporous material 110. The detection unit 10 is added with a biopolymer having a molecular weight of 1000 or more, a synthetic polymer having a molecular weight of 1000 or more, and / or an electrolyte.
That is, by fixing the enzyme 100 inside the pores of the silica-based mesoporous material 110, it is possible to prevent a change in the three-dimensional structure of the enzyme 100 accompanying a change in the external environment. Can be suppressed.
Furthermore, it has been found that when the coenzyme 300 coexists with the silica-based mesoporous material 110, the coenzyme 300 is adsorbed on the surface of the silica-based mesoporous material 110 and causes a decrease in the activity of the enzyme 100. A bioenzyme having a molecular weight of 1000 or more and a molecular weight of 1000 or more are added to the detection unit 10 by adding a substance for inhibiting the decrease in coenzyme activity (a biopolymer having a molecular weight of 1000 or more, a synthetic polymer and / or an electrolyte having a molecular weight of 1000 or more) Ions generated by ionization of the above synthetic polymer and / or electrolyte are adsorbed on the surface of the silica-based mesoporous material 110 and the adsorption of the coenzyme 300 to the surface of the silica-based mesoporous material 110 is suppressed. Even when coenzyme 300 is used by adding an enzyme activity decrease inhibitor, it is also stored in a buffer solution in which coenzyme 300 is dissolved. Even when an, it is possible to suppress the reduction of the activity of the enzyme 100.
Therefore, the enzyme sensor 1 having excellent long-term stability can be provided.
The coenzyme activity decrease inhibitor was adsorbed on the surface of the silica-based mesoporous material 110, thereby suppressing the adsorption of the coenzyme 300 to the surface of the silica-based mesoporous material 110. The adsorption of the coenzyme 300 to the surface of the silica mesoporous material 110 may be suppressed by modifying the surface of the silica mesoporous material 110 with, for example.
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、シリカ系メソ多孔体１１０と、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００と、を備え、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔のサイズが、酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍に設定されている。
したがって、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に、酵素１００をしっかりと固定することができるとともに、酵素１００を高い自由度をもって固定することができるため、酵素１００の立体構造の変化が防止され、酵素１００の活性の低下を抑制することができる。
また、シリカ系メソ多孔体１１０は多孔質であり、比表面積が非常に大きい。したがって、シリカ系メソ多孔体１１０を担体として用いると、シリカ系メソ多孔体１１０よりも比表面積が小さい担体を用いる場合と比較して、より大きな吸着量でより高濃度に酵素１００を固定することができる。さらに、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に酵素１００をしっかりと固定することで、酵素１００は適度に分散された状態に維持されるため、酵素１００が凝集を起こして失活する等を避けることができる。すなわち、細孔のサイズが、酵素１００のサイズの０．５〜２．０倍に設定されているシリカ系メソ多孔体１１０を担体として用いることで、より大きな吸着量でより高濃度に酵素１００を固定することができるとともに、酵素１００が凝集を起こして失活する等を避けることができるため、優れた感度を有する酵素センサ１を提供することができる。
また、酵素１００は、適度に分散された状態に固定されることになるため、物質の透過拡散性が良好となり、酵素反応が効率的に進行する。
In addition, according to the enzyme sensor 1 of the present invention described above, the silica mesoporous material 110 and the enzyme 100 fixed inside the pores of the silica mesoporous material 110 are provided, and the silica mesoporous material. The size of the 110 pores is set to 0.5 to 2.0 times the size of the enzyme 100.
Therefore, the enzyme 100 can be firmly fixed inside the pores of the silica-based mesoporous material 110, and the enzyme 100 can be fixed with a high degree of freedom, thereby preventing a change in the three-dimensional structure of the enzyme 100. Thus, a decrease in the activity of the enzyme 100 can be suppressed.
Further, the silica-based mesoporous material 110 is porous and has a very large specific surface area. Therefore, when the silica-based mesoporous material 110 is used as a carrier, the enzyme 100 is immobilized at a higher concentration with a larger adsorption amount than when a carrier having a specific surface area smaller than that of the silica-based mesoporous material 110 is used. Can do. Furthermore, since the enzyme 100 is maintained in a moderately dispersed state by firmly fixing the enzyme 100 inside the pores of the silica-based mesoporous material 110, the enzyme 100 is agglomerated and deactivated. Can be avoided. That is, by using the silica-based mesoporous material 110 whose pore size is set to 0.5 to 2.0 times the size of the enzyme 100 as a carrier, the enzyme 100 can be concentrated at a higher concentration with a larger adsorption amount. Since the enzyme 100 can be agglomerated and inactivated due to aggregation, the enzyme sensor 1 having excellent sensitivity can be provided.
In addition, since the enzyme 100 is fixed in a moderately dispersed state, the permeation diffusibility of the substance is improved and the enzyme reaction proceeds efficiently.
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、シリカ系メソ多孔体１１０が、検出対象物質の濃縮作用を有するため、気相又は液相中の微量な検出対象物質を極めて高感度に検出することができる。また、電子伝達体２００を利用することにより、シリカ系メソ多孔体１１０の細孔の内部に固定された酵素１００の活性中心と電極２０との間の電子移動が媒介・促進され、高感度で高速な応答を得ることが可能となる。これらの作用により、電気化学的計測による極めて高速且つ高感度な検出対象物質の検出が可能となり、高速且つ高感度で、長寿命な、安定性に優れた酵素センサ１を構成することができる。 Further, according to the enzyme sensor 1 of the present invention described above, the silica-based mesoporous material 110 has a concentration action of the detection target substance, so that a very small amount of the detection target substance in the gas phase or the liquid phase can be obtained with extremely high sensitivity. Can be detected. In addition, by using the electron carrier 200, the electron transfer between the active center of the enzyme 100 fixed inside the pores of the silica-based mesoporous material 110 and the electrode 20 is mediated and promoted, with high sensitivity. A high-speed response can be obtained. Due to these actions, it becomes possible to detect a detection target substance with extremely high speed and high sensitivity by electrochemical measurement, and it is possible to configure the enzyme sensor 1 having high speed, high sensitivity, long life and excellent stability.
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、気相又は液相中の微量な検出対象物質を極めて高感度に検出することにより、特定の匂い、又は、ガスを検出するためのセンサとして使用することができる。また、液相中での特定の味を検出するためのセンサや、バイオリアクター中で特定物質の生成及び／又は生成量を検出するために用いることもできる。 Moreover, according to the enzyme sensor 1 of the present invention described above, a sensor for detecting a specific odor or gas by detecting a very small amount of a detection target substance in a gas phase or a liquid phase with extremely high sensitivity. Can be used as It can also be used to detect a specific taste in the liquid phase or to detect the production and / or production amount of a specific substance in a bioreactor.
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、測定に際しては、参照電極４０に対する作用電極（電極２０）の電圧を特定の電圧に設定することにより、測定妨害物質の影響を避け、検出対象物質を高感度かつ選択的に測定することができる。特に、電子伝達体２００を利用することにより、この設定電圧を下げることができ、選択性を向上することが可能となる。 Further, according to the enzyme sensor 1 of the present invention described above, in measuring, the voltage of the working electrode (electrode 20) with respect to the reference electrode 40 is set to a specific voltage, thereby avoiding the influence of the measurement interfering substance and detecting. The target substance can be measured with high sensitivity and selectivity. In particular, by using the electron carrier 200, the set voltage can be lowered and the selectivity can be improved.
また、以上説明した本発明の酵素センサ１によれば、検出対象物質によって分子識別素子としての酵素１００の種類を変えることが必要である。例えば、酵素１００として、検出対象物質（測定対象）がグルコースの場合にはグルコースオキシターゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを、測定対象がエタノールの場合にはアルコールオキシターゼ又はアルコールデヒドロゲナーゼを、測定対象がホルムアルデヒドの場合にはホルムアルデヒドオキシターゼ又はホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを、測定対象が総コレステロールの場合にはコレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとの混合物等を用いることができる。 Further, according to the enzyme sensor 1 of the present invention described above, it is necessary to change the type of the enzyme 100 as the molecular identification element depending on the substance to be detected. For example, the enzyme 100 is glucose oxidase or glucose dehydrogenase when the detection target substance (measurement target) is glucose, alcohol oxidase or alcohol dehydrogenase when the measurement target is ethanol, and formaldehyde when the measurement target is formaldehyde. For oxidase or formaldehyde dehydrogenase, a mixture of cholesterol esterase and cholesterol oxidase can be used when the measurement target is total cholesterol.
なお、本発明は、上記した実施の形態のものに限るものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。 The present invention is not limited to the above-described embodiment, and can be appropriately changed without departing from the gist thereof.
酵素センサ１にポテンショスタット５０を含むよう構成したが、これに限ることはなく、酵素センサ１とポテンショスタット５０とは別体であっても良い。 Although the enzyme sensor 1 is configured to include the potentiostat 50, the present invention is not limited to this, and the enzyme sensor 1 and the potentiostat 50 may be provided separately.
酵素センサ１による電気化学的計測は、一つの基板上に形成した二極構造（作用電極（電極２０）と対照電極３０）又は三極構造（作用電極（電極２０）と対照電極３０と参照電極４０）の電極を用いても良いし、独立した各電極（作用電極（電極２０）、対照電極３０、参照電極４０）を組み合わせて用いても良い。 The electrochemical measurement by the enzyme sensor 1 is performed by using a bipolar structure (working electrode (electrode 20) and control electrode 30) or tripolar structure (working electrode (electrode 20), reference electrode 30 and reference electrode) formed on one substrate. 40) may be used, or independent electrodes (working electrode (electrode 20), reference electrode 30, reference electrode 40) may be used in combination.
二極構造（作用電極（電極２０）と対照電極３０）又は三極構造（作用電極（電極２０）と対照電極３０と参照電極４０）の各電極を、所定の絶縁性基板上に形成した場合、例えば、この絶縁性基板上における電極２０が形成された領域を含む領域（以下、「分析領域」という。）上に所定の電解液を滴下して、この分析領域上を検出部１０としても良いし、例えば、分析領域上に所定の電解液で満たされた液相室を設けて、この分析領域上（液相室内）を検出部１０としても良い。 When each electrode of bipolar structure (working electrode (electrode 20) and reference electrode 30) or tripolar structure (working electrode (electrode 20), reference electrode 30 and reference electrode 40) is formed on a predetermined insulating substrate For example, a predetermined electrolyte may be dropped on a region including the region where the electrode 20 is formed on the insulating substrate (hereinafter referred to as “analysis region”), and the detection region 10 may be formed on the analysis region. For example, a liquid phase chamber filled with a predetermined electrolytic solution may be provided on the analysis region, and the detection unit 10 may be provided on the analysis region (liquid phase chamber).
酵素１００は、検出部１０に含有されていれば任意であり、例えば、反応器１０ａに導入された所定の電解液に溶解された遊離酵素の状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、シリカ系メソ多孔体１１０以外の担体に固定された状態で検出部１０に含有されていても良いし、例えば、電極２０等に直接固定された状態で検出部１０に含有されていても良い。 The enzyme 100 is optional as long as it is contained in the detection unit 10. For example, the enzyme 100 may be contained in the detection unit 10 in a state of a free enzyme dissolved in a predetermined electrolyte introduced into the reactor 10 a. For example, it may be contained in the detection unit 10 in a state of being fixed to a carrier other than the silica-based mesoporous material 110, or may be contained in the detection unit 10 in a state of being directly fixed to the electrode 20 or the like, for example. Also good.
１ 酵素センサ
１０ 検出部
１００ 酵素
１１０ シリカ系メソ多孔体
２００ 電子伝達体
３００ 補酵素
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Enzyme sensor 10 Detection part 100 Enzyme 110 Silica mesoporous body 200 Electron carrier 300 Coenzyme
Claims (1)
前記電子伝達体は、下記の一般式（１）で表される化合物、下記の一般式（２）で表される化合物及び下記の一般式（３）で表される化合物のうちの少なくとも１種類であり、
前記酵素及び前記電子伝達体は、シリカ系メソ多孔体の細孔の内部に固定された状態で前記検出部に含有され、
前記検出部には、分子量１０００以上の生体高分子、分子量１０００以上の合成高分子及び電解質のうちの少なくとも１つが添加されていることを特徴とする酵素センサ。
The electron carrier is at least one of a compound represented by the following general formula (1), a compound represented by the following general formula (2), and a compound represented by the following general formula (3). der is,
The enzyme and the electron carrier are contained in the detection unit in a state of being fixed inside the pores of the silica-based mesoporous material,
At least one of a biopolymer having a molecular weight of 1000 or more, a synthetic polymer having a molecular weight of 1000 or more, and an electrolyte is added to the detection unit .
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