JP5250441B2 - Measurement method of natural moisturizing factor by infrared absorption spectrum - Google Patents
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Description
本発明は、赤外吸収スペクトルを用いて、皮膚の角層中の天然保湿因子（ＮＭＦ）量を測定する方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring the amount of natural moisturizing factor (NMF) in the stratum corneum of skin using an infrared absorption spectrum.
化粧品類、皮膚洗浄料等の販売において、顧客に最も適した化粧品を推奨するために、顧客の皮膚の水分・油分・色調・形態等を店頭で測定するサービスが広く行われている。また、こういった化粧品類や皮膚洗浄料の研究開発の過程においても、肌の状態を機器計測により指標化することは、より効果の高い化粧品、皮膚洗浄料等の開発の上で必要不可欠のものとなっている。そのため、皮膚の水分・油分・色調・形態等を評価するための種々の技術開発が行われてきており、これに関係した多数の特許が今までに取得されている。 In order to recommend cosmetics most suitable for customers in sales of cosmetics, skin cleansing products, etc., services for measuring the moisture, oil content, color tone, form, etc. of customers' skin at stores are widely used. Also, in the process of research and development of cosmetics and skin cleansers, it is indispensable to develop more effective cosmetics, skin cleansers, etc., by indexing the skin condition by instrument measurement. It has become a thing. Therefore, various technical developments for evaluating the moisture, oil content, color tone, form, etc. of the skin have been performed, and many patents related to this have been obtained so far.
化粧品及び皮膚洗浄料の販売や化粧品及び皮膚洗浄料開発等において重要な肌性状の評価指標の一つとして、角層中の天然保湿因子（ＮＭＦ：Ｎａｔｕｒａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）量が知られている。ＮＭＦは、角層中の水溶性保水成分（アミノ酸類、有機酸類、無機塩類等）の総称である。皮膚は、蛋白質・脂質・ＮＭＦ等で構成されている。従来、ＮＭＦ測定法として、角層を剥離後に抽出して液体クロマトグラフで分析することが知られていた。しかし、この方法は侵襲的であり、また、その場で結果を得ることができないため、店頭での応用使用や、研究開発における多数の評価試料の測定には不向きであった。 As one of the evaluation indexes of skin properties important in the sale of cosmetics and skin cleansing agents and the development of cosmetics and skin cleansing agents, the amount of natural moisturizing factor (NMF) in the stratum corneum is known. NMF is a general term for water-soluble water-retaining components (amino acids, organic acids, inorganic salts, etc.) in the stratum corneum. The skin is composed of proteins, lipids, NMF, and the like. Conventionally, as an NMF measurement method, it has been known that a stratum corneum is extracted after peeling and analyzed by a liquid chromatograph. However, this method is invasive, and results cannot be obtained on the spot, so that it is not suitable for use in stores or for measurement of many evaluation samples in research and development.
液体クロマトグラフ以外の方法で角層中のＮＭＦ量の増減（相対量）を測定した例がある（例えば、非特許文献１参照）。この方法は、剥離角層の顕微ＩＲ−透過測定に基づくものであり、ＮＭＦの相対量を求めることができる。非特許文献１には、ＮＭＦを構成する化学種（アミノ酸類、ピロリドンカルボン酸、乳酸塩など）の多くがカルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）を有するため、この信号強度を見積もることにより、角層中のＮＭＦ量の変化を評価できることが記載されている。このことについて、図１を参照しながら説明する。図１は、皮膚の典型的なＩＲ−ＡＴＲ（赤外減衰全反射）スペクトルである。図１に示すように、カルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）に関するピークとしては、１４０４ｃｍ-1付近の波数領域に、カルボキシレートアニオンの対称伸縮振動を示す信号強度が出現する。そのため、非特許文献１に記載された方法では、この１４０４ｃｍ-1付近の波数領域における信号強度を用いて測定を行っている。
There is an example in which the increase / decrease (relative amount) of the amount of NMF in the stratum corneum was measured by a method other than liquid chromatography (for example, see Non-Patent Document 1). This method is based on microscopic IR-transmission measurement of the exfoliated stratum corneum and can determine the relative amount of NMF. In
しかしながら、１４０４ｃｍ-1付近の波数領域に出現しているピークは、カルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）の対称伸縮振動だけではなく、主に皮脂に由来するＣ−Ｈ変角振動が重畳したものである。そのため、皮脂量が増減すると計測値が大きく変動し、正確にＮＭＦ量を測定することができないという問題があった。そのため非特許文献１では、ＩＲスペクトル測定前に試料のヘキサン洗浄を行う必要がある。
However, the peak appearing in the wave number region near 1404 cm −1 is not only the symmetrical stretching vibration of the carboxylate anion (—COO − group) but also the superposition of C—H bending vibration mainly derived from sebum It is. Therefore, when the amount of sebum increases or decreases, the measured value fluctuates greatly, and there is a problem that the amount of NMF cannot be measured accurately. Therefore, in
本発明は、上述の課題に鑑みてなされたものであり、角層中のＮＭＦ量を皮脂の影響を受けることなく精度良く測定することができる、角層中のＮＭＦ測定法を提供することを目的とする。また、角層中のＮＭＦ量を非侵襲的に簡便に測定する方法を提供することを目的とする。 This invention is made | formed in view of the above-mentioned subject, and provides the NMF measuring method in a stratum corneum which can measure the amount of NMF in a stratum corneum accurately, without receiving the influence of sebum. Objective. It is another object of the present invention to provide a method for simply and non-invasively measuring the amount of NMF in the stratum corneum.
通常、カルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）に関する信号強度としては、カルボキシ基対称伸縮振動を示す１４０４ｃｍ-1付近の他にも、１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域にカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動を示す信号強度が存在する。しかしながら、図１に示すように、皮膚の角層中のＮＭＦ測定する場合には、皮膚の蛋白質に由来する１７００〜１６２０ｃｍ-1の波数領域であるアミドＩ吸収帯および１５６０〜１５２０ｃｍ-1の波数領域であるアミドＩＩ吸収帯に強い吸収ピークが存在するため、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動を示す１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度がアミド吸収ピークの谷間に埋もれてしまい、ピークとしては観測されず、従来の方法では定量的に取り扱うことができない。 Usually, carboxylate anion - The signal intensity for (-COO group), in addition to the vicinity of 1404 cm -1 indicating the carboxyl group symmetric stretching vibration, the carboxylate anion antisymmetric stretching vibration wavenumber region of 1610～1570Cm -1 There is a signal strength to indicate. However, as shown in FIG. 1, when measuring NMF in the stratum corneum of the skin, the amide I absorption band, which is a wave number region of 1700 to 1620 cm −1 derived from skin proteins, and the wave number of 1560 to 1520 cm −1 . Since there is a strong absorption peak in the amide II absorption band that is the region, the signal intensity in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1 indicating the carboxylate anion inversely symmetric stretching vibration is buried in the valley of the amide absorption peak, It is not observed and cannot be handled quantitatively by conventional methods.
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、皮膚の角層のＩＲスペクトル中における、強い二本のアミド吸収ピークの谷間に埋もれてピークとしては観測されないカルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）逆対称伸縮振動（１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域）の信号強度を数値処理によって抽出することにより、皮脂の影響を受けずに角層中のＮＭＦ量を定量的に精度良く測定できることを見出した。本発明は、このような知見に基づきなされるに至ったものである。 As a result of intensive studies to achieve the above object, the inventors of the present invention have found that a carboxylate anion (−− embedded in a valley between two strong amide absorption peaks in the IR spectrum of the stratum corneum of the skin and not observed as a peak. COO - group) By extracting the signal intensity of inversely symmetric stretching vibration (wave number range of 1610 to 1570 cm -1 ) by numerical processing, the amount of NMF in the stratum corneum can be measured quantitatively and accurately without being affected by sebum I found out that I can do it. The present invention has been made based on such findings.
本発明は、皮膚の角層の赤外吸収スペクトルを測定して角層中の天然保湿因子（ＮＭＦ）量を測定する方法であって、角層の赤外吸収スペクトルから１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度Ａ、および前記赤外吸収スペクトルから蛋白質由来の信号強度Ｂを観測する工程と、前記信号強度Ａからカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ’を抽出する工程とを含み、該信号強度Ａ’と前記信号強度Ｂとの比から角層中の天然保湿因子ＮＭＦ量を測定する方法を提供するものである。 The present invention is a method of measuring the amount of natural moisturizing factor (NMF) in the stratum corneum by measuring the infrared absorption spectrum of the stratum corneum of the skin, which is from 1610 to 1570 cm −1 from the infrared absorption spectrum of the stratum corneum. A step of observing a signal intensity A in the wave number region and a signal intensity B derived from a protein from the infrared absorption spectrum, and a step of extracting the signal intensity A ′ of the carboxylate anion inversely symmetric stretching vibration from the signal intensity A. The present invention provides a method for measuring the amount of natural moisturizing factor NMF in the stratum corneum from the ratio between the signal intensity A ′ and the signal intensity B.
本発明によれば、角層中のＮＭＦ量を正確に、迅速・簡便に測定することができる。特に、非侵襲的な測定方法において有用である。 According to the present invention, the amount of NMF in the stratum corneum can be measured accurately, quickly and simply. In particular, it is useful in a non-invasive measurement method.
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の方法では、皮膚の角層の赤外吸収スペクトルを測定する。測定は、皮膚から角層を採取して赤外吸収スペクトルを測定する方法（侵襲法）や、皮膚から直接赤外吸収スペクトルを測定する方法（非侵襲法）等が挙げられるが、直接肌の状態を測定できる非侵襲法が好ましい。非侵襲法としては、光ファイバ型ＩＲ−ＡＴＲ測定法乃至ＩＲ−ＡＴＲ測定法などが挙げられるが、本発明はこれに限定されない。ＩＲ−ＡＴＲ測定は、例えば、ＰＩＲ光ファイバ型ＩＲ−ＡＴＲプローブ（システムズエンジニアリング社製）を用いて行うことができる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the method of the present invention, the infrared absorption spectrum of the stratum corneum of the skin is measured. Measurements include the method of measuring the infrared absorption spectrum by collecting the stratum corneum from the skin (invasive method) and the method of measuring the infrared absorption spectrum directly from the skin (noninvasive method). Non-invasive methods that can measure the condition are preferred. Examples of the non-invasive method include an optical fiber type IR-ATR measurement method and an IR-ATR measurement method, but the present invention is not limited to this. The IR-ATR measurement can be performed using, for example, a PIR optical fiber type IR-ATR probe (manufactured by Systems Engineering).
本発明では、角層の赤外吸収スペクトルから１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度Ａ、および前記赤外吸収スペクトルから蛋白質由来の信号強度Ｂを観測する工程と、前記信号強度Ａからカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ’を抽出する工程とを含む。 In the present invention, the step of observing the signal intensity A in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1 from the infrared absorption spectrum of the stratum corneum and the signal intensity B derived from the protein from the infrared absorption spectrum; Extracting the signal intensity A ′ of the rate anion inversely symmetric stretching vibration.
１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における赤外吸収は、カルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基を表す。）の逆対称伸縮振動の情報を含むものである。より詳細には、１６１０〜１５８０cm-1に出現するのは主にアミノ酸類のカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動で、１５９０〜１５７０cm-1に出現するのは主に有機酸類のカルボキシレートアニオンの逆対称伸縮振動である。しかし、カルボキシレートアニオンの逆対称伸縮振動の情報は、蛋白質由来の強い二本の吸収ピーク（アミドＩおよびアミドＩＩ）の谷間に存在するために、角層のＩＲスペクトル中ではピークとしては観測されない。このため、通常の方法では定量的に取り扱うことができず、これまでこの１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における吸収をＮＭＦ量の測定に使用することは容易に想到し得なかった。これに対して、本発明では、１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度Ａからカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ’を抽出することで、油脂成分の影響をほとんど受けないＮＭＦ情報を得ることができる。
ここで、本発明における「有機酸類」とは各層中にＮＭＦとして存在するものであれば特に制限はなく、例えば、乳酸塩、クエン酸塩、ピロリドンカルボン酸等が挙げられる。
Infrared absorption in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1 includes information on the inversely symmetric stretching vibration of the carboxylate anion (representing a —COO − group). More specifically, to appear in 1610～1580Cm -1 mainly carboxylate anion antisymmetric stretching vibration of amino acids, anti-symmetric carboxylate anions are mainly organic acids to appear in 1590～1570Cm -1 It is stretching vibration. However, the information on the inversely symmetric stretching vibration of the carboxylate anion is not observed as a peak in the IR spectrum of the stratum corneum because it exists in the valleys of two strong protein-derived absorption peaks (amide I and amide II). . For this reason, it cannot be handled quantitatively by a normal method, and until now it has not been easily conceivable to use the absorption in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1 for the measurement of the amount of NMF. On the other hand, in the present invention, the NMF information that is hardly affected by the fat and oil component by extracting the signal intensity A ′ of the inversely symmetrical stretching vibration of the carboxylate anion from the signal intensity A in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1. Can be obtained.
Here, the “organic acids” in the present invention are not particularly limited as long as they are present as NMF in each layer, and examples thereof include lactate, citrate, and pyrrolidone carboxylic acid.
本発明を更に詳細に説明する。
第一の実施態様として、上記波数領域のうち、１６１０〜１５８０cm-1の波数領域における信号強度Ａ１を観測し、これを用いてカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ’を抽出することにより角層中の天然保湿因子ＮＭＦ量を精度よく測定することが出来ることができる。そして、上記波数領域のうち、１６１０〜１５９０cm-1の波数領域の信号強度Ａ１１を用いると、より精度よく測定することができる。
また第二の実施態様として、１６１０〜１５９０cm-1の波数領域における信号強度Ａ１１と１５９０〜１５７０cm-1の波数領域における信号強度Ａ１２を観測する。信号強度Ａ１１及び信号強度Ａ１２各々から抽出したカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度Ａ１１’及びＡ１２’の和を信号強度Ａ’とする。当該信号強度Ａ’を用いることによって、アミノ酸類のカルボキシレートアニオン由来の逆対称伸縮運動の信号と共に有機酸類のカルボキシレートアニオン由来の逆対称伸縮振動の信号強度を観測することができる。そのため、更に高い精度でＮＭＦ量を測定することが可能となる。
The present invention will be described in further detail.
As a first embodiment, by observing the signal intensity A1 in the wave number region of 1610 to 1580 cm −1 in the wave number region, and extracting the signal strength A ′ of the carboxylate anion inversely symmetric stretching vibration using this The amount of natural moisturizing factor NMF in the stratum corneum can be accurately measured. If the signal intensity A11 in the wave number region of 1610 to 1590 cm −1 is used in the wave number region, the measurement can be performed with higher accuracy.
As a second embodiment, to observe the signal strength A12 in wavenumber region of the signal strength A11 and 1590～1570Cm -1 at a wave number region of 1610~1590cm -1. The sum of the signal intensities A11 ′ and A12 ′ of the carboxylate anion inversely symmetric stretching vibrations extracted from the signal intensity A11 and the signal intensity A12 is defined as a signal intensity A ′. By using the signal intensity A ′, the signal intensity of the reverse symmetric stretching vibration derived from the carboxylate anion of the organic acid can be observed together with the signal of the reverse symmetric stretching movement derived from the carboxylate anion of the amino acid. Therefore, it becomes possible to measure the amount of NMF with higher accuracy.
本発明において観測される信号強度Ｂは、蛋白質由来の吸収帯における赤外吸収スペクトルであればいかなるものを使用してもよいが、アミドＩ吸収帯（１７００〜１６２０ｃｍ-1の波数領域）および／またはアミドＩＩ吸収帯（１５６０〜１５２０ｃｍ-1の波数領域）由来の吸収信号を使用することが好ましい。 As the signal intensity B observed in the present invention, any infrared absorption spectrum in the protein-derived absorption band may be used, but the amide I absorption band (1700 to 1620 cm −1 wavenumber region) and / or Alternatively, it is preferable to use an absorption signal derived from the amide II absorption band (wave number range of 1560 to 1520 cm −1 ).
本発明では、皮膚のＩＲスペクトル中のカルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）逆対称伸縮振動の信号強度を数値処理によって算出する。逆対称伸縮振動の信号強度（Ａ’、Ａ１１’、Ａ１２’）を抽出する手段としては特に限定されないが、カーブフィッティング法、差スペクトル法、スペクトル合成法を好ましく適用することができる。 In the present invention, the signal intensity of the carboxylate anion (—COO − group) inversely symmetric stretching vibration in the IR spectrum of the skin is calculated by numerical processing. The means for extracting the signal strength (A ′, A11 ′, A12 ′) of the inversely symmetric stretching vibration is not particularly limited, but a curve fitting method, a difference spectrum method, and a spectrum synthesis method can be preferably applied.
（１）カーブフィッティング法
カーブフィッティング法は、皮膚の角層のＩＲスペクトルを、適切な関数の重ね合わせで表現し、各信号成分の寄与を定量的に見積もる方法である。カーブフィッティング法を用いることにより、各成分の吸収バンドを分離し、各々の吸収バンドの正確な位置や面積を計算することができる。カーブフィッティング法に用いられる関数形としては、ガウス関数、ローレンツ関数、フォークト関数等が挙げられる。皮膚は蛋白質・脂質・ＮＭＦ等で構成されており、そのＩＲスペクトルはきわめて複雑であるが、適切な関数（例えばガウス関数）の重ね合わせで、そのスペクトル形状を良く表現することが可能である。
実際にカーブフィッティングを行うには、市販の数値解析ソフトを使用してもよいし、専用ソフトを作成してもよい。
市販ソフトとしては、例えばＩＧＯＲ Ｐｒｏ ６．０（株式会社ヒューリンクス）やＯｒｉｇｉｎ８．０（株式会社ライトストーン）が利用できる。例えば分光学の分野で現在広く普及しているＩＧＯＲ Ｐｒｏ ６．０では、回帰分析 （カーブフィッティングと同じ）用の組み込み回帰関数として、線形、多項式、サイン、指数、二重指数、ガウス、ローレンツ、ヒルの微分方程式、シグモイド、ログノーマル、ガウス ２Ｄ （２次元ガウスピーク）、多項式 ２Ｄ （２次元多項式）が用意されている。解析したいＩＲスペクトルをＩＧＯＲ Ｐｒｏ ６．０に読み込み、スペクトル形状を最も良く表現できる波数位置に任意の関数（例えばガウス関数）を必要な個数だけ配置し、固定するパラメーター（例えばピーク位置やピーク幅等）と、可変とするパラメーター（例えばピーク高さ）を指定する。その後に回帰分析機能を実行すれば、関数の重ね合わせにより合成したスペクトルと、実測のＩＲスペクトルの各データ点における、二乗誤差の総和が最小になる可変パラメーター値群を本ソフトは出力してくれる。
専用ソフトを作成する場合は、例えば代表的なプログラミング言語であるＶｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ６．０やＶｉｓｕａｌ Ｃ＋＋上で作成することができる。解析したいＩＲスペクトル形状を、上記市販ソフトの場合と同様に、ガウス関数のような非線形関数の重ね合わせで最小二乗近似するソフトを記述することになる。最小二乗近似法としては、例えば最小二乗Ｔａｙｌｏｒ微分補正法を用いることで、関数の重ね合わせにより合成したスペクトルと、実測のＩＲスペクトルの各データ点における二乗誤差の総和が最小になる可変パラメーター値群を算出することができる。最小二乗Ｔａｙｌｏｒ微分補正法のプログラミング方法については、以下の書籍を参考にすれば実行することができる。
「科学計測のための波形データ処理」，南 著，ＣＱ出版社
「最小二乗法による実験データ解析」，中川，小柳 著，東京大学出版会
“Numerical Recipes in C” by H．w．Press，S．A．Teukolsky，W．T．Vetterling，and B．P．Flannery，Cambrige University Press（１９８８）
邦訳：「Ｃ言語による数値計算のレシピ」、技術評論社
上述のように市販ソフト、あるいは作成した専用ソフトを用いることにより、測定対象の角層のＩＲスペクトルにおける各々の吸収バンドの、正確な面積を計算することができる。このようにして得られた各吸収バンド面積のうち、蛋白質由来の吸収バンドの面積を蛋白質由来の信号強度Ｂとし、カルボキシレートアニオン（−ＣＯＯ-基）逆対称伸縮振動由来の吸収バンドの面積をカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度（Ａ’、Ａ１１’、Ａ１２’）とすることができる。
(1) Curve fitting method The curve fitting method is a method for quantitatively estimating the contribution of each signal component by expressing the IR spectrum of the skin stratum corneum by superimposing appropriate functions. By using the curve fitting method, the absorption band of each component can be separated, and the exact position and area of each absorption band can be calculated. Examples of the function form used in the curve fitting method include a Gaussian function, a Lorentz function, a Forked function, and the like. The skin is composed of proteins, lipids, NMF, and the like, and its IR spectrum is extremely complicated, but the spectrum shape can be well expressed by superimposing appropriate functions (for example, Gaussian functions).
In order to actually perform curve fitting, commercially available numerical analysis software may be used, or dedicated software may be created.
As commercially available software, for example, IGOR Pro 6.0 (Hulinks Co., Ltd.) and Origin 8.0 (Light Stone Co., Ltd.) can be used. For example, in IGOR Pro 6.0, which is now widely used in the field of spectroscopy, linear, polynomial, sine, exponential, double exponential, Gaussian, Lorentz, as built-in regression functions for regression analysis (same as curve fitting) Hill's differential equation, sigmoid, lognormal, Gaussian 2D (two-dimensional Gaussian peak), and polynomial 2D (two-dimensional polynomial) are prepared. Load the IR spectrum you want to analyze into IGOR Pro 6.0, place the required number of arbitrary functions (for example, Gaussian functions) at wave number positions that can best represent the spectrum shape, and fix parameters (for example, peak position and peak width) ) And a variable parameter (for example, peak height). After that, if the regression analysis function is executed, this software will output a variable parameter value group that minimizes the sum of the square error at each data point of the spectrum synthesized by superimposing the function and the measured IR spectrum. .
When creating dedicated software, for example, it can be created on Visual Basic 6.0 or Visual C ++, which are typical programming languages. As in the case of the above-described commercially available software, software for approximating the least squares by superimposing a nonlinear function such as a Gaussian function is described. As the least square approximation method, for example, by using the least square Taylor differential correction method, a variable parameter value group that minimizes the sum of square errors at each data point of a spectrum synthesized by superimposing functions and an actually measured IR spectrum. Can be calculated. The programming method of the least square Taylor differential correction method can be executed with reference to the following books.
“Waveform data processing for scientific measurement”, Minami, CQ Publisher “Experimental data analysis by least squares”, Nakagawa, Koyanagi, University of Tokyo Press “Numerical Recipes in C” by H. w. Press, S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling, and B. P. Flannery, Cambrige University Press (1988)
Japanese translation: "C recipe for numerical computation", Technical Review, Inc. By using commercially available software or special software created as described above, the exact area of each absorption band in the IR spectrum of the stratum corneum to be measured Can be calculated. Of the absorption band areas thus obtained, the area of the protein-derived absorption band is defined as the signal intensity B derived from the protein, and the area of the absorption band derived from the carboxylate anion (-COO - group) inversely symmetric stretching vibration is defined as The signal intensity (A ′, A11 ′, A12 ′) of the carboxylate anion inversely symmetric stretching vibration can be obtained.
（２）差スペクトル法
差スペクトル法は、測定対象の角層のＩＲスペクトル（ＮＭＦを含む皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトル）から、ＮＭＦを除去した角層のＩＲスペクトル（ＮＭＦを含まない皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトル）を差し引くことにより、測定対象の角層のＩＲスペクトルにおける、ＮＭＦの信号強度を見積もる方法である。角層中のＮＭＦを除去する方法としては、例えば、皮膚表面に有機溶媒（アセトンとジエチルエーテルの混合溶媒等）を接触させた後に水に接触させることにより行うことが挙げられる。
スペクトルの差し引きを行う前に、差し引きに用いる２つのＩＲスペクトル（測定対象の角層と、ＮＭＦを除去した角層）の吸光度表示での信号強度を、ＮＭＦの影響を受けない吸収ピークの強度を基準に規格化しておくことが必要である。ＮＭＦの影響を受けない吸収ピークとしては蛋白質に特徴的な吸収が好ましく、その中でも特に特徴的な吸収であるアミドＩまたはアミドＩＩの吸収ピーク強度を基準とするのが最も好ましい。
例えばアミドＩを基準とする場合であれば、例えば１８００ｃｍ-1〜１６００ｃｍ-1における最大値と最小値が、それぞれ１．５および０になるように、差し引きに用いる２つのＩＲスペクトル（測定対象の角層と、ＮＭＦを除去した角層）の吸光度を規格化し、その後に差分スペクトル（測定対象の角層の規格化後のスペクトル―ＮＭＦを除去した角層の規格化後のスペクトル）の算出を行うことになる。差分の算出は一般的なＩＲスペクトルの解析ソフト（例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のＯＭＮＩＣソフトウェア）の機能により求めることができる。
このようにして得られた差分スペクトルにおける、１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域に出現する各信号の強度を、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度（Ａ’、Ａ１１’、Ａ１２’）とし、規格化後の２つのＩＲスペクトル（測定対象の角層と、ＮＭＦを除去した角層）のいずれかにおける蛋白質由来の吸収バンドの面積を蛋白質由来の信号強度Ｂすることができる。
(2) Difference spectrum method In the difference spectrum method, the IR spectrum of the stratum corneum in which NMF is removed from the IR spectrum of the stratum corneum to be measured (IR-ATR spectrum of the skin containing NMF) (IR- of the skin not containing NMF) This is a method for estimating the NMF signal strength in the IR spectrum of the stratum corneum to be measured by subtracting the (ATR spectrum). As a method for removing NMF in the stratum corneum, for example, an organic solvent (such as a mixed solvent of acetone and diethyl ether) is brought into contact with the skin surface and then brought into contact with water.
Before subtracting the spectrum, the signal intensity in the absorbance display of the two IR spectra used for subtraction (the stratum corneum to be measured and the stratum corneum from which NMF has been removed) is expressed as the intensity of the absorption peak that is not affected by NMF. It is necessary to standardize the standard. Absorption peaks that are not affected by NMF are preferably absorptions characteristic of proteins. Among them, absorption peak intensities of amide I or amide II, which are particularly characteristic absorptions, are most preferable.
For example, when the amide I is used as a reference, two IR spectra used for subtraction (measurement object to be measured) are set so that the maximum value and the minimum value at 1800
In the difference spectrum obtained in this way, the intensity of each signal appearing in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1 is the signal intensity of the carboxylate anion inversely symmetric stretching vibration (A ′, A11 ′, A12 ′), The protein-derived signal intensity B can be defined as the area of the protein-derived absorption band in one of the two normalized IR spectra (the stratum corneum to be measured and the stratum corneum from which NMF has been removed).
（３）スペクトル合成法
スペクトル合成法は、測定対象の角層のＩＲスペクトル（ＮＭＦを含む皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトル）を、ＮＭＦを除去した角層のＩＲスペクトル（ＮＭＦを含まない皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトル）と、ＮＭＦのＩＲスペクトルの重ね合わせで近似することにより、測定対象の角層のＩＲスペクトルにおける、ＮＭＦの信号強度を見積もる方法である。角層中のＮＭＦを除去する方法としては、例えば、皮膚表面に有機溶媒（アセトンとジエチルエーテルの混合溶媒等）を接触させた後に水に接触させることにより行うことが挙げられる。このとき抽出された水溶液の乾固物のＩＲ−ＡＴＲスペクトル、あるいは水溶液のＩＲ−ＡＴＲスペクトルより水の信号を差し引いた差スペクトルを、ＮＭＦのＩＲスペクトルとみなすことができる。あるいは角層のＮＭＦ組成を模した組成を有す混合物（アミノ酸、有機酸等で構成）のＩＲ−ＡＴＲスペクトル、あるいは本モデルＮＭＦの水溶液のＩＲ−ＡＴＲスペクトルより水の信号を差し引いた差スペクトルを、ＮＭＦのＩＲスペクトルとみなすことができる。
このようにして得られた、測定対象の角層のＩＲスペクトルを、ＮＭＦを除去した角層のＩＲスペクトルとＮＭＦのＩＲスペクトルで合成・近似することになる。
ここで
測定対象の角層のＩＲスペクトル＝α×（ＮＭＦを除去した角層のＩＲスペクトル）＋β×（ＮＭＦのＩＲスペクトル）
とし、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動を含む波数領域において、測定対象の角層のＩＲスペクトルを最も良く表現するαとβの組み合わせを求めることになる。計算に適した波数領域としてはアミドＩ、アミドＩＩ、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号を含む１８００〜１４５０ｃｍ-1を有していることが好ましい。
最適なα、βの算出法としては、上述のような市販の数値解析ソフトを使用してもよいが、一般的な表計算ソフト（例えばマイクロソフト社のエクセル）のソルバー機能を用いても簡単に算出することができる。この場合、α、βの関数として得られる合成スペクトルと測定対象の角層のＩＲスペクトルとの間で、各波数データ点ごとに差分値を算出する。そして、この差分値の二乗値を全データ点で積分した値が最小値を示すように、ソルバー機能を用いてα、βを最適化すればよい。このようにして得られたパラメーターβをカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度（Ａ’、Ａ１１’、Ａ１２’）とし、パラメーターαを蛋白質由来の信号強度Ｂすることができる。
(3) Spectral synthesis method The spectral synthesis method uses the IR spectrum of the stratum corneum to be measured (IR-ATR spectrum of skin containing NMF) and the IR spectrum of the stratum corneum from which NMF has been removed (IR- of skin not containing NMF). This is a method for estimating the NMF signal strength in the IR spectrum of the stratum corneum to be measured by approximating the ATR spectrum) and the NMF IR spectrum. As a method for removing NMF in the stratum corneum, for example, an organic solvent (such as a mixed solvent of acetone and diethyl ether) is brought into contact with the skin surface and then brought into contact with water. The IR-ATR spectrum of the dried aqueous solution extracted at this time or the difference spectrum obtained by subtracting the water signal from the IR-ATR spectrum of the aqueous solution can be regarded as the IR spectrum of NMF. Alternatively, the difference spectrum obtained by subtracting the water signal from the IR-ATR spectrum of a mixture (consisting of amino acids, organic acids, etc.) having a composition simulating the NMF composition of the stratum corneum, or the IR-ATR spectrum of an aqueous solution of this model NMF , NMF IR spectrum.
The IR spectrum of the stratum corneum to be measured thus obtained is synthesized and approximated by the IR spectrum of the stratum corneum from which NMF is removed and the IR spectrum of the NMF.
Where IR spectrum of stratum corneum to be measured = α × (IR spectrum of stratum corneum with NMF removed) + β × (IR spectrum of NMF)
In the wavenumber region including the carboxylate anion inversely symmetric stretching vibration, the combination of α and β that best represents the IR spectrum of the stratum corneum to be measured is obtained. The wave number region suitable for the calculation preferably has 1800 to 1450 cm −1 including signals of amide I, amide II and carboxylate anion inversely symmetric stretching vibration.
As a method for calculating the optimum α and β, commercially available numerical analysis software as described above may be used, but it is also easy to use the solver function of general spreadsheet software (eg Microsoft Excel). Can be calculated. In this case, a difference value is calculated for each wave number data point between the combined spectrum obtained as a function of α and β and the IR spectrum of the stratum corneum to be measured. Then, α and β may be optimized using the solver function so that a value obtained by integrating the square value of the difference value at all data points indicates a minimum value. The parameter β thus obtained can be used as the signal intensity (A ′, A11 ′, A12 ′) of the carboxylate anion inversely symmetrical stretching vibration, and the parameter α can be the signal intensity B derived from the protein.
本発明において、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度（Ａ’、Ａ１１’、Ａ１２’）を抽出した後、信号強度Ａ’と前記の観測された蛋白質由来の信号強度Ｂとの比から、角層中の天然保湿因子ＮＭＦ量を測定する。このとき、角層中におけるＮＭＦの絶対量を精度良く測定するために、ＮＭＦと蛋白質とを含む試料における蛋白質質量当たりのＮＭＦ量と、当該試料の１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域におけるカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度とから作成した検量線を用いて、前記信号強度Ａ’と前記信号強度Ｂとの比から角層単位蛋白質質量当たりの天然保湿因子ＮＭＦ量を求めることが好ましい。 In the present invention, after extracting the signal intensity (A ′, A11 ′, A12 ′) of the carboxylate anion inversely symmetric stretching vibration, from the ratio of the signal intensity A ′ and the observed signal intensity B derived from the protein, The amount of natural moisturizing factor NMF in the stratum corneum is measured. At this time, in order to accurately measure the absolute amount of NMF in the stratum corneum, the amount of NMF per protein mass in a sample containing NMF and protein and the carboxylate anion in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1 of the sample. It is preferable to determine the amount of natural moisturizing factor NMF per stratum corneum protein mass from the ratio of the signal intensity A ′ and the signal intensity B using a calibration curve created from the signal intensity of the inversely symmetric stretching vibration.
検量線の作成法としては、例えば、以下の（１）又は（２）に示す方法が挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
（１）採取した皮膚角層を用いた検量線の作成法
ヒト皮膚のＩＲ−ＡＴＲ測定を行った後に、該皮膚より角層を採取し、該角層中のＮＭＦ量（アミノ酸類、及び乳酸塩、ピロリドンカルボン酸等の有機酸類）および蛋白質量を液体クロマトグラフ等により測定して、両者の比から蛋白質質量あたりのＮＭＦ量を求める。次いで、上記ヒト皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおけるカルボキシレートアニオンの信号強度（１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域）と蛋白質の信号強度との比と、蛋白質質量あたりのＮＭＦ量との関係の検量線を得る。
Examples of the method for creating a calibration curve include the methods shown in the following (1) or (2), but the present invention is not limited to these.
(1) Method of preparing a calibration curve using the collected skin stratum corneum After IR-ATR measurement of human skin, the stratum corneum was collected from the skin, and the amount of NMF (amino acids and lactic acid in the stratum corneum) Salt, organic acids such as pyrrolidone carboxylic acid) and the amount of protein are measured by liquid chromatography or the like, and the amount of NMF per mass of protein is determined from the ratio of the two. Next, a calibration curve for the relationship between the signal intensity of the carboxylate anion (wave number region of 1610 to 1570 cm −1 ) in the IR-ATR spectrum of human skin and the signal intensity of the protein and the amount of NMF per protein mass is shown below. obtain.
（２）モデル蛋白質およびモデルＮＭＦを用いた検量線の作成法
アルブミンのようなモデル蛋白質とモデルＮＭＦ（アミノ酸類、及び乳酸塩、ピロリドンカルボン酸等の有機酸類単品又はこれら２種以上の組合せの混合物）との混合物を調製し、該混合物のモデル蛋白質とモデルＮＭＦとの混合比と、該混合物のＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおけるカルボキシレートアニオンの信号強度（１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域）と蛋白質の信号強度との比の関係の検量線を得る。
(2) Method of preparing a calibration curve using model protein and model NMF Model protein such as albumin and model NMF (amino acids and organic acids such as lactate and pyrrolidone carboxylic acid, or a mixture of two or more of these) ), The mixture ratio of the model protein of the mixture and model NMF, the signal intensity of the carboxylate anion (wave number region of 1610 to 1570 cm −1 ) and the protein signal in the IR-ATR spectrum of the mixture Obtain a calibration curve of the ratio of intensity to ratio.
本発明によれば、角層中のＮＭＦ量を正確に、迅速・簡便に測定することができる。特に、非侵襲的な測定方法において有用である。本発明の方法は、化粧品、皮膚洗浄料等の販売における店頭でのＮＭＦ測定や、化粧品、皮膚洗浄料等の研究開発における多数の評価試料のＮＭＦ測定などに好ましく応用することができる。 According to the present invention, the amount of NMF in the stratum corneum can be measured accurately, quickly and simply. In particular, it is useful in a non-invasive measurement method. The method of the present invention can be preferably applied to NMF measurement at stores in the sale of cosmetics, skin cleansing agents, etc., and NMF measurement of many evaluation samples in research and development of cosmetics, skin cleansing agents, etc.
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to these.
本実施例においては、ＩＲ測定を以下の装置構成にて行った。
（１）ＦＴＩＲ（Ｎｉｃｏｌｅｔ３８０、商品名、サーモサイエンティフィック社製）
（２）光ファイバカップリングユニット（ＦｉｂｅｒＭａｔｅ、商品名、システムズエンジニアリング社製）
（３）ＰＩＲ光ファイバ型ＩＲ−ＡＴＲプローブ（システムズエンジニアリング社製）
（４）装置制御・データ処理用コンピュータ
In this example, IR measurement was performed with the following apparatus configuration.
(1) FTIR (Nicolet 380, trade name, manufactured by Thermo Scientific)
(2) Optical fiber coupling unit (FiberMate, trade name, manufactured by Systems Engineering)
(3) PIR optical fiber type IR-ATR probe (manufactured by Systems Engineering)
(4) Computer for device control and data processing
参考例
皮膚のＩＲスペクトルにおける１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における吸収がＮＭＦに由来するものであることを確認するために、以下の測定を行った。
１）皮膚表面に有機溶媒（アセトンとジエチルエーテルとの１：１混合溶媒、体積比）を３０分接触させる。
２）有機溶媒を除去後、皮膚を乾燥させる。
３）該有機溶媒処理部に、水を３０分間接触させる。
４）水抽出液を乾燥・濃縮し、ＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定する。
Reference Example In order to confirm that the absorption in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1 in the IR spectrum of the skin is derived from NMF, the following measurement was performed.
1) An organic solvent (a 1: 1 mixed solvent of acetone and diethyl ether, volume ratio) is brought into contact with the skin surface for 30 minutes.
2) After removing the organic solvent, dry the skin.
3) Contact the organic solvent treatment unit with water for 30 minutes.
4) Dry and concentrate the water extract and measure the IR-ATR spectrum.
さらに、下記表１に示す組成を持つモデルＮＭＦ水溶液を調製し、ＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定した。 Furthermore, a model NMF aqueous solution having the composition shown in Table 1 below was prepared, and an IR-ATR spectrum was measured.
皮膚からの水抽出物のＩＲ−ＡＴＲスペクトル及びモデルＮＭＦ水溶液のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを図２に示す。水抽出物のスペクトルの特徴として以下のことが言える。
１）脂質に特徴的な鋭いアルキル鎖のＣＨ伸縮振動（２９００ｃｍ-1付近に出現）のピークが存在しない。
２）蛋白質に特徴的なアミドＩ（１６５０ｃｍ-1付近）とアミドＩＩ（１５４０ｃｍ-1付近）の二本の組み合わせのピークが存在しない。
３）アミノ酸や有機酸に特徴的なカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動（１６００ｃｍ-1付近）とカルボキシレートアニオン対称伸縮振動（１４０５ｃｍ-1付近）が出現している。
４）ＣＨ伸縮振動（２９００ｃｍ−１付近に出現）の強度に比較して、ＣＨ変角振動（１４００ｃｍ-1付近に出現）の強度が強いことが、鎖状アルキル骨格由来でないＣＨ基の存在を示唆している。
皮膚角層の主要構成成分が、蛋白質、ＮＭＦ、脂質であることを考慮すると、本水抽出物は主としてＮＭＦで構成されていることが強く支持される。実際に上記特徴は、モデルＮＭＦ水溶液のスペクトルの特徴とも一致しており、皮膚のＩＲスペクトルにおける１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における吸収がＮＭＦに由来するものであることが確認できた。
The IR-ATR spectrum of the water extract from the skin and the IR-ATR spectrum of the model NMF aqueous solution are shown in FIG. The following can be said as the characteristics of the spectrum of the water extract.
1) There is no peak of CH stretching vibration (appearing in the vicinity of 2900 cm −1 ) of a sharp alkyl chain characteristic of lipids.
2) no two combinations of peaks of proteins characteristic amide I (1650 cm -1 vicinity) and amide II (1540 cm around -1) exists.
3) Characteristic carboxylate anion antisymmetric stretching vibration to the amino acid or an organic acid (1600 cm -1 vicinity) and carboxylate anion symmetric stretching vibration (1405cm around -1) it has emerged.
4) Compared with the intensity of CH stretching vibration (appears in the vicinity of 2900 cm −1 ), the strength of CH bending vibration (appears in the vicinity of 1400 cm −1 ) is stronger, indicating the presence of CH groups not derived from a chain alkyl skeleton. Suggests.
Considering that the main components of the skin stratum corneum are protein, NMF, and lipid, it is strongly supported that the present water extract is mainly composed of NMF. Actually, the above characteristics coincide with the characteristics of the spectrum of the model NMF aqueous solution, and it was confirmed that the absorption in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1 in the IR spectrum of the skin is derived from NMF.
実施例１
（１）皮膚の角層の赤外吸収スペクトルの測定
前記の構成の装置を用いて、ヒトの前腕皮膚のＩＲ測定を行った。通常ＩＲ−ＡＴＲ測定の分析深さは１μｍ程度であり、これは一般的なヒト皮膚の角層（約１５μｍ）よりも十分に浅い。そのため本装置構成で得られる皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルは、角層のＩＲ−ＡＴＲスペクトルとみなすことができる。
Example 1
(1) Measurement of infrared absorption spectrum of stratum corneum of skin Using the apparatus having the above-described configuration, IR measurement of human forearm skin was performed. Usually, the analysis depth of IR-ATR measurement is about 1 μm, which is sufficiently shallower than the stratum corneum of general human skin (about 15 μm). Therefore, the IR-ATR spectrum of the skin obtained with this device configuration can be regarded as the IR-ATR spectrum of the stratum corneum.
（２）カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度の抽出
得られたＩＲスペクトルにおいて、１６１０〜１５８０ｃｍ-1の波数領域における信号強度及び１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域における信号強度Ａから、カルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度をカーブフィッティング法によって抽出した。２８個のガウス関数のピーク位置を下記表２に示した位置にそれぞれ固定した後に、ピーク幅を皮膚スペクトル形状に合わせて適宜調整し、その後ピーク高さのみを可変パラメータとして、皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルに対して、最小二乗法によりフィッティングした。図３に、１８００〜８００ｃｍ-1の波数領域における皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを２８個のガウス関数の重ね合わせでフィッティングした結果を示す。
(2) In carboxylate extracted resulting IR spectrum of the signal strength of the anion antisymmetric stretching vibrations, from the signal intensity A at a wave number region of the signal strength and 1610～1570Cm -1 at a wave number region of 1610～1580Cm -1, carboxylate The signal intensity of the anion antisymmetric stretching vibration was extracted by curve fitting method. After fixing the peak positions of the 28 Gaussian functions at the positions shown in Table 2 below, the peak width is appropriately adjusted in accordance with the skin spectrum shape, and then only the peak height is used as a variable parameter, and the IR-ATR of the skin is adjusted. The spectrum was fitted by the least square method. FIG. 3 shows the result of fitting the IR-ATR spectrum of the skin in the wave number region of 1800 to 800 cm −1 by superposing 28 Gauss functions.
（３）蛋白質の信号強度あたりのＮＭＦの信号強度の算出
前記表２中のピーク番号３、４、５の面積和（アミドＩ吸収帯の信号に相当）を蛋白質
の信号強度とした。また、前記表２中のピーク番号６の面積（アミノ酸類のカルボキシレートアニオンの逆対称伸縮振動および有機酸類のカルボキシレートアニオンの逆対称伸縮振動の一部に相当）、または前記表２中のピーク番号６とピーク番号７の面積の合計（アミノ酸類および有機酸類のカルボキシレートアニオンの逆対称伸縮振動に相当）をＮＭＦの信号強度とした。図３における両者の比から、蛋白質の信号強度あたりのＮＭＦの信号強度を算出した。
(3) Calculation of NMF signal intensity per protein signal intensity The sum of the areas of peak numbers 3, 4, and 5 in Table 2 (corresponding to the signal of the amide I absorption band) was defined as the signal intensity of the protein. Further, the area of peak number 6 in Table 2 (corresponding to a part of the reverse symmetrical stretching vibration of the carboxylate anion of amino acids and the reverse symmetrical stretching vibration of the carboxylate anion of organic acids), or the peak in Table 2 The sum of the areas of No. 6 and Peak No. 7 (corresponding to the inverse symmetrical stretching vibration of the carboxylate anion of amino acids and organic acids) was defined as the NMF signal intensity. From the ratio of both in FIG. 3, the signal strength of NMF per signal strength of protein was calculated.
（４）皮膚角層を用いた検量線の作成
（４−１）１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比、及び１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和と、アミドＩの信号強度との信号強度比の算出 別途、検量線を作成するために、以下の測定試料についてＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定した。
＜測定試料＞ヒト（０歳〜４０代の合計５３名）の腹部、大腿部、臀部、腰部の皮膚
＜測定条件＞光ファイバ型ＩＲプローブを皮膚に約１０秒間押し当てて２０００〜５００ｃｍ-1の波数領域のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定した。
各測定試料について、得られたＩＲスペクトルについて前記カーブフィッティング法を適用し、１６０５ｃｍ-1（前記表２中のピーク番号６）の信号強度とアミドＩ吸収帯（前記表２中のピーク番号３、４、５）の信号強度との信号強度比、及び１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和とアミドＩ吸収帯の信号強度との信号強度比とをそれぞれ求めた。
(4) the sum of the signal strength of the signal intensity ratio, and 1605 cm -1 and 1574 -1 of the signal strength of the signal strength and the amide I creating a calibration curve using the stratum corneum (4-1) 1605 cm -1 Calculation of signal intensity ratio with signal intensity of amide I In order to prepare a calibration curve separately, IR-ATR spectra were measured for the following measurement samples.
The abdomen of the <sample> person (total of 53 people aged 0 to 40 generations), thighs, buttocks, the waist of the skin <Measurement conditions> optical fiber type IR probe was pressed about 10 seconds to the skin 2000~500cm - An IR-ATR spectrum in the wave number region of 1 was measured.
For each measurement sample, the curve fitting method was applied to the obtained IR spectrum, and the signal intensity of 1605 cm −1 (peak number 6 in Table 2) and the amide I absorption band (peak number 3, the signal intensity ratio of the signal intensity of the 4, 5), and 1605 cm -1 and the signal strength of 1574 -1 sum and the signal intensity ratio between the signal intensity of the amide I absorption band was determined, respectively.
（４−２）単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量の算出
各測定試料について、上記ＩＲ−ＡＴＲスペクトルの測定後に、同測定部位の角層をＰＰＳ（ポリフェニレンサルファイド）テープを用いて採取した。
角層を剥離したテープの一部を溶媒（メタノールと水との混合溶媒、体積比１：１）に浸漬させ、抽出液を液体クロマトグラフで測定し、アミノ酸、乳酸塩、ピロリドンカルボン酸とこれらの総量（ＮＭＦ量）を求めた。また、角層を剥離したテープの残りの部分を溶媒（硫酸ドデシルナトリウムを含んだ塩酸水溶液）に浸漬させ、水酸化ナトリウム水溶液で中和した後にビシンコニン酸（ＢＣＡ）法により抽出液を呈色させて吸光度を測定し、角層内の蛋白質の質量を求めた。
測定したＮＭＦ量を、測定した蛋白質の質量で除すことにより、単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量を算出した。
(4-2) Calculation of NMF amount per unit protein mass After measurement of the IR-ATR spectrum for each measurement sample, the stratum corneum at the same measurement site was collected using a PPS (polyphenylene sulfide) tape.
Part of the tape from which the stratum corneum has been peeled is immersed in a solvent (mixed solvent of methanol and water, volume ratio 1: 1), and the extract is measured with a liquid chromatograph. Amino acids, lactates, pyrrolidone carboxylic acids and these The total amount (NMF amount) was determined. Further, the remaining part of the tape from which the stratum corneum was peeled was immersed in a solvent (aqueous hydrochloric acid solution containing sodium dodecyl sulfate), neutralized with an aqueous sodium hydroxide solution, and then the extract was colored by the bicinchoninic acid (BCA) method. The absorbance was measured to determine the protein mass in the stratum corneum.
By dividing the measured NMF amount by the measured protein mass, the NMF amount per unit protein mass was calculated.
（４−３）検量線の作成
各測定試料について、上記（４−１）項で求めた１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比と、上記（４−２）項で求めた単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量とをプロットして、検量線を作成した。結果を図４に示す。
図４から明らかなように、１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比と、ＮＭＦ量との間に良好な線形性があることがわかった。したがって、図４の検量線を用いることで、皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルから、角層中の単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量を算出することができる。
(4-3) Preparation of calibration curve For each measurement sample, the signal intensity ratio between the signal intensity of 1605 cm −1 and the signal intensity of amide I determined in the above (4-1) section, and the above (4-2) section A calibration curve was created by plotting the amount of NMF per unit protein mass determined in (1). The results are shown in FIG.
As is apparent from FIG. 4, it was found that there is a good linearity between the signal intensity ratio between the signal intensity of 1605 cm −1 and the signal intensity of amide I and the amount of NMF. Therefore, by using the calibration curve in FIG. 4, the amount of NMF per unit protein mass in the stratum corneum can be calculated from the IR-ATR spectrum of the skin.
また、各測定試料について、上記（４−１）項で求めた１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和とアミドＩの信号強度との信号強度比と、上記（４−２）項で求めた単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量とをプロットして、検量線を作成した。結果を図５に示す。
図５から明らかなように、１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和とアミドＩの信号強度との信号強度比と、ＮＭＦ量との間に良好な線形性があることがわかった。したがって、図５検量線を用いることで、皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルから、角層中の単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量を算出することができる。
Also, for each sample, the (4-1) the signal intensity ratio of the signal intensities of the sum and the amide I signal strength 1605 cm -1 and 1574 -1 obtained as in section and, in the above (4-2) term A calibration curve was prepared by plotting the obtained NMF amount per unit protein mass. The results are shown in FIG.
As apparent from FIG. 5, the signal intensity ratio of the signal intensity of the sum and the amide I signal strength 1605 cm -1 and 1574 -1, it was found that there is good linearity between the NMF content. Therefore, by using the calibration curve shown in FIG. 5, the amount of NMF per unit protein mass in the stratum corneum can be calculated from the IR-ATR spectrum of the skin.
（５）モデル蛋白質およびモデルＮＭＦを用いた検量線の作成
さらに別途、モデル蛋白質およびモデルＮＭＦを用いて検量線を作成した。角層を構成する主要な蛋白質はケラチン、フィラグリン、インボルクリン等であるので、モデル蛋白質としてはこれらの混合物を用いることが最も好ましい。しかしこれらの蛋白質の標品はきわめて高価であり、標品の混合物を検量線作成に用いることは現実的ではない。そこで代替の角層モデル蛋白質として、安価に入手可能な牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。ＢＳＡも角層蛋白質と同様に、アミドＩおよびアミドＩＩの強い吸収帯を示すため、ＢＳＡとモデルＮＭＦ混合物を用いれば、ＢＳＡ換算での検量線を得ることができる。
(5) Preparation of calibration curve using model protein and model NMF Further, a calibration curve was prepared separately using model protein and model NMF. Since the main proteins constituting the stratum corneum are keratin, filaggrin, involucrin, etc., it is most preferable to use a mixture thereof as a model protein. However, these protein preparations are extremely expensive, and it is not practical to use a mixture of preparations for preparing a calibration curve. Therefore, bovine serum albumin (BSA), which is available at low cost, was used as an alternative stratum corneum model protein. Since BSA also exhibits a strong absorption band of amide I and amide II, as with stratum corneum protein, a calibration curve in terms of BSA can be obtained by using a mixture of BSA and model NMF.
前記表１に示す組成を持つモデルＮＭＦを調製し、次いで、ＢＳＡとモデルＮＭＦとの混合水溶液を、混合比（質量％）を様々に変更して調製した。これらの混合水溶液について、ＩＲ−ＡＴＲスペクトルの測定後、水のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを差し引いた後に、前述のカーブフィッティング解析を行い、１６０５ｃｍ-1（前記表２中のピーク番号６）の信号強度とアミドＩ吸収帯（前記表２中のピーク番号３、４、５）の信号強度との信号強度比を算出した。 A model NMF having the composition shown in Table 1 was prepared, and then a mixed aqueous solution of BSA and model NMF was prepared with various mixing ratios (mass%) being changed. For these mixed aqueous solutions, after measuring the IR-ATR spectrum, after subtracting the IR-ATR spectrum of water, the curve fitting analysis described above was performed, and the signal intensity of 1605 cm −1 (peak number 6 in Table 2 above) and The signal intensity ratio with the signal intensity of the amide I absorption band (peak numbers 3, 4, and 5 in Table 2 above) was calculated.
各測定試料について、上記で求めた１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比と、モデルＮＭＦとＢＳＡとの混合質量比（単位蛋白質質量あたりのＮＭＦ量）とをプロットして、検量線を作成した。結果を図６に示す。
図６から明らかなように、１６０５ｃｍ-1の信号強度とモデルＮＭＦ量との間に良好な直線関係があることがわかった。したがって、図６の検量線を用いることで、皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルから、蛋白質質量あたりのＮＭＦ量を算出することができる。
For each measurement sample, the signal intensity ratio between the signal intensity of 1605 cm −1 and the signal intensity of amide I obtained above and the mixture mass ratio of model NMF and BSA (the amount of NMF per unit protein mass) are plotted. A calibration curve was created. The results are shown in FIG.
As apparent from FIG. 6, it was found that there is a good linear relationship between the signal intensity of 1605 cm −1 and the amount of model NMF. Therefore, by using the calibration curve of FIG. 6, the amount of NMF per protein mass can be calculated from the IR-ATR spectrum of the skin.
（６）角層中のＮＭＦ量の測定
上述のようにして、ヒトの前腕皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定した後、カーブフィッティング法を適用して１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比、及び１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和とアミドＩの信号強度との信号強度比を、それぞれ算出した。その後、前述の１６０５ｃｍ-1の信号強度または１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和に基づく検量線（（４）で得られた角層単位蛋白質質量当たりのＮＭＦ量の算出用検量線、並びに（５）で得られたＢＳＡ換算蛋白質質量当たりのＮＭＦ量の算出用検量線）を用いて、角層中のＮＭＦ量を測定した。
また、同様にして、前記前腕皮膚を市販食器用洗剤で洗浄・乾燥した後のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを測定し、角層中のＮＭＦ量を測定した。
１６０５ｃｍ-1の信号強度とアミドＩの信号強度との信号強度比を用いて算出したＮＭＦ量の結果を表３に、１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和とアミドＩの信号強度との信号強度比を用いて算出したＮＭＦ量の結果を表４に示す。また洗浄処理前後の皮膚のＩＲ−ＡＴＲスペクトルを図７に示す。
(6) Measurement of the amount of NMF in the stratum corneum After measuring the IR-ATR spectrum of human forearm skin as described above, the curve fitting method was applied to the signal intensity of 1605 cm −1 and the signal intensity of amide I the signal intensity ratio between, and the signal intensity ratio of the signal intensity of the sum and the amide I signal strength 1605 cm -1 and 1574 -1, was calculated. Thereafter, the above-mentioned 1605 cm -1 of the signal strength or 1605 cm -1 and a calibration curve based on the sum of the signal strength of 1574cm -1 ((4) NMF amount of calculation for the calibration curve of the stratum corneum unit protein mass per obtained in, And the amount of NMF in the stratum corneum was measured using the calibration curve for calculating the amount of NMF per BSA equivalent protein mass obtained in (5).
Similarly, the IR-ATR spectrum after the forearm skin was washed and dried with a commercial dish detergent was measured, and the amount of NMF in the stratum corneum was measured.
NMF content results calculated using the signal intensity ratio between the signal strength of the signal strength and the amide I of 1605 cm -1 in Table 3, and the signal intensity of the sum and the amide I signal strength 1605 cm -1 and 1574 -1 Table 4 shows the result of the NMF amount calculated using the signal intensity ratio. Moreover, the IR-ATR spectrum of the skin before and after the washing treatment is shown in FIG.
表３及び表４の結果から明らかなように、食器用洗剤を皮膚に接触させることで、角層表層のＮＭＦ量が低下することが定量的に測定できた。また表３及び表４の角層内蛋白質質量あたりのＮＭＦ質量はほぼ同様の結果を示しており、１６０５ｃｍ-1の信号強度を用いても、１６０５ｃｍ-1と１５７４ｃｍ-1の信号強度の和を用いても、それぞれの検量線に従って同様のＮＭＦ量を測定することができることがわかった。したがって、本発明の方法によれば、日常のＮＭＦ量の変動を敏感に把握できることがわかった。このような評価は、食器用洗剤や皮膚洗浄料の皮膚へのマイルド性の評価等に、非常に有用である。 As is clear from the results of Tables 3 and 4, it was quantitatively measured that the NMF content of the stratum corneum surface layer was lowered by bringing the dish detergent into contact with the skin. The Tables 3 and NMF mass per square layer protein mass in Table 4 shows substantially the same result, even if a signal strength of 1605 cm -1, the sum of the signal intensities of 1605 cm -1 and 1574 -1 Even when used, it was found that the same NMF amount can be measured according to each calibration curve. Therefore, according to the method of this invention, it turned out that the fluctuation | variation of the daily NMF amount can be grasped sensitively. Such an evaluation is very useful for evaluating the mildness of dishwashing detergents and skin cleansing agents on the skin.
実施例２
実施例１におけるカルボキシレートアニオン逆対称伸縮振動の信号強度の抽出について、カーブフィッティング法を下記の差スペクトル法に代えたこと以外は実施例１と同様にして角層中のＮＭＦ量の測定を行ったところ、実施例１と同様に、皮膚の角層中のＮＭＦ量を相対的に定量測定できることがわかった。
Example 2
For the extraction of the signal intensity of the carboxylate anion inversely symmetric stretching vibration in Example 1, the amount of NMF in the stratum corneum was measured in the same manner as in Example 1 except that the curve fitting method was replaced with the following difference spectrum method. As a result, as in Example 1, it was found that the amount of NMF in the stratum corneum of skin can be relatively quantitatively measured.
（差スペクトル法）
ＮＭＦを含む皮膚ＡのＩＲ−ＡＴＲスペクトルから、ＮＭＦを含まない皮膚ＢのＩＲ−ＡＴＲスペクトルを差し引くことにより、皮膚ＡのＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおけるＮＭＦの信号強度を算出した。
ＮＭＦを含まない皮膚の調製は以下のように行った。
１）皮膚表面に有機溶媒（アセトンとジエチルエーテルの１：１混合溶媒）を３０分接触させる。
２）有機溶媒を除去後、皮膚を乾燥させる。
３）該有機溶媒処理部に、水を３０分間接触させる。
４）水を除去後、皮膚を乾燥させる。
以上の処理により、角層表層部のＮＭＦを完全に取り除くことができる。
処理前の皮膚である皮膚ＡおよびＮＭＦを含まないよう調製した（処理１）〜４）を施した）皮膚である皮膚Ｂのスペクトルを図８に示す。皮膚Ａおよび皮膚Ｂのスペクトル中の、アミドＩのピーク強度が一致するように皮膚Ｂのスペクトル強度に対して定数を乗じ、その後、皮膚Ａのスペクトルより皮膚Ｂの強度補正後のスペクトルを差し引くことにより、１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域にピークを持つＮＭＦの信号を得た。この差スペクトル中の１６１０〜１５７０ｃｍ-1の波数領域にピークを持つＮＭＦの信号強度と、皮膚Ｂの強度補正後のスペクトルの蛋白質の信号強度（例えばアミドＩ）の強度比を算出することで、皮膚ＡのＩＲ−ＡＴＲスペクトルにおける、蛋白質の信号強度あたりのＮＭＦの信号強度を算出した。
(Difference spectrum method)
The signal intensity of NMF in the IR-ATR spectrum of skin A was calculated by subtracting the IR-ATR spectrum of skin B not containing NMF from the IR-ATR spectrum of skin A containing NMF.
Preparation of skin without NMF was performed as follows.
1) An organic solvent (a 1: 1 mixed solvent of acetone and diethyl ether) is brought into contact with the skin surface for 30 minutes.
2) After removing the organic solvent, dry the skin.
3) Contact the organic solvent treatment unit with water for 30 minutes.
4) Dry the skin after removing the water.
By the above processing, NMF in the surface layer portion of the horny layer can be completely removed.
FIG. 8 shows the spectrum of skin A which is skin before treatment and skin B which has been prepared so as not to contain NMF (treatments 1) to 4). In the spectrum of skin A and skin B, the spectrum intensity of skin B is multiplied by a constant so that the peak intensities of amide I match, and then the spectrum after correction of the intensity of skin B is subtracted from the spectrum of skin A. Thus, an NMF signal having a peak in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1 was obtained. By calculating the intensity ratio between the signal intensity of NMF having a peak in the wave number region of 1610 to 1570 cm −1 in this difference spectrum and the signal intensity of the protein in the spectrum after intensity correction of skin B (for example, amide I), In the IR-ATR spectrum of skin A, NMF signal intensity per protein signal intensity was calculated.
Claims (9)
The signal strength B is an infrared absorption spectrum in the amide II absorption band is the wave number region of the amide I absorption band and / or 1560～1520Cm -1 wave number region of 1700～1620Cm -1, claim 1-8 the method according to any one of.
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