JP5242672B2 - 心臓における線維症の非侵襲性の定量的検出のためのシステム - Google Patents

Description

（関連出願の引用）
本願は、米国仮特許出願第６０／９１１，１１０号（２００７年４月１１日出願）に基づく優先権を主張する。該仮出願の開示全体が、その全てにおいて本明細書に参照により援用される。

実施形態は、医療診断およびモニタリングの分野に関し、より具体的には、心臓におけるびまん性および局所性線維症の非侵襲性の定量的検出のための方法および装置に関する。

心筋線維症は、複数の心疾患状態に対し一般的な形態変化である。置換性（瘢痕）線維症に加え、罹患心臓の構造的リモデリング、ならびに突然心臓死につながる致命的不整脈の発生において重要な役割を果たす、間質性（反応性）線維症に関する認識が高まりつつある。

現在、線維症は、外科生検により取得される組織資料の組織化学的分析よって定量化される。コラーゲン容量分率（ＣＶＦ）と相関し得る、置換性および間質性線維症を定量化するための非侵襲性試験の可用性は、大幅な進歩となるであろう。

実施形態は、付随の図面と併せて、以下の発明を実施するための形態によって、容易に理解されるであろう。実施形態は、一例として例証されるものであって、付随の図面の図における制限として示されるものではない。

以下の発明を実施するための形態では、本明細書の一部を形成する付随の図面を参照して、例証として、種々の実施形態が示される。他の実施形態が利用され得、また、意図される範囲から逸脱することなく、構造的または論理的変更が成され得ることを理解されたい。したがって、以下の発明を実施するための形態は、制限として捉えられるべきではなく、実施形態の範囲は、添付の請求項およびその同等物によって定義される。

種々の操作は、実施形態の理解を助けるように、複数の個別操作として、順に説明され得る。しかしながら、説明の順序は、これらの操作が順序依存性であることを含意するものと解釈されるべきではない。

説明は、上／下、後／前、左／右、および上面／裏面等、視点を基準とした説明を使用する場合がある。そのような説明は、議論を促進するために単に使用され、実施形態の用途を制限することを意図するものではない。

説明の目的のため、「Ａ／Ｂ」あるいは「Ａおよび／またはＢ」の形態の語句は、「（Ａ）、（Ｂ）、もしくは（ＡおよびＢ）」を意味する。説明の目的のため、「Ａ、Ｂ、およびＣのうちの少なくとも１つ」の形態の語句は、「（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（ＡおよびＢ）、（ＡおよびＣ）、（ＢおよびＣ）、あるいは（Ａ、Ｂ、およびＣ）」を意味する。説明の目的のため、「（Ａ）Ｂ」の形態の語句は、「（Ｂ）または（ＡＢ）」を意味する、すなわち、Ａは、任意の要素である。

説明は、語句「ある実施形態では」または「実施形態では」を使用し得るが、それぞれ、同一または異なる実施形態のうちの１つ以上を指す場合がある。さらに、種々の実施形態に関して使用される用語「備える」、「含む」、「有する」等は、同義的である。

種々の実施形態では、心筋組織における線維症の有無および程度を判定するための方法、装置、およびシステムが提供される。例示的実施形態では、計算システムは、開示される装置および／またはシステムのうちの１つ以上の構成要素を備え得、本明細書に開示される１つ以上の方法を実行するために採用され得る。

実施形態は、心臓における線維症の程度および／または種類を検出するための非侵襲性の定量的方法を提供する。実施形態では、線維症の程度および／または種類に関する情報は、特定の心疾患ならびに心不全の診断の補助となり得、および／または好適な治療選択肢を判定する役に立ち得る。実施形態は、その結果、心疾患および心不全に相関し得る、生存および非生存心筋における線維症の程度を判定するための方法および装置を提供する。したがって、ある実施形態では、心疾患または心不全防止の目的のために、個人をスクリーニングする方法が、本明細書に記載の検出方法論を使用して提供され得る。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
心臓組織における線維症を検出する方法であって、
生存または非生存心臓組織の試料を選択するステップと、
該試料を細胞外造影剤と接触させるステップと、
撮像装置によって、該試料の造影剤取り込み量の１つ以上の測定値を求め、びまん性間質性および／または置換性線維症の指標として、該試料内の細胞外容量の拡張程度を判定するステップと
を包含する、方法。
（項目２）
上記試料を細胞外造影剤と接触させるステップは、上記試料をガドリニウム含有造影剤と接触させるステップを包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記試料を細胞外造影剤と接触させるステップは、上記試料をガドジアミドと接触させるステップを包含する、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記試料を細胞外造影剤と接触させるステップは、上記試料を細胞外コラーゲン結合造影剤と接触させるステップを包含する、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記試料を細胞外造影剤と接触させるステップは、上記試料をインビボで細胞外造影剤と接触させるステップを包含する、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記試料を細胞外造影剤と接触させるステップは、上記試料をインビトロで細胞外造影剤と接触させるステップを包含する、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記試料の１つ以上の画像を取得するステップは、磁気共鳴映像法を使用して、１つ以上の画像を取得するステップを包含する、項目１に記載の方法。
（項目８）
磁気共鳴映像法を使用して、１つ以上の画像を取得するステップは、１つ以上の造影剤との接触前後に、血液および上記試料において、複数のＴ１緩和時間測定を実行し、上記細胞外造影剤の組織試料分配係数を判定するステップを包含する、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記緩和時間（Ｔ１）は、Ｒ１＝１／Ｔ１によって、緩和率に変換され、上記試料に対し判定される各Ｒ１率は、上記血液において判定されたＲ１率に対し、直線的に回帰する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
血液ヘマトクリット値を求めるステップをさらに包含し、上記試料分配係数および該血液ヘマトクリット値は、上記組織試料における上記細胞外容量を計算するために使用される、項目８に記載の方法。
（項目１１）
磁気共鳴映像法を使用して、１つ以上の画像を取得するステップは、造影剤との接触前、間、および後において、高速撮像を実行し、試料と、心室腔または１つ以上の大血管内に存在する血液とにおける造影強化を測定するステップを包含する、項目７に記載の方法。
（項目１２）
造影強化の動態は、２空間モデルによって分析され、上記試料における上記細胞外容量を判定する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
線維症のマーカーとして、上記細胞外容量のパラメータマップを生成するステップをさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記試料における大域的びまん性線維症負荷を判定するステップをさらに備える、項目１に記載の方法。
（項目１５）
患者におけるびまん性線維症の程度を分類するステップをさらに包含し、上記試料は、心不全または心疾患のリスクを判定するように選択される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記試料における間質性と置換性線維症の程度を判定および区別するステップをさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記試料の１つ以上の画像を取得するステップは、Ｘ線コンピュータ断層撮影法を使用して、１つ以上の画像を取得するステップを包含する、項目１に記載の方法。
（項目１８）
組織試料または心臓全体における間質性と置換性線維症の有無、位置、および／または程度を判定し、該判定を心臓の病気、疾患、または特定の心疾患または心不全の関連リスクと相関させるステップをさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１９）
上記判定を心臓の病気、疾患、または特定の心疾患または心不全の関連リスクと相関させるステップは、数的またはテキスト形式のリスク要因として表される、項目１８に記載の方法。

図１は、反転回復信号強度曲線を示す。造影剤分配係数の判定のために、心臓における着目ユーザ定義領域に対し、Ｔ１を定量化した。ソフトウェアプログラムを使用し、一連の１２から１７の反転時間に対し、ＤＩＣＯＭ形式ＭＲＩ画像をロードし、図１における２つの領域に対し示されるように、適正反転回復信号強度曲線を生成し、Ｔ１を判定した。本分析は、１回目は、造影強化前、次いで、２４時間のガドリニウム造影剤溶液中における試料の培養後のＴ１の測定と、２回行なった。グラフは、造影剤溶液中に試料を留置後の局部Ｔ１における差異を示し、より短いＴ１（後側領域）を有する区域は、マークされた線維症を伴う領域に対応する。 図２Ａは、心臓スライス画像を示す。図２Ａは、造影剤（ガドジアミド）溶液中での２４時間培養後の心臓スライス（心肥大および広汎性アテローム性動脈硬化症患者）の死後Ｔ１強化ＭＲＩ画像を示す。反転時間３００ｍｓによって、より高いガドジアミド分布量を伴う組織がより明るく見えるような造影がもたらされた。図２Ｂは、染色され、後側区域における広汎性線維症を示す、同一心筋スライスの組織画像であって、ＭＲＩ画像上の増加した信号強度を伴うものと一致する。 図２Ｂは、心臓スライス画像を示す。図２Ａは、造影剤（ガドジアミド）溶液中での２４時間培養後の心臓スライス（心肥大および広汎性アテローム性動脈硬化症患者）の死後Ｔ１強化ＭＲＩ画像を示す。反転時間３００ｍｓによって、より高いガドジアミド分布量を伴う組織がより明るく見えるような造影がもたらされた。図２Ｂは、染色され、後側区域における広汎性線維症を示す、同一心筋スライスの組織画像であって、ＭＲＩ画像上の増加した信号強度を伴うものと一致する。 図３Ａは、染色され、偏光下で観察された組織試料であって、正常あるいはそれぞれ間質性または置換性線維症を示すとして分類される。測定されたガドジアミド分布量、およびこれら３つの分類に対するＣＶＦが示される（ボックスは、２５％および７５％パーセンタイル限界を示す）。点は、測定値およびガドジアミド分布量を表す。白丸は、６０時間未融解のままであった試料を表す。黒丸は、３２時間未融解のままであった試料を表す。 図３Ｂは、染色され、偏光下で観察された組織試料であって、正常あるいはそれぞれ間質性または置換性線維症を示すとして分類される。測定されたガドジアミド分布量、およびこれら３つの分類に対するＣＶＦが示される（ボックスは、２５％および７５％パーセンタイル限界を示す）。点は、測定値およびガドジアミド分布量を表す。白丸は、６０時間未融解のままであった試料を表す。黒丸は、３２時間未融解のままであった試料を表す。 図４は、心筋組織内のガドジアミド分布量（心臓試料の融解後３２時間時点で測定）がＣＶＦ（ｒ＝０．７２７；ｐ＝０．０１７）と密接に相関していることを示すグラフを提供する。右側のグラフは、ガドジアミド分布量とＣＶＦ（ｒ＝０．９８７；ｐ＝０．０１２）との間の相関を表す。２つのグラフは、試料の融解と造影後ＭＲＩ測定との間の時間のずれに基づいて、異なる勾配を示す。遅延時間が長い程、細胞膜破壊が増加し、したがって、ガドジアミド分布量は、試料培養時間が長い一連の測定に対しより大きくなる。グラフ内の点線は、９５％信頼限界を示す。 図５は、実施形態に従って、細胞外容量分率を測定する方法を概説する工程図である。 図６Ａは、実施形態に従って、造影剤との接触前、間、および後に高速撮像を実行し、試料と、心室腔または１つ以上の大血管内に存在する血液とにおける造影強化を測定する方法の出力グラフを提供する。 図６Ｂは、実施形態に従って、造影剤との接触前、間、および後に高速撮像を実行し、試料と、心室腔または１つ以上の大血管内に存在する血液とにおける造影強化を測定する方法の出力グラフを提供する。

ある実施形態では、方法は、組織学的評価の代替として、造影強化磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）（または、コンピュータ断層撮影法等の別の撮像方法）を使用して、心臓線維症の検出および定量化を可能にする。ある実施形態では、方法は、細胞外造影剤に対する心筋分配係数の測定を提供し、造影剤の相対的分布量を示し、現在の方法によって不適切に検出され得る病態である、びまん性、反応性、間質性、または置換性線維症を定量化するために使用され得る。あらゆる形態の線維症は、細胞外基質の拡張につながり、次第に、ＭＲＩの場合、ガドジアミド等の細胞外造影剤に到達可能な容量を増加させる。実施形態は、インビトロおよびインビボ評価に適用され得る。

ガドジアミドＤＴＰＡ等の細胞外造影剤による遅延性造影強化（ＤＣＥ）のＭＲＩは、高空間分解能による非生存心筋を描写する望ましい方法となっている。ＤＣＥ ＭＲＩは、同一心臓内の他の遠隔区域に対する造影強化の検出に依存する。びまん性線維症の組織学からの証拠を伴う非虚血性拡張型心筋症等の心疾患では、心臓ＭＲＩに基づくものを含む、現在の非侵襲性試験は、このようなびまん性全身性線維症を検出できない場合がある。遅延性造影強化の局所性区域は存在しないか、または線維症の程度および負荷の部分的測定のみを提供し得る。本明細書に開示される実施形態は、新規アプローチを提供し、それによって、造影剤の相対的分布量および／または造影剤に対する心筋分配係数が判定され、生存または非生存心筋における線維症のマーカーとして、細胞外容量分率の定量的測定値を求める。生存心筋では、心筋分配係数は、細胞外容量分率に比例する。ある実施形態では、細胞外容量分率は、造影剤の投与前後に、それぞれ組織および血液におけるＲ１緩和率定数の変化を判定することによって、ＭＲＩにより定量化され得る。代替として、ある実施形態では、動的撮像方法を採用し、造影前と造影後状態との間の強くＴ１強調パルスシーケンスによって観測される信号変化を測定し得る。

ある実施形態では、Ｇｄ−ＤＴＰＡ等のある造影剤に対する心筋分配係数の測定は、正常心筋から、生存心筋におけるびまん性、間質性、および置換性線維症、非生存線維性瘢痕組織までの範囲に及ぶ、連続的尺度に基づいて、心筋線維症の程度を分化するために好適である。

組織分配係数の定量化では、造影剤に対する心筋分配係数は、平衡状態での組織および血液における造影剤濃度の比率として定義される。平衡状態では、間質空間内の細胞外造影剤の濃度は、血漿濃度に等しいはずである。間質（ｖ_ｉｓｆ）および血漿空間（ｖ_ｐ）の比容量（組織重量によって正規化され、ｍｌ／ｇの組織として表される容量）の点から見ると、細胞外造影剤に対する分配係数は、以下のように表され得る。

式中、Ｈｃｔは、血液ヘマトクリット値である。ＭＲＩ造影剤は、典型的には、^１Ｈ ＭＲ信号に及ぼすその効果を通して検出される。血液成分、血漿、および赤血球からの信号は、血漿と赤血球との間の水の高速交換（赤血球内の水の細胞内寿命は、生理学的状態下では１０ｍｓ以下である）による単一緩和率によって特徴付けられる。

ＭＲＩによって、細胞外造影剤に対する心筋分配係数を測定するための種々の戦略が考案されているが、健常志願者または虚血性心疾患および心筋壊死患者に、ほぼ排他的に焦点が当てられていた。心筋分配係数は、血液プール中のＲ１の変化によって除される、組織中のＲ１（Ｒ１＝１／Ｔ１）の変化から計算され得る。代替として、高度Ｔ１強調を生成するパルスシーケンスを伴う信号変化を測定し得る。

ある実施形態では、ある造影剤の分布量は、軽度間質性線維症を伴う心筋においてさえ上昇し得る。加えて、ある実施形態では、分布量は、心筋線維症の確立された組織学的定量化であるＣＶＦに線形的に関連し得る。

ある実施形態では、好適な造影剤は、細胞外造影剤またはコラーゲン結合剤であり得る。ある実施形態では、好適な造影剤は、ガドリニウム、またはガドジアミド等のガドリニウムをベースとする化合物であり得る。

ある実施形態では、インビトロＭＲＩ技術が、心筋線維症の定量化の現在の標準である、組織学的に判定される心筋ＣＶＦによって、置換性および間質性心筋線維症の両方の測定値として、造影剤分布量の比較のために提供される。ある実施形態では、線維症のＭＲＩ測定は、新しい方法論の好適性を指示するＣＶＦと有意に相関し得る。エキソビボ心筋組織試料を使用することによって、ガドジアミドＭＲＩが、正常心筋と間質性（反応性）線維症と、および正常心筋と置換性（瘢痕）線維症とを分化することが観測され得る。また、ある実施形態によると、造影剤分布量およびＣＶＦは、線維症の分類、すなわち、正常、間質性、および置換性線維症間で有意に変動し、同様に、線維症の種類を区別可能とする。実施形態は、ＭＲＩを使用して、心筋組織内のＣＶＦと相関する、線維症の定量的測定値を導出する。

急性心筋梗塞後、ガドジアミド造影剤による遅延性造影剤高強化のＭＲＩは、細胞膜の破壊を反映し、該破壊は、生存心筋に対するガドジアミド造影剤の分布量を増加させる。心筋梗塞の区域では、密コラーゲン基質は、生存心筋を伴う区域と比べ、局所性高強化をもたらす。梗塞ゾーン内に密コラーゲン基質を伴う慢性心筋梗塞のイヌモデルでは、造影剤高強化が、急性梗塞において認められた高強化に類似することが示されている。また、心筋線維症増加の他の原因も、正常組織と比較して増加したガドジアミド造影剤取り込み量につながることが示されている。

現在、総ＣＶＦは、線維症負荷の最も広範に使用されている測定値である。本質的に、総ＣＶＦを判定するための２つの方法が存在する（コラーゲンを結合し、他の組織成分から分離するヒドロキシプロリンを使用する絶対測定値と、組織染色および測光を使用するＣＶＦの測定）。本明細書の実施形態は、従来のＣＶＦおよび組織学的分析を超えて拡大する、ＣＶＦを測定する半定量的方法として、造影強化ＭＲＩを提供する。本明細書に記載のＣＶＦとＭＲＩとの間の相関は、２つの方法間で観測されたデータの比較を可能にする。加えて、ＭＲＩの非侵襲的性質のため、種々の開示される実施形態は、心内膜生検の必要性を低減し得る。

ＭＲＩからの造影剤分布量推定値と、測光アッセイからのＣＶＦとは十分に相関するが、その根底にある方法は、注目に値するある程度の有意差を有する。ＣＶＦの測光ベースの判定は、画素数のために、顕微鏡下、小（約４０ｍｍ^２）区域の選択を必要とし、結果として生じるＣＶＦ推定値は、ある壁区分を代表するものではない場合がある。ＭＲＩでは、ずっと低い倍率で、着目領域がユーザ定義され、任意のサイズ領域の信号平均は、各画像に対し容易に計算される。ＣＶＦ測定とＭＲＩ方法との間のこのような差異は、撮像ベースの測定と比較した生検ベースの測定に類似する。前者は、心臓内の組織の時として恣意的かつ制限された選択を表す一方、後者は、観測者によって、自由に指定され得、良好な画質および空間分解能をとる。

上述の方法論の実施例として、ヒト心筋の８つの試料を死後に取得し、ガドジアミド分配係数の判定のために、ガドジアミド生理食塩水中への浸漬前後、非スライス選択反転パルスを伴う高速スピンエコーシーケンス（３テスラ）を行なった。Ｔ１値は、反転回復信号曲線から計算した。同一試料をホルマリン中に固定し、半自動偏光デジタル顕微鏡システムを使用して、ピクロシリウス赤染色法によって、コラーゲン容量分率を判定した。結果は、ガドジアミド分布量ならびにＣＶＦ値の両方が、正常心筋対間質性線維症（ｐ＝．００１）、および正常対置換性線維症（ｐ＝．０１５）において有意に異なっていたことを示唆した。さらに、心筋線維症の全３つの組織学的分類にわたって、２つの方法間に有意な正相関が認められた（ｒ＝０．７３；ｐ＝０．０１７）。したがって、これらの所見は、間質および置換性心筋線維症の両方の定量化のための組織学的評価に対する新規の非侵襲的代替として、造影強化ＭＲＩの潜在性の拡張を示す。

上記に概略されたように、例示的実施形態に従って、心筋の８つの試料が、死亡患者から取得された。心室筋の各試料は、厚さ１〜２ｃｍであって、左右心室自由壁を含むように、心室中隔の中位を切断した。全試料は、分析時まで−８０°Ｃで保存した。

造影前ＭＲＩは、各試料融解後約１０〜１２時間で実行した。試料は、各ＭＲＩ測定前に、室温に戻した。非スライス選択反転パルスを伴うスピンエコーＭＲＩパルスシーケンスによって、１２〜１５の反転遅延（Ｔ１＝５０〜２０００ｍｓの範囲の反転時間）に対し、心筋組織および生理食塩水の縦緩和時間Ｔ１を測定した。他のシーケンスパラメータは、繰り返し時間（ＴＲ）＝２５００ｍｓ、エコー時間（ＴＥ）＝９．５ｍｓ、スライス厚２．５ｍｍ、受信機帯域幅＝１９０Ｈｚ／画素、および画像行列＝２５６×２５６とした。各試料に対し、生理食塩水中に浸漬した組織試料を伴うビーカーを手首撮像用に設計された小型無線周波数コイル内に留置し、全画像を３テスラで取得した（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｔｒｉｏ，Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ）。

最初のＭＲＩスキャン後、２４時間、３〜４°Ｃで、ガドジアミド生理食塩水中で試料を培養した（組織スライスの浸漬前の生理食塩水中の初期ガドジアミド濃度は、３ｍＭ以下；２４時間培養後の３テスラにおける生理食塩水Ｒ１は、３．９±０．３ｓ^−１）。ガドジアミド造影剤（Ｏｍｎｉｓｃａｎ；ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）は、３７°Ｃでオスモル濃度７８９（ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ水）を有する。次いで、最初の測定と同一シーケンスパラメータによって、第２の造影後ＭＲＩを行なった。また、融解期間の作用も評価した。第２のＭＲＩ実行前の６０時間、２つの組織試料を融解したままとした。他の全組織試料は、ガドジアミド培養の間、３〜４°Ｃの温度範囲に、第２のＭＲＩ前の３２時間、室温に維持した。組織が凍結されていない時間の間、細胞膜の完全性は劣化するため、融解時間は、潜在的に重要である。故に、異なる融解期間を伴うこれらの２セットの試料を別々に分析した。

画像分析のため、カスタムソフトウェアプログラムを書き、ＤＩＣＯＭ形式で異なる反転時間値に対する画像をロードし、非線形最小二乗法アルゴリズム（Ｍａｔｌａｂ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．５，Ｔｈｅ Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を使用して、ガドジアミド造影剤の有無の両方において、心筋組織および生理食塩水の反転回復信号曲線からＴ１を判定した。緩和率Ｒ１（Ｒ１＝１／Ｔ１）の変化は、組織中のガドジアミドの局所濃度に比例する。ガドジアミド造影剤分配係数を以下のように求めた。

生理食塩水中の組織のエキソビボ測定のため、ガドジアミド溶液中において組織スライスの２４時間培養後、ガドジアミド造影剤濃度が平衡状態に達したと仮定して、測定された分配係数を相対的分布量と同等であると見なした。図１は、試料のＭＲＩ画像の実施例である。

ＭＲＩ分析後、試料をホルマリン中に保存した。次いで、ホルマリン固定組織を処理し、パラフィン中に埋め込み、隔膜、左心室自由壁、および右心室自由壁を含む、試料の全表面積に対し、区画を調製した。厚さ５ミクロンの区画をピクロシリウス赤染色法で染色し、４０倍の倍率で、偏光下において観察した。

２人の調査者が、別々に、低（１０倍）倍率下、全８つ試料を分析した。試料は、全体的に正常であるもの、または異常分布およびコラーゲンの含有量を伴う含有区域のいずれかに分類した。異常試料は、間質性（反応性）線維症を有するもの、または置換性線維症を有するものにさらに下位分割した。また、線維症の区域を伴う試料では、線維症または異常コラーゲン分布を伴わない遠隔領域も識別した。１５の着目領域が、８つの試料内に識別され、１つの完全に正常な試料は、１つの領域のみ含んでいた。識別された区域を４０倍の倍率下で観察し、ＣＶＦを判定した。図２は、染色された試料と、対応するＭＲＩ画像とを示し、一致する区域は、矢印によって識別される。

着目区域は、上述のように、パラフィン埋入スライス上で組織学的に識別した。一致位置は、左心室内への右心室の付着点、または乳頭筋等の解剖学的ランドマークを使用して、ＭＲＩ画像上で識別した。新鮮組織とパラフィン埋入組織との間の組織サイズおよび形状の差異を考慮すると、ある実施形態では、位置は、周方向に約±１ｃｍ、および半径方向に約±０．５ｃｍの正確性を伴って一致すると推定される。

ＣＶＦは、心筋コラーゲン含有量の分析のために広範に使用される、組織学的区分における心筋線維症のコンピュータ支援定量化である。ある実施形態では、トリクロム染色の代わりに、ピクロシリウス赤染色法を使用して、本研究において、修正版の測光アッセイを採用した。ピクロシリウス赤染色法は、コラーゲンを排他的に分極し、コラーゲンのより客観的識別を可能にする。本利点は、計算された観測者内および観測者間の一致に反映される（それぞれｒ＝．９９および．９９）。

保存された心筋スライスが染色されると、着目区分が識別された。各着目区域を四半部に下位分割した。各四半部内において、４０倍の倍率下、１６枚のデジタル写真を撮影した。各写真は、２．５ｍｍ^２に相当した。したがって、各区分から４０ｍｍ^２を分析した。これは、ＣＶＦの典型的なサンプリングを可能とする。

光を偏光することによって容易に識別されたコラーゲンを、マウスパッドにより手動で追跡した。本ステップは、染色された筋肉に繰り返し、その区域を同様に判定した。次いで、以下の式によって、各区分のＣＶＦを求めた。
ＣＶＦ＝１６領域中の結合組織画素数／１６領域中の総画素数 （３）
組織試料分類間のＣＶＦと心筋分配係数との比較のため、分散分析を使用した。複数の比較のためのＴｕｋｅｙ'ｓ Ｈｏｎｅｓｔ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅを使用して、個々のデータ点間の差異の有意性を評価した。線形回帰分析を使用して、心筋分配係数とＣＶＦとの間の関連性を判定した。全統計分析は、Ｒ（Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ．ＩＳＢＮ ３−９０００５１−０７−０，ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）によって行なった。^{カットオフ値として}ｐ値０．０５を使用して、統計的有意性を判定した。

ＣＶＦの平均値は、組織学的分類、すなわち、正常心筋と、間質性線維症と、置換性線維症（ｐ＝０．０１５）とに基づいて、有意に異なっていた。複数の比較のための調整を伴う分散分析は、正常試料と置換性線維症の試料との間のＣＶＦにおいて有意差を示した（ｐ＝０．０１２）が、正常対間質性（ｐ＝０．４５）、また、間質性対置換性（ｐ＝０．１９、図３Ｂ）に対しては示さなかった。具体的には、置換性線維症、間質性線維症、および正常心筋の対応する９５％信頼区間を伴う平均値は、それぞれ４．１％＋／−．２３、２．３％＋／−．２３、および１．３％＋／−．２６であった。

同様に、ガドジアミド分布量の平均値は、組織学的分類、すなわち、正常心筋と、間質性線維症と、置換性線維症とに基づいて、有意に異なっていた（ｐ＝０．００１、図３Ａ）。具体的には、置換性線維症、間質性線維症、および正常心筋の対応する９５％信頼区間を伴う分布量の平均値は、それぞれ０．４６＋／−．０５、０．４３＋／−．２２、および０．１７＋／−．０５であった。複数の比較のための調整を伴う分散分析は、正常試料と置換性線維症の試料との間（ｐ＝０．００３）、正常と間質性線維症（ｐ＝０．００７）との間のガドジアミド分布量に有意差を示したが、間質性線維症対置換性線維症（ｐ＝０．９０）に対しては有意差を示さなかった。

ＣＶＦおよびガドジアミド分布量の測定値は、密接に相関していることが認められた（図４）。図４の２つのグラフは、２つのバッチの試料のそれぞれの結果を表す。各バッチは、異なる融解時間を有していた。３２時間で融解した試料に対する図４の左側のパネルは、ガドジアミド分布量とＣＶＦとの間の相関を示す（Ｐｅａｒｓｏｎ相関ｒ＝０．７３；ｐ＝０．０１７）。同様に、６０時間で融解した試料に対する右側のグラフは、相関ｒ＝０．９９を示す（ｐ＝０．０１２）。興味深いことに、２つの勾配は、試料の融解と造影後ＭＲＩ測定との間の時間のずれに基づいて異なる。

図４は、ＣＶＦとガドジアミドＭＲＩとの間の強い正相関を示す。所見は、いずれの融解時間とも一致するが、細胞膜破壊の増加のために、時間が長い程、ガドジアミド分布量は増進する可能性があり、したがって、回帰線の勾配が増大する。６０時間後の組織試料中のガドジアミドのより均一な分布は、３２時間ガドジアミド生理食塩水中で培養した試料と比較して、ＣＶＦとの見掛けガドジアミド分布量のさらなる相関を部分的に説明し得る。

図５は、実施形態に従って、細胞外容量分率を測定する種々の方法を概説する工程図である。実施形態では、ＭＲ造影剤を有する組織試料中の細胞外容量分率の測定値を求め得る。ある実施形態では、複数の造影剤注入前後のＴ１測定値を求め得る。そのような操作は、約１５〜２０分の例示的期間にかけて行なわれ得る。さらに、分配係数は、組織および血液中のＲ１＝１／Ｔ１の変化から計算し得る。次いで、ある実施形態では、患者のヘマトクリット値（Ｈｃｔ）を使用して、分配係数Ｖ_ｅｃ＝λ（１−Ｈｃｔ）から細胞外容量分率（Ｖ_ｅｃ）を計算し得る。したがって、ある実施形態では、細胞外造影剤の組織試料分配係数を判定するために、１つ以上の造影剤との接触前後に、血液および試料中において、複数のＴ１緩和時間測定を行ない得る。緩和時間（Ｔ１）は、Ｒ１＝１／Ｔ１によって、緩和率に変換し得、試料に対し判定される各Ｒ１率は、血液中で判定されるＲ１率に対し、直線的に回帰し得る。ある実施形態では、血液ヘマトクリット値が求められ得、試料分配係数および血液ヘマトクリット値を使用して、組織試料中の細胞外容量を計算し得る。

代替実施形態では、血液および組織中の信号強化の経時変化は、初回通過の際に判定され得る。そのような操作は、約４〜５分の例示的期間にかけて行なわれ得る。組織造影強化のモデルベースの分析を行ない、次いで、細胞外容量を最良適合モデルパラメータから計算し得る。したがって、ある実施形態では、造影剤接触前、間、および後の高速撮像を行ない、試料と、心室腔または１つ以上の大血管内に存在する血液とにおける造影強化を測定し得る。ある実施形態では、造影強化の動態は、２空間モデルによって分析され、試料中の細胞外容量を判定し得る。

図６Ａおよび６Ｂは、ある実施形態に従って、造影剤接触前、間、および後の高速撮像を行い、試料と、心室腔または１つ以上の大血管内に存在する血液とにおける造影強化を測定する方法の出力グラフを提供する。そのような方法では、心臓の画像は、注入された細胞外造影剤の初期通過の際に高速で取得され得、図６Ａに示されるように、左心室腔の血液プール（「動脈流入量」）および心筋組織内の信号強度変化をもたらす。動脈流入量の初期ピークは、造影剤の初期通過の際に認められ得、再循環および準平衡状態への近似が続く。このような準平衡状態の後期の間、心筋組織の信号強度と動脈流入量の比率を求め、分配係数を判定し得る。本計算を図６Ａのデータに適用すると、図６Ｂの第１の（より大きく変化する）曲線の結果となる。分配係数の計算では、また、移動平均（図６Ｂの第２の（平滑）曲線）を求め、血液プール中の濃度が準平衡状態にある時の分配係数を推定し得る。好適な準平衡状態を表す窓は、図６Ｂの小さいボックスによって輪郭が描かれている。ある実施形態では、また、トレーサー動態モデルを使用して、動脈流入量の任意の変動に対し、分配係数の推定値を補正し得る。

心筋線維症の定性的および定量的測定値が診断および／またはリスク査定に有益となるであろういくつかの重要な心疾患／病態が存在し、（１）家族性疾患から心筋梗塞の範囲に及ぶ種々の病態から生じる広義の心不全、（２）同様に、一連の心臓の病気から生じ得る、将来的突然心停止に苦しむであろう患者、および（３）最終的に心筋線維症の成分を有するいくつかの独特な疾患を備える、先天性心疾患が含まれる。虚血性および非虚血性心疾患の両方において、線維症は、重要な役割を果たす場合が多い。健康的な老化の場合でも、びまん性線維症は、拡張機能障害の重要な誘因であり得る心室の硬化の根底原因である可能性がある。

従来の方法は、生検を利用して、線維症の指標を得ているが、生検は、単に局所化された試料であって、全体的（大域的）線維症負荷の信頼性のある指標を提供しない。したがって、本明細書の実施形態は、撮像ベースの試験を提供し、びまん性線維症を分析し、大域的線維症負荷を判定する。そのような分析は、好適な治療を計画する際に役に立つ、重要な情報を提供する。

ある実施形態によると、本明細書に提示される方法論と、間質性ならびに置換性線維症の両方の心筋線維症の量との間の正相関が示されている。別の実施形態では、本方法は、突然心臓死ならびに上述の病態の疾患重症度のリスクの階層化の役に立ち得る。

したがって、実施形態を使用して、組織試料もしくは心臓全体における線維症の有無、位置、または程度の判定と、心臓の病気、疾患、あるいは特定の心疾患または心不全の関連リスクとを相関させ得る。ある実施形態では、心筋線維症の判定量および／または位置は、心疾患または心不全のリスクに相関し得る。ある実施形態では、数的またはテキスト形式のリスク要因等のリスク要因は、心筋線維症の程度および／または位置を反映するように割り当てられ得る（すなわち、尺度数値、パーセンテージ、高、中、低等のテキスト形式の指標）。例えば、ある実施形態では、線維症のより高い量（線維性組織対健康組織のパーセンテージとして表されるような）は、より高いリスク要因をもたらし得る。実施形態では、患者の年齢、他の健康状態等の他の要因が分析に含められ得る。

上述のような種々の実施形態のうちのいずれか１つ以上は、部分的または全体的に、装置あるいはシステムに組み込まれ得る。種々の実施形態では、装置またはシステムは、サーバまたは他の計算デバイス、記憶媒体、および記憶媒体に格納される複数のプログラミング命令を備え得る。これらの実施形態の種々のものにおいて、プログラミング命令は、装置に上述の方法のうちの１つ以上を実行させるように、装置をプログラムするように適合され得る。例えば、プログラミング命令は、装置に画像取得および／または分析を実行させるように、装置をプログラムするように適合され得る。

好ましい実施形態の説明の目的のために、ある実施形態が、本明細書に例証および説明されたが、当業者は、同一目的を達成するために計算される、広範な種々の代替および／または同等の実施形態、あるいは実装は、意図される範囲から逸脱することなく、図示および説明された実施形態と置換され得ることを理解するであろう。当業者は、実施形態が、非常に広範な種々の方法において実装され得ることを容易に理解するであろう。本願は、本明細書で論じられた実施形態のあらゆる適合例および変形例を網羅することを意図する。したがって、実施形態は、請求項およびその同等物によってのみ制限されることが、明白に意図される。

Claims (19)

1. 心臓組織における線維症を検出するシステムであって、
   生存または非生存心臓組織の試料を選択する選択手段と、
   該試料を細胞外造影剤と接触させる接触手段と、
   該試料の造影剤取り込み量の１つ以上の測定値を取得して、びまん性間質性および／または置換性線維症の指標として、該試料内の細胞外容量の拡張程度を判定する取得手段と
   を備える、システム。
2. 前記試料を細胞外造影剤と接触させることは、前記試料をガドリニウム含有造影剤と接触させることを含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記試料を細胞外造影剤と接触させることは、前記試料をガドジアミドと接触させることを含む、請求項１に記載のシステム。
4. 前記試料を細胞外造影剤と接触させることは、前記試料を細胞外コラーゲン結合造影剤と接触させることを含む、請求項１に記載のシステム。
5. 前記試料を細胞外造影剤と接触させることは、前記試料をインビボで細胞外造影剤と接触させることを含む、請求項１に記載のシステム。
6. 前記試料を細胞外造影剤と接触させることは、前記試料をインビトロで細胞外造影剤と接触させることを含む、請求項１に記載のシステム。
7. 前記試料の１つ以上の測定値を取得することは、磁気共鳴映像法を使用して、１つ以上の画像を取得することを含む、請求項１に記載のシステム。
8. 磁気共鳴映像法を使用して、１つ以上の画像を取得することは、１つ以上の造影剤との接触前後に、血液および前記試料において、複数のＴ１緩和時間測定を実行し、前記細胞外造影剤の組織試料分配係数を判定する測定手段を含む、請求項７に記載のシステム。
9. 計算手段が、前記緩和時間（Ｔ１）を、Ｒ１＝１／Ｔ１によって、緩和率に変換し、前記試料に対し判定される各Ｒ１率は、該計算手段によって、前記血液において判定されたＲ１率に対し、直線的に回帰される、請求項８に記載のシステム。
10. 前記取得手段が、血液ヘマトクリット値を取得し、前記試料分配係数および該血液ヘマトクリット値は、前記組織試料における前記細胞外容量を計算するために計算手段によって使用される、請求項８に記載のシステム。
11. 磁気共鳴映像法を使用して、１つ以上の画像を取得することは、造影剤との接触前、間、および後において、高速撮像を実行し、試料と、心室腔または１つ以上の大血管内に存在する血液とにおける造影強化を測定することを含む、請求項７に記載のシステム。
12. 造影強化の動態は、計算手段によって、２空間モデルを用いて分析され、前記試料における前記細胞外容量を判定する、請求項１１に記載のシステム。
13. 計算手段が、線維症のマーカーとして、前記細胞外容量のパラメータマップを生成することをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
14. 判定手段が、前記試料における大域的びまん性線維症負荷を判定することをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
15. 計算手段が、患者におけるびまん性線維症の程度を分類することをさらに含み、前記試料は、心不全または心疾患のリスクを判定するように選択される、請求項１に記載のシステム。
16. 計算手段が、前記試料における間質性と置換性線維症の程度を判定および区別することをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
17. 前記取得手段が、前記試料の１つ以上の画像を取得することは、Ｘ線コンピュータ断層撮影法を使用して、１つ以上の画像を取得することを含む、請求項１に記載のシステム。
18. 計算手段をさらに含み、該計算手段が、組織試料または心臓全体における間質性と置換性線維症の有無、位置、および／または程度を判定し、該判定を心臓の病気、疾患、または特定の心疾患または心不全の関連リスクと相関させることをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
19. 前記判定を心臓の病気、疾患、または特定の心疾患または心不全の関連リスクと相関させることは、数的またはテキスト形式のリスク要因として表される、請求項１８に記載のシステム。

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