JP5252519B2 - Recombinant hypoallergenic plants and hypoallergenic plant markers - Google Patents

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Description

本発明は、組換え低アレルゲン植物及び低アレルゲン植物マーカーに関する。   The present invention relates to recombinant low allergen plants and low allergen plant markers.

食物アレルギーはアナフィラキシーやアトピー性皮膚炎等の原因となる。その対策としては、原因となる食品を避けることや薬物投与が挙げられるが、主食であるコメなどに関しては、完全に摂取を絶つことは難しい。そこで、低アレルゲン米の需要が高まっており、その開発が検討されている。   Food allergies cause anaphylaxis and atopic dermatitis. Countermeasures include avoiding the causative food and drug administration, but it is difficult to completely stop the intake of rice as a staple food. Therefore, the demand for low allergen rice is increasing, and its development is under consideration.

米アレルゲンとしては、グロブリンなどの塩可溶性タンパク質が最もよく知られており、特に分子量１６ｋＤａのタンパク質が強くアレルギーを誘発する（例えば、非特許文献１参照）。塩可溶性タンパク質以外にも、ワキシイタンパク質（例えば、特許文献１参照）などが知られている。   As a rice allergen, a salt-soluble protein such as globulin is best known, and a protein having a molecular weight of 16 kDa is particularly strong and induces allergy (see, for example, Non-Patent Document 1). In addition to salt-soluble proteins, waxy proteins (see, for example, Patent Document 1) are known.

このような米アレルゲンを低減させた低アレルゲン米は、主要な米アレルゲンが塩可溶性であることから、例えば、高圧処理と塩水溶液洗浄でグロブリンなどを低減させたり（Ａカット米）、通常より、精米率を高くし、タンパク質が多く含まれる米粒の周辺部を削り取ったり（高度精白米）することにより作製されている。また、遺伝子組換えなどにより低アレルゲン植物を作製する技術も開発されている（例えば、非特許文献２参照）。   Low allergen rice with reduced rice allergens is because the main rice allergen is salt-soluble, for example, globulin is reduced by high-pressure treatment and salt solution washing (A-cut rice), It is made by increasing the milling rate and scraping the periphery of rice grains rich in protein (highly polished rice). In addition, a technique for producing a low allergen plant by genetic recombination or the like has been developed (for example, see Non-Patent Document 2).

一方、日本型イネ「金南風（キンマゼ）」を化学的突然変異原（ＭＮＵ、ＥＭＳ、ＥＩ）で処理することにより、胚乳が紛質になる表現型を有する変異体flouryが得られた（例えば、非特許文献３参照）。このflouryは、その後、５番染色体上にあるfloury-1(flo1)、４番染色体上にあるfloury-2(flo2)、６番染色体上にあるfloury-3(flo3)などに分類された（例えば、非特許文献４，５参照）。中でも、flo2の表現型が詳細に解析され、未成熟な種子において、ＲＢＥ１（rice branching enzyme 1）をはじめとする、ＲＢＥ３や顆粒結合型デンプン合成酵素（granule-bound starch synthase）などのデンプン生合成酵素の発現が低下していた（例えば、非特許文献６参照）。さらに、flo2変異体において、上記の１６ｋＤａアレルゲンタンパク質の発現が減少していること（例えば、特許文献２参照）から、flo2変異体が低アレルゲン米として有望であることが示されていた（例えば、特許文献２参照）。
特開２００１−２０４２８４ 特開２００３−２５９７５０ T,Matsuda et al., Agri. Biol. Chem. 52, 1465-1470, 1988 Y. Tada et al. FEBS Lett. 391, 341-345, 1996 H. Satoh and T. Omura Japan J. Breed. 31, 316-326, 1981 R.P.Kaushik and G.S.Khush Theo. Appl. Genet. 83, 146-152, 1991 山下和宏、佐藤 光、西 愛子、浅川今日子 日本育種学会２０００年春季講演会 口頭発表タイトル（250番）２０００年４月３日「染色体６に座乗するイネの新たな粉質胚乳変異体遺伝子floury ３について」 T. Kawasaki et al. Plant Physiol. 110, 89-96, 1996 On the other hand, by treating Japanese rice “Kinnamaze” with a chemical mutagen (MNU, EMS, EI), a mutant floury having a phenotype in which endosperm becomes a powder was obtained ( For example, refer nonpatent literature 3). This floury was then classified into floury-1 (flo1) on chromosome 5, floury-2 (flo2) on chromosome 4, floury-3 (flo3) on chromosome 6, etc. ( For example, refer nonpatent literature 4 and 5.). In particular, the phenotype of flo2 was analyzed in detail, and starch biosynthesis in immature seeds such as RBE1 (rice branching enzyme 1), RBE3 and granule-bound starch synthase. The expression of the enzyme was reduced (for example, see Non-Patent Document 6). Furthermore, in the flo2 mutant, the expression of the above 16 kDa allergen protein is reduced (see, for example, Patent Document 2), which indicates that the flo2 mutant is promising as a low allergen rice (for example, Patent Document 2).
JP 2001-204284 A JP 2003-259750 A T, Matsuda et al., Agri. Biol. Chem. 52, 1465-1470, 1988 Y. Tada et al. FEBS Lett. 391, 341-345, 1996 H. Satoh and T. Omura Japan J. Breed. 31, 316-326, 1981 RPKaushik and GSKhush Theo. Appl. Genet. 83, 146-152, 1991 Kazuhiro Yamashita, Hikaru Sato, Aiko Nishi, Kyoko Asakawa Japanese Breeding Society 2000 Spring Lecture Oral Presentation Title (No. 250) April 3, 2000 “A new floury endosperm mutant gene floury of rice sitting on chromosome 6” About 3 " T. Kawasaki et al. Plant Physiol. 110, 89-96, 1996

しかしながら、flo2 変異の原因遺伝子が単離されていなかったため、新たなflo2 対立遺伝子を有する変異体を作製するには、例えば、化学的突然変異原をもちいて膨大な変異体ライブラリーを作製し、その中から数少ないflo2変異体を同定しなければならなかった。また、flo2変異体のマーカーも存在しなかったため、flo2変異体を同定する際にも、例えば、相補性試験などにより、従来のflo2変異体と相補しない変異体を選択しなければならなかった。   However, because the gene responsible for the flo2 mutation has not been isolated, to create a mutant with a new flo2 allele, for example, create a huge mutant library using chemical mutagens, A few flo2 mutants had to be identified. In addition, since there was no marker for the flo2 mutant, when identifying the flo2 mutant, a mutant that did not complement the conventional flo2 mutant had to be selected by, for example, a complementation test.

そこで、本発明は、より時間も労力も必要としない、遺伝子組換えを利用したflo2変異植物及び低アレルゲン植物の製造方法並びにflo2変異植物及び低アレルゲン植物を同定するためのマーカーを提供することを目的としてなされた。   Therefore, the present invention provides a method for producing a flo2 mutant plant and a low allergen plant using genetic recombination and a marker for identifying the flo2 mutant plant and the low allergen plant, which require less time and effort. It was made as a purpose.

本発明者らは、flo2変異の原因遺伝子のクローニングを目的として鋭意努力した結果、４番染色体のゲノム・ウォーキングによって、flo2遺伝子を同定することができ、本発明の完成に至った。   As a result of diligent efforts for the purpose of cloning the causative gene of the flo2 mutation, the present inventors were able to identify the flo2 gene by genome walking of the 4th chromosome, thereby completing the present invention.

本発明にかかる遺伝子組換え低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物の製造方法は、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを特徴とする。ここで、「floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させる」とは、突然変異ライブラリーからfloury-2遺伝子の機能が低下した植物を選択するという場合のように、機能を低下させるときに、特定の遺伝子ではなく不特定多数の遺伝子の機能を低下させるのではなく、特定の遺伝子の機能を狙って低下させることを意味する。製造する際、外来性核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を低下させてもよい。例えば、前記外来性核酸が、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸であることが考えられる。また、floury-2遺伝子の発現を低下させることにより、floury-2遺伝子の機能を低下させてもよい。前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子、またはその相同遺伝子であってもよい。また、前記植物がイネであってもよい。   The method for producing a transgenic low allergen plant or a floury-2 mutant plant according to the present invention is characterized in that the function of the floury-2 gene is specifically reduced. Here, “specifically lowering the function of the floury-2 gene” means to select a plant having a reduced function of the floury-2 gene from a mutation library when the function is reduced. This means that the function of a specific gene is not lowered, but the function of a specific gene is not lowered. During production, the function of the floury-2 gene may be reduced by introducing an exogenous nucleic acid into the genome. For example, the exogenous nucleic acid may be a floury-2 gene for homologous recombination, an RNAi nucleic acid for the floury-2 gene, or an antisense RNA nucleic acid. Further, the function of the floury-2 gene may be lowered by reducing the expression of the floury-2 gene. The floury-2 gene may be a gene encoding a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a homologous gene thereof. The plant may be rice.

本発明にかかる遺伝子組換え低アレルゲン植物は、上記いずれかに記載の製造方法によって製造されたものである。その植物の種子も本特許の権利の範囲内である。   The genetically modified hypoallergenic plant according to the present invention is produced by any one of the production methods described above. The plant seeds are also within the scope of this patent.

本発明にかかるfloury-2変異植物の製造方法は、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを特徴とする。「特異的に低下させる」の意味は、上記と同様である。その際、外来性核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を低下させてもよい。例えば、前記外来性核酸が、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸であることが考えられる。また、floury-2遺伝子の発現を低下させることにより、floury-2遺伝子の機能を低下させてもよい。前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子、またはその相同遺伝子であってもよい。また、前記植物がイネであってもよい。   The method for producing a floury-2 mutant plant according to the present invention is characterized by specifically reducing the function of the floury-2 gene. The meaning of “specifically lower” is the same as described above. At that time, the function of the floury-2 gene may be lowered by introducing an exogenous nucleic acid into the genome. For example, the exogenous nucleic acid may be a floury-2 gene for homologous recombination, an RNAi nucleic acid for the floury-2 gene, or an antisense RNA nucleic acid. Further, the function of the floury-2 gene may be lowered by reducing the expression of the floury-2 gene. The floury-2 gene may be a gene encoding a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a homologous gene thereof. The plant may be rice.

本発明にかかるfloury-2変異植物は、上記いずれかに記載の製造方法によって製造されたものである。その植物の種子も本特許の権利の範囲内である。   The floury-2 mutant plant according to the present invention is produced by any one of the production methods described above. The plant seeds are also within the scope of this patent.

本発明にかかる低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物のマーカーは、floury-2遺伝子の遺伝子関連物質である。前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子、またはその相同遺伝子であってもよい。前記植物がイネであってもよい。   The marker for low allergen plants or floury-2 mutant plants according to the present invention is a gene-related substance of the floury-2 gene. The floury-2 gene may be a gene encoding a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a homologous gene thereof. The plant may be rice.

本発明にかかる低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物の同定方法は、floury-2遺伝子の機能の増減または発現を調べることを特徴とする。前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子、またはその相同遺伝子であってもよい。前記植物がイネであってもよい。   The method for identifying a low allergen plant or a floury-2 mutant plant according to the present invention is characterized by examining the increase or decrease or expression of the function of the floury-2 gene. The floury-2 gene may be a gene encoding a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a homologous gene thereof. The plant may be rice.

本発明にかかる低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物を同定するためのキットは、floury-2遺伝子の発現検出用ＰＣＲプライマーペア、またはfloury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を含有していることを特徴とする。本キットは、前記floury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を用いたイムノクロマト法（Immunochromatography）によってfloury-2遺伝子産物を検出できる検出器を備えていてもよい。   The kit for identifying a low allergen plant or a floury-2 mutant plant according to the present invention contains a PCR primer pair for detecting the expression of the floury-2 gene or an antibody for detecting the expression of the floury-2 gene product. It is characterized by. The kit may include a detector capable of detecting the floury-2 gene product by immunochromatography using the antibody for detecting the expression of the floury-2 gene product.

本発明によって、遺伝子組換えを利用したflo2変異体及び低アレルゲン植物の製造方法並びにflo2変異体及び低アレルゲン植物を同定するためのマーカーを提供することが可能になった。   According to the present invention, it has become possible to provide a method for producing a flo2 mutant and a low allergen plant using genetic recombination, and a marker for identifying the flo2 mutant and the low allergen plant.

実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J.Sambrook, E.F.Fritsch & T.Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。   Unless otherwise stated in the embodiments and examples, J. Sambrook, EFFritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); FM Ausubel, R. Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, K. Struhl (Ed.), Standard Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. The method described in the protocol collection, or a modified or modified method thereof is used. In addition, when using commercially available reagent kits and measuring devices, unless otherwise explained, protocols attached to them are used.

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。   The objects, features, advantages, and ideas of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the description of the present specification, and those skilled in the art can easily reproduce the present invention from the description of the present specification. it can. The embodiments and specific examples of the invention described below show preferred embodiments of the present invention and are shown for illustration or explanation, and the present invention is not limited to them. It is not limited. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made based on the description of the present specification within the spirit and scope of the present invention disclosed herein.

＝＝floury-2 (flo2)遺伝子＝＝
実施例で示すように、本発明者らは、イネにおいて、４番染色体上に位置するfloury-2(flo2)変異の原因遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡに含まれることを明らかにした。さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを明らかにし、本明細書では、この遺伝子（即ち、ＤＮＡ上で、エクソン、イントロン、５’非コード領域、及び３’非コード領域からなる転写領域、並びにその転写領域の転写を調節するエンハンサー／プロモーター領域からなる領域のことをいう。）をイネfloury-2遺伝子と呼ぶ。また、他の植物において、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡと相同領域に含まれ、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子の相同遺伝子を、その植物におけるfloury-2遺伝子と呼ぶ。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対し、１〜数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであって、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと同じ機能を有するペプチドをコードする遺伝子も、floury-2遺伝子と呼ぶものとする。 == floury-2 (flo2) gene ==
As shown in the Examples, the present inventors show that in rice, a cause-2 gene of a floury-2 (flo2) mutation located on chromosome 4 is contained in DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Was revealed. Furthermore, the gene encoding the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is clarified. In the present specification, this gene (ie, exon, intron, 5 ′ non-coding region, and 3 on DNA) 'A transcription region consisting of a non-coding region and an enhancer / promoter region that regulates the transcription of the transcription region) is called rice floury-2 gene. Further, in other plants, a homologous gene of a gene contained in a homologous region with the DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and encoding the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Called 2 genes. Further, it is a peptide having an amino acid sequence in which one to several amino acids are inserted, deleted or substituted with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and is the same as the peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A gene encoding a functional peptide is also referred to as a floury-2 gene.

＝＝flo2 変異植物の製造方法＝＝
本発明の一実施態様は、flo2変異植物の新規製造方法である。従来は、植物に変異源を投与して、ランダムに染色体DNAに変異を導入し、以前から知られていたflo2変異植物（例えば、イネの場合ＥＭ３６系統やＥＭ３７系統）と交配させ、相補しない変異体を選ぶという相補性検定によりflo2変異体を選択していた。しかし、本発明の発明者らによりflo2変異体における原因変異、及びflo2変異の原因遺伝子であるfloury-2遺伝子が同定され、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることができるようになった。 == flo2 mutant plant production method ==
One embodiment of the present invention is a novel method for producing a flo2 mutant plant. Conventionally, mutation sources are administered to plants, mutations are randomly introduced into chromosomal DNA, and then crossed with a previously known flo2 mutant plant (for example, EM36 or EM37 in the case of rice), and non-complementary mutations. The flo2 mutant was selected by the complementation test of selecting the body. However, the inventors of the present invention have identified the causal mutation in the flo2 mutant and the floury-2 gene that is the causative gene of the flo2 mutation, and can specifically reduce the function of the floury-2 gene. It was.

すなわち、外来性核酸である組換えfloury-2遺伝子をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させ、flo2変異体を作製することができる。flo2変異体の作製は、常法に従い、相同組換え法、siRNAやmsRNAなどのRNA干渉法、アンチセンスRNA法等に用いるための核酸をゲノムに導入すればよい。これらの方法は、いずれも、floury-2遺伝子の発現を減少させるために用いることができ、その結果として、floury-2遺伝子の機能が低下する。相同組換え法に関しては、変異を導入し機能の低下した組換えfloury-2遺伝子を用いることにより、発現レベルは同じままで、機能を低下させることも可能である。ここで、変異の種類は特に限定されないが、具体的な変異の例としては、実施例に示すように、配列番号１に示すＤＮＡの第９９８１番目のＧをＡに置換すれば、アンバー突然変異を有するflo2変異体を作製することができ、それ以外にも、プロモーターに変異を導入する、機能ドメインに機能を失わせるような変異を導入する、など、様々な実施形態が可能である。   That is, by introducing a recombinant floury-2 gene, which is an exogenous nucleic acid, into the genome, the function of the floury-2 gene can be specifically reduced to produce a flo2 mutant. In order to produce the flo2 mutant, nucleic acids for use in homologous recombination methods, RNA interference methods such as siRNA and msRNA, antisense RNA methods and the like may be introduced into the genome according to conventional methods. Any of these methods can be used to reduce the expression of the floury-2 gene, resulting in a decrease in the function of the floury-2 gene. With regard to the homologous recombination method, it is possible to reduce the function while maintaining the same expression level by using a recombinant floury-2 gene whose function is reduced by introducing a mutation. Here, the type of mutation is not particularly limited, but as an example of a specific mutation, as shown in the Examples, if the 9981st G of the DNA shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with A, an amber mutation In addition, various embodiments such as introducing a mutation into a promoter and introducing a mutation that causes a loss of function in a functional domain are possible.

ここで、対象となる植物は、特に限定されないが、flo2変異の表現型の一つが低アレルゲン種子を生産することなので、種子を食用とするイネ、麦、ソバ等の植物が好ましい。   Here, the target plant is not particularly limited, but one of the phenotypes of the flo2 mutation is to produce low allergen seeds, and therefore plants such as rice, wheat and buckwheat that use the seeds as food are preferred.

＝＝遺伝子組換え低アレルゲン植物の製造方法＝＝
本発明の他の実施態様は、遺伝子組換え低アレルゲン植物の新規製造方法である。
flo2変異イネでは、食物アレルギーの主因である１６ｋＤａアレルゲンタンパク質の発現が減少していることが明らかになっている（上記特許文献２参照）。従って、上記のようにflo2変異植物を製造することにより、遺伝子組換え低アレルゲン植物を製造することができる。 == Method for producing transgenic low-allergen plant ==
Another embodiment of the present invention is a novel method for producing a transgenic hypoallergenic plant.
It has been clarified that the expression of 16 kDa allergen protein, which is a major cause of food allergy, is decreased in flo2 mutant rice (see Patent Document 2 above). Therefore, a genetically modified low allergen plant can be produced by producing a flo2 mutant plant as described above.

＝＝低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物のマーカー＝＝
本発明のさらに別の実施態様は、floury-2遺伝子の遺伝子関連物質である低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物のマーカーである。ここで、遺伝子関連物質とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部を含み、遺伝子が転写されてから最終産物になるまでの過程に関係する分子であって、さらに、機能の低下を検出するために用いることができる物質のことをいう。
ここでも、対象となる植物は、特に限定されないが、低アレルゲン植物の開発が期待されている、イネ、麦、ソバ等の植物が好ましい。 == Marker of low allergen plant or floury-2 mutant plant ==
Yet another embodiment of the present invention is a marker for a hypoallergenic plant or a floury-2 mutant plant that is a gene-related substance of the floury-2 gene. Here, the gene-related substance is a molecule including DNA, RNA, protein, or a part thereof, which is related to the process from the transcription of the gene to the final product, and further reduces the function. A substance that can be used for detection.
Here, the target plant is not particularly limited, but plants such as rice, wheat and buckwheat, which are expected to develop low allergen plants, are preferable.

例えば、floury-2遺伝子にhypomorphやamorphの変異を有するが、発現は正常であるような植物の場合、floury-2遺伝子を含有するゲノムＤＮＡを抽出し、floury-2遺伝子をPCRで増幅して塩基配列を調べたり、RFLPを検出するために適切な制限酵素で切断したりして、当該変異を検出することができる。floury-2遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを単離し、直接配列を決定してもよい。特定の変異を検出する場合には、その変異を含むプライマーを作製してＰＣＲを行なうことにより、変異を検出してもよい。   For example, in the case of a plant that has hypomorph and amorphic mutations in the floury-2 gene but normal expression, extract the genomic DNA containing the floury-2 gene and amplify the floury-2 gene by PCR. The mutation can be detected by examining the nucleotide sequence or cleaving with an appropriate restriction enzyme to detect RFLP. mRNA that is a transcription product of the floury-2 gene may be isolated and directly sequenced. When detecting a specific mutation, the mutation may be detected by preparing a primer containing the mutation and performing PCR.

また、floury-2遺伝子の発現が低下している植物の場合、ゲノムＤＮＡやｍＲＮＡの配列を調べてもよいが、floury-2遺伝子の発現の低下がfloury-2遺伝子内の変異によらない可能性があるため、floury-2遺伝子のｍＲＮＡやタンパク質の量を測定するほうが好ましい。例えば、組織化学的手法（個体や切片を用いて、in situでｍＲＮＡやタンパク質を検出する方法等）や分子生物学的手法（ノーザン・ブロッティング、ウエスタン・ブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ等）を用いて、floury-2遺伝子の発現を調べることができる。   In addition, in the case of plants with reduced expression of the floury-2 gene, the sequence of genomic DNA or mRNA may be examined, but the decrease in the expression of the floury-2 gene may not be due to mutations in the floury-2 gene. Therefore, it is preferable to measure the amount of mRNA and protein of the floury-2 gene. For example, histochemical methods (methods of detecting mRNA and protein in situ using individuals and sections, etc.) and molecular biological methods (Northern blotting, Western blotting, quantitative RT-PCR, ELISA, etc.) Can be used to examine the expression of the floury-2 gene.

この場合、floury-2遺伝子の発現を容易に検出するために、発現検出に必要な試薬（例えば、floury-2遺伝子の発現検出用ＰＣＲプライマーペア、またはfloury-2遺伝子産物の発現検出用抗体など）を、反応バッファー等とともにキット化してもよい。また、最近は、インフルエンザウイルス検出キットなどにも広く用いられているように、発現検出用抗体を用いたイムノクロマト法（Immunochromatography）によって検出できる検出器をキットに含めれば、floury-2遺伝子産物を容易に検出できるようになる。   In this case, in order to easily detect the expression of the floury-2 gene, reagents necessary for the detection of the expression (for example, a PCR primer pair for detecting the expression of the floury-2 gene or an antibody for detecting the expression of the floury-2 gene product, etc.) ) May be made into a kit together with a reaction buffer or the like. Recently, as widely used in influenza virus detection kits, etc., if a detector that can be detected by immunochromatography using an antibody for expression detection is included in the kit, the flour-2 gene product can be easily obtained. Can be detected.

このようにして低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物のマーカーが検出できれば、例えば、ランダムに変異を導入した植物を大規模に作成し、その中から、floury-2遺伝子の機能や発現が低下している低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物を容易に同定することができる。また、交配によって生じた低アレルゲン植物の候補植物の中から、低アレルゲン植物を容易に検出することができるようになる。   If markers for low allergen plants or floury-2 mutant plants can be detected in this way, for example, plants with random mutations can be created on a large scale, and the function and expression of the floury-2 gene can be reduced. Low allergen plants or floury-2 mutant plants can be easily identified. In addition, low allergen plants can be easily detected from candidate plants of low allergen plants generated by crossing.

＜実施例１＞floury-2 (flo2)遺伝子のクローニング
＝＝flo2遺伝子座の詳細なマッピング＝＝
これまでに、flo2遺伝子座は、４番染色体上にあることが明らかになっていた。そこで、ＤＮＡマーカーを用い、flo2遺伝子座の詳細なマッピングを行った。 <Example 1> Cloning of the floury-2 (flo2) gene == Detailed mapping of the flo2 locus ==
So far it has been shown that the flo2 locus is on chromosome 4. Therefore, detailed mapping of the flo2 gene locus was performed using a DNA marker.

まず、イネ日本型品種Japonica（flo2変異型ＥＭ３７）とインド型品種Indica (野生型カサラス)を交配し、得られたＦ１を自家受粉させることにより、約４０００個体のＦ２を得た。このうちのflo2の表現型を示す劣性ホモ系統の種子を選抜し、これらflo2変異体のうちの約８００個体からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを用い、以下のようにflo2遺伝子座のマッピングを行った。 First, rice japonica cultivar Japonica and (fLO2 mutant EM37) were crossed India type varieties Indica (wild type Kasalath), the F 1 obtained by self-pollination, to obtain an F 2 of about 4000 individuals. Among them, recessive homozygous seeds exhibiting the flo2 phenotype were selected, and genomic DNA was extracted from about 800 individuals of these flo2 mutants. Using this genomic DNA, the flo2 locus was mapped as follows.

まず、Rice genome Integrated Map database(ＩＮＥ)(http://rgp.dna.affrc.go.jp/giot/INE.html)を利用して、JaponicaとIndicaの４番染色体の塩基配列を比較し、多型を検索してＳＮＩＰ（single nucleotide polimorphism）を同定し、その位置にプライマーを作成した。ここでは、７２．４ｃＭの位置にある以下のプライマーを用い、９４℃で５分変性した後、９４℃ ３０秒-５５℃ ３０秒-７２℃ ３０秒のサイクルを３０サイクル行った後、７２℃ ７分処理する、という条件（条件１）で、３００サンプルのＦ２に対しＰＣＲを行ったところ、組み替え率が３３％であったので、flo2遺伝子座は３９．４ｃＭまたは１０５．４ｃＭの付近にあることが明らかになった。
72.4-5-1(In): ＡＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＡＴＣ（配列番号３）
72.4-3-1(In): ＴＴＣＴＣＧＡＡＴＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＣ（配列番号４）
72.4-5-1(Jp): ＣＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＣＡＣＣ（配列番号５）
72.4-3-1(Jp): ＴＴＣＴＣＧＴＡＣＧＣＧＡＴＴＧＣＧＡＣ（配列番号６） First, using Rice genome Integrated Map database (INE) (http://rgp.dna.affrc.go.jp/giot/INE.html), the base sequences of chromosomes 4 of Japonica and Indica are compared, The polymorphism was searched to identify SNIP (single nucleotide polimorphism), and a primer was created at that position. Here, the following primer at the position of 72.4 cM was used, denatured at 94 ° C. for 5 minutes, then subjected to 30 cycles of 94 ° C. 30 seconds-55 ° C. 30 seconds-72 ° C. 30 seconds, then 72 ° C. When PCR was performed on 300 samples of F 2 under the condition of 7 minutes treatment (Condition 1), the recombination rate was 33%, so the flo2 locus was near 39.4 cM or 105.4 cM. It became clear that there was.
72.4-5-1 (In): ATGTGTGGTGTTTGAGCATC (SEQ ID NO: 3)
72.4-3-1 (In): TTCTCGAATGCAATAGCGCC (SEQ ID NO: 4)
72.4-5-1 (Jp): CTGTGTGGTGTTTGTGCACC (SEQ ID NO: 5)
72.4-3-1 (Jp): TTCTCGTACCGCGATTGCAC (SEQ ID NO: 6)

次に、８５ｃＭの位置にある以下のプライマーを用い、アニーリングを６０秒にする以外は上記と同じ条件（条件２）で、同様に３００サンプルのＦ２に対しＰＣＲを行ったところ、組み替え率が２２％であったので、flo2遺伝子座は６２．５ｃＭまたは１０６．５ｃＭの付近にあることが明らかになった。
85-5-1(In):ＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＴＣＡ（配列番号７）
85-3-4(In):ＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＣＴＧＴＣＧＴＣＡＣ（配列番号８）
85-5-1(Jp):ＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＴＧＡ（配列番号９）
85-3-4(Jp):ＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＣＴＡＣＣＧＴＣＧＣ（配列番号１０）
これらの結果より、flo2遺伝子座は１０５ｃＭ付近にあることが示唆されたので、その近傍でＰＣＲを行うことにより、より詳細なマッピングを行った。 Next, PCR was performed on 300 samples of F 2 under the same conditions as described above (condition 2) except that the following primer at the position of 85 cM was used and annealing was performed for 60 seconds. Since it was 22%, it became clear that the flo2 locus was in the vicinity of 62.5 cM or 106.5 cM.
85-5-1 (In): CCAGGATCTTGGGGCCTTCA (SEQ ID NO: 7)
85-3-4 (In): CTCCGGCTCTCTGTTCACAC (SEQ ID NO: 8)
85-5-1 (Jp): CCAGGATCTTGGGGCCTTGA (SEQ ID NO: 9)
85-3-4 (Jp): CTCCGGCTCTCTACCGTCGC (SEQ ID NO: 10)
From these results, it was suggested that the flo2 gene locus was in the vicinity of 105 cM, and thus more detailed mapping was performed by performing PCR in the vicinity thereof.

まず、１０６ｃＭの位置にある以下のプライマーを用い、条件２で、同様に５００サンプルのＦ２に対しＰＣＲを行ったところ、組み替え率が３．８７％であったので、flo2遺伝子座は１０２ｃＭまたは１０９．７ｃＭの付近にあることが明らかになった。
106-5-3(In):ＡＣＣＧＴＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＧＣＡＣＡ（配列番号１１）
106-3-2(In):ＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＧＴＴＴＧＡＣＴＡＴ（配列番号１２）
106-5-3(Jp):ＡＣＣＧＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴＡＧＣＡＴＡ（配列番号１３）
106-3-2(Jp):ＣＣＧＴＧＣＴＡＡＣＧＴＴＴＧＡＣＴＧＴ（配列番号１４） First, using the following primers in a position of 106cm, the condition 2 was performed similarly 500 PCR to F 2 samples, since recombination rate was 3.87%, fLO2 locus 102cM or It was found to be in the vicinity of 109.7 cM.
106-5-3 (In): ACCGTTGAACTTTTAGCACA (SEQ ID NO: 11)
106-3-2 (In): CCATGCCAACGTTTGACTAT (SEQ ID NO: 12)
106-5-3 (Jp): ACCGTTAACTTTTAGTAGATA (SEQ ID NO: 13)
106-3-2 (Jp): CCGTGCTAACGTTTGAACTGT (SEQ ID NO: 14)

さらに、１０５ｃＭの位置にある以下のプライマーを用い、条件２で、同様に２７０サンプルのＦ２に対しＰＣＲを行ったところ、組み替え率が４．６６％であったので、flo2遺伝子座は１００．１ｃＭまたは１０９．５ｃＭの付近にあることが明らかになった。
105-5-3(In):ＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＣＣＴＣＴ（配列番号１５）
105-3-1(In):ＣＣＴＴＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＡＴＴＣＴＴ（配列番号１６）
105-5-3(Jp):ＣＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴ（配列番号１７）
105-3-1(Jp):ＣＣＴＴＡＧＡＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＴ（配列番号１８） Furthermore, using the following primers in a position of 105 cm, in condition 2, it was subjected to the same PCR to 270 samples of F 2, since recombination rate was 4.66%, fLO2 locus 100. It was found to be in the vicinity of 1 cM or 109.5 cM.
105-5-3 (In): CTTGTGTTTTCAATCCTCT (SEQ ID NO: 15)
105-3-1 (In): CCTTAGATGAACTTTATTCTT (SEQ ID NO: 16)
105-5-3 (Jp): CTTGTGTTTTCAATCCCTTT (SEQ ID NO: 17)
105-3-1 (Jp): CCTTAGATAAACTATTATTCCT (SEQ ID NO: 18)

これらの結果より、flo2遺伝子座は１０９．６ｃＭ付近にあることが示唆された。   These results suggested that the flo2 locus is in the vicinity of 109.6 cM.

さらに、１１０ｃＭ近傍のＳＳＲ（マイクロサテライト）マーカーを用いてより精密なマッピングを行った。多数のflo2の表現型を示すＦ２個体に対し、１０９．６ｃＭ付近にあるＳＳＲマーカー（２１７９５１、２１８０４２、２１８３４５、ＲＭ８２１７、２１８７６７、２１８７８７、２１８８０１）（詳細は表１に示す）を調べたところ、図１に示すように（白抜きの領域がJaponica由来であり、斜線の部分がIndica由来である。）、２１８０４２〜２１８７８７のＤＮＡ領域の由来と表現型が常に一致し、この結果、flo2遺伝子座はこの領域の約３７ｋｂの範囲に存在することが明らかになった。 Furthermore, more precise mapping was performed using an SSR (microsatellite) marker near 110 cM. To F 2 individuals showing the phenotype of a large number of fLO2, SSR markers in the vicinity 109.6cM (217951,218042,218345, RM8217,218767,218787,218801) where (details in table 1) were examined, As shown in FIG. 1 (the white area is derived from Japonica and the shaded area is derived from Indica), the origin and phenotype of the 218042 to 218787 DNA region always coincide, and as a result, the flo2 locus Was found to be in the region of about 37 kb in this region.

＝＝flo2遺伝子の同定＝＝
３７kbのＤＮＡに対し、ＯＲＦの検索を行ったところ、（Ａ）OSJNBa0033G05.19（２９７）、（Ｂ）OSJNBa0033G05.20（８０２）、（Ｃ）OSJNBa0033G05.21（５７５）、（Ｄ）OSJNBa0070011.2（１７２１）の４つの遺伝子（Ａ）〜（Ｄ）が３７kb 内に存在し、flo2遺伝子の候補になった（カッコ内はアミノ酸数）。そこで、flo2変異型ＥＭ３７変異体の塩基配列を決定したところ、（Ｄ）OSJNBa0070011.2遺伝子において、配列番号１に示すＤＮＡの第９９８１番目のＧがＡに置換し、その結果、本来８２８番目のトリプトファンをコードするコドンが、ストップコドンに変異していた（図２）。一方、他の３つの遺伝子には、変異は無かった。 == Identification of flo2 gene ==
When ORF was searched for 37 kb DNA, (A) OSJNBa0033G05.19 (297), (B) OSJNBa0033G05.20 (802), (C) OSJNBa0033G05.21 (575), (D) OSJNBa0070011.2 Four genes (A) to (D) of (1721) were present within 37 kb and became candidates for the flo2 gene (number of amino acids in parentheses). Thus, when the nucleotide sequence of the flo2 mutant EM37 mutant was determined, (D) in the OSJNBa0070011.2 gene, the 9981st G of the DNA shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with A, and as a result, the 828th originally The codon encoding tryptophan was mutated to a stop codon (FIG. 2). On the other hand, there were no mutations in the other three genes.

また、野生型イネとＥＭ３７変異体において、ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲによってこれらの４つの遺伝子の発現を調べた（図３）。逆転写酵素はReverTraAce（TOYOBO社）を用い、条件は添付のプロトコールに従った。プライマーペアは、それぞれ、
Ａ：ＧＴＣＡＴＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＡＧ（配列番号３１）
ＧＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＴＣＧＡＡＡＣ（配列番号３２）
Ｂ：ＴＴＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴ（配列番号３３）
ＴＧＧＧＣＴＣＴＡＡＧＡＡＣＴＡＧＡＣ（配列番号３４）
Ｃ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧ（配列番号３５）
ＧＣＧＡＡＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＴＧＧ（配列番号３６）
Ｄ−１：ＣＴＣＡＡＴＡＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＴＴ（配列番号３７）
ＴＡＴＴＧＧＣＡＧＧＣＡＴＧＴＴＣＴＣ（配列番号３８）
Ｄ−２：ＴＴＡＧＧＣＣＧＴＧＴＧＧＴＡＧＡＧ（配列番号３９）
ＧＧＡＣＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＴＡＣＡ（配列番号４０）
を用い、９４℃で３０秒−５５℃で３０秒−７２℃で３分のサイクルを３０サイクル行なった。図３に示すように、野生型と比べ、ＥＭ３７においては、OSJNBa0070011.2遺伝子（Ｄ）の発現は低下していた。他の遺伝子に関しては、遺伝子ＡはＥＭ３７の方が発現量が高く、遺伝子Ｂは両者とも発現が極めて低く、遺伝子Ｂ、遺伝子Ｃともに発現量に変化がなかった。 Moreover, RNA was isolated in wild-type rice and EM37 mutants, and the expression of these four genes was examined by RT-PCR (FIG. 3). The reverse transcriptase was ReverTraAce (TOYOBO), and the conditions were in accordance with the attached protocol. Each primer pair is
A: GTCATGGGGCGGTCCAAG (SEQ ID NO: 31)
GGCAGGCTCTCGTCGAAAC (SEQ ID NO: 32)
B: TTGGTTATGCTGGCTCTT (SEQ ID NO: 33)
TGGGCTCTAAGAACTAGAC (SEQ ID NO: 34)
C: GAAGATCTGCCCAGCAATGG (SEQ ID NO: 35)
GCGAATCACGGAAGATTGG (SEQ ID NO: 36)
D-1: CTCAATACTCGGAGGTGTT (SEQ ID NO: 37)
TATTGGCAGGCATGTTCTC (SEQ ID NO: 38)
D-2: TTAGGCCGTGTGTAGAG (SEQ ID NO: 39)
GGACCACAAACTGCTACA (SEQ ID NO: 40)
30 cycles of 94 ° C. for 30 seconds at −55 ° C. for 30 seconds at −72 ° C. for 3 minutes. As shown in FIG. 3, the expression of OSJNBa0070011.2 gene (D) was decreased in EM37 as compared to the wild type. Regarding the other genes, the expression level of gene A was higher in EM37, the expression level of both genes B was extremely low, and the expression levels of both genes B and C did not change.

これらの結果より、OSJNBa0070011.2遺伝子が目的のflo2変異の原因遺伝子（floury-2遺伝子）であることが明らかになった。従って、配列番号１に示すＤＮＡの第９９８１番目のＧがＡに置換した変異植物や、floury-2遺伝子の機能を低下させた変異植物を作製すれば、低アレルゲン性イネであるflo2変異体を作製することができる。また、上記floury-2遺伝子の遺伝子関連物質は、低アレルゲン植物やflo2変異体のマーカーとなり得る。   From these results, it was revealed that the OSJNBa0070011.2 gene is the gene responsible for the desired flo2 mutation (floury-2 gene). Therefore, if a mutant plant in which the 9981st G of the DNA shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with A or a mutant plant with reduced function of the floury-2 gene is produced, a flo2 mutant that is a low allergenic rice is obtained. Can be produced. Further, the gene-related substance of the floury-2 gene can be a marker for hypoallergenic plants and flo2 mutants.

本発明の実施例において、ＳＳＲマーカーを用いて作製されたマップを表す図である。Ｉ（斜線）はIndica由来のＤＮＡ、ＪはJaponica由来のＤＮＡを表す。In the Example of this invention, it is a figure showing the map produced using the SSR marker. I (diagonal line) represents DNA derived from Indica, and J represents DNA derived from Japonica. 本発明の実施例において、OSJNBa0070011.2遺伝子近傍の塩基配列と、OSJNBa0070011.2遺伝子がコードするアミノ酸配列を並列させた図である。白抜きで表したＧは、ＥＭ３７変異体において、Ａに置換している塩基である。ここでは、連続した配列を図２Ａ〜図２Ｊに分けて示した。In the Example of this invention, it is the figure which juxtaposed the base sequence of OSJNBa0070011.2 gene vicinity, and the amino acid sequence which OSJNBa0070011.2 gene codes. G shown in white is a base substituted for A in the EM37 mutant. Here, the continuous arrangement is divided into FIGS. 2A to 2J. 図２Ａに示した配列の続きである。It is a continuation of the arrangement | sequence shown to FIG. 2A. 図２Ｂに示した配列の続きである。2B is a continuation of the arrangement shown in FIG. 2B. 図２Ｃに示した配列の続きである。2C is a continuation of the arrangement shown in FIG. 2C. 図２Ｄに示した配列の続きである。2D is a continuation of the arrangement shown in FIG. 2D. 図２Ｅに示した配列の続きである。2E is a continuation of the arrangement shown in FIG. 2E. 図２Ｆに示した配列の続きである。2B is a continuation of the arrangement shown in FIG. 2F. 図２Ｇに示した配列の続きである。FIG. 2B is a continuation of the arrangement shown in FIG. 2G. 図２Ｈに示した配列の続きである。FIG. 2H is a continuation of the arrangement shown in FIG. 2H. 図２Ｉに示した配列の続きである。FIG. 2B is a continuation of the arrangement shown in FIG. 2I. 本発明の実施例において、ＳＳＲマーカーを用いて行なったマッピングで特定された３７ｋｂの領域内に存在する４つの遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで検出した結果を示す図である。ＷＴは野生型のイネ、ＥＭはＥＭ３７のイネにおける発現を示す。矢印は、ＥＭ３７変異体において、野生型イネで検出されるバンドが検出されないことを示している。In the Example of this invention, it is a figure which shows the result of having detected the expression of four genes which exist in the 37-kb area | region specified by the mapping performed using the SSR marker by RT-PCR. WT indicates expression in wild-type rice, and EM indicates expression in EM37 rice. The arrow indicates that no band detected in wild-type rice is detected in the EM37 mutant.

Claims (26)

遺伝子組換え低アレルゲンイネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする製造方法。 A method for producing a transgenic low allergen rice, wherein the function of the floury-2 gene is introduced by introducing into the genome a floury-2 gene for homologous recombination, RNAi for the floury-2 gene or RNA for antisense RNA. Including specifically reducing,
The production method, wherein the floury-2 gene is DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. 遺伝子組換え低アレルゲンイネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする製造方法。 A method for producing a transgenic low allergen rice, wherein the function of the floury-2 gene is introduced by introducing into the genome a floury-2 gene for homologous recombination, RNAi for the floury-2 gene or RNA for antisense RNA. Including specifically reducing,
The production method, wherein the floury-2 gene is a gene encoding a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. floury-2遺伝子の発現を低下させることにより、floury-2遺伝子の機能を低下させることを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。   The production method according to claim 1 or 2, wherein the function of the floury-2 gene is lowered by lowering the expression of the floury-2 gene. 遺伝子組換え低アレルゲンイネの製造方法であって、配列番号１に示すＤＮＡの第９９８１番目のＧをＡに置換した相同組換え用floury-2遺伝子をゲノムに導入することを特徴とする方法。   A method for producing a genetically modified low allergen rice, comprising introducing into a genome a floury-2 gene for homologous recombination in which the 9981st G of the DNA shown in SEQ ID NO: 1 has been replaced with A. floury-2変異イネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする製造方法。 A method for producing floury-2 mutant rice, by introducing into the genome a floury-2 gene for homologous recombination, RNAi for the floury-2 gene or a nucleic acid for antisense RNA. Including degrading,
The production method, wherein the floury-2 gene is DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. floury-2変異イネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するＲＮＡｉ用またはアンチセンスＲＮＡ用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする製造方法。 A method for producing floury-2 mutant rice, by introducing into the genome a floury-2 gene for homologous recombination, RNAi for the floury-2 gene or a nucleic acid for antisense RNA. Including degrading,
The production method, wherein the floury-2 gene is a gene encoding a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. floury-2遺伝子の発現を低下させることにより、floury-2遺伝子の機能を低下させることを特徴とする請求項５又は６に記載の製造方法。   The production method according to claim 5 or 6, wherein the function of the floury-2 gene is lowered by lowering the expression of the floury-2 gene. floury-2変異イネの製造方法であって、配列番号１に示すＤＮＡの第９９８１番目のＧをＡに置換した相同組換え用floury-2遺伝子をゲノムに導入することを特徴とする方法。   A method for producing floury-2 mutant rice, which comprises introducing into a genome a floury-2 gene for homologous recombination in which the 9981st G of the DNA shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with A. 請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法によって製造された遺伝子組換え低アレルゲンイネ。   A genetically modified low allergen rice produced by the production method according to claim 1. 請求項５〜８のいずれかに記載の製造方法によって製造されたfloury-2変異イネ。   A floury-2 mutant rice produced by the production method according to claim 5. 請求項９または１０に記載のイネの種子。   Rice seed according to claim 9 or 10. 単離された、floury-2遺伝子のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部である低アレルゲンイネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とするマーカー。 An isolated marker for hypoallergenic rice that is DNA, RNA, protein of a floury-2 gene, or a part thereof,
The marker, wherein the floury-2 gene is DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. 単離された、floury-2遺伝子のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部である低アレルゲンイネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とするマーカー。 An isolated marker for hypoallergenic rice that is DNA, RNA, protein of a floury-2 gene, or a part thereof,
The marker, wherein the floury-2 gene is a gene encoding a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. 低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする方法。 A method for identifying low allergen rice,
including examining the increase or decrease in function of floury-2 gene,
The method wherein the floory-2 gene is DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. 低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。 A method for identifying low allergen rice,
including examining the increase or decrease in function of floury-2 gene,
The method wherein the floury-2 gene is a gene encoding a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. 低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする方法。 A method for identifying low allergen rice,
including examining the expression of the floury-2 gene,
The method wherein the floory-2 gene is DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. 低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。 A method for identifying low allergen rice,
including examining the expression of the floury-2 gene,
The method wherein the floury-2 gene is a gene encoding a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. 単離された、floury-2遺伝子のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部であるfloury-2変異イネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とするマーカー。 An isolated marker of floury-2 mutant rice that is DNA, RNA, protein, or part of floury-2 gene,
The marker, wherein the floury-2 gene is DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. 単離された、floury-2遺伝子のＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの一部であるfloury-2変異イネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とするマーカー。 An isolated marker of floury-2 mutant rice that is DNA, RNA, protein, or part of floury-2 gene,
The marker, wherein the floury-2 gene is a gene encoding a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする方法。 A method for identifying floury-2 mutant rice,
including examining the increase or decrease in function of floury-2 gene,
The method wherein the floory-2 gene is DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。 A method for identifying floury-2 mutant rice,
including examining the increase or decrease in function of floury-2 gene,
The method wherein the floury-2 gene is a gene encoding a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とする方法。 A method for identifying floury-2 mutant rice,
including examining the expression of the floury-2 gene,
The method wherein the floory-2 gene is DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。 A method for identifying floury-2 mutant rice,
including examining the expression of the floury-2 gene,
The method wherein the floury-2 gene is a gene encoding a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. 低アレルゲンイネまたはfloury-2変異イネを同定するためのキットであって、
floury-2遺伝子の発現検出用ＰＣＲプライマーペア、またはfloury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を含有し、
前記floury-2遺伝子が、配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡであることを特徴とするキット。 A kit for identifying low allergen rice or floury-2 mutant rice,
Contains a PCR primer pair for detecting the expression of the floury-2 gene, or an antibody for detecting the expression of the floury-2 gene product,
The kit, wherein the floury-2 gene is DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. 低アレルゲンイネまたはfloury-2変異イネを同定するためのキットであって、
floury-2遺伝子の発現検出用ＰＣＲプライマーペア、またはfloury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を含有し、
前記floury-2遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とするキット。 A kit for identifying low allergen rice or floury-2 mutant rice,
Contains a PCR primer pair for detecting the expression of the floury-2 gene, or an antibody for detecting the expression of the floury-2 gene product,
The kit, wherein the floury-2 gene is a gene encoding a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. floury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を用いたイムノクロマト法（Immunochromatography）によってfloury-2遺伝子産物を検出できる検出器を備えていることを特徴とする請求項２４又は２５に記載のキット。   The kit according to claim 24 or 25, further comprising a detector capable of detecting the floury-2 gene product by immunochromatography using an antibody for detecting the expression of the floury-2 gene product.
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