JP5236311B2

JP5236311B2 - IgG-Fab fragment antibody binding peptide

Info

Publication number: JP5236311B2
Application number: JP2008041269A
Authority: JP
Inventors: 壮一守川; 慎一吉田; 岳弘西本
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2028-02-22
Also published as: JP2009195184A

Description

本発明は、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体と結合する新規なポリペプチドに関する。また、本発明は、該ポリペプチドを担持させた吸着材料に関する。また、本発明は、該吸着材料を用いたＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体およびＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を分離精製する方法に関する。また、本発明は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを有するベクター、このベクターで形質転換された形質転換体、該ポリペプチドの製造方法に関する。 The present invention relates to novel polypeptides that bind to human IgG-Fab fragment antibodies. The present invention also relates to an adsorbing material carrying the polypeptide. The present invention also relates to a method for separating and purifying an IgG-Fab fragment antibody and an IgG-Fab fragment antibody derivative using the adsorbing material. The present invention also relates to a DNA encoding the polypeptide, a vector having the DNA, a transformant transformed with the vector, and a method for producing the polypeptide.

プロテインＧ蛋白質は、細菌ストレプトコッカス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）より見出された蛋白質であり（以下、ＳｐＧ蛋白質と称する）、ＳｐＧ蛋白質はヒトＩｇＧ抗体と結合する性質を持つ。その性質の原因はＳｐＧ蛋白質のｂｅｔａ−１ドメイン、ｂｅｔａ−２ドメインおよびｂｅｔａ−３ドメインにある。それら３種類のドメインはいずれも、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部位およびヒトＩｇＧ抗体のＦａｂ部位の両構造を分子認識し、特異的に結合するとされている（非特許文献１、２）。ＳｐＧ蛋白質のｂｅｔａ−１ドメイン、ｂｅｔａ−２ドメインおよびｂｅｔａ−３ドメインのアミノ酸配列は、それらの由来する細菌種や細菌株によって細部が異なっている。ＳｐＧ蛋白質のうち、いくつかの亜種はｂｅｔａ−３ドメインを欠く。野生型ＳｐＧ蛋白質のｂｅｔａ−１ドメインのアミノ酸配列の一例として配列番号５を、野生型ＳｐＧ蛋白質のｂｅｔａ−２ドメインのアミノ酸配列の一例として配列番号６をそれぞれ示す。ＳｐＧ蛋白質のｂｅｔａ−１ドメインおよびｂｅｔａ−２ドメインは互いに配列相同性が高く、両者を一括りとしてプロテインＧ−ｂｅｔａドメインと呼ばれる（以下、ＳｐＧｂポリペプチドと称する）。ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法として、ＳｐＧ蛋白質あるいはＳｐＧｂポリペプチドを担持させた吸着剤を用いたアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法が知られている（特許文献１〜３）。この精製法においては、ＳｐＧｂポリペプチドがＩｇＧ−Ｆｃ部位を特異的に認識し、比較的強く結合するというＳｐＧｂポリペプチドの性質が主として利用されている。該方法により分離精製されたヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体は、医薬品、分析試薬あるいは研究用試薬として、産業利用されている。 Protein G protein is a protein found from the bacteria Streptococcus sp. (Hereinafter referred to as SpG protein), and SpG protein has a property of binding to a human IgG antibody. The cause of the nature lies in the beta-1 domain, beta-2 domain, and beta-3 domain of the SpG protein. All of these three types of domains are supposed to specifically recognize and bind to both structures of the Fc site of human IgG antibody and the Fab site of human IgG antibody (Non-patent Documents 1 and 2). The details of the amino acid sequences of the beta-1 domain, beta-2 domain, and beta-3 domain of the SpG protein differ depending on the bacterial species and bacterial strain from which they are derived. Of the SpG protein, some subspecies lack the beta-3 domain. SEQ ID NO: 5 is shown as an example of the amino acid sequence of the beta-1 domain of the wild-type SpG protein, and SEQ ID NO: 6 is shown as an example of the amino acid sequence of the beta-2 domain of the wild-type SpG protein. The beta-1 domain and beta-2 domain of the SpG protein have high sequence homology with each other, and both are collectively referred to as a protein G-beta domain (hereinafter referred to as SpGb polypeptide). As a method for separating and purifying human IgG antibodies and IgG antibody derivatives, affinity column chromatography purification methods using an adsorbent carrying SpG protein or SpGb polypeptide are known (Patent Documents 1 to 3). In this purification method, the property of the SpGb polypeptide that the SpGb polypeptide specifically recognizes the IgG-Fc site and binds relatively strongly is mainly used. Human IgG antibodies and IgG antibody derivatives separated and purified by this method are industrially used as pharmaceuticals, analytical reagents or research reagents.

一方、ＩｇＧ抗体分子の一部分であるＩｇＧ−Ｆａｂドメイン（以下、ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体（ＩｇＧ−Ｆａｂａｎｔｉｂｏｄｙｆｒａｇｍｅｎｔ）と称する）もまた、医薬品、分析試薬あるいは研究用試薬として利用されている。ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を分離精製する方法の一つとして、ＳｐＧ蛋白質あるいはＳｐＧｂポリペプチドを担持させた吸着剤を用いたアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法が一般的に利用されている。ＳｐＧｂポリペプチドの別の特徴的な性質として、ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体を特異的に認識し、結合することもできるためである。しかしながら、ＳｐＧｂポリペプチドとＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体との結合能は、ＳｐＧｂポリペプチドとＩｇＧ−Ｆｃ部位との結合能に比べて弱く、アフィニティ・カラム・クロマトグラフィ用途のリガンド分子としては改良の余地があった。
特表平１−５０２０７６号公報特表平３−５０１８０１号公報特開平３−１２８４００号公報特許第３９０８２７８号明細書特表２００２−５２７１０７号公報Ｓａｕｅｒ−Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ａ．Ｅ．ｅｔ．ａｌ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９５年、３巻、２６５頁Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９４年、３３巻、４７１２頁 On the other hand, an IgG-Fab domain (hereinafter referred to as IgG-Fab antibody fragment), which is a part of an IgG antibody molecule, is also used as a pharmaceutical, an analytical reagent, or a research reagent. As one of the methods for separating and purifying IgG-Fab fragment antibodies or IgG-Fab fragment antibody derivatives, an affinity column chromatography purification method using an adsorbent carrying SpG protein or SpGb polypeptide is generally used. ing. This is because another characteristic property of SpGb polypeptide is that an IgG-Fab fragment antibody can be specifically recognized and bound. However, the binding ability of SpGb polypeptide and IgG-Fab fragment antibody is weaker than that of SpGb polypeptide and IgG-Fc site, and there is room for improvement as a ligand molecule for affinity column chromatography. It was.
Japanese National Publication No. 1-502076 Japanese National Patent Publication No. 3-501801 Japanese Patent Laid-Open No. 3-128400 Japanese Patent No. 3908278 Japanese translation of PCT publication No. 2002-527107 Sauer-Eriksson, A.M. E. et. al. Structure, 1995, Vol. 3, p. 265 Gallagher, T .; et. al. , Biochemistry, 1994, 33, 4712

本発明は、野生型プロテインＧ蛋白質ｂｅｔａドメインと比較して、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体とより強く結合する、プロテインＧ蛋白質ｂｅｔａドメイン様の新規なポリペプチドを提供する。さらに本発明は、該ポリペプチドを吸着リガンドとして用いることを特徴とするＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体吸着剤、ならびに該吸着剤を用いてＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体を分離除去または分離精製する方法を提供する。さらに本発明は該ポリペプチドを形質転換体を用いて生産する方法を提供する。 The present invention provides a novel polypeptide like protein G protein beta domain that binds more strongly to human IgG-Fab fragment antibodies compared to wild type protein G protein beta domain. Furthermore, the present invention provides an IgG-Fab fragment antibody adsorbent characterized by using the polypeptide as an adsorbing ligand, and a method for separating and removing or separating and purifying IgG-Fab fragment antibodies using the adsorbent. Furthermore, the present invention provides a method for producing the polypeptide using the transformant.

本発明者らは、上記の課題を解決すべく、蛋白質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて、数多くのポリペプチドを分子設計し、形質転換細胞から取得し、該ポリペプチドの物性を比較検討することにより、本発明を完成させるに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have designed a number of polypeptides using protein engineering techniques and genetic engineering techniques, obtained them from transformed cells, and compared the physical properties of the polypeptides. By studying, the present invention has been completed.

すなわち本発明は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有し、かつ、ヒトＩｇＧ抗体のＦａｂ部分との結合能を有する、変異型プロテインＧ−ｂｅｔａドメインを含むポリペプチドに関する。 That is, the present invention relates to a polypeptide containing a mutant protein G-beta domain, which has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 and has the ability to bind to the Fab portion of a human IgG antibody.

さらに本発明は、上記ポリペプチドであって、配列番号５または６に示されるアミノ酸配列において、少なくともＴｈｒ−１７が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。 Furthermore, the present invention relates to the above polypeptide, which has an amino acid sequence in which at least Thr-17 is substituted with another amino acid residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 or 6.

さらに本発明は、上記のポリペプチドであって、プロテインＧ−ｂｅｔａドメインが配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるプロテインＧ−ｂｅｔａ−１型であるポリペプチド、あるいは、プロテインＧ−ｂｅｔａドメインが配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるプロテインＧ−ｂｅｔａ−２型であるポリペプチドに関する。 Furthermore, the present invention provides the above polypeptide, wherein the protein G-beta domain is a protein G-beta-1 type consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or the protein G-beta domain is a sequence. The present invention relates to a polypeptide of the protein G-beta-2 type consisting of the amino acid sequence shown in No. 6.

さらに本発明は、上記のポリペプチドと他のポリペプチドとが共有結合した融合ポリペプチドに関する。 Furthermore, the present invention relates to a fusion polypeptide in which the above polypeptide and another polypeptide are covalently bound.

さらに本発明は、上記のポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端または／およびアミノ酸側鎖に１〜１００個のアミノ酸残基が共有結合したポリペプチドに関する。 Furthermore, the present invention relates to a polypeptide in which 1 to 100 amino acid residues are covalently bonded to the N-terminus, C-terminus or / and amino acid side chain of the above polypeptide.

さらに本発明は、上記のポリペプチドを１ドメイン単位として、該ドメイン単位２〜１００個を共有結合にて融合させたポリペプチドに関する。 Furthermore, the present invention relates to a polypeptide in which the above-mentioned polypeptide is used as one domain unit and 2 to 100 domain units are fused by a covalent bond.

さらに本発明は、上記のポリペプチドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、吸着材料に関する。 Furthermore, the present invention relates to an adsorbing material characterized in that the above polypeptide is immobilized on a water-insoluble carrier.

さらに本発明は、上記の吸着材料であって、抗体、抗体誘導体、断片抗体および断片抗体誘導体のいずれかを吸着することができる吸着材料に関する。 Furthermore, the present invention relates to an adsorbing material that is capable of adsorbing any one of the above-mentioned adsorbing materials, antibodies, antibody derivatives, fragment antibodies, and fragment antibody derivatives.

さらに本発明は、上記の吸着材料を用いることを特徴とする、抗体、抗体誘導体、断片抗体および断片抗体誘導体のいずれかを分離精製する方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for separating and purifying any of an antibody, an antibody derivative, a fragment antibody and a fragment antibody derivative, characterized by using the above-mentioned adsorbing material.

さらに本発明は、上記のポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。 Furthermore, the present invention relates to a DNA encoding the above polypeptide.

さらに本発明は、上記のＤＮＡを有するベクターに関する。 Furthermore, this invention relates to the vector which has said DNA.

さらに本発明は、上記のベクターにより形質転換された形質転換体に関する。 Furthermore, this invention relates to the transformant transformed with said vector.

さらに本発明は、上記の形質転換体を用いた、ポリペプチドの製造方法に関する。 Furthermore, this invention relates to the manufacturing method of polypeptide using said transformant.

本発明は、野生型ＳｐＧ蛋白質あるいはその断片であるＳｐＧｂポリペプチドと比較して、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体と特異的により強く結合する性質を有する新規なポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドを水不溶性担体に固定化した吸着材料を用いることにより、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体または種々のＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を分離精製することが可能となる。また本発明の形質転換細胞を用いることにより、本発明のポリペプチドを製造することが可能となる。 The present invention provides a novel polypeptide that has a property of specifically and strongly binding to a human IgG-Fab fragment antibody as compared to an SpGb polypeptide that is a wild-type SpG protein or a fragment thereof. By using an adsorbing material in which the polypeptide of the present invention is immobilized on a water-insoluble carrier, it is possible to separate and purify human IgG-Fab fragment antibodies or various IgG-Fab fragment antibody derivatives. Moreover, the polypeptide of the present invention can be produced by using the transformed cell of the present invention.

以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、タンパク質は下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて表される。また、特に明示しない限りペプチド及びタンパク質のアミノ酸残基の配列は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるように、またＮ末端が１番になるように表される。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、
Ｂ＝Ａｓｘ＝ＡｓｐまたはＡｓｎ、Ｚ＝Ｇｌｘ＝ＧｌｕまたはＧｌｎ、
Ｘ＝Ｘａａ＝任意のアミノ酸。 In the present specification, amino acids, peptides, and proteins are represented using abbreviations adopted by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Committee (CBN) shown below. Unless otherwise specified, the amino acid residue sequences of peptides and proteins are expressed from the N-terminal to the C-terminal from the left end to the right end and so that the N-terminal is number 1.
A = Ala = alanine, C = Cys = cysteine,
D = Asp = aspartic acid, E = Glu = glutamic acid,
F = Phe = phenylalanine, G = Gly = glycine,
H = His = histidine, I = Ile = isoleucine,
K = Lys = Lysine, L = Leu = Leucine,
M = Met = methionine, N = Asn = asparagine,
P = Pro = proline, Q = Gln = glutamine,
R = Arg = arginine, S = Ser = serine,
T = Thr = threonine, V = Val = valine,
W = Trp = tryptophan, Y = Tyr = tyrosine,
B = Asx = Asp or Asn, Z = Glx = Glu or Gln,
X = Xaa = any amino acid.

本明細書において、「変異体」とは、ポリペプチドのアミノ酸配列に含まれるアミノ酸が少なくとも１つ以上置換、付加、挿入、もしくは欠失、または修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。 As used herein, the term “variant” refers to a polypeptide having an amino acid sequence in which at least one amino acid contained in the amino acid sequence of the polypeptide is substituted, added, inserted, deleted, or modified.

本明細書において、「ドメイン」とは、蛋白質およびポリペプチドの高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なアミノ酸高分子の単位をいう。 In the present specification, a “domain” is a unit in a higher-order structure of proteins and polypeptides, and is composed of a sequence of several tens to several hundreds of amino acid residues, and has some physicochemical or biochemical function. A unit of amino acid polymer sufficient for expression.

本明細書において、「ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体」とは、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ抗体、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ抗体のＣＬドメイン部分およびＣＨ１ドメイン部分と他生物種ＩｇＧ抗体のいくつかのＶドメイン部分とを融合させたキメラＩｇＧ−Ｆａｂ抗体、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ抗体のＣＤＲ部分を除いた残余の部分と他生物種ＩｇＧ抗体のＣＤＲ部分とを融合させたヒト型化ＩｇＧ−Ｆａｂ抗体、およびそれらに化学的修飾を加えた蛋白質であって、ＩｇＧ抗体のＣＬドメイン部分およびＣＨ１ドメイン部分とを有するＩｇＧ−Ｆａｂ抗体誘導体をいう。 In the present specification, “IgG-Fab fragment antibody derivative” refers to human IgG-Fab antibody, CL domain portion and CH1 domain portion of human IgG-Fab antibody, and several V domain portions of other species IgG antibody. A fused chimeric IgG-Fab antibody, a humanized IgG-Fab antibody obtained by fusing the remaining part excluding the CDR part of a human IgG-Fab antibody and the CDR part of another species IgG antibody, and chemically An IgG-Fab antibody derivative, which is a modified protein and has a CL domain portion and a CH1 domain portion of an IgG antibody.

以下、所望の変異体もしくはポリペプチドを取得するための、タンパク質のアミノ酸の変異について説明する。アミノ酸の置換などを実施する方法は、化学合成、または遺伝子工学を利用する技術においてアミノ酸をコードするＤＮＡ配列のコドンを変化させることを含むが、これらに限定されない。 Hereinafter, amino acid mutations in a protein for obtaining a desired mutant or polypeptide will be described. Methods for performing amino acid substitution and the like include, but are not limited to, changing the codons of a DNA sequence encoding an amino acid in a technique utilizing chemical synthesis or genetic engineering.

本発明者らは、野生型ＳｐＧｂポリペプチドのアミノ酸配列を雛形として、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体のＣＨ１鎖構造部分およびＣＬ鎖構造部分と特異的に結合する性質を有する新規なポリペプチドの設計を、立体構造のデータを利用した種々の検討およびモデリングによる分析により実施した。これらの設計作業の結果として、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ抗体誘導体に結合し得る種々のポリペプチドを考案した。考案したポリペプチドを遺伝子工学的手法により数多く取得し、それらポリペプチドの特徴を種々の科学的手法を用いて解析したところ、いくつかのポリペプチドに野生型ＳｐＧｂポリペプチドと比較して、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体とより強く結合する性質を見出した。 The present inventors have designed a novel polypeptide having the property of specifically binding to the CH1 chain structure portion and CL chain structure portion of a human IgG-Fab fragment antibody using the amino acid sequence of the wild-type SpGb polypeptide as a template. It was carried out by various examinations using modeling data and analysis by modeling. As a result of these design work, various polypeptides have been devised that can bind to human IgG-Fab fragment antibodies or IgG antibody derivatives. Many of the devised polypeptides were obtained by genetic engineering techniques, and the characteristics of these polypeptides were analyzed using various scientific techniques. As compared with the wild-type SpGb polypeptide, some polypeptides were compared with human IgG. -The property of binding more strongly to the Fab fragment antibody was found.

前記設計による考案および実施形態を具体的に以下に示す。野生型ＳｐＧｂポリペプチドとＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体は複合体を形成し、その立体構造情報は公開データベースであるプロテイン・データ・バンク（ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ）に、コード番号１ＩＧＣとして登録公開されている。この立体構造情報を種々検討し、ＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体との結合能を強化すべく、ポリペプチド変異体の分子設計を行った。分子設計により考案された種々のポリペプチドを遺伝子工学的手法により取得し、配列番号１で示される、ＳｐＧｂ様新規ポリペプチドのＴｈｒ−１７残基をＧｌｙへと置換することが特に有効であると判断された。好ましい実施形態としては、配列番号１〜３で示されるＳｐＧｂ様新規ポリペプチドが挙げられる。配列番号１〜２はＳｐＧのｂｅｔａ−１ドメイン配列を雛形として設計取得した新規ポリペプチドであり、配列番号３はＳｐＧのｂｅｔａ−２ドメイン配列を雛形として設計取得した新規ポリペプチドである。別の実施形態としては、配列番号１〜３のいずれかで示されるポリペプチドに対して９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドが挙げられる。配列番号１〜３で示されるポリペプチドに対して十分な配列同一性を有するポリペプチドに関しても、本発明によるヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体およびＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体への結合能を示すことが期待できるためである。配列同一性は、プログラムＦＡＳＴＡ（ＰｅｒａｓｏｎＷ．Ｒ．ｅｔａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４６、２４−３６（１９９７））やＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ＳｔｅｐｈｅｎＦ．ｅｔａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５、３３８９−３４０２（１９９７））を用いたアミノ酸配列相同性解析により、決定することができる。 The ideas and embodiments of the above design are specifically shown below. A wild-type SpGb polypeptide and an IgG-Fab fragment antibody form a complex, and its three-dimensional structure information is registered and released in the protein data bank (Protein Data Bank), which is a public database, as code number 1IGC. In order to enhance the ability to bind to IgG-Fab fragment antibodies, various molecular structures of polypeptide variants were designed. It is particularly effective to obtain various polypeptides devised by molecular design by genetic engineering techniques and to replace Thr-17 residue of SpGb-like novel polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 with Gly. It was judged. Preferred embodiments include SpGb-like novel polypeptides represented by SEQ ID NOs: 1-3. SEQ ID NOs: 1-2 are novel polypeptides designed and acquired using the SpG beta-1 domain sequence as a template, and SEQ ID NO: 3 is a novel polypeptide designed and acquired using the SpG beta-2 domain sequence as a template. Another embodiment includes a polypeptide having 90% or more sequence identity to the polypeptide represented by any of SEQ ID NOs: 1-3. It is expected that the polypeptide having sufficient sequence identity to the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 1 to 3 will also show the binding ability to the human IgG-Fab fragment antibody and IgG-Fab fragment antibody derivative according to the present invention. This is because it can. Sequence identity is determined by the program FASTA (Perason WR et al., Genomics, 46, 24-36 (1997)) and BLAST (Altschul, Stephen F. et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 ( 1997))) and can be determined by amino acid sequence homology analysis.

本発明の別の実施形態としては、それらのポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端もしくはアミノ酸側鎖に１〜１０個のアミノ酸残基を共有結合により付加したポリペプチドであって、それら付加したアミノ酸残基が該ポリペプチド間のリンカーとして、あるいは担持材料（担体）とのリンカーとして利用できるポリペプチドが挙げられる。好ましくは、ポリペプチド間のリンカーとしてはＩｇＧ抗体との相互作用が少ないＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ等が挙げられ、担体とのリンカーとしてはチオール基を持つＣｙｓ、アミノ基を持つＬｙｓ、カルボキシル基を持つＧｌｕ、Ａｓｐ等が挙げられ、さらにそれらのアミノ酸残基を複数個利用することもできる。さらに別の実施形態としては、それらのポリペプチド単位２〜１０個を共有結合にて融合させ、ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体への結合能を高めた融合ポリペプチドが挙げられる。好ましくは、本発明のポリペプチド単位２〜５個および前記した各種のリンカー部分を含む融合ポリペプチドが挙げられる。 Another embodiment of the present invention is a polypeptide in which 1 to 10 amino acid residues are covalently added to the N-terminus, C-terminus or amino acid side chain of these polypeptides, and the added amino acid residues Polypeptides whose groups can be used as a linker between the polypeptides or as a linker with a support material (carrier) are mentioned. Preferably, Gly, Ala, Ser, etc. that have little interaction with IgG antibodies are used as a linker between polypeptides, and Cys having a thiol group, Lys having an amino group, or carboxyl group as a linker with a carrier. Glu, Asp and the like can be mentioned, and a plurality of these amino acid residues can also be used. Yet another embodiment includes a fusion polypeptide in which 2 to 10 of these polypeptide units are covalently fused to enhance the binding ability to human IgG antibodies and IgG antibody derivatives. Preferably, fusion polypeptides containing 2 to 5 polypeptide units of the present invention and the various linker moieties described above are included.

また本発明の一つの実施態様としては、上記方法で得られたポリペプチドまたは配列番号４で示されるポリペプチド（特許文献４）を水不溶性担体に固定化したことを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体の吸着材料を提供しうる。さらに、その吸着材料を用いることを特徴とする、ヒトＩｇＧ抗体およびＩｇＧ抗体誘導体を分離精製する方法を提供しうる。 Moreover, as one embodiment of the present invention, a human IgG antibody, wherein the polypeptide obtained by the above method or the polypeptide represented by SEQ ID NO: 4 (Patent Document 4) is immobilized on a water-insoluble carrier. And an adsorption material for IgG antibody derivatives. Furthermore, it is possible to provide a method for separating and purifying human IgG antibody and IgG antibody derivative, characterized by using the adsorbing material.

本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂ、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギットＣ２５０Ｌ等を例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体、活性化担体のみに限定されるものではない。また、本発明に用いる水不溶性担体は、本吸着材料の使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、繊維状、膜状（中空糸を含む）など何れも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。 Examples of the water-insoluble carrier used in the present invention include inorganic carriers such as glass beads and silica gel, synthetic polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene, crystalline cellulose, crosslinked cellulose, crosslinked agarose, Examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as cross-linked dextran, and organic-organic, organic-inorganic and other composite carriers obtained by a combination thereof. Commercially available products include GCL2000, which is a porous cellulose gel, Sephacryl S-1000 in which allyldextran and methylenebisacrylamide are covalently crosslinked, Toyopearl, which is an acrylate carrier, Sepharose CL4B, which is an agarose crosslinking carrier, and epoxy group For example, Eupergite C250L, which is polymethacrylamide activated by the above, can be exemplified. However, the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers and activated carriers. Further, the water-insoluble carrier used in the present invention desirably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the present adsorbent material, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size. The form of the carrier can be any of beads, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.

本発明のポリペプチドを前記担体へ固定化する方法は特に限定されるものではないが、一般に蛋白質やペプチドを担体に固定化する場合に採用される方法を例示する。担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンなどと反応させて担体を活性化あるいは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物と反応、固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。 A method for immobilizing the polypeptide of the present invention on the carrier is not particularly limited, but a method generally employed when immobilizing a protein or peptide on the carrier is exemplified. A compound that activates the carrier by reacting the carrier with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine, etc., or introduces a reactive functional group on the surface of the carrier and immobilizes it as a ligand And a method of reaction and immobilization with a carrier, and addition of a condensing reagent such as carbodiimide or a reagent having multiple functional groups in the molecule such as glutaraldehyde in a system in which a compound to be immobilized as a carrier and a ligand exists. Examples of the immobilization method include condensation and crosslinking.

本発明のポリペプチド結合担体を吸着材料として、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体およびＩｇＧ抗体誘導体をアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。本発明の精製法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ蛋白質を担持させた吸着材料を用いたアフィニティ・カラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順（特許文献５）により達成することができる。すなわち、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液を本発明の吸着材料を充填したアフィニティ・カラムに通過させ、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を吸着させる。次いで、アフィニティ・カラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体はカラム内の本発明の吸着材料に吸着されている。次いで、適切なｐＨに調整した酸性もしくはアルカリ性の純粋な緩衝液をカラムに通過させ、所望のヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体またはＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体誘導体を溶出することにより、高純度な精製が達成される。本発明の吸着材料を充填したアフィニティ・カラムは、強酸性もしくは強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。 Human IgG-Fab fragment antibodies and IgG antibody derivatives can be separated and purified by affinity column chromatography purification using the polypeptide-binding carrier of the present invention as an adsorbing material. The purification method of the present invention can be achieved by a procedure (Patent Document 5) according to an affinity column chromatography purification method using an adsorbent material carrying Protein-A protein. That is, after adjusting the buffer containing the human IgG-Fab fragment antibody or IgG-Fab fragment antibody derivative to be neutral, the solution is passed through an affinity column packed with the adsorption material of the present invention, An IgG-Fab fragment antibody or IgG-Fab fragment antibody derivative is adsorbed. Next, an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed. At this point, the desired human IgG-Fab fragment antibody or IgG-Fab fragment antibody derivative is adsorbed to the adsorption material of the present invention in the column. High purity purification is then achieved by passing a pure acidic or alkaline buffer adjusted to the appropriate pH through the column and eluting the desired human IgG-Fab fragment antibody or IgG-Fab fragment antibody derivative. The The affinity column packed with the adsorbing material of the present invention can be reused by passing it through a pure buffer solution having strong acidity or strong alkalinity.

さらに本発明の一つの実施態様としては、前記方法により得られたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、そのヌクレオチド配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、またはその組換えＤＮＡがプラスミド又はファージである組換えＤＮＡ、またはその組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。また、本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドと細胞での蛋白質発現を補助する作用のある公知の蛋白質との融合蛋白質として取得することができる。すなわち、本発明のポリペプチドと該蛋白質との融合蛋白質をコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。該蛋白質の例としては、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらの蛋白質に限定されるものではない。 Furthermore, as one embodiment of the present invention, a nucleotide sequence encoding the polypeptide obtained by the above method, a recombinant DNA having one or more nucleotide sequences, or the recombinant DNA is a plasmid or a phage. Recombinant DNA, or a microorganism or cell containing at least one of the recombinant DNA can be obtained. In addition, the polypeptide of the present invention can be obtained as a fusion protein of the polypeptide and a known protein having an action of assisting protein expression in cells. That is, a microorganism or cell containing at least one recombinant DNA encoding a fusion protein of the polypeptide of the present invention and the protein can be obtained. Examples of the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.

本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、ポリペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。 The introduction of site-specific mutations for modifying the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be carried out using recombinant DNA techniques, PCR methods and the like as follows. That is, the introduction of mutations by recombinant DNA technology is performed when, for example, appropriate restriction enzyme recognition sequences exist on both sides of the target site where mutation is desired in the gene encoding the polypeptide of the present invention. Cleavage the restriction enzyme recognition sequence with the restriction enzyme, remove the region containing the site where mutation is desired, and insert the DNA fragment mutated only into the target site by chemical synthesis or the like. Can do. In addition, the introduction of site-specific mutation by PCR is performed, for example, using a double-stranded plasmid encoding a polypeptide as a template and two synthetic oligo primers containing mutations complementary to the + and − chains. This can be done by the double primer method.

本発明のベクターは、前述したポリペプチドをコードする遺伝子を適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ等のプラスミドＤＮＡ、ＥＭＢＬ３、Ｍ１３、λｇｔ１１等のファージＤＮＡ等を、酵母を宿主として用いる場合は、ＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等を、植物細胞を宿主として用いる場合には、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１等を、動物細胞を宿主として用いる場合は、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ等をベクターとして用いることができる。 The vector of the present invention can be obtained by linking or inserting a gene encoding the above-mentioned polypeptide into an appropriate vector, and the vector for inserting the gene can be any one that can autonomously replicate in the host. There is no particular limitation, and plasmid DNA or phage DNA can be used as a vector. For example, when using Escherichia coli as a host, plasmid DNA such as pBR322, pUC18, pBluescript II, phage DNA such as EMBL3, M13, λgt11, etc., and when using yeast as a host, YEp13, YCp50, etc. are used as plant cells. PBI121, pBI101 and the like can be used as a host, and pcDNAI, pcDNAI / Amp and the like can be used as a vector when animal cells are used as the host.

本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組み換えベクターを導入することにより得ることができる。細菌への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法やエレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。植物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法等が挙げられる。動物細胞への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。 The transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell. Examples of methods for introducing recombinant DNA into bacteria include a method using calcium ions and an electroporation method. Examples of the method for introducing the recombinant DNA into yeast include an electroporation method, a spheroplast method, and a lithium acetate method. Examples of methods for introducing recombinant DNA into plant cells include the Agrobacterium infection method, the particle gun method, and the polyethylene glycol method. Examples of methods for introducing recombinant DNA into animal cells include the electroporation method and the calcium phosphate method.

本発明のポリペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養物（培養菌体または培養上清）中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のポリペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明のポリペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養物（培養菌体または培養上清）中に本発明のポリペプチドを含む融合蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該融合蛋白質を採取し、該融合蛋白質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のポリペプチドを採取することにより製造することができる。 The polypeptide of the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cells in a medium, producing and accumulating the polypeptide of the present invention in a culture (cultured cells or culture supernatant), and obtaining the desired polypeptide from the culture. It can be manufactured by sampling. In addition, the polypeptide of the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cells in a medium, and generating and accumulating a fusion protein containing the polypeptide of the present invention in a culture (cultured cells or culture supernatant). The fusion protein can be collected from the protein, and the fusion protein can be cleaved with an appropriate protease to obtain the desired polypeptide.

本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の細菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、完全培地又は合成培地、例えばＬＢ培地、Ｍ９培地等が挙げられる。また、培養温度は２０〜４０℃で好気的に６〜２４時間培養することにより本発明のポリペプチドを菌体内に蓄積させ、回収する。 The method of culturing the transformed cell of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for host culture. Examples of the medium for culturing transformed cells obtained using bacteria such as Escherichia coli as a host include complete medium or synthetic medium such as LB medium, M9 medium and the like. In addition, the polypeptide of the present invention is accumulated in the microbial cells and collected by aerobically culturing at 20 to 40 ° C. for 6 to 24 hours.

本発明のポリペプチドの精製は、前述した培養法により得られる培養物を遠心して回収し（細胞についてはソニケーター等にて破砕する）、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のポリペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。 For purification of the polypeptide of the present invention, the culture obtained by the above-described culture method is collected by centrifugation (cells are crushed with a sonicator or the like), affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration. Chromatography and the like can be performed alone or in appropriate combination. Confirmation that the obtained purified substance is the target polypeptide can be carried out by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.

前記実施態様の一例として、請求項３に記載のポリペプチド（配列番号３）とＩｇＧ−Ｆａｂとの結合能を、表面プラズモン共鳴現象を利用したＢＩＡＣＯＲＥ分析実験（ビアコア株式会社、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００システム、３３−１１４１４３８−３７１９）にて測定した結合解離曲線を図１に示した。別の例として、請求項１〜４に記載のポリペプチド（配列番号１〜４）それぞれと、ＩｇＧ−Ｆａｂとの結合能（解離定数）をＢＩＡＣＯＲＥ分析実験にて解析した結果を表１に示した。さらに別の例として、配列番号４で示されるポリペプチドをセルロース担体に固定化し、該担体を用いたアフィニティ・クロマトグラフィー精製法により、ＩｇＧ−Ｆａｂ分子を含む溶液からＩｇＧ−Ｆａｂ分子を選択的に分離精製した実験から得られた、吸着解離プロフィール図を図２に示した。本発明により、配列番号１〜４で示したポリペプチドは、野生型ＳｐＧｂポリペプチドに比べて優れたＩｇＧ−Ｆａｂ吸着解離能力を示し、アフィニティ・クロマトグラム担体としての性能が向上していることは明らかである。 As an example of the embodiment, the binding ability between the polypeptide (SEQ ID NO: 3) according to claim 3 and IgG-Fab was analyzed using a BIACORE analysis experiment using a surface plasmon resonance phenomenon (Biacore Corporation, BIACORE 3000 system, 33- 1114438-3719) is shown in FIG. As another example, Table 1 shows the results of analyzing the binding ability (dissociation constant) of each of the polypeptides according to claims 1 to 4 (SEQ ID NOs: 1 to 4) and IgG-Fab in a BIACORE analysis experiment. It was. As yet another example, the polypeptide shown in SEQ ID NO: 4 is immobilized on a cellulose carrier, and IgG-Fab molecules are selectively selected from a solution containing IgG-Fab molecules by affinity chromatography purification using the carrier. The adsorption dissociation profile obtained from the separated and purified experiment is shown in FIG. According to the present invention, the polypeptides represented by SEQ ID NOs: 1 to 4 exhibit superior IgG-Fab adsorption / dissociation ability compared to the wild-type SpGb polypeptide, and the performance as an affinity chromatogram carrier is improved. it is obvious.

以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。特に明記していない方法についてはMolecular Cloning, A laboratory manual, second edition （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples. The method not particularly specified can be performed according to the method described in Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

なお、以下の実施例１〜６では、野生型ＳｐＧポリペプチドに相当する、配列番号５、６で示される各ポリペプチド、および、ヒトＩｇＧ−Ｆａｂ断片抗体と特異的により強く結合する性質を有する新規なＳｐＧｂポリペプチドとして、配列番号１、２、３で示される各ポリペプチドの取得方法について説明する。以下の配列番号７〜２０のＤＮＡは、後述するように、上記配列番号１〜３、５、６をコードする各々の遺伝子のクローニングのために設計した。上記各種ＤＮＡについて、シグマアルドリッチジャパン株式会社に合成を依頼した。 In Examples 1 to 6 below, each of the polypeptides shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, corresponding to the wild-type SpG polypeptide, and a human IgG-Fab fragment antibody have a property of specifically and strongly binding. A method for obtaining each polypeptide represented by SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 will be described as a novel SpGb polypeptide. The following DNAs of SEQ ID NOs: 7 to 20 were designed for cloning of the genes encoding the above SEQ ID NOs: 1 to 3, 5 and 6, as described later. The various DNAs were requested to be synthesized by Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.

（実施例１）
配列番号５をコードするＤＮＡの調製
配列番号７および８に記載のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ３００ｐｍｏｌを混合し、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ポリメラーゼにはＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ株式会社）を用い、さらに添付のバッファーとｄＮＴＰも反応に用いた。反応液量は０．０５ｍＬとした。反応条件は９６℃５分１回、９６℃２分・５５℃３０秒・７２℃３０秒のサイクルを１０回とした。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、約９０ｂｐのサイズに相当するバンドを切り出し、抽出した二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉ（いずれもタカラバイオ株式会社）により切断した。 Example 1
Preparation of DNA encoding SEQ ID NO: 5 300 pmol of the synthetic DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 7 and 8 was mixed, and an overlap PCR reaction was performed. Pyrobest (Takara Bio Inc.) was used as the polymerase, and the attached buffer and dNTP were also used for the reaction. The reaction volume was 0.05 mL. The reaction conditions were 96 ° C. for 5 minutes once, 96 ° C. for 2 minutes, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds for 10 cycles. The PCR reaction product was subjected to agarose electrophoresis, a band corresponding to a size of about 90 bp was cut out, and the extracted double-stranded DNA was cut with restriction enzymes BamHI and Eco52I (both were Takara Bio Inc.).

また、配列番号９および１０に記載の合成ＤＮＡ３００ｐｍｏｌを混合し、同様の組成および反応条件でオーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、約１１０ｂｐのサイズに相当するバンドを切り出し、抽出した二本鎖ＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩ（タカラバイオ株式会社）により切断した。 In addition, 300 pmol of the synthetic DNA described in SEQ ID NOs: 9 and 10 were mixed, and an overlap PCR reaction was performed under the same composition and reaction conditions. The PCR reaction product was subjected to agarose electrophoresis, a band corresponding to a size of about 110 bp was cut out, and the extracted double-stranded DNA was cleaved with restriction enzymes Eco52I and EcoRI (Takara Bio Inc.).

プラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。なお、上記２種の二本鎖ＤＮＡが、Ｅｃｏ５２Ｉ切断サイトで結合し、ｐＧＥＸ−２Ｔにサブクローニングしたときに、配列番号５をコードするように、配列番号７、８、９、１０のＤＮＡを設計した。このサブクローニングしたＤＮＡの配列は、配列番号２１に示した。この配列番号２１のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−２Ｔを用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞（タカラバイオ株式会社）の形質転換を行い、定法によって、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。 The above two types of double-stranded DNAs were subcloned into the BamHI / EcoRI site in the multiple cloning site of the plasmid vector pGEX-2T (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.). The DNAs of SEQ ID NOs: 7, 8, 9, and 10 are designed to encode SEQ ID NO: 5 when the above two types of double-stranded DNAs are combined at the Eco52I cleavage site and subcloned into pGEX-2T. did. The sequence of this subcloned DNA is shown in SEQ ID NO: 21. Using pGEX-2T containing the DNA of SEQ ID NO: 21, Escherichia coli DH5α cells (Takara Bio Inc.) were transformed, and plasmid DNA was amplified and extracted by a conventional method.

また、増幅・抽出したプラスミドＤＮＡを鋳型として、ｐＧＥＸ−３´プライマーおよびｐＧＥＸ−５´プライマー（両者ともＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）を用いて、配列番号２１に相当する二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ反応によって増幅した。鋳型プラスミドＤＮＡを５０ｎｇ、各プライマーを１０ｐｍｏｌ、ポリメラーゼとしてＴａｋａｒａＥｘＴａｑ（タカラバイオ株式会社）、および、添付のバッファーとｄＮＴＰを加えて反応を行った。反応液量は０．０５ｍＬとした。反応条件は９４℃３分１回、９４℃１分・５５℃３０秒・７２℃３０秒のサイクルを２５回とした。ＰＣＲ反応生成物から、上記と同様にアガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩにより切断した後に、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。同様に、この配列番号２１のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。 In addition, using the amplified and extracted plasmid DNA as a template, a double-stranded DNA corresponding to SEQ ID NO: 21 was PCR-encoded using pGEX-3 ′ primer and pGEX-5 ′ primer (both from GE Healthcare Biosciences). Amplified by reaction. The reaction was performed by adding 50 ng of template plasmid DNA, 10 pmol of each primer, Takara Ex Taq (Takara Bio Inc.) as a polymerase, and the attached buffer and dNTP. The reaction volume was 0.05 mL. The reaction conditions were 94 ° C for 3 minutes once, 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds for 25 cycles. The double-stranded DNA separated and collected from the PCR reaction product by agarose electrophoresis as described above was cleaved with BamHI and EcoRI, and then the plasmid vector pGEX-6P-1 (GE Healthcare Biosciences) Subcloned into the BamHI / EcoRI site. Similarly, pGEX-6P-1 containing the DNA of SEQ ID NO: 21 was used to transform E. coli DH5α cells, and plasmid DNA was amplified and extracted.

（実施例２）
配列番号２をコードするＤＮＡの調製
配列番号１１および１２に記載の合成ＤＮＡを用い、実施例１と同様の方法で、オーバーラップＰＣＲ反応を行い、アガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉにより切断した。この二本鎖ＤＮＡ、および、実施例１において配列番号９および１０に記載の合成ＤＮＡからＰＣＲ反応によって調製したＥｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩで切断済みの二本鎖ＤＮＡを、プラスミドベクターｐＧＥＸ−２ＴのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。なお、上記２種の二本鎖ＤＮＡが、Ｅｃｏ５２Ｉ切断サイトで結合し、ｐＧＥＸ−２Ｔにサブクローニングしたときに、配列番号２をコードするように、配列番号９、１０、１１、１２のＤＮＡを設計した。このサブクローニングしたＤＮＡの配列は、配列番号２２に示した。実施例１と同様に、配列番号２２のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−２Ｔを用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。 (Example 2)
Preparation of DNA encoding SEQ ID NO: 2 Double strands separated and recovered by agarose electrophoresis after performing overlap PCR reaction using the synthetic DNAs described in SEQ ID NOs: 11 and 12 in the same manner as in Example 1. DNA was cut with BamHI and Eco52I. This double-stranded DNA and the double-stranded DNA cleaved with Eco52I and EcoRI prepared by PCR reaction from the synthetic DNAs described in SEQ ID NOs: 9 and 10 in Example 1 were transformed into BamHI / EcoRI of plasmid vector pGEX-2T. Subcloned into the site. The DNAs of SEQ ID NOs: 9, 10, 11, and 12 are designed to encode SEQ ID NO: 2 when the above two types of double-stranded DNAs are combined at the Eco52I cleavage site and subcloned into pGEX-2T. did. The sequence of this subcloned DNA is shown in SEQ ID NO: 22. In the same manner as in Example 1, pGEX-2T containing DNA of SEQ ID NO: 22 was used to transform E. coli DH5α cells, and plasmid DNA was amplified and extracted.

また、実施例１と同様の手法によって、配列番号２２に相当する二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ反応によって増幅し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１にサブクローニングした。この配列番号２２のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅および抽出した。 In addition, a double-stranded DNA corresponding to SEQ ID NO: 22 was amplified by PCR reaction and subcloned into pGEX-6P-1 by the same method as in Example 1. PGEX-6P-1 containing the DNA of SEQ ID NO: 22 was used to transform E. coli DH5α cells, and plasmid DNA was amplified and extracted.

（実施例３）
配列番号１をコードするＤＮＡの調製
配列番号５をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を鋳型として、配列番号１３および１４の合成ＤＮＡプライマーを用い、クイックチェンジ法で、配列番号５のアミノ酸配列においてＴｈｒ−１７がＧｌｙに変換された変異体、すなわち配列番号１をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を作成した。上記方法で作成した、配列番号１をコードするＤＮＡの配列を、配列番号２３に示す。クイックチェンジ法に関しては、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用い、添付のプロトコルに従って行った。実施例１と同様に、配列番号２３のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。 (Example 3)
Preparation of DNA encoding SEQ ID NO: 1 Using pGEX-6P-1 containing DNA encoding SEQ ID NO: 5 as a template, the synthetic DNA primers of SEQ ID NOS: 13 and 14 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 by the quick change method PGEX-6P-1 containing a DNA in which Thr-17 was converted to Gly, that is, DNA encoding SEQ ID NO: 1 was prepared. The DNA sequence encoding SEQ ID NO: 1 prepared by the above method is shown in SEQ ID NO: 23. The quick change method was performed using QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) according to the attached protocol. In the same manner as in Example 1, pGEX-6P-1 containing DNA of SEQ ID NO: 23 was used to transform E. coli DH5α cells, and plasmid DNA was amplified and extracted.

（実施例４）
配列番号６をコードするＤＮＡの調製
配列番号１５および１６に記載の合成ＤＮＡを用い、実施例１と同様の方法で、オーバーラップＰＣＲ反応を行い、アガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＥｃｏ５２Ｉにより切断した。また同様に、配列番号１７および１８に記載の合成ＤＮＡを用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行い、アガロース電気泳動にて分離・回収した二本鎖ＤＮＡを、Ｅｃｏ５２ＩとＥｃｏＲＩにより切断した。上記２種の二本鎖ＤＮＡを、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトにサブクローニングした。上記２種の二本鎖ＤＮＡが、Ｅｃｏ５２Ｉ切断サイトで結合し、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１にサブクローニングしたときに、配列番号６をコードするように、配列番号１５、１６、１７、１８のＤＮＡを設計した。このサブクローニングしたＤＮＡの配列は、配列番号２４に示した。実施例１と同様に、配列番号２４のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。 Example 4
Preparation of DNA encoding SEQ ID NO: 6 Double strands separated and recovered by agarose electrophoresis after performing overlap PCR reaction using the synthetic DNAs described in SEQ ID NOs: 15 and 16 in the same manner as in Example 1. DNA was cut with BamHI and Eco52I. Similarly, an overlap PCR reaction was performed using the synthetic DNAs described in SEQ ID NOs: 17 and 18, and double-stranded DNA separated and recovered by agarose electrophoresis was cleaved with Eco52I and EcoRI. The two types of double-stranded DNAs were subcloned into the BamHI / EcoRI site of pGEX-6P-1. The DNAs of SEQ ID NOs: 15, 16, 17, and 18 are designed to encode SEQ ID NO: 6 when the above two types of double-stranded DNAs are combined at the Eco52I cleavage site and subcloned into pGEX-6P-1. did. The sequence of this subcloned DNA is shown in SEQ ID NO: 24. In the same manner as in Example 1, pGEX-6P-1 containing DNA of SEQ ID NO: 24 was used to transform E. coli DH5α cells, and plasmid DNA was amplified and extracted.

（実施例５）
配列番号３をコードするＤＮＡの調製
配列番号６をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を鋳型として、配列番号１９および２０の合成ＤＮＡプライマーを用い、実施例３と同様に、クイックチェンジ法で、配列番号６のアミノ酸配列においてＴｈｒ−１７がＧｌｙに変換された変異体、すなわち配列番号３をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を作成した。上記方法で作成した、配列番号３をコードするＤＮＡの配列を、配列番号２５に示した。実施例１と同様に、配列番号２５のＤＮＡを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換を行い、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。 (Example 5)
Preparation of DNA encoding SEQ ID NO: 3 Using pGEX-6P-1 containing DNA encoding SEQ ID NO: 6 as a template, the synthetic DNA primers of SEQ ID NOS: 19 and 20 were used in the same manner as in Example 3 by the quick change method. A mutant in which Thr-17 was converted to Gly in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, that is, pGEX-6P-1 containing DNA encoding SEQ ID NO: 3 was prepared. The DNA sequence encoding SEQ ID NO: 3 prepared by the above method is shown in SEQ ID NO: 25. In the same manner as in Example 1, pGEX-6P-1 containing DNA of SEQ ID NO: 25 was used to transform E. coli DH5α cells, and plasmid DNA was amplified and extracted.

（実施例６）
各ＤＮＡの配列確認
実施例１〜５で得られた、配列番号２１〜２５のＤＮＡを含む、各々のプラスミドＤＮＡの配列確認は、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ．１．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、添付のプロトコルに従い、各々のプラスミドＤＮＡのシークエンシングＰＣＲ反応を行い、そのシークエンシング産物を精製し、配列解析に用いた。 (Example 6)
Sequence confirmation of each DNA The sequence confirmation of each plasmid DNA containing DNA of sequence number 21-25 obtained in Examples 1-5 uses DNA sequencer 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). I went. BigDye Terminator v. 1.1 Cycle sequencing of each plasmid DNA was performed using Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) according to the attached protocol, and the sequencing products were purified and used for sequence analysis.

（実施例７）
各ＳｐＧポリペプチド（ＧＳＴ融合蛋白質）の発現
実施例１〜５で得られた、配列番号２１〜２５のＤＮＡのいずれかを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を導入したＤＨ５α細胞を、アンピシリン（和光純薬工業株式会社）を０．１ｇ／Ｌの濃度で含有するＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％乾燥酵母エキス、１％ＮａＣｌ（全て和光純薬工業株式会社））を用い、各々別々に３７℃にて８時間培養した。各々の培養液から２．５ｍＬ分を、アンピシリンを０．１ｇ／Ｌの濃度で含有する０．５Ｌの２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％乾燥酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）に接種し、３７℃にて培養を始めた。接種から２時間後に、終濃度０．１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトシド、和光純薬工業株式会社）を添加し、さらにＩＰＴＧ添加後１２時間培養した。培養終了後、各々の培養液を遠心にて集菌し、終濃度１ｍＭのＡＥＢＳＦ（４−（２−Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌＦｌｕｏｒｉｄｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ナカライテスク株式会社）、終濃度０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃＡｃｉｄ、和光純薬工業株式会社）、終濃度１ｍＭのＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、和光純薬工業株式会社）を含むＰＢＳ緩衝液（８ｇ／ＬＮａＣｌ、０．２ｇ／ＬＫＣｌ、１．１５ｇ／ＬＮａ_２ＨＰＯ_４、０．２ｇ／ＬＫＨ_２ＰＯ_４、和光純薬工業株式会社）２５ｍＬに、各々の集菌ペレットを再懸濁した。超音波破砕にて菌体を破砕し、各々の菌体破砕液を遠心分離にて上清画分と沈殿画分とに分画した（本操作は４℃にて行った）。 (Example 7)
Expression of each SpG polypeptide (GST fusion protein) DH5α cells into which pGEX-6P-1 containing any of the DNAs of SEQ ID NOs: 21 to 25 obtained in Examples 1 to 5 were introduced were treated with ampicillin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). LB medium (1% tryptone, 0.5% dry yeast extract, 1% NaCl (all Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) containing 37 g. The cells were cultured at 0 ° C. for 8 hours. 2.5 mL of each culture broth, 0.5 L of 2 × YT medium (1.6% tryptone, 1% dry yeast extract, 0.5% NaCl) containing ampicillin at a concentration of 0.1 g / L The culture was started at 37 ° C. Two hours after inoculation, IPTG (isopropyl 1-thio-β-D-galactoside, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to a final concentration of 0.1 mM, and further cultured for 12 hours after the addition of IPTG. After completion of the culture, each culture solution was collected by centrifugation, and the final concentration of 1 mM AEBSF (4- (2-Aminoethyl) benzenefluoride Hydrochloride, Nacalai Tesque, Inc.), final concentration of 0.5 mM EDTA (Ethylenediaminetic acid, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), PBS buffer (8 g / L NaCl, 0.2 g / L KCl, 1.15 g / L Na ₂ HPO ₄ ) containing DTT (Dithiothreitol, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with a final concentration of 1 mM. , 0.2 g / L KH ₂ PO ₄ , Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 25 mL, each collected pellet was resuspended. The microbial cells were crushed by ultrasonic pulverization, and each microbial cell lysate was fractionated into a supernatant fraction and a precipitate fraction by centrifugation (this operation was performed at 4 ° C.).

ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のマルチクローニングサイトに遺伝子を導入した大腸菌を培養し、ＩＰＴＧを添加して発現を誘導すると、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）がＮ末端に付与した融合蛋白質として発現される。したがって、配列番号２１〜２５のＤＮＡのいずれかを含むｐＧＥＸ−６Ｐ−１を導入した大腸菌から、配列１、２、３、５、６のいずれかのＳｐＧポリペプチドがＧＳＴ融合蛋白質として発現された。 When E. coli having the gene introduced into the multicloning site of pGEX-6P-1 is cultured and expression is induced by adding IPTG, GST (glutathione-S-transferase) is expressed as a fusion protein imparted to the N-terminus. Therefore, the SpG polypeptide of any one of sequences 1, 2, 3, 5, and 6 was expressed as a GST fusion protein from E. coli into which pGEX-6P-1 containing any of the DNAs of SEQ ID NOs: 21 to 25 was introduced. .

各々のＧＳＴが融合したＳｐＧポリペプチドが、ＩＰＴＧの誘導によって発現されたこと、および、菌体破砕液から遠心分離にて得られた上清画分に存在することを、ＳＤＳ電気泳動による分析で確認した。 Analysis by SDS electrophoresis shows that each GST-fused SpG polypeptide was expressed by induction of IPTG and present in the supernatant fraction obtained by centrifugation from the cell disruption solution. confirmed.

（実施例８）
各ＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドの精製
上記の通り、実施例７において、ＩＰＴＧにより誘導されたと考えられる各蛋白質は、配列番号１、２、３、５、６のいずれかのＳｐＧポリペプチドが、Ｎ末端側にＧＳＴが付与したＧＳＴ融合蛋白質として発現された。 (Example 8)
Purification of each GST-fused SpG polypeptide As described above, in Example 7, each protein considered to have been induced by IPTG is any one of the SpG polypeptides of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, and 6 at the N-terminus. It was expressed as a GST fusion protein with GST attached to the side.

実施例７で得られた各々の上清画分から、ＧＳＴアフィニティ・クロマトグラフィーによって、ＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドを精製した。ＰＢＳ緩衝液にて平衡化したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）に添加し、ＰＢＳ緩衝液にてカラムを洗浄、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭＧｌｕｔａｈｉｏｎｅ、ｐＨ８．０、全て和光純薬工業株式会社）にてＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドを溶出・分取した。溶出・分取した各々の蛋白質溶液を、ＰＢＳ緩衝液にて透析した。 From each supernatant fraction obtained in Example 7, GST-fused SpG polypeptide was purified by GST affinity chromatography. It is added to a Glutathione Sepharose Fast Flow column (GE Healthcare Biosciences) equilibrated with PBS buffer, and the column is washed with PBS buffer, followed by elution buffer (50 mM Tris-HCl, 20 mM Glutaione, GST-fused SpG polypeptide was eluted and collected at pH 8.0, all at Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Each protein solution eluted and collected was dialyzed against PBS buffer.

透析後に回収した各々の蛋白質溶液を、ＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、目的のＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドが高純度（９０％以上）で存在することを確認した。したがって、透析後に回収した各々の蛋白質溶液を、ＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドの精製サンプルとして、以後の実施例で用いた。 When each protein solution collected after dialysis was analyzed by SDS electrophoresis, it was confirmed that the target GST-fused SpG polypeptide was present in high purity (90% or more). Therefore, each protein solution collected after dialysis was used in subsequent examples as a purified sample of GST-fused SpG polypeptide.

（実施例９）
ポリペプチドの精製
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１マルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）でＧＳＴを切断することが可能な部位も導入された。これにより、導入したＤＮＡがコードするポリペプチドのみを得ることが可能だが、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼで切断後も、ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１側のプロテアーゼ認識サイトと制限酵素サイトに由来するアミノ酸配列が、Ｎ末端側に付与された形で残った。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに目的のポリペプチドをコードするＤＮＡをサブクローニングし、そのＤＮＡプラスミドを用いて形質転換した大腸菌で目的のポリペプチドをＧＳＴが融合した形で発現し、そのＧＳＴ融合ポリペプチドをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼで切断した場合、Ｎ末端側にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの配列が付与された形の、目的のポリペプチドが得られた。したがって、実施例１〜８で得られたいずれかのＧＳＴ融合ＳｐＧポリペプチドをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼで切断した場合、配列番号１、２、３、５、６のいずれかのアミノ酸配列のＮ末端側に、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの配列が付与したＳｐＧポリペプチドが得られた。本特許の実施例において用いられた、配列番号１、２、３、５、６に対応する各々のＳｐＧポリペプチドは、上記のように、Ｎ末端側に５残基からなるベクター由来のアミノ酸配列が付与したポリペプチドであった。 Example 9
Purification of polypeptide When a gene was introduced into the pGEX-6P-1 multicloning site, a site capable of cleaving GST with PreScission protease (GE Healthcare Biosciences) was also introduced. This makes it possible to obtain only the polypeptide encoded by the introduced DNA, but the amino acid sequence derived from the protease recognition site and the restriction enzyme site on the vector pGEX-6P-1 side is N-terminal after being cleaved by PreScission protease. Remained in the form given to the side. The DNA encoding the polypeptide of interest is subcloned at the BamHI / EcoRI site of pGEX-6P-1, and the polypeptide of interest is expressed in the form of fused GST in E. coli transformed with the DNA plasmid. When the fusion polypeptide was cleaved with PreScission protease, the target polypeptide in the form of the Gly-Pro-Leu-Gly-Ser sequence added to the N-terminal side was obtained. Therefore, when any of the GST-fused SpG polypeptides obtained in Examples 1 to 8 is cleaved with PreScission protease, on the N-terminal side of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, and 6, An SpG polypeptide provided with the sequence Gly-Pro-Leu-Gly-Ser was obtained. As described above, each SpG polypeptide corresponding to SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, and 6 used in the examples of this patent has an amino acid sequence derived from a vector having 5 residues on the N-terminal side. Was a polypeptide that was applied.

実施例８で得られた、透析後の各々の蛋白質溶液に、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼを、ＧＳＴ融合蛋白質１ｍｇあたり１Ｕｎｉｔ添加し、４℃にて１８時間インキュベートした。各々のプロテアーゼ反応溶液をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗカラムに添加し、素通り画分（正確には、２カラム分のＰＢＳ緩衝液で洗浄した画分も加えている）を回収した。回収した各々の素通り画分について、トリシン‐ＳＤＳ電気泳動にて分析したところ、各々のＳｐＧポリペプチドと考えられるバンドを確認した。したがって、この素通り画分を回収した各々のポリペプチド溶液を、ＳｐＧポリペプチドの精製サンプルとして、以後の実施例で用いた。 PreScission protease was added to each protein solution obtained in Example 8 after dialysis at 1 unit per mg of GST fusion protein and incubated at 4 ° C. for 18 hours. Each protease reaction solution was added to a Glutathione Sepharose Fast Flow column, and a flow-through fraction (accurately, a fraction washed with 2 columns of PBS buffer was also added) was collected. Each collected flow-through fraction was analyzed by Tricine-SDS electrophoresis. As a result, a band considered to be each SpG polypeptide was confirmed. Therefore, each polypeptide solution from which this flow-through fraction was collected was used in the following examples as a purified sample of SpG polypeptide.

（実施例１０）
ＢＩＡＣＯＲＥによるヒトＩｇＧ―Ｆａｂ断片抗体への結合能の検討
表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用した分析機器ＢＩＡＣＯＲＥ３０００（ビアコア株式会社、３３−１１４１４３８−３７１９）を用いて、取得した各々のＳｐＧポリペプチドのヒトＩｇＧ―Ｆａｂへの結合を測定した。ヒトＩｇＧ―ＦａｂをセンサーチップＣＭ５（ビアコア株式会社、ロット番号１１５０７５４）に固定し、ＳｐＧポリペプチドをチップ上に流し、固定化したヒトＩｇＧ―Ｆａｂへの結合・解離を観測する実験系で両者の解離定数Ｋ_Ｄ（Ｍ）を算出した。 (Example 10)
Examination of binding ability to human IgG-Fab fragment antibody by BIACORE Each SpG polypeptide obtained using analytical instrument BIACORE 3000 (Biacore, 33-11141438-3719) using surface plasmon resonance Binding to human IgG-Fab was measured. Human IgG-Fab was immobilized on sensor chip CM5 (Biacore Corp., Lot No. 1150754), SpG polypeptide was allowed to flow on the chip, and the binding and dissociation to the immobilized human IgG-Fab were observed. The dissociation constant K _D (M) was calculated.

ヒトＩｇＧ―ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、カップリング剤としてＮ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−（３−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ、ビアコア株式会社）およびＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ、ビアコア株式会社）を用い、およびブロッキング剤としてＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ビアコア株式会社）を用いて、添付のプロトコルに従い、アミンカップリング法で行った。ヒト血漿由来ＩｇＧ−Ｆａｂ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ、ロット番号１５１６７）を、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５、ビアコア株式会社）にて０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、注入量を適宜調整しながら、添付のプロトコルに従ってヒトＩｇＧ−Ｆａｂを固定化した。また、ヒト血清アルブミン（シグマアルドリッチ株式会社、ロット番号１７５４Ｂ）をＰＢＳ緩衝液にて１０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解し、さらに１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）にて１０００倍希釈し、注入量を適宜調整しながら、添付プロトコルに従ってヒト血清アルブミンを別のフローセルに固定化し、リファレンスセルとした。測定時のランニング緩衝液および試料の希釈液として、ＰＢＳ緩衝液に終濃度０．００５％となるようＰ−２０（ビアコア株式会社）を加えた緩衝液を用いた。配列番号１、２、３、４、５、６に対応する、各々のＳｐＧポリペプチドを、ランニング緩衝液で終濃度２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２０００ｎＭ、４０００ｎＭ、８０００ｎＭになるよう希釈調製した。配列番号１、２、３、５、６に対応するＳｐＧポリペプチドは、実施例１〜８で得られたＳｐＧポリペプチドの精製サンプルを用い、配列番号４に対応するＳｐＧポリペプチドは、特許文献３に開示された方法に従って調製されたＳｐＧポリペプチドの精製サンプル（凍結乾燥サンプル）を用いた。この特許文献３に開示された方法に従って調製されたＳｐＧポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列のＮ末端側にＭｅｔが、および、Ｃ末端側にＣｙｓが付与したポリペプチドとなっていた。 For immobilization of human IgG-Fab on the sensor chip CM5, N-ethyl-N- (3-diethylaminepropyl) carbodiimide (EDC, Biacore) and N-hydroxysuccinimide (NHS, Biacore) were used as coupling agents. , And Ethanolamine (Biacore Co., Ltd.) as a blocking agent, and an amine coupling method according to the attached protocol. While diluting human plasma-derived IgG-Fab (ROCKLAND, lot number 15167) to a concentration of 0.01 mg / mL with 10 mM acetate buffer (pH 4.5, Biacore), adjusting the injection volume as appropriate, Human IgG-Fab was immobilized according to the attached protocol. In addition, human serum albumin (Sigma Aldrich Co., Ltd., lot number 1754B) was dissolved in PBS buffer so as to be 10 mg / mL, and further diluted 1000 times with 10 mM acetate buffer (pH 4.5). The human serum albumin was immobilized on another flow cell in accordance with the attached protocol, and adjusted as a reference cell. As a running buffer and a sample diluent at the time of measurement, a buffer solution obtained by adding P-20 (Biacore Corp.) to a PBS buffer solution to a final concentration of 0.005% was used. Each SpG polypeptide corresponding to SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 was diluted with running buffer to a final concentration of 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM, and 8000 nM. SpG polypeptides corresponding to SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, and 6 were obtained by using purified SpG polypeptide samples obtained in Examples 1 to 8, and SpG polypeptides corresponding to SEQ ID NO: 4 A purified sample of SpG polypeptide (lyophilized sample) prepared according to the method disclosed in 3 was used. The SpG polypeptide prepared according to the method disclosed in Patent Document 3 was a polypeptide having Met attached to the N-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and Cys attached to the C-terminal side.

センサーチップＣＭ５上のヒトＩｇＧ−Ｆａｂおよびヒト血清アルブミンが固定化されているレーンに、各々の計６種類のＳｐＧポリペプチドを、上記の通り計６通りの濃度に調製したものを、それぞれ流速０．０２ｍＬ／分で２分間添加した。各々の測定は２５℃で行い、添加している２分間における結合反応曲線、および、添加後２分間における解離反応曲線を得た。解析ソフトＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ(ビアコア株式会社)を用いて、各々のＳｐＧポリペプチドの固定化ヒトＩｇＧ−Ｆａｂへの結合・解離反応曲線から固定化ヒト血漿アルブミン（リファレンス）への結合・解離反応曲線を差し引いた結合・解離反応曲線を対象に解析した。各々のＳｐＧポリペプチドと固定化ヒトＩｇＧ−Ｆａｂの解離定数Ｋ_Ｄ（Ｍ）は、解析ソフトＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ(ビアコア株式会社)を用いて、ＳｐＧポリペプチドの各々の濃度に対する平衡状態での結合レスポンス（平衡値）のプロットから解離定数Ｋ_Ｄ（Ｍ）を算出した。 In the lane where the human IgG-Fab and human serum albumin are immobilized on the sensor chip CM5, a total of 6 types of SpG polypeptides were prepared to a total of 6 concentrations as described above. Added at 02 mL / min for 2 minutes. Each measurement was performed at 25 ° C., and a binding reaction curve for 2 minutes during addition and a dissociation reaction curve for 2 minutes after addition were obtained. Using analysis software BIA evaluation (Biacore, Inc.), subtract the binding / dissociation reaction curve to immobilized human plasma albumin (reference) from the binding / dissociation reaction curve of each SpG polypeptide to immobilized human IgG-Fab. We analyzed the binding and dissociation reaction curves. The dissociation constant K _D (M) of each SpG polypeptide and immobilized human IgG-Fab was determined by using the analysis software BIA evaluation (Biacore Corp.) and the binding response in equilibrium for each concentration of SpG polypeptide ( The dissociation constant K _D (M) was calculated from the plot of (equilibrium value).

センサーチップＣＭ５に固定したＩｇＧ−Ｆａｂと配列番号３で示されるＳｐＧポリペプチドとの結合・解離反応曲線を図１に示した。図中の横軸は通液時間（秒）、縦軸は共鳴強度（ＲＵ）を示す。各々の結合・解離反応曲線について、図中下部より上部に向かってそれぞれ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２０００ｎＭ、４０００ｎＭ、８０００ｎＭの配列番号３で示されるＳｐＧポリペプチドを流した時の反応曲線を示す。 A binding / dissociation reaction curve between the IgG-Fab immobilized on the sensor chip CM5 and the SpG polypeptide represented by SEQ ID NO: 3 is shown in FIG. In the figure, the horizontal axis represents liquid passing time (seconds), and the vertical axis represents resonance intensity (RU). About each binding / dissociation reaction curve, the reaction curve when SpG polypeptide shown by sequence number 3 of 250 nM, 500 nM, 1000 nM, 2000 nM, 4000 nM, and 8000 nM is made to flow from the lower part to the upper part in the figure is shown.

（表１）配列番号１〜４で示されるポリペプチドおよび２種の野生型ＳｐＧｂとＩｇＧ−Ｆａｂの解離定数 (Table 1) Dissociation constants of polypeptides shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 and two types of wild-type SpGb and IgG-Fab

（実施例１１）
ＳｐＧポリペプチドの水不溶性担体への固定化
ＳｐＧポリペプチドをリガンドとして固定化した担体のＩｇＧ−Ｆａｂ吸着能を検証するため、配列番号４で示されるＳｐＧポリペプチドを固定化した担体を作製した。ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０２６７８６において開示される、水不溶性担体にエポキシ基を導入し、そのエポキシ基の開環・酸化反応によりアルデヒド基を生成させて得られた担体にリガンドを固定化する方法によって、本ＳｐＧポリペプチド固定化担体を作製した。 (Example 11)
Immobilization of SpG polypeptide on water-insoluble carrier In order to verify the IgG-Fab adsorption ability of the carrier immobilized with the SpG polypeptide as a ligand, a carrier on which the SpG polypeptide represented by SEQ ID NO: 4 was immobilized was prepared. According to the method disclosed in PCT application WO 96/026786, an epoxy group is introduced into a water-insoluble carrier and an aldehyde group is generated by ring-opening / oxidation reaction of the epoxy group to immobilize the ligand on the carrier. An SpG polypeptide-immobilized carrier was prepared.

セルロース系多孔質硬質ゲルであるＣＫＡ（チッソ株式会社、ロット番号０４０２２０−５）６０ｍＬ（自然沈降体積）に水２４．６ｍＬ、４ＮＮａＯＨ（和光純薬株式会社）３３．６ｍＬを加え４０℃で３０分加温した後、エピクロロヒドリン（和光純薬株式会社）３３ｍＬを加え４０℃で２時間攪拌し、エポキシ化反応を行った。反応後、担体の４０倍量の水で洗浄した。 24.6 mL of water and 33.6 mL of 4N NaOH (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are added to 60 mL (natural sedimentation volume) of CKA (Chisso Corporation, lot number 040220-5), which is a cellulose-based porous hard gel, and 30 at 40 ° C. After partial heating, 33 mL of epichlorohydrin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and stirred at 40 ° C. for 2 hours to carry out an epoxidation reaction. After the reaction, it was washed with 40 times the amount of water as the carrier.

次にエポキシ化担体４４ｍＬ(自然沈降体積)を０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（和光純薬株式会社）で置換した。配列番号４に対応するＳｐＧポリペプチド４４０ｍｇをゲルと等量の０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液に溶解し、上記のゲルに加えて４０℃で８時間攪拌した。反応後、２０倍量の水で洗浄し、反応前後の上清をＨＣｌ（和光純薬株式会社）で中和した。 Next, 44 mL (natural sedimentation volume) of the epoxidized carrier was replaced with 0.5 M sodium hydrogen carbonate buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). 440 mg of SpG polypeptide corresponding to SEQ ID NO: 4 was dissolved in 0.5 M sodium bicarbonate buffer equivalent to the gel, added to the above gel, and stirred at 40 ° C. for 8 hours. After the reaction, it was washed with 20 times the amount of water, and the supernatant before and after the reaction was neutralized with HCl (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

（実施例１２）
ＳｐＧポリペプチド固定化担体のＩｇＧ−Ｆａｂアフィニティ・カラムクロマト実験
実施例１０で得た、配列番号４で示されるＳｐＧポリペプチドを固定化した担体がＩｇＧ−Ｆａｂに対してアフィニティ・カラムの様相を示すことを確認するため、以下に示す条件で評価を行った。 (Example 12)
IgG-Fab affinity column chromatography of SpG polypeptide-immobilized carrier The carrier immobilized with the SpG polypeptide shown in SEQ ID NO: 4 obtained in Example 10 shows an affinity column aspect for IgG-Fab. In order to confirm this, the evaluation was performed under the following conditions.

カラム中での担体の高さが約５ｃｍとなるよう、配列番号４で示されるＳｐＧポリペプチドを固定化したＣＫＡ担体、および、固定化を施していないＣＫＡ担体を、内径１ｃｍの空カラムに流し入れ、脱泡水で４００ｃｍ／ｈで１時間通液した。さらに、結合用緩衝液（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）４０ｍＬで、各々のカラムを平衡化した。通液するＩｇＧ−Ｆａｂは、ヒト免疫グロブリン製剤であるガンマガード（バクスター株式会社、ロット番号ＪＫ１０９Ｔ）から、非特許文献３に開示される方法にて調製した。なお、パパイン消化には、調製したＩｇＧ−Ｆａｂにパパインが混入しないよう、パパインが固定化されたゲルである、ＰａｐａｉｎＡｇａｒｏｓｅ（シグマアルドリッチ株式会社、ロット番号０９４Ｋ７０１７）を使用した。また、パパイン消化後の副産物であるＩｇＧ−Ｆｃを除くために、ＩｇＧ−Ｆｃを吸着するｒＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社、ロット番号３１１２７２）も精製に利用した。精製したＩｇＧ−Ｆａｂを結合用緩衝液で１ｍｇ／ｍＬに希釈したもの２０ｍＬ分を、各々のカラムに通液した。ＩｇＧ−Ｆａｂ通液後、各々のカラムを１２０ｍＬの結合用緩衝液で洗浄し、８０ｍＬの溶出用緩衝液（０．０５Ｍリン酸ナトリウム、０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、０．３ＭＮａＣｌ、ｐＨ３．０、和光純薬工業株式会社）で溶出した。さらに、４０ｍＬの結合用緩衝液で再平衡化した。溶出した画分の回収に利用した試験管には、あらかじめ２２．５％量の１．０ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を中和液として投入した。一連の工程において、カラム通過後の溶液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定した。さらに、２８０ｎｍにおいて高い吸光度を示した画分に、ＩｇＧ−Ｆａｂが含まれているかどうか、ＳＤＳ電気泳動によって確認した。 The CKA carrier to which the SpG polypeptide represented by SEQ ID NO: 4 is immobilized and the CKA carrier that has not been immobilized are poured into an empty column having an inner diameter of 1 cm so that the height of the carrier in the column is about 5 cm. Then, it was passed for 1 hour at 400 cm / h with defoamed water. In addition, each column was equilibrated with 40 mL of binding buffer (0.02 M sodium phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.4). The IgG-Fab to be passed was prepared by a method disclosed in Non-Patent Document 3 from Gamma Guard (Baxter Co., Ltd., lot number JK109T) which is a human immunoglobulin preparation. For papain digestion, Papain Agarose (Sigma Aldrich Co., Ltd., lot number 094K7017), a gel in which papain was immobilized, was used so that papain was not mixed into the prepared IgG-Fab. In addition, rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Bioscience Co., Ltd., lot number 311272) that adsorbs IgG-Fc was also used for purification in order to remove IgG-Fc, a by-product after papain digestion. 20 mL of purified IgG-Fab diluted to 1 mg / mL with binding buffer was passed through each column. After passing IgG-Fab, each column was washed with 120 mL of binding buffer, and 80 mL of elution buffer (0.05 M sodium phosphate, 0.05 M sodium citrate, 0.3 M NaCl, pH 3.0). , Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Furthermore, it was re-equilibrated with 40 mL of binding buffer. The test tube used for collecting the eluted fraction was previously charged with 22.5% of 1.0M Tris-HCl, pH 8.0 as a neutralizing solution. In a series of steps, the absorbance at 280 nm of the solution after passing through the column was measured. Furthermore, it was confirmed by SDS electrophoresis whether IgG-Fab was contained in the fraction showing high absorbance at 280 nm.

配列番号４で示されるＳｐＧポリペプチドを担持させたＣＫＡ担体および何も固定化していないＣＫＡ担体を用いて、ＩｇＧ−Ｆａｂをアフィニティ・クロマトグラフィー精製した際の吸着解離プロフィール図を図２に示した。図中の横軸は通算通液量（ｍＬ）、縦軸は波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を示す。ＣＫＡ−Ｓｅｑ−４は配列番号４で示されるＳｐＧポリペプチドを担持させたＣＫＡ担体を、ＣＫＡは何も固定化していないＣＫＡ担体をそれぞれ示す。 FIG. 2 shows an adsorption dissociation profile when IgG-Fab is purified by affinity chromatography using a CKA carrier carrying SpG polypeptide represented by SEQ ID NO: 4 and a CKA carrier on which nothing is immobilized. . In the figure, the horizontal axis represents the total liquid flow rate (mL), and the vertical axis represents the absorbance (Absorbance) at a wavelength of 280 nm. CKA-Seq-4 represents a CKA carrier carrying the SpG polypeptide represented by SEQ ID NO: 4, and CKA represents a CKA carrier on which nothing is immobilized.

配列番号３で示されるポリペプチドとＩｇＧの結合反応曲線Binding reaction curve of polypeptide shown in SEQ ID NO: 3 and IgG 配列番号４で示されるポリペプチドを担持させたＣＫＡ担体を用いて、ＩｇＧ−Ｆａｂをアフィニティ・クロマトグラフィー精製した際の吸着解離プロフィールAdsorption / dissociation profile when IgG-Fab is purified by affinity chromatography using CKA carrier carrying the polypeptide represented by SEQ ID NO: 4

Claims

Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.

Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.

Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.

Polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.

The polypeptide according to claim 1, characterized in that immobilized on a water-insoluble carrier, adsorbent material.

6. The adsorbing material according to claim 5 , which can adsorb any one of an antibody, an antibody derivative, a fragment antibody and a fragment antibody derivative.

The adsorbing material according to claim 6 , wherein the adsorbing material can adsorb any one of IgG antibody, IgG antibody derivative, IgG-Fab fragment antibody and IgG-Fab fragment antibody derivative.

The adsorbing material according to claim 7 , wherein the adsorbing material can adsorb any one of human IgG antibody, human IgG antibody derivative, human IgG-Fab fragment antibody and human IgG-Fab fragment antibody derivative.

A method for separating and purifying any of an antibody, an antibody derivative, a fragment antibody and a fragment antibody derivative, wherein the adsorbent material according to claim 6 is used.

A method for separating and purifying any of an IgG antibody, an IgG antibody derivative, an IgG-Fab fragment antibody, and an IgG-Fab fragment antibody derivative, wherein the adsorbing material according to claim 7 is used.

A method for separating and purifying any one of a human IgG antibody, a human IgG antibody derivative, a human IgG-Fab fragment antibody, and a human IgG-Fab fragment antibody derivative, wherein the adsorbing material according to claim 8 is used.

DNA encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 4 .

A vector comprising the DNA according to claim 12 .

A transformant transformed with the vector according to claim 13 .

The method for producing a polypeptide according to any one of claims 1 to 4 , wherein the transformant according to claim 14 is used.