JP5212371B2 - Method for producing peptide - Google Patents
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Classifications
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- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
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- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
Description
本発明は、ペプチドの液相合成法、特にワンポット合成可能な方法に関する。 The present invention relates to a liquid phase synthesis method for peptides, and more particularly to a method capable of one-pot synthesis.
ペプチドの有機化学的合成法は、Ｎ−保護アミノ酸とＣ−保護ペプチド（ジペプチド形成反応時には、Ｃ−保護アミノ酸）とのカップリング反応とそれに引き続くＮ末端脱保護反応とからなるペプチド伸長反応の繰り返しから構成され、Ｃ−保護ペプチド（またはＣ−保護アミノ酸）の態様により固相法と液相法が挙げられる。 The peptide organic chemical synthesis method is a repetition of a peptide extension reaction comprising a coupling reaction between an N-protected amino acid and a C-protected peptide (C-protected amino acid at the time of dipeptide formation reaction), followed by an N-terminal deprotection reaction. The solid phase method and the liquid phase method can be mentioned depending on the mode of the C-protected peptide (or C-protected amino acid).
固相法では、ペプチド（またはアミノ酸）のＣ末端を固体支持体に結合した状態でペプチド伸長を行ない、最終段階で目的のペプチドは固体から切り離される。したがって，過剰または未反応により残留した試薬や副生成物は固体支持体の洗浄により容易に淘汰することができる。しかしながら、反応が固体表面に限定されるためスケールアップや反応性などに課題がある。 In the solid phase method, peptide elongation is performed with the C-terminus of the peptide (or amino acid) bound to a solid support, and the target peptide is cleaved from the solid at the final stage. Therefore, reagents and by-products remaining due to excess or unreacted can be easily removed by washing the solid support. However, since the reaction is limited to the solid surface, there are problems in scale-up and reactivity.
それに対して、液相法はスケールアップが容易であり、反応性も相対的に良好となるため、ペプチド医薬品などの工業的製造に利用されている。しかし液相法は、カップリング反応および脱保護の各工程において、残留試薬や副生成物を除去するために結晶化などの単離操作が必要であり、製造工程が複雑化し、製造期間が増大するという問題があった。
かかる状況から、液相法の各工程において種々の手段で残留試薬や副生成物を淘汰し、結晶化などの単離操作をすることなく次工程のペプチド伸長反応を行うことによって、ワンポットで目的とするペプチドまで合成する試みがなされている。On the other hand, the liquid phase method is easy to scale up and has relatively good reactivity, and thus is used for industrial production of peptide drugs and the like. However, the liquid phase method requires an isolation operation such as crystallization in order to remove residual reagents and by-products in each step of the coupling reaction and deprotection, which complicates the manufacturing process and increases the manufacturing period. There was a problem to do.
From such a situation, in each step of the liquid phase method, residual reagents and by-products are trapped by various means, and the peptide elongation reaction of the next step is performed without performing an isolation operation such as crystallization. Attempts have been made to synthesize even a peptide.
非特許文献１および２では、カップリング反応の後に希塩酸および炭酸ナトリウム水溶液による洗浄、および脱保護の後に炭酸ナトリウム水溶液および中性水溶液による洗浄を行うことにより、酸性および塩基性の残留試薬や副生成物を淘汰する方法が記載されている。しかしこの方法では、中性残留物であるＮ−保護アミノ酸活性エステルを淘汰することが出来ず、それが次工程以降で不純物ペプチド副成の原因となってしまうという問題がある。 In Non-Patent Documents 1 and 2, acidic and basic residual reagents and by-products are obtained by performing washing with dilute hydrochloric acid and aqueous sodium carbonate after the coupling reaction, and washing with aqueous sodium carbonate and neutral aqueous solution after deprotection. A method of hesitating things is described. However, in this method, there is a problem that the N-protected amino acid active ester which is a neutral residue cannot be removed, which causes an impurity peptide by-product in the subsequent steps.
特許文献１および非特許文献３には、Ｎ−Ｚアミノ酸やＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸を用いてカップリング反応を行い、反応混合物中に残留するＮ−保護アミノ酸活性エステルをβ−アラニンエステル（ベンジルエステルまたはフルオレニルメチルエステル）でクエンチングさせ、次いでＮ−末端保護基の脱保護反応を行うことにより、クエンチングにより生成したＮ−保護アミノ酸−β−アラニンエステルのＺ基又はＦｍｏｃ基などのＮ−保護基、およびベンジル又はフルオレニルメチルなどのカルボン酸保護基を同時に脱保護して水溶性物質に導いて水層に淘汰する方法が記載されている。この方法では、脱保護した後でなければ淘汰性のある水溶性物質には導くことはできず、脱保護させた後に塩基性の高い炭酸ナトリウム水溶液で洗浄して、淘汰している。しかしながら、炭酸ナトリウム水溶液など比較的塩基性の強い条件で処理すると、ペプチドのＣ末端、又はＣ末端より２番目のアミノ酸残基がプロリンのペプチドである場合には、ジケトピペラジン環が生成する副反応が進行したり、Ｃ末端保護基がメチルエステル、エチルエステルなどである場合は加水分解を受けたり、あるいはＣ末端がシステインの場合はエピメリ化しやすいなど、好ましくない副反応が生じるという問題があった。 In Patent Document 1 and Non-Patent Document 3, a coupling reaction is performed using an NZ amino acid or an N-Fmoc amino acid, and an N-protected amino acid active ester remaining in the reaction mixture is converted to a β-alanine ester (benzyl ester or N-terminal amino acid-β-alanine ester such as Z group or Fmoc group produced by quenching is then quenched with fluorenylmethyl ester) followed by deprotection of the N-terminal protecting group. A method is described in which a protecting group and a carboxylic acid protecting group such as benzyl or fluorenylmethyl are simultaneously deprotected and led to a water-soluble substance and poured into an aqueous layer. In this method, it is not possible to lead to a water-soluble substance having a fertility unless it has been deprotected, and after deprotecting, it is washed with a highly basic aqueous sodium carbonate solution. However, when treated under relatively basic conditions such as an aqueous sodium carbonate solution, if the C-terminal of the peptide or the second amino acid residue from the C-terminal is a proline peptide, a diketopiperazine ring is formed. When the reaction proceeds, when the C-terminal protecting group is methyl ester, ethyl ester or the like, hydrolysis occurs, or when the C-terminal is cysteine, epimerization tends to occur, which causes undesirable side reactions. It was.
非特許文献４には、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルをカップリング反応で用い、残留したＮ−Ｂｏｃアミノ酸活性ペンタフルオロフェニルエステルをＮ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミド（ＤＭＰＤＡ）などのポリアミンとカップリングさせて塩基性物質に導いた後に酸性水溶液洗浄で水層に淘汰する方法が記載されている。この方法では、Ｂｏｃ基をトリフルオロ酢酸などの強酸で脱保護した後、使用した酸を除くため炭酸ナトリウム水溶液などで洗浄する必要があり、塩基処理における上記と同様の問題がある。 In Non-Patent Document 4, N-Boc amino acid pentafluorophenyl ester is used in a coupling reaction, and the remaining N-Boc amino acid active pentafluorophenyl ester is used as N, N-dimethylpropane-1,3-diamide (DMPDA). A method is described in which an aqueous solution is washed with an acidic aqueous solution after being coupled with a polyamine and led to a basic substance. In this method, after deprotecting the Boc group with a strong acid such as trifluoroacetic acid, it is necessary to wash with a sodium carbonate aqueous solution or the like in order to remove the used acid, and there is a problem similar to the above in the base treatment.
また、Ｎ末端保護基としてＺ基（ベンジルオキシカルボニル）を使用した場合も、脱保護での接触還元反応が酸性条件下で行われ、後処理で塩基を用いて酸を中和する必要があるため、塩基処理における上記と同様の問題がある。
本発明の目的は、Ｂｏｃ−ＮＨ基又はＺ−ＮＨ基の脱保護を含むペプチドの液相合成法において、工業的製造に適したペプチドの液相合成法、特にワンポット合成を可能とする方法を提供することである。 It is an object of the present invention to provide a liquid phase synthesis method of peptides suitable for industrial production, particularly a method enabling one-pot synthesis, in a liquid phase synthesis method of peptides including deprotection of a Boc-NH group or a Z-NH group. Is to provide.
本発明者は上記課題を解決するため、特にＣ末端付近にプロリン残基やシステイン残基を有したり、Ｃ末端保護基がメチルエステル、エチルエステルの場合のペプチド合成において問題となる副反応を回避すべく鋭意検討した結果、意外なことに、脱保護の後、反応混合物のｐＨを一定範囲に制御するという簡便な操作により、脱保護で用いた酸を除去し、又、ジケトピペラジン生成などの副反応を回避し、かつ目的のＣ−保護ペプチドを効率よく抽出できることを見出した。かかる知見に基づき、従来、ワンポット合成が困難であったこのようなペプチドに本法を適用したところ、ワンポットで高収率に合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下に示される内容を包含する。
［１］液相合成法によるペプチドの製造方法において、
（Ｉ）Ｂｏｃ−ＮＨ基を含むペプチドを酸と反応させることにより脱保護した後、または（ＩＩ）Ｚ−ＮＨ基を含むペプチドを酸性条件下で接触還元に付すことにより脱保護した後に、
反応混合物のｐＨを４〜７に調整する工程を含むことを特徴とする方法。
［２］ｐＨを５〜６に調整する、上記［１］に記載の方法。
［３］ペプチドのＣ末端アミノ酸残基がプロリンもしくはシステイン、および／またはＣ末端から２番目のアミノ酸残基がプロリンである、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］ペプチドのＣ末端がメチルエステル又はエチルエステルで保護されている、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］（１）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸またはＮ−Ｚアミノ酸と、縮合剤の存在下縮合させる工程、および／または
（２）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｚアミノ酸活性エステルと縮合させる工程
を含む、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］上記［５］の（１）の縮合工程において、活性化剤をさらに存在させる、上記［５］記載の方法。
［７］上記［５］記載の縮合工程の後、反応混合物を酸性水溶液洗浄および／または塩基性水溶液洗浄する工程をさらに含む、上記［５］または［６］記載の方法。
［８］上記［５］記載の縮合工程の後、反応混合物をクエンチ剤で処理する、上記［５］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］クエンチ剤がＤＭＰＤＡである、上記［８］記載の方法。
［１０］上記［１］記載の工程で得られた中間体ペプチドを固体として単離せずに上記［５］記載の工程に供することを含む、上記［５］〜［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］ワンポット合成で行う、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。In order to solve the above-mentioned problems, the present inventor has a side reaction which has a problem in peptide synthesis particularly when it has a proline residue or a cysteine residue near the C-terminal, or when the C-terminal protecting group is methyl ester or ethyl ester. As a result of diligent studies to avoid it, surprisingly, after deprotection, the acid used in the deprotection is removed by a simple operation of controlling the pH of the reaction mixture within a certain range, and diketopiperazine formation The present inventors have found that the desired C-protected peptide can be efficiently extracted while avoiding such side reactions. Based on this finding, when this method was applied to such a peptide that was conventionally difficult to synthesize in one pot, it was found that it could be synthesized in one pot with a high yield, and the present invention was completed.
That is, the present invention includes the following contents.
[1] In a method for producing a peptide by a liquid phase synthesis method,
After deprotecting (I) a peptide containing a Boc-NH group by reacting with an acid, or (II) deprotecting a peptide containing a Z-NH group by subjecting it to catalytic reduction under acidic conditions,
Adjusting the pH of the reaction mixture to 4-7.
[2] The method according to [1] above, wherein the pH is adjusted to 5-6.
[3] The method according to [1] or [2] above, wherein the C-terminal amino acid residue of the peptide is proline or cysteine, and / or the second amino acid residue from the C-terminal is proline.
[4] The method according to any one of [1] to [3] above, wherein the C-terminus of the peptide is protected with a methyl ester or an ethyl ester.
[5] (1) a step of condensing a C-protected peptide or C-protected amino acid with an N-Boc amino acid or NZ amino acid in the presence of a condensing agent, and / or (2) a C-protected peptide or C- The method according to any one of [1] to [4] above, comprising a step of condensing a protected amino acid with an N-Boc amino acid active ester or an NZ amino acid active ester.
[6] The method according to [5] above, wherein an activator is further present in the condensation step of (1) in [5] above.
[7] The method according to [5] or [6] above, further comprising a step of washing the reaction mixture with an acidic aqueous solution and / or a basic aqueous solution after the condensation step according to [5].
[8] The method according to any one of [5] to [7] above, wherein the reaction mixture is treated with a quenching agent after the condensation step according to [5].
[9] The method of the above-mentioned [8], wherein the quenching agent is DMPDA.
[10] Any one of [5] to [9] above, comprising subjecting the intermediate peptide obtained in the step [1] above to the step [5] above without being isolated as a solid. The method described in 1.
[11] The method according to any one of [1] to [10], which is carried out by one-pot synthesis.
本発明によれば、Ｂｏｃ−ＮＨ基又はＺ−ＮＨ基の脱保護を含むペプチドの液相合成法において、工業的製造に適したペプチドの液相合成法が提供される。特に従来ワンポット合成が困難であったＣ末端またはＣ末端から２番目のアミノ酸残基がプロリンであるペプチド、Ｃ末端保護基がメチルエステル、エチルエステルであるペプチド、Ｃ末端アミノ酸がシステインであるペプチドをワンポットで合成できる方法が提供される。
本発明の方法は、Ｎ末端保護基としてＢｏｃ、Ｃ末端保護基としてメチルエステルなどの安価かつ脱保護が容易な保護基のみにてペプチド合成を行いうるので、接触還元によるベンジルの脱保護が困難である含硫アミノ酸を含むペプチドのワンポット合成に好適に適用できる。ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the liquid phase synthesis method of the peptide suitable for industrial manufacture is provided in the liquid phase synthesis method of the peptide including deprotection of Boc-NH group or Z-NH group. In particular, a peptide in which the C-terminal or the second amino acid residue from the C-terminal is proline, a peptide in which the C-terminal protecting group is a methyl ester or an ethyl ester, and a peptide in which the C-terminal amino acid is a cysteine, which has conventionally been difficult to synthesize in one pot A method is provided that can be synthesized in one pot.
In the method of the present invention, peptide synthesis can be performed only with an inexpensive and easy deprotecting group such as Boc as the N-terminal protecting group and methyl ester as the C-terminal protecting group, so that it is difficult to deprotect benzyl by catalytic reduction. It can be suitably applied to one-pot synthesis of peptides containing sulfur-containing amino acids.
本明細書において使用される記号、略号の意味を以下に示す。
（１）Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
（２）Ｚ：ベンジルオキシカルボニル
（３）Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
（４）Ｂｓｍｏｃ：１，１−ジオキソベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメトキシカルボニル
（５）Ａｌｌｏｃ：アリルオキシカルボニル
（６）Ａｃ：アセチル
（７）Ｍｅ：メチル
（８）Ｅｔ：エチル
（９）ｉＰｒ：イソプロピル
（１０）ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
（１１）Ｂｚｌ：ベンジル
（１２）Ｔｒｔ：トリチル
（１３）Ｆｍ：９−フルオレニルメチル
（１４）ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（１５）ＨＯＣｔ：６−クロロ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（１６）ＨＯＡｔ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
（１７）ＨＯＯＢｔ：３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１．２．３−ベンゾトリアジン
（１８）ＨＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
（１９）ＨＯＰｈｔ：Ｎ−ヒドロキシフタルイミド
（２０）ＨＯＮｂ：Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
（２１）Ｂｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール−１−イル
（２２）Ｃｔ：１−ヒドロキシ−６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル
（２３）Ａｔ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル
（２４）ＯＢｔ：３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１．２．３−ベンゾトリアジン−３−イル
（２５）Ｓｕ：スクシンイミドイル
（２６）Ｐｈｔ：フタルイミドイル
（２７）Ｎｂ：５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドイル
（２８）ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
（２９）ＥＤＣ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド
（３０）ＥＤＣ．ＨＣｌ：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩
（３１）ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
（３２）ＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス(ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３３）ＰｙＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３４）ＰｙＢｒｏＰ：ブロモトリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３５）ＨＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３６）ＨＣＴＵ：Ｏ−（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３７）ＴＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート
（３８）ＨＡＴＵ：Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート
（３９）ＣＤＩ：カルボニルジイミダゾール
（４０）ＤＭＴ−ＭＭ：４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホニウム クロリド
（４１）ＡＡｎ：アミノ酸残基（下付のｎは１以上の任意の整数であり、ペプチドＣ末端からの順番を示す。）
（４２）ＰＧ０：ペプチドのＣ末端カルボキシル基の保護基
（４３）ＰＧｎ：アミノ基の保護基（下付のｎは１以上の任意の整数であり、ＡＡｎのアミノ基の保護基であることを示す。）
（４４）ＨＯＥ：活性化剤
（４５）Ｅ：活性エステル基
（４６）Ｇｌｙ：グリシン
（４７）Ａｌａ：アラニン
（４８）Ｖａｌ：バリン
（４９）Ｌｅｕ：ロイシン
（５０）Ｉｌｅ：イソロイシン
（５１）Ｍｅｔ：メチオニン
（５２）Ｐｈｅ：フェニルアラニン
（５３）Ｔｙｒ：チロシン
（５４）Ｔｒｐ：トリプトファン
（５５）Ｈｉｓ：ヒスチジン
（５６）Ｌｙｓ：リジン
（５７）Ａｒｇ：アルギニン
（５８）Ｓｅｒ：セリン
（５９）Ｔｈｒ：トレオニン
（６０）Ａｓｐ：アスパラギン酸
（６１）Ｇｌｕ：グルタミン酸
（６２）Ａｓｎ：アスパラギン
（６３）Ｇｌｎ：グルタミン
（６４）Ｃｙｓ：システイン
（６５）Ｐｒｏ：プロリン
（６６）Ｏｒｎ：オルニチン
（６７）Ｓａｒ：サルコシン
（６８）β−Ａｌａ：β−アラニン
（６９）ＧＡＢＡ：γ−アミノ酪酸
（７０）Ｐａｌ：３−ピリジルアラニン
（７１）Ｃｐａ：４−クロロフェニルアラニン
（７２）Ｎａｌ：２−ナフチルアラニン
（７３）ＤＭＰＤＡ：Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミンThe meanings of symbols and abbreviations used in this specification are shown below.
(1) Boc: tert-butoxycarbonyl (2) Z: benzyloxycarbonyl (3) Fmoc: 9-fluorenylmethoxycarbonyl (4) Bsmoc: 1,1-dioxobenzo [b] thiophen-2-ylmethoxycarbonyl ( 5) Alloc: allyloxycarbonyl (6) Ac: acetyl (7) Me: methyl (8) Et: ethyl (9) iPr: isopropyl (10) tBu: tert-butyl (11) Bzl: benzyl (12) Trt: Trityl (13) Fm: 9-fluorenylmethyl (14) HOBt: 1-hydroxybenzotriazole (15) HOCt: 6-chloro-1-hydroxybenzotriazole (16) HOAt: 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (17) HOOBt: 3-hydroxy-3,4-di Dro-4-oxo-1.2.3-benzotriazine (18) HOSu: N-hydroxysuccinimide (19) HOPht: N-hydroxyphthalimide (20) HONb: N-hydroxy-5-norbornene-2,3-di Carboximide (21) Bt: 1-hydroxybenzotriazol-1-yl (22) Ct: 1-hydroxy-6-chlorobenzotriazol-1-yl (23) At: 1-hydroxy-7-azabenzotriazole-1 -Yl (24) OBt: 3,4-dihydro-4-oxo-1.2.3-benzotriazin-3-yl (25) Su: succinimidyl (26) Pht: phthalimidoyl (27) Nb: 5- Norbornene-2,3-dicarboximidoyl (28) DCC: N, N′-dicyclohexylcarbodi Bromide (29) EDC: N- (3- dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide (30) EDC. HCl: N- (3-dimethylaminopropyl) -N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (31) DIC: N, N′-diisopropylcarbodiimide (32) BOP: (benzotriazol-1-yloxy) tris (dimethylamino) phosphonium Hexafluorophosphate (33) PyBOP: (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate (34) PyBroP: Bromotripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (35) HBTU: O- (benzotriazol-1-yl ) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (36) HCTU: O- (6-chlorobenzotriazol-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyl Uronium heki Fluorophosphate (37) TBTU: O- (benzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N′-tetramethyluronium tetrafluoroborate (38) HATU: O- (7-azabenzotriazole-1 -Yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (39) CDI: carbonyldiimidazole (40) DMT-MM: 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5 -Triazin-2-yl) -4-methylmorphonium chloride (41) AA n : amino acid residue (subscript n is an arbitrary integer of 1 or more and indicates the order from the peptide C-terminus)
(42) PG 0 : protective group for the C-terminal carboxyl group of the peptide (43) PG n : protective group for the amino group (subscript n is an integer of 1 or more, and is a protective group for the amino group of AA n It shows that there is.)
(44) HOE: activator (45) E: active ester group (46) Gly: glycine (47) Ala: alanine (48) Val: valine (49) Leu: leucine (50) Ile: isoleucine (51) Met : Methionine (52) Phe: Phenylalanine (53) Tyr: Tyrosine (54) Trp: Tryptophan (55) His: Histidine (56) Lys: Lysine (57) Arg: Arginine (58) Ser: Serine (59) Thr: Threonine (60) Asp: Aspartic acid (61) Glu: Glutamic acid (62) Asn: Asparagine (63) Gln: Glutamine (64) Cys: Cysteine (65) Pro: Proline (66) Orn: Ornithine (67) Sar: Sarcosine ( 68) β-Ala: β-alanine (69) GABA : Γ-aminobutyric acid (70) Pal: 3-pyridylalanine (71) Cpa: 4-chlorophenylalanine (72) Nal: 2-naphthylalanine (73) DMPDA: N, N-dimethylpropane-1,3-diamine
ＰＧ０で示されるＣ末端カルボキシル基の保護基としては、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉＰｒ、ｔＢｕなどのアルキル基、Ｂｚｌ、Ｆｍ、Ｔｒｔ、ジフェニルメチル、１，１−ジメチルベンジル等のアラルキル基、ジメチルフェニル等が挙げられる。
ＰＧｎで示されるアミノ基の保護基としては、Ｂｏｃ、Ｚ、Ｆｍｏｃ、Ｂｓｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、Ａｃ等が挙げられる。
Ｅで示される活性エステル基とは、アミノ基による求核攻撃を受けて「ＥＯ−」として容易に脱離し、アミド結合を生成させうる基を意味し、Ｂｔ、Ｃｔ，Ａｔ、ＯＢｔ、Ｓｕ、Ｐｈｔ、Ｎｂ、ペンタフルオロフェニル等が挙げられる。Examples of the protecting group for the C-terminal carboxyl group represented by PG 0 include alkyl groups such as Me, Et, iPr and tBu, aralkyl groups such as Bzl, Fm, Trt, diphenylmethyl and 1,1-dimethylbenzyl, dimethylphenyl and the like Is mentioned.
As the amino-protecting group represented by PG n, Boc, Z, Fmoc , Bsmoc, Alloc, Ac , and the like.
The active ester group represented by E means a group that can be easily eliminated as “EO − ” upon nucleophilic attack by an amino group to form an amide bond, and includes Bt, Ct, At, OBt, Su, Pht, Nb, pentafluorophenyl and the like can be mentioned.
本明細書においてアミノ酸を「Ｈ−ＡＡ−ＯＨ」と表示した場合は、左側がアミノ基、右側がカルボキシル基であることを意味し、アミノ基およびカルボキシル基がそれぞれ保護されていないことを意味する。
この場合において、例えば、カルボキシル基が保護されている場合は、「Ｈ−ＡＡ−ＯＰＧ０」と表示され、アミノ基が保護されている場合は、「ＰＧｎ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。
アミノ基が保護されたアミノ酸のカルボキシル基が活性エステル化されている場合は、「ＰＧｎ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。
ＰＧｎ−ＡＡ−ＯＨの対称酸無水物は、「（ＰＧｎ−ＡＡ）２−Ｏ」と表示される。
アミノ酸が側鎖官能基を有する場合に、該官能基が保護されている場合は、「Ｈ−ＡＡ（ＰＧ）−ＯＨ」（ＰＧは側鎖官能基の保護基を示す）と表示される。In the present specification, when the amino acid is represented as “H-AA-OH”, it means that the left side is an amino group and the right side is a carboxyl group, and that the amino group and the carboxyl group are not protected respectively. .
In this case, for example, when the carboxyl group is protected, “H-AA-OPG 0 ” is displayed, and when the amino group is protected, “PG n -AA-OH” is displayed. .
When the carboxyl group of the amino acid in which the amino group is protected is active esterified, “PG n -AA-OE” is displayed.
Symmetric acid anhydride of PG n -AA-OH is displayed as "(PG n -AA) 2 -O".
When an amino acid has a side chain functional group, when the functional group is protected, “H-AA (PG) —OH” (PG represents a protecting group for the side chain functional group) is displayed.
本明細書においてペプチドを「Ｈ−ＡＡｎ’−ＡＡｎ’−１−・・・−ＡＡ１−ＯＨ」（下付けのｎ’は２以上の任意の整数を示す。）と表示した場合は、左側がＮ末端、右側がＣ末端であり、Ｎ末端およびＣ末端がそれぞれ保護されていないアミノ酸残基をｎ’個有するペプチドであることを意味する。ここで、Ｎ末端とはアミノ酸残基のα位アミノ基に限定されず、ペプチド伸長が側鎖アミノ基（例えば、Ｌｙｓのεアミノ基）を介して行われる場合は、当該側鎖アミノ基もＮ末端に含まれる。以下、同様。
この場合において、例えば、Ｃ末端が保護されている場合は、「Ｈ−ＡＡｎ’−ＡＡｎ’−１−・・・−ＡＡ１−ＯＰＧ０」と表示し、さらにＮ末端が保護されている場合は、「ＰＧｎ’−ＡＡｎ’−ＡＡｎ’−１−・・・−ＡＡ１−ＯＰＧ０」と表示するものとする。In the present specification, when a peptide is represented as “H-AA n ′ -AA n′-1 −... -AA 1 -OH” ( subscript n ′ represents an arbitrary integer of 2 or more) This means that the left side is the N-terminus, the right side is the C-terminus, and the N-terminus and C-terminus are peptides each having n ′ amino acid residues that are not protected. Here, the N-terminus is not limited to the α-position amino group of the amino acid residue, and when peptide elongation is performed via a side chain amino group (for example, the ε amino group of Lys), the side chain amino group is also Included at the N-terminus. The same applies hereinafter.
In this case, for example, when the C-terminal is protected, “H-AA n ′ -AA n′-1-... -AA 1 -OPG 0 ” is displayed, and the N-terminal is further protected. If it is, “PG n ′ -AA n ′ -AA n′-1-... -AA 1 -OPG 0 ” is displayed.
本発明方法により合成されるペプチドの構成単位となるアミノ酸残基としては、天然アミノ酸または非天然アミノ酸が特に限定されることなく含まれ、また、それらのＬ体あるいはラセミ体も包含される。
天然アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｏｒｎ、Ｓａｒ、β−Ａｌａ、ＧＡＢＡ等が挙げられる。
非天然アミノ酸としては、上記の天然アミノ酸のＤ体、Ｐａｌ、Ｎａｌ、Ｃｐａ等が挙げられる。
また、当該アミノ酸が側鎖に官能基を有する場合に、該官能基を保護基により保護したアミノ酸とすることもできる。かかる側鎖保護アミノ酸としては、例えば、Ｇｌｕのγ位又はＡｓｐのβ位のカルボキシル基をベンジル基で保護したγ-Ｂｚｌ−Ｇｌｕ又はβ−Ｂｚｌ−Ａｓｐ；、Ｇｌｕのγ位又はＡｓｐのβ位のカルボキシル基をｔｅｒｔ−ブチル基で保護したγ−ｔＢｕ−Ｇｌｕ又はβ−ｔＢｕ−Ａｓｐ；Ｌｙｓのεアミノ基を保護したε−Ｚ−Ｌｙｓ、ε−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ、ε−ｉＰｒ−ε−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ；ＣｙｓのＳＨ基をフェニルカルバモイル基で保護したＳ−フェニルカルバモイル−Ｃｙｓ；ＣｙｓのＳＨ基をトリチル基で保護したＳ−Ｔｒｔ−Ｃｙｓ；Ｔｙｒ及びＳｅｒの水酸基の酸素をＢｚｌで保護した誘導体等が挙げられる。The amino acid residue that is a structural unit of the peptide synthesized by the method of the present invention includes natural amino acids or non-natural amino acids without particular limitation, and also includes L-forms or racemates thereof.
Natural amino acids include Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, Cys, Met, Phe, Tyr, Trp, His, Pro, Orn, Sar, β -Ala, GABA, etc. are mentioned.
Examples of non-natural amino acids include D-forms of the above natural amino acids, Pal, Nal, Cpa and the like.
Moreover, when the said amino acid has a functional group in a side chain, it can also be set as the amino acid which protected this functional group with the protective group. Examples of such side chain-protected amino acids include γ-Bzl-Glu or β-Bzl-Asp in which the carboxyl group at the γ position of Glu or the β position of Asp is protected with a benzyl group; the γ position of Glu or the β position of Asp Γ-tBu-Glu or β-tBu-Asp in which the carboxyl group of γ is protected with tert-butyl group; ε-Z-Lys, ε-Boc-Lys, ε-iPr-ε-Boc in which the ε amino group of Lys is protected -Lys; S-phenylcarbamoyl-Cys in which the SH group of Cys is protected with a phenylcarbamoyl group; S-Trt-Cys in which the SH group of Cys is protected with a trityl group; Derivatives in which the hydroxyl group of Tyr and Ser is protected with Bzl Etc.
本発明において「Ｂｏｃ−ＮＨ基を含むペプチド」とは、該ペプチドが有するアミノ基の一つ以上がＢｏｃで保護されたペプチドを意味し、該アミノ基はＮ末端アミノ基であってもよいし、側鎖のアミノ基であってもよい。
本発明において「Ｚ−ＮＨ基を含むペプチド」とは、該ペプチドが有するアミノ基の一つ以上がＺで保護されたペプチドを意味し、該アミノ基はＮ末端アミノ基であってもよいし、側鎖のアミノ基であってもよい。
「Ｂｏｃ−ＮＨ基を含むペプチド」または「Ｚ−ＮＨ基を含むペプチド」の脱保護は、ペプチドの液相合成法に含まれるアミノ基の脱保護であれば、特に限定されない。例えば、後掲のＮ末端脱保護工程であってもよいし、最終脱保護における側鎖アミノ基の脱保護であってもよい。好ましくは、後掲のペプチド伸長反応において、次工程のカップリングの対象となるアミノ基を生成させる脱保護である。In the present invention, the “peptide containing Boc-NH group” means a peptide in which one or more amino groups of the peptide are protected with Boc, and the amino group may be an N-terminal amino group. It may be a side chain amino group.
In the present invention, the “peptide containing a Z—NH group” means a peptide in which one or more amino groups of the peptide are protected with Z, and the amino group may be an N-terminal amino group. It may be a side chain amino group.
The deprotection of “peptide containing Boc-NH group” or “peptide containing Z-NH group” is not particularly limited as long as it is a deprotection of an amino group included in a liquid phase synthesis method of a peptide. For example, the N-terminal deprotection step described later may be used, or the side chain amino group may be deprotected in the final deprotection. Preferably, it is deprotection that generates an amino group to be coupled in the next step in the peptide elongation reaction described later.
本発明において「Ｎ−保護アミノ酸」とは、アミノ基が保護されており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「ＰＧｎ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。
本発明において「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル」とは、アミノ基が保護され、カルボキシル基がＥにより活性エステル化されたアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「ＰＧｎ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。
なお、Ｎ−保護アミノ酸活性エステルとして単離可能なものは、Ｅがペンタフルオロフェニル、ＳｕまたはＮｂであるものであり、その他のＮ−保護アミノ酸活性エステルは、Ｎ−保護アミノ酸を縮合剤（例えば、ＥＤＣ）および活性化剤（例えば、ＨＯＢｔ）と反応させることにより、反応系中で生成される。In the present invention, the “N-protected amino acid” means an amino acid in which the amino group is protected and the carboxyl group is unprotected, and is expressed as “PG n -AA-OH” according to the above notation. .
In the present invention, “N-protected amino acid active ester” means an amino acid whose amino group is protected and whose carboxyl group is active esterified with E. According to the above notation, “PG n -AA-OE” Is displayed.
In addition, what can be isolated as an N-protected amino acid active ester is one in which E is pentafluorophenyl, Su or Nb. , EDC) and an activator (eg, HOBt).
本発明において「Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸」とは、アミノ基がＢｏｃで保護されており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｂｏｃ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。
本発明において「Ｎ−Ｚアミノ酸」とは、アミノ基がＺで保護されており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｚ−ＡＡ−ＯＨ」と表示される。
本発明において、例えば、「（Ｂｏｃ ｏｒ Ｚ）−ＡＡ−ＯＨ」と表示した場合は、アミノ基がＢｏｃまたはＺで保護されており、カルボキシル基が無保護のアミノ酸を意味する。
本発明において「Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステル」とは、アミノ基がＢｏｃで保護され、カルボキシル基がＥにより活性エステル化された任意のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｂｏｃ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。
本発明において「Ｎ−Ｚアミノ酸活性エステル」とは、アミノ基がＺで保護され、カルボキシル基がＥにより活性エステル化された任意のアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｚ−ＡＡ−ＯＥ」と表示される。
本発明において、例えば、「（Ｂｏｃ ｏｒ Ｚ）−ＡＡ−ＯＥ」と表示した場合は、アミノ基がＢｏｃまたはＺで保護されており、カルボキシル基が活性エステル化されているアミノ酸を意味する。
Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｚアミノ酸活性エステルとして単離可能なものは、Ｅがペンタフルオロフェニル、ＳｕまたはＮｂであるものであり、その他のＮ−保護アミノ酸活性エステルは、Ｎ−保護アミノ酸を縮合剤（例えば、ＥＤＣ）および活性化剤（例えば、ＨＯＢｔ）と反応させることにより、反応系中で生成される。In the present invention, “N-Boc amino acid” means an amino acid whose amino group is protected with Boc and whose carboxyl group is unprotected. According to the above notation, “N-Boc amino acid” is expressed as “Boc-AA-OH”. The
In the present invention, “NZ amino acid” means an amino acid in which the amino group is protected with Z and the carboxyl group is unprotected. According to the above notation, “Z-AA-OH” is indicated. The
In the present invention, for example, “(Boc or Z) -AA-OH” means an amino acid in which the amino group is protected with Boc or Z and the carboxyl group is unprotected.
In the present invention, “N-Boc amino acid active ester” means any amino acid in which an amino group is protected with Boc and a carboxyl group is active esterified with E. According to the above notation, “Boc-AA” -OE "is displayed.
In the present invention, “NZ amino acid active ester” means any amino acid in which the amino group is protected with Z and the carboxyl group is active esterified with E. According to the above notation, “Z-AA” -OE "is displayed.
In the present invention, for example, “(Boc or Z) -AA-OE” means an amino acid in which the amino group is protected with Boc or Z and the carboxyl group is active esterified.
N-Boc amino acid active ester or NZ amino acid active ester that can be isolated is that in which E is pentafluorophenyl, Su or Nb, and other N-protected amino acid active esters are N-protected amino acids Is reacted with a condensing agent (eg, EDC) and an activator (eg, HOBt) in the reaction system.
本発明において「Ｃ−保護ペプチド」とは、Ｃ末端が保護されており、Ｎ末端が保護されていない任意の個数のアミノ酸残基を有するペプチドを意味し、上記表記法によれば、「Ｈ−ＡＡｎ’−ＡＡｎ’−１−・・・−ＡＡ１−ＯＰＧ０」（ｎ’は２以上の整数を示す）と表示される。
本発明において「Ｃ−保護アミノ酸」とは、カルボキシル基が保護されており、アミノ基が保護されていないアミノ酸を意味し、上記表記法によれば、「Ｈ−ＡＡ１−ＯＰＧ０」と表示される。
本発明において「Ｎ，Ｃ−ジ保護ペプチド」とは、Ｎ末端とＣ末端の両方が保護されている任意の個数のアミノ酸残基を有するペプチドを意味し、上記表記法によれば、「ＰＧｎ’−ＡＡｎ’−ＡＡｎ’−１−・・・−ＡＡ１−ＯＰＧ０」（ｎ’は２以上の整数を示す）と表示される。また、例えば、Ｎ末端がＢｏｃで保護されていて、Ｃ末端がＥｔで保護されているＮ，Ｃ−ジ保護ペプチドは「Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃ−Ｅｔペプチド」と表示するものとする。
本発明において「中間体ペプチド」とは、ペプチド液相合成における各工程で得られる合成中間体であるペプチドであって、最終的に目的とするペプチドよりアミノ酸残基数が少ないものを意味する。好ましい中間体ペプチドは、後掲のＮ末端脱保護後に得られるＣ−保護ペプチドである。In the present invention, “C-protected peptide” means a peptide having an arbitrary number of amino acid residues in which the C-terminal is protected and the N-terminal is not protected. -AA n '-AA n'-1 - ··· -AA 1 -OPG 0 "(n' is an integer of 2 or more) is displayed.
In the present invention, “C-protected amino acid” means an amino acid in which a carboxyl group is protected and an amino group is not protected. According to the above notation, “H-AA 1 -OPG 0 ” is displayed. Is done.
In the present invention, “N, C-diprotected peptide” means a peptide having an arbitrary number of amino acid residues in which both the N-terminus and the C-terminus are protected. n '-AA n' -AA n'- 1 - ··· -AA 1 -OPG 0 "(n 'is an integer of 2 or more) is displayed. In addition, for example, an N, C-diprotected peptide whose N-terminus is protected with Boc and whose C-terminus is protected with Et is denoted as “N-Boc-C-Et peptide”.
In the present invention, the “intermediate peptide” means a peptide that is a synthetic intermediate obtained in each step of peptide liquid phase synthesis, and finally has fewer amino acid residues than the target peptide. Preferred intermediate peptides are C-protected peptides obtained after N-terminal deprotection as described below.
本発明において「縮合剤」としては、ＤＣＣ、ＥＤＣ（塩酸塩およびフリー体を含む。）、ＤＩＣ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒｏＰ、ＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＣＤＩ、ＤＭＴ−ＭＭ等が挙げられる。
本発明において「活性化剤」とは、縮合剤との共存化でカルボキシル基を活性エステル、対称酸無水物などに導いてアミド結合を形成させやすくする試薬であり、「ＨＯＥ」で示される。具体的には、ＨＯＢｔ、ＨＯＣｔ、ＨＯＡｔ、ＨＯＯＢｔ、ＨＯＳｕ、ＨＯＰｈｔ、ＨＯＮｂ、ペンタフルオロフェノール等が挙げられる。In the present invention, examples of the “condensing agent” include DCC, EDC (including hydrochloride and free form), DIC, BOP, PyBOP, PyBroP, HBTU, HCTU, TBTU, HATU, CDI, DMT-MM and the like.
In the present invention, the “activator” is a reagent that facilitates formation of an amide bond by introducing a carboxyl group to an active ester, a symmetric acid anhydride, etc. by coexistence with a condensing agent, and is indicated by “HOE”. Specific examples include HOBt, HOCt, HOAt, HOOBt, HOSu, HOPht, HONb, and pentafluorophenol.
本発明において「クエンチ剤」とは、Ｎ−保護アミノ酸活性エステル、Ｎ−保護アミノ酸のアシルイソウレア、Ｎ−保護アミノ酸の対称酸無水物などのアミン成分と縮合しうる反応混合物中の残留物や副生成物（以下、本明細書において「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等」と総称する。）と反応して、塩基性、酸性または水溶性のＮ−保護アミノ酸誘導体に変換させ、酸性洗浄、塩基性洗浄または水洗によって該誘導体を容易に水層に移行させうる試薬または当該「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等」と反応して捕捉する樹脂などを意味し、例えば、ＤＭＰＤＡ、ジエチルプロパンジアミン、プロパンジアミン、エチレンジアミン、プトレッシン、アミノメチルピリジンなどの多価アミン類、Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノメチルポリスチレンなどの固体に担持された求核性除去剤、β−Ａｌａエステル（例えば、β−Ａｌａ−ＯＢｚｌ、β−Ａｌａ−ＯＦｍ等）等が挙げられる。Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等と多価アミン類との反応により、Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等を塩基性のＮ−保護アミノ酸アミド誘導体に導くことができ、これを酸性水溶液洗浄で水層に淘汰することができる。
Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等とβ−Ａｌａエステルとの反応により、Ｎ−保護アミノ酸−β−Ａｌａエステルに導き、さらにこれを脱保護することにより酸性の（Ｎ−保護）アミノ酸−β−Ａｌａ誘導体に導くことができる。これは、塩基性水溶液洗浄で水層に淘汰することができる。
Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等を固体に担持された求核性除去剤と反応させることにより、Ｎ−保護アミノ酸と固体の間にアミド結合が形成され、Ｎ−保護アミノ酸を固体表面上に捕捉することができる。In the present invention, the “quenching agent” means a residue in a reaction mixture that can be condensed with an amine component such as an N-protected amino acid active ester, an acylisourea of an N-protected amino acid, a symmetric acid anhydride of an N-protected amino acid, It reacts with a by-product (hereinafter collectively referred to as “N-protected amino acid active ester and the like” in the present specification) to be converted into a basic, acidic or water-soluble N-protected amino acid derivative, and an acidic wash, a base Means a reagent that can easily transfer the derivative to an aqueous layer by water washing or water washing, or a resin that reacts with and captures the “N-protected amino acid active ester etc.”, such as DMPDA, diethylpropanediamine, propanediamine, etc. , Polyamines such as ethylenediamine, putrescine, aminomethylpyridine, N- (2-aminoethyl) -aminomethylpoly Solid supported on the nucleophilic scavengers, such as styrene, beta-Ala ester (e.g., β-Ala-OBzl, β-Ala-OFm etc.) and the like. By reacting an N-protected amino acid active ester or the like with a polyvalent amine, the N-protected amino acid active ester or the like can be led to a basic N-protected amino acid amide derivative, which is washed into an aqueous layer by washing with an acidic aqueous solution. can do.
By reacting an N-protected amino acid active ester or the like with a β-Ala ester, it leads to an N-protected amino acid-β-Ala ester, which is further deprotected to give an acidic (N-protected) amino acid-β-Ala derivative. Can lead to. This can be drowned into the aqueous layer with a basic aqueous solution wash.
By reacting an N-protected amino acid active ester or the like with a nucleophilic removal agent supported on a solid, an amide bond is formed between the N-protected amino acid and the solid, and the N-protected amino acid is captured on the solid surface. be able to.
本発明において「ワンポット合成」とは、ペプチドの液相合成法において、各工程で得られる中間体ペプチドを反応容器から取り出さずに目的とするペプチドまで合成することを意味する。 In the present invention, “one-pot synthesis” means that in the liquid phase synthesis method of peptides, the intermediate peptide obtained in each step is synthesized up to the target peptide without taking it out of the reaction vessel.
本発明の方法により最終的に合成されるペプチドは特に限定されるものはないが、合成医薬ペプチド、化粧品、電子材料（有機ＥＬなど）、食品などの合成に好適に利用可能である。
該ペプチドの構成アミノ酸残基数は特に限定されないが、一般的な合成ペプチドにみられる３〜１５個程度が好適である。
また、本発明の方法は、ジケトピペラジン副成の問題があるＣ末端、またはＣ末端から２番目のアミノ酸残基がプロリンである場合や、エピメリ化の問題があるシステインがＣ末端に位置する場合、又、Ｃ末端保護基がメチルエステル、エチルエステルの場合に適している。Although the peptide finally synthesize | combined by the method of this invention is not specifically limited, It can utilize suitably for the synthesis | combination of a synthetic pharmaceutical peptide, cosmetics, electronic materials (organic EL etc.), foodstuffs, etc.
The number of amino acid residues constituting the peptide is not particularly limited, but about 3 to 15 found in general synthetic peptides is preferable.
In addition, the method of the present invention is such that the C-terminal having a diketopiperazine by-product problem or the second amino acid residue from the C-terminal is proline, or the cysteine having a problem of epimerization is located at the C-terminal. In addition, it is also suitable when the C-terminal protecting group is a methyl ester or an ethyl ester.
本発明は、ペプチドの液相合成法に適用されるものである。ここで、「ペプチドの液相合成法」とは、固相法ではないことを意味し、全ての試薬が溶媒に溶解している場合の他、試薬の全部または一部が溶媒に溶解せず、懸濁などしているいわゆる不均一反応も本発明の方法に含まれる。 The present invention is applied to a liquid phase synthesis method of peptides. Here, “liquid phase synthesis method of peptide” means that it is not a solid phase method. In addition to the case where all reagents are dissolved in a solvent, all or part of the reagents are not dissolved in the solvent. So-called heterogeneous reactions such as suspension are also included in the method of the present invention.
本発明のペプチドの液相合成法は、ペプチド合成化学で常用される一般的な方法を特に制限なく採用することができる。
具体的には、下記スキームに示す方法、すなわち、
（１）Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ’）（ｎ’は、２以上の任意の整数を示し、アミノ酸残基がｎ’個のペプチドであることを意味する。以下、同様。）または一回目のペプチド伸長においてはＣ−保護アミノ酸（Ａ１）（以下、本明細書において「Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等」（ｎは、１以上の任意の整数を示し、ｎが１の場合は、Ｃ−保護アミノ酸（Ａ１）を意味する。以下、同様。）と総称する。）を、Ｎ−保護アミノ酸（ＰＡｎ＋１）と、縮合剤（および好ましくは活性化剤）の存在下、縮合させるか、あるいは
（２）Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等を、Ｎ−保護アミノ酸活性エステル（ＰＡＥｎ＋１）と縮合させて、
アミノ酸残基が一つ伸長したＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（ＰＰｎ＋１）を得る工程（以下、本明細書においてそれぞれ「カップリング工程（１）」および「カップリング工程（２）」という。）、
得られたＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（ＰＰｎ＋１）のアミノ保護基を脱保護してＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）を得る工程（以下、本明細書において「Ｎ末端脱保護工程」という。）を１サイクルとする反応（以下、本明細書において「ペプチド伸長反応」という。）の繰り返しからなる方法であり、
最終段階で、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｍ）のカルボキシ保護基および側鎖官能基が保護されている場合は当該保護基を脱保護することにより（以下、本明細書において「最終脱保護工程」という。）、目的のペプチド（Ｐ）が得られる。
本発明のペプチド合成法において、ｎ番目のペプチド伸長反応を「ペプチド伸長反応（ｎ）」、ペプチド伸長反応（ｎ）を構成する各工程をそれぞれ「カップリング工程（１−ｎ）」、「カップリング工程（２−ｎ）」および「Ｎ末端脱保護工程（ｎ）」と表示するものとする。For the liquid phase synthesis method of the peptide of the present invention, a general method commonly used in peptide synthesis chemistry can be employed without any particular limitation.
Specifically, the method shown in the following scheme, that is,
(1) C-protected peptide (P n ′ ) (n ′ represents any integer of 2 or more, meaning that the amino acid residue is n ′ peptides. The same applies hereinafter) or the first time. In the peptide extension of C-protected amino acid (A 1 ) (hereinafter referred to as “C-protected peptide (P n ) etc. in the present specification” (where n represents an integer of 1 or more and n is 1) , C-protected amino acid (A 1 ), hereinafter the same))) in the presence of an N-protected amino acid (PA n + 1 ) and a condensing agent (and preferably an activator). Or (2) condensing a C-protected peptide (P n ) or the like with an N-protected amino acid active ester (PAE n + 1 ),
A step of obtaining an N, C-diprotected peptide (PP n + 1 ) in which one amino acid residue is extended (hereinafter referred to as “coupling step (1)” and “coupling step (2)”, respectively, in this specification). ,
The step of deprotecting the amino protecting group of the obtained N, C-diprotected peptide (PP n + 1 ) to obtain a C-protected peptide (P n + 1 ) (hereinafter referred to as “N-terminal deprotection step” in the present specification). ) In one cycle (hereinafter referred to as “peptide extension reaction” in the present specification).
In the final stage, when the carboxy protecting group and the side chain functional group of the C-protected peptide (P m ) are protected, the protecting group is deprotected (hereinafter referred to as “final deprotecting step” in the present specification). The desired peptide (P) is obtained.
In the peptide synthesis method of the present invention, the nth peptide extension reaction is referred to as “peptide extension reaction (n)”, and the steps constituting the peptide extension reaction (n) are referred to as “coupling step (1-n)” and “cup”, respectively. “Ring step (2-n)” and “N-terminal deprotection step (n)” shall be indicated.
（式中、ｍは目的とするペプチドのアミノ酸残基数を示し、他の記号は上記で定義した通りである。）
本発明は、一連のペプチド伸長反応の少なくとも一回で、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸またはＮ−Ｚアミノ酸を使用してカップリング工程（１）を行うか、またはＮ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｚアミノ酸活性エステルを使用してカップリング工程（２）を行い、続くＮ末端脱保護工程で
（Ｉ）Ｂｏｃ基を酸と反応させることにより脱保護した後（以下、本明細書において「Ｎ末端脱保護工程（Ｉ）」といい、ペプチド伸長反応（ｎ）においては「Ｎ末端脱保護工程（Ｉ−ｎ）」と表示する。）、または
（ＩＩ）Ｚ基を酸性条件下で接触還元に付すことにより脱保護した後（以下、本明細書において「Ｎ末端脱保護工程（ＩＩ）」といい、ペプチド伸長反応（ｎ）においては「Ｎ末端脱保護工程（ＩＩ−ｎ）」と表示する。）
のワークアップにおいて、反応混合物のｐＨを４〜７に調整する工程を含むことを特徴とする（以下、「本発明のペプチド伸長反応」といい、ｎ回目のペプチド伸長反応においては「本発明のペプチド伸長反応（ｎ）」と表示する。）。
本発明のペプチド合成において、少なくとも１回、本発明のペプチド伸長反応が含まれていればよいが、全ての工程を本発明のペプチド伸長反応で行うことが好ましく、それにより目的のペプチドまでワンポットで合成することができる。
以下に、本発明のペプチド伸長反応（ｎ）のスキームを示す。(In the formula, m represents the number of amino acid residues of the target peptide, and other symbols are as defined above.)
The present invention performs coupling step (1) using N-Boc amino acid or NZ amino acid at least once in a series of peptide extension reactions, or N-Boc amino acid active ester or NZ amino acid. After performing the coupling step (2) using an active ester and deprotecting by reacting the Boc group with an acid in the subsequent N-terminal deprotection step (hereinafter referred to as “N-terminal deprotection” in this specification). Step (I) ”, which is indicated as“ N-terminal deprotection step (In) ”in the peptide extension reaction (n)), or (II) subjecting the Z group to catalytic reduction under acidic conditions (Hereinafter referred to as “N-terminal deprotection step (II)” in the present specification, and “N-terminal deprotection step (II-n)” in the peptide extension reaction (n)).
In the workup of (2), the step of adjusting the pH of the reaction mixture to 4 to 7 (hereinafter referred to as “the peptide elongation reaction of the present invention”), Peptide elongation reaction (n) ").
In the peptide synthesis of the present invention, it is sufficient that the peptide extension reaction of the present invention is included at least once. However, it is preferable that all steps are performed by the peptide extension reaction of the present invention, so that the target peptide can be obtained in one pot. Can be synthesized.
The scheme of the peptide extension reaction (n) of the present invention is shown below.
（式中、各記号は上記で定義した通りである。）
Ｂｏｃ基またはＺ基のＮ末端脱保護工程のワークアップで、反応混合物のｐＨを４〜７という範囲に調整することにより、意外なことに塩基性にしなくとも酸を効率的に除去でき、さらに意外なことには反応混合物のｐＨが酸性域にあるにも係わらず遊離アミノ基を有するＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）を効率よく抽出できることが見出された。このような弱酸性条件でワークアップが可能となることにより、ジケトピペラジン生成、エステル加水分解、エピメリ化などの副反応を回避し、洗浄のみで残留物などを淘汰することができるので、単離操作をすることなく得られたＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）を次のペプチド伸長反応に供することができ、ワンポット合成に繋げることができる。(In the formula, each symbol is as defined above.)
By adjusting the pH of the reaction mixture to a range of 4-7 in the workup of the N-terminal deprotection step of the Boc group or Z group, the acid can be removed efficiently without being made basic, Surprisingly, it has been found that a C-protected peptide having a free amino group (P n + 1 ) can be efficiently extracted even though the pH of the reaction mixture is in the acidic range. By enabling work-up under such weakly acidic conditions, side reactions such as diketopiperazine formation, ester hydrolysis, and epimerization can be avoided, and residues can be removed only by washing. The C-protected peptide (P n + 1 ) obtained without performing the separation operation can be subjected to the next peptide extension reaction, which can lead to one-pot synthesis.
この場合、ｐＨが４より低いと酸が除去されにくく、またＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）が水層に淘汰されてしまう虞がある。また、ｐＨが７より高いと、ジケトピペラジン生成、エステル加水分解、エピメリ化などの副反応が進行してしまう虞がある。かかるｐＨの範囲内であれば如何なる値も採用されうるが、より好ましくはｐＨ５〜６であり、ｐＨ５．５が特に好ましい。In this case, if the pH is lower than 4, the acid is difficult to remove, and the C-protected peptide (P n + 1 ) may be trapped in the aqueous layer. Moreover, when pH is higher than 7, there exists a possibility that side reactions, such as diketopiperazine production | generation, ester hydrolysis, and epimerization, may advance. Any value can be adopted as long as it is within this pH range, but it is more preferably pH 5-6, and particularly preferably pH 5.5.
なお、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ６４， ｐ． ４３２５−４３３８, １９９９およびＯｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｖｏｌ． ７， ｐ． ２８−３７， ２００７には、Ｎ−Ｆｍｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｂｓｍｏｃアミノ酸活性エステルを用いてカップリング工程を行い、続くＮ末端脱保護工程において４−（アミノメチル）ピペラジン（４−ＡＭＰ）、トリス（２−アミノエチル）アミン（ＴＡＥＡ）などの多価アミン類を用いることにより副成するジベンゾフルベンなどを塩基性誘導体に導いた後に、当該誘導体を水層に淘汰するために反応混合物をｐＨ５．５に調整していることが記載されている。しかし、上記文献はＦｍｏｃまたはＢｓｍｏｃの脱保護後の処理であり、本発明とは構成を異にし、また、脱保護の結果副成するジベンゾフルベン誘導体などを除去することを目的としており、本発明とは趣旨が全く異なる。さらには、上記文献は、脱保護後に反応混合物を塩基性から弱酸性に調整するものであり、酸性領域から弱酸性に調整することにより作用効果を奏する本発明の方法を示唆するものではない。 In addition, Journal of Organic Chemistry, vol. 64, p. 4325-4338, 1999 and Organic Process Research & Development, vol. 7, p. 28-37, 2007, a coupling step is performed using N-Fmoc amino acid active ester or N-Bsmoc amino acid active ester, and 4- (aminomethyl) piperazine (4-AMP), After introducing dibenzofulvene or the like, which is a by-product by using a polyvalent amine such as tris (2-aminoethyl) amine (TAEA), to a basic derivative, the reaction mixture is adjusted to pH 5 in order to place the derivative in an aqueous layer. .5 is described as adjusting. However, the above document is a treatment after deprotection of Fmoc or Bsmoc, which is different from the present invention and aims to remove dibenzofulvene derivatives and the like which are formed as a result of deprotection. Is completely different in purpose. Furthermore, the above-mentioned document adjusts the reaction mixture from basic to weakly acidic after deprotection, and does not suggest the method of the present invention that exhibits an effect by adjusting from acidic region to weakly acidic.
以下に、本発明のペプチド伸長反応について説明する。
１．カップリング工程
１−１．カップリング工程（１）
本発明のペプチド伸長反応のカップリング工程（１）においては、例えば、溶媒中において、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸またはＮ−Ｚアミノ酸（以下、本明細書において「Ｎ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）」と総称する。）、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等および縮合剤を（好ましくは、活性化剤と共に）混合することによって一つアミノ酸残基が伸長したＮ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチドまたはＮ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（以下、本明細書において「Ｎ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）」と総称する。）が得られる。添加順序は特に限定はないが、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等が一つ前のペプチド伸長反応（ｎ−１）によって得られたものである場合は、反応容器中のＣ−保護ペプチド（Ｐｎ）等の溶液にＮ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）および縮合剤を添加すればよい。Hereinafter, the peptide elongation reaction of the present invention will be described.
1. Coupling step 1-1. Coupling process (1)
In the coupling step (1) of the peptide extension reaction of the present invention, for example, in a solvent, an N-Boc amino acid or an NZ amino acid (hereinafter referred to as “N-protected amino acid (B / Z-A n + 1)” is used. N-Boc-C-protected peptide in which one amino acid residue has been extended by mixing a C-protected peptide (P n ) and the like and a condensing agent (preferably with an activator). Alternatively, an NZC-protected peptide (hereinafter collectively referred to as “N, C-diprotected peptide (B / ZPn + 1 )” in the present specification) is obtained. The order of addition is not particularly limited, but when the C-protected peptide (P n ) or the like is obtained by the previous peptide extension reaction (n-1), the C-protected peptide ( An N-protected amino acid (B / Z-A n + 1 ) and a condensing agent may be added to a solution such as P n ).
Ｎ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等に対して、通常０．９〜２．０当量、好ましくは１．０〜１．５当量である。この範囲より少ないと、未反応のＣ−保護ペプチド（Ｐｎ）等が残りやすく、多いと過剰のＮ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）を除去しにくくなる。The amount of N-protected amino acid (B / Z-A n + 1 ) used is usually 0.9 to 2.0 equivalents, preferably 1.0 to 1.5 equivalents, relative to the C-protected peptide (P n ) and the like. It is. When the amount is less than this range, unreacted C-protected peptide (P n ) or the like tends to remain, and when the amount is larger, excess N-protected amino acid (B / Z-A n + 1 ) is difficult to remove.
Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等を酸付加塩として使用した場合には中和するため、塩基が添加される。該塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリンなどが挙げられる。該塩基の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等に対して、通常０．８〜２．０当量、好ましくは１．０〜１．５当量である。塩基の使用量がこの範囲より少ないと中和が不十分となり反応が進行しにくくなり、多い場合はジケトピペラジン生成やエピメリ化などの副反応が進行する虞がある。When C-protected peptide (P n ) or the like is used as an acid addition salt, a base is added to neutralize it. Examples of the base include triethylamine, diisopropylethylamine, pyridine, N-methylmorpholine and the like. The usage-amount of this base is 0.8-2.0 equivalent normally with respect to C-protection peptide ( Pn ) etc., Preferably it is 1.0-1.5 equivalent. If the amount of the base used is less than this range, neutralization becomes insufficient and the reaction does not proceed easily. If it is large, side reactions such as diketopiperazine formation and epimerization may proceed.
縮合剤は上記で例示したものを特に制限なく使用することができ、ＥＤＣ（フリー体または塩酸塩）、ＤＩＣ（フリー体または塩酸塩）が、残留した縮合剤や縮合剤の分解物を洗浄により淘汰することが容易であるため好ましい。特に、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等が本発明のペプチド伸長反応で得られたものである場合は、ＥＤＣのフリー体が好ましい。本発明のペプチド伸長反応で得られるＣ−保護ペプチド（Ｐｎ）等はｐＨ４〜７で処理されているため酸付加塩で得られるが、当該縮合剤のフリー体を使用することにより、中和と活性化を同時に行うことができる。この場合、上記の塩基を使用する必要がなく、反応混合物が塩基性になる虞がないので、ジケトピペラジン生成などの副反応を回避することができる。縮合剤の使用量は、Ｎ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）に対して通常０．８〜３．０当量、好ましくは１．０〜１．５当量である。As the condensing agent, those exemplified above can be used without any particular limitation, and EDC (free form or hydrochloride) and DIC (free form or hydrochloride) can wash the remaining condensing agent or decomposition product of the condensing agent by washing. It is preferable because it is easy to wrinkle. In particular, when a C-protected peptide (P n ) or the like is obtained by the peptide elongation reaction of the present invention, a free form of EDC is preferable. The C-protected peptide (P n ) and the like obtained by the peptide extension reaction of the present invention is obtained as an acid addition salt because it is treated at pH 4 to 7, but it is neutralized by using a free form of the condensing agent. And activation can be performed simultaneously. In this case, it is not necessary to use the above-mentioned base, and there is no possibility that the reaction mixture becomes basic, so that side reactions such as diketopiperazine formation can be avoided. The usage-amount of a condensing agent is 0.8-3.0 equivalent normally with respect to N-protection amino acid (B / Z- An + 1 ), Preferably it is 1.0-1.5 equivalent.
カップリング工程（１）において、反応を促進し、ラセミ化などの副反応を抑制するために、好ましくは、活性化剤が添加される。活性化剤を存在させた場合は、反応系中で一時的にＮ−保護アミノ酸の活性エステルなどが生成する。
活性化剤は上記で例示したものを制限無く使用することができ、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ、ＨＯＣｔ、ＨＯＮｂ等が好ましい。活性化剤の使用量は、Ｎ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）に対して通常、０．０１〜１．２当量、好ましくは０．０５〜０．５当量である。In the coupling step (1), an activator is preferably added to accelerate the reaction and suppress side reactions such as racemization. When an activator is present, an active ester of an N-protected amino acid is temporarily generated in the reaction system.
As the activator, those exemplified above can be used without limitation, and HOBt, HOBt, HOCt, HONb and the like are preferable. The usage-amount of an activator is 0.01-1.2 equivalent normally with respect to N-protected amino acid (B / Z- An + 1 ), Preferably it is 0.05-0.5 equivalent.
溶媒としては、本反応を阻害しない溶媒であればいずれでもよく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、酢酸エチル、塩化メチレン、クロロホルム、アセトニトリルなどまたはそれらの混合溶媒が挙げられ、酢酸エチルまたはＤＭＦが好ましい。溶媒の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等に対して、通常３〜５０倍重量であり、好ましくは５〜２０倍重量である。Any solvent may be used as long as it does not inhibit this reaction. For example, N, N-dimethylformamide (DMF), N-methylpyrrolidone (NMP), ethyl acetate, methylene chloride, chloroform, acetonitrile, etc. A mixed solvent is mentioned, and ethyl acetate or DMF is preferable. The usage-amount of a solvent is 3-50 times weight normally with respect to C-protection peptide ( Pn ) etc., Preferably it is 5-20 times weight.
反応温度は、通常−２０〜４０℃、好ましくは０〜２０℃の範囲内である。反応時間は、上記温度範囲内で、通常０．５〜２４時間である。 The reaction temperature is usually in the range of -20 to 40 ° C, preferably 0 to 20 ° C. The reaction time is usually 0.5 to 24 hours within the above temperature range.
カップリング工程（１）反応終了後のワークアップは、カップリング工程（２）と同様であるので、後掲の１−３においてまとめて説明する。 Since the work-up after the completion of the coupling step (1) reaction is the same as the coupling step (2), it will be collectively described in 1-3 below.
１−２．カップリング工程（２）
本発明のペプチド伸長反応のカップリング工程（２）においては、例えば、溶媒中において、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｚアミノ酸活性エステル（以下、本明細書において「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル（Ｂ／Ｚ−ＡＥｎ＋１）」と総称する。）およびＣ−保護ペプチド（Ｐｎ）等を混合することによってＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）が得られる。添加順序は特に限定はないが、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等が一つ前のペプチド伸長反応（ｎ−１）によって得られたものである場合は、反応容器中のＣ−保護ペプチド（Ｐｎ）等の溶液にＮ−保護アミノ酸活性エステル（Ｂ／Ｚ−ＡＥｎ＋１）を添加すればよい。1-2. Coupling process (2)
In the coupling step (2) of the peptide extension reaction of the present invention, for example, in a solvent, an N-Boc amino acid active ester or an NZ amino acid active ester (hereinafter referred to as “N-protected amino acid active ester ( B / Z-AE n + 1 ) ”)), C-protected peptide (P n ) and the like are mixed to obtain N, C-diprotected peptide (B / Z-P n + 1 ). The order of addition is not particularly limited, but when the C-protected peptide (P n ) or the like is obtained by the previous peptide extension reaction (n-1), the C-protected peptide ( An N-protected amino acid active ester (B / Z-AE n + 1 ) may be added to a solution such as P n ).
Ｎ−保護アミノ酸活性エステル（Ｂ／Ｚ−ＡＥｎ＋１）の使用量はカップリング工程（１）におけるＮ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）と同様である。
また、塩基、溶媒およびその使用量、反応温度、反応時間等のその他の反応条件は、カップリング工程（１）と同様である。The amount of N-protected amino acid active ester (B / Z-AE n + 1 ) used is the same as that of the N-protected amino acid (B / Z-A n + 1 ) in the coupling step (1).
In addition, other reaction conditions such as a base, a solvent and its use amount, a reaction temperature, and a reaction time are the same as those in the coupling step (1).
１−３．カップリング工程（１）および（２）のワークアップ
カップリング工程（１）およびカップリング工程（２）の反応終了後、「Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等」を洗浄により淘汰し得る誘導体に導くため、または捕捉するために、好ましくは反応混合物にクエンチ剤が添加される。
クエンチ剤は上記で例示したものを制限無く使用することができ、ＤＭＰＤＡなどが好ましい。クエンチ剤の使用量は、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等に対するＮ−保護アミノ酸活性エステル（Ｂ／Ｚ−ＡＥｎ＋１）またはＮ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）の使用量の過剰使用量を考慮して決定すればよい。クエンチ剤の使用量は、当該過剰使用量に対して通常０．５〜５．０当量、好ましくは１．０〜３．０当量である。
クエンチ剤とＮ−保護アミノ酸活性エステル等との反応は、通常−２０〜４０℃、好ましくは０〜３０℃の範囲内で、１０〜６０分行えばよい。1-3. Workup of coupling steps (1) and (2) After completion of the reactions in coupling step (1) and coupling step (2), to lead “N-protected amino acid active ester etc.” to a derivative that can be removed by washing. Or a quenching agent is preferably added to the reaction mixture for capture.
As the quenching agent, those exemplified above can be used without limitation, and DMPDA is preferred. The amount of quenching agent used is an excessive amount of N-protected amino acid active ester (B / Z-AE n + 1 ) or N-protected amino acid (B / Z-A n + 1 ) used relative to C-protected peptide (P n ) and the like. It may be determined in consideration of the amount. The usage-amount of a quenching agent is 0.5-5.0 equivalent normally with respect to the said excess usage-amount, Preferably it is 1.0-3.0 equivalent.
The reaction between the quenching agent and the N-protected amino acid active ester or the like is usually carried out for 10 to 60 minutes within a range of -20 to 40 ° C, preferably 0 to 30 ° C.
カップリング工程（１）および（２）のワークアップでは、好ましくは、酸性水溶液洗浄および／または塩基性水溶液洗浄が行われる。酸性水溶液洗浄により、Ｎ−保護アミノ酸活性エステル等とクエンチ剤との反応により生成する塩基性誘導体、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ）等、残留した縮合剤またはその分解物、塩基などを水層に淘汰することができる。塩基性水溶液洗浄により、活性化剤、残留したＮ−保護アミノ酸（Ｂ／Ｚ−Ａｎ＋１）などを水層に淘汰することができる。In the workup of the coupling steps (1) and (2), preferably, an acidic aqueous solution cleaning and / or a basic aqueous solution cleaning is performed. By washing with an acidic aqueous solution, a residual derivative such as a basic derivative produced by reaction of an N-protected amino acid active ester or the like with a quenching agent, a C-protected peptide (P n ), or a decomposition product thereof, a base, or the like is added to the aqueous layer. Can be jealous. By washing with basic aqueous solution, activator, residual N-protected amino acid (B / Z-A n + 1 ) and the like can be poured into the aqueous layer.
酸性水溶液洗浄は、例えば、反応混合物を希塩酸水溶液（例えば、１Ｎ塩酸水溶液）、クエン酸水溶液、リン酸水溶液、硫酸水溶液などと攪拌後、分液して水層を除去することにより行われる。 The acidic aqueous solution washing is performed, for example, by stirring the reaction mixture with dilute hydrochloric acid aqueous solution (for example, 1N hydrochloric acid aqueous solution), citric acid aqueous solution, phosphoric acid aqueous solution, sulfuric acid aqueous solution, and the like, and separating and removing the aqueous layer.
塩基性水溶液洗浄は、エステル加水分解などの副反応を回避するため、あまり長時間かけて行わないようにするのが好ましい。なお、Ｎ末端が保護された状態のＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）の塩基性水溶液洗浄では、ジケトピペラジン生成の副反応はほとんど進行しない。
具体的には、反応混合物を炭酸水素ナトリウム水溶液（例えば、５％炭酸水素ナトリウム水溶液）、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素カリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液などと攪拌後、分液して水層を除去することにより行われる。In order to avoid side reactions such as ester hydrolysis, the basic aqueous solution washing is preferably not performed for a long time. In addition, in the basic aqueous solution washing of N, C-diprotected peptide (B / Z-P n + 1 ) with the N-terminal protected, the side reaction of diketopiperazine formation hardly proceeds.
Specifically, the reaction mixture is stirred with an aqueous sodium hydrogen carbonate solution (for example, 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution), an aqueous sodium carbonate solution, an aqueous potassium hydrogen carbonate solution, an aqueous potassium carbonate solution, etc., and then separated to remove the aqueous layer. Is done.
必要に応じてさらに水洗し、有機層を濃縮することにより、Ｎ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）を得ることができ、そのまま容器から取り出すことなく、続くＮ末端脱保護工程に供することができる。また、濃縮することなく、Ｎ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）の溶液としてＮ末端脱保護工程に用いてもよい。The N, C-diprotected peptide (B / ZPn + 1 ) can be obtained by further washing with water and concentrating the organic layer as necessary, and the subsequent N-terminal deprotection step without taking it out from the container. Can be used. Moreover, you may use for a N terminal deprotection process as a solution of a N, C- diprotection peptide (B / Z- Pn + 1 ), without concentrating.
本発明のペプチド合成において、Ｂｏｃ、Ｚ以外のアミノ保護基を使用するカップリング工程が含まれる場合も、上記と同様に行えばよい。 When the peptide synthesis of the present invention includes a coupling step using an amino protecting group other than Boc and Z, the same procedure as described above may be performed.
２．Ｎ末端脱保護工程
２−１．Ｎ末端脱保護工程（Ｉ）
本発明のペプチド伸長反応におけるＮ末端脱保護工程（Ｉ）においては、Ｎ末端がＢｏｃで保護されたＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）（以下、本明細書において「Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＢＰｎ＋１）」と称す。）を、溶媒中または無溶媒で、酸と反応させることによりＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）が得られる。具体的には、カップリング工程で得られたＮ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＢＰｎ＋１）の濃縮残査に酸を添加すればよい。2. N-terminal deprotection step 2-1. N-terminal deprotection step (I)
In the N-terminal deprotection step (I) in the peptide extension reaction of the present invention, N, C-diprotected peptide (B / Z-P n + 1 ) whose B-terminal is protected with Boc (hereinafter referred to as “N -Boc-C-protected peptide (BPn + 1 ) ") is reacted with an acid in a solvent or without solvent to give a C-protected peptide ( Pn + 1 ). Specifically, an acid may be added to the concentrated residue of the N-Boc-C-protected peptide (BP n + 1 ) obtained in the coupling step.
酸としては、トリフルオロ酢酸、塩酸、ギ酸、メタンスルホン酸、トシル酸などが挙げられ、トリフルオロ酢酸、ギ酸、塩酸が好ましい。
酸の使用量は、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＢＰｎ＋１）に対して、通常５〜１００当量、好ましくは１０〜５０当量である。この範囲より少ないと、未反応のＮ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＢＰｎ＋１）が残りやすく、多いと酸の除去操作に時間を要することとなる。Examples of the acid include trifluoroacetic acid, hydrochloric acid, formic acid, methanesulfonic acid, and tosylic acid, and trifluoroacetic acid, formic acid, and hydrochloric acid are preferable.
The usage-amount of an acid is 5-100 equivalent normally with respect to N-Boc-C-protection peptide (BPn + 1 ), Preferably it is 10-50 equivalent. If it is less than this range, unreacted N-Boc-C-protected peptide (BP n + 1 ) tends to remain, and if it is too much, it takes time to remove the acid.
溶媒を使用する場合、本反応を阻害しない溶媒であればいずれでもよく、例えば、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチル、ジオキサンなどまたはそれらの混合溶媒が挙げられ、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸エチルが好ましい。溶媒の使用量は、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｃ−保護ペプチド（ＢＰｎ＋１）に対して、通常３〜５０倍重量であり、好ましくは５〜２０倍重量である。トリフルオロ酢酸を酸として使用する場合は、無溶媒が好ましい。When a solvent is used, any solvent that does not inhibit this reaction may be used. Examples thereof include chloroform, methylene chloride, ethyl acetate, dioxane, and the like, or a mixed solvent thereof, and chloroform, methylene chloride, and ethyl acetate are preferable. The usage-amount of a solvent is 3-50 times weight normally with respect to N-Boc-C-protection peptide (BPn + 1 ), Preferably it is 5-20 times weight. When trifluoroacetic acid is used as the acid, no solvent is preferred.
反応温度は、通常−１０〜４０℃、好ましくは０〜３０℃の範囲内である。反応時間は、上記温度範囲内で、通常０．５〜１５時間である。
反応終了後のワークアップでのｐＨ調整は、Ｎ末端脱保護工程（ＩＩ）と同様であるので、後掲の２−３でまとめて説明する。The reaction temperature is usually in the range of −10 to 40 ° C., preferably 0 to 30 ° C. The reaction time is usually 0.5 to 15 hours within the above temperature range.
The pH adjustment in the work-up after the completion of the reaction is the same as in the N-terminal deprotection step (II), and will be described collectively in 2-3 below.
２−２．Ｎ末端脱保護工程（ＩＩ）
本発明のペプチド伸長反応におけるＮ末端脱保護工程（ＩＩ）においては、Ｎ末端がＺで保護されたＮ，Ｃ−ジ保護ペプチド（Ｂ／Ｚ−Ｐｎ＋１）（以下、「Ｎ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（ＺＰｎ＋１）」と称す。）を、酸性条件下、接触還元に付すことによりＣ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）が得られる。具体的には、カップリング工程で得られたＮ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（ＺＰｎ＋１）を、溶媒中、触媒存在下、水素還元条件又はギ酸等を添加する水素移動型還元条件にて脱保護させる。水素還元条件の場合、酸を添加しなくても反応は進行するが、酸を添加したほうが効率的である。2-2. N-terminal deprotection step (II)
In the N-terminal deprotection step (II) in the peptide extension reaction of the present invention, an N, C-diprotected peptide (B / Z-P n + 1 ) (hereinafter referred to as “NZC”) in which the N-terminal is protected with Z. -Protected peptide (ZPn + 1 ) ") is subjected to catalytic reduction under acidic conditions to give C-protected peptide ( Pn + 1 ). Specifically, the NZC-protected peptide (ZP n + 1 ) obtained in the coupling step is removed in a solvent in the presence of a catalyst under hydrogen reduction conditions or hydrogen transfer-type reduction conditions to which formic acid or the like is added. Protect. In the case of hydrogen reduction conditions, the reaction proceeds without addition of an acid, but it is more efficient to add an acid.
添加する酸としては塩酸、酢酸、メタンスルホン酸、トシル酸などが挙げられる。酸の量は脱保護されて、遊離するアミノ基と等量以上になるように添加すればよい。 Examples of the acid to be added include hydrochloric acid, acetic acid, methanesulfonic acid, and tosylic acid. The amount of the acid may be added so that it is deprotected and equal to or more than the free amino group.
触媒としては、パラジウム炭素、水酸化パラジウム、酸化白金、ルテニウム炭素、ロジウム炭素、ラネーニッケルなどが挙げられる。触媒の使用量は、Ｎ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（ＺＰｎ＋１）に対して、０．０１〜２００重量％の範囲から適宜選択すればよい。Examples of the catalyst include palladium carbon, palladium hydroxide, platinum oxide, ruthenium carbon, rhodium carbon, Raney nickel and the like. What is necessary is just to select the usage-amount of a catalyst from the range of 0.01 to 200 weight% suitably with respect to a NZC-protection peptide (ZPn + 1 ).
溶媒としては、本反応を阻害しない溶媒であればいずれでもよく、例えば、メタノール、エタノール、酢酸エチル、ＤＭＦ、テトラヒドロフラン、アセトニトリルなどまたはそれらの混合溶媒が挙げられ、酢酸エチルが好ましい。溶媒の使用量は、Ｎ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（ＺＰｎ＋１）に対して、通常３〜５０倍重量であり、好ましくは５〜２０倍重量である。The solvent may be any solvent as long as it does not inhibit this reaction. Examples thereof include methanol, ethanol, ethyl acetate, DMF, tetrahydrofuran, acetonitrile and the like, or a mixed solvent thereof, and ethyl acetate is preferable. The usage-amount of a solvent is 3-50 times weight normally with respect to NZC-protection peptide (ZPn + 1 ), Preferably it is 5-20 times weight.
水素還元条件の場合は、具体的には、水素雰囲気下、反応混合物を攪拌すればよい。水素圧は常圧〜１０気圧の範囲から適宜選択される。 In the case of hydrogen reduction conditions, specifically, the reaction mixture may be stirred under a hydrogen atmosphere. The hydrogen pressure is appropriately selected from the range of normal pressure to 10 atm.
水素移動型還元条件の場合は、ギ酸、ギ酸アンモニウム、シクロヘキサジエン、シクロヘキセン、トリイソプロピルシランなどの水素源が添加される。水素源の使用量は、Ｎ−Ｚ−Ｃ−保護ペプチド（ＺＰｎ＋１）に対して、通常１〜１００当量であり、好ましくは１．５〜１０当量である。In the case of hydrogen transfer type reduction conditions, a hydrogen source such as formic acid, ammonium formate, cyclohexadiene, cyclohexene, triisopropylsilane is added. The usage-amount of a hydrogen source is 1-100 equivalent normally with respect to a NZC-protection peptide (ZPn + 1 ), Preferably it is 1.5-10 equivalent.
反応温度は、通常−１０〜４０℃、好ましくは０〜３０℃の範囲内である。反応時間は、上記温度範囲内で、通常０．５〜１５時間である。反応終了後、濾過により触媒を除去した後に、濾液をｐＨ調整に付せばよい。 The reaction temperature is usually in the range of −10 to 40 ° C., preferably 0 to 30 ° C. The reaction time is usually 0.5 to 15 hours within the above temperature range. After completion of the reaction, after removing the catalyst by filtration, the filtrate may be subjected to pH adjustment.
２−３．Ｎ末端脱保護後のワークアップでのｐＨ調整
Ｎ末端脱保護工程（Ｉ）または（ＩＩ）のワークアップでのｐＨ調整法としては特に限定はない。例えば、必要に応じて酸を減圧蒸留などによりある程度除去した後に、反応混合物のｐＨをモニターしながら、塩基（例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウムなど）の水溶液を滴下して、所望のｐＨに調整する方法、予めｐＨを調整した緩衝液を加える方法、反応混合物を緩衝液中に加える方法またはそれらを組み合わせた方法などが挙げられる。好ましいｐＨ調製方法として、Ｎ末端脱保護工程後の反応混合物と塩基とを、ｐＨをモニターしながら同時に反応容器に添加する方法が挙げられる。反応容器には予め酢酸エチルと水との混合溶媒などの溶媒を加えておき、該溶媒中に反応混合物と塩基を加えてもよい。2-3. PH adjustment in workup after N-terminal deprotection The pH adjustment method in the workup in N-terminal deprotection step (I) or (II) is not particularly limited. For example, the acid is removed to some extent by distillation under reduced pressure as necessary, and then an aqueous solution of a base (for example, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, potassium carbonate, etc.) is added dropwise while monitoring the pH of the reaction mixture. Examples thereof include a method for adjusting to pH, a method for adding a buffer solution whose pH has been adjusted in advance, a method for adding a reaction mixture into a buffer solution, and a method for combining them. As a preferred pH adjusting method, there is a method in which the reaction mixture and the base after the N-terminal deprotection step are simultaneously added to the reaction vessel while monitoring the pH. A solvent such as a mixed solvent of ethyl acetate and water may be added to the reaction vessel in advance, and the reaction mixture and the base may be added to the solvent.
また、ｐＨをモニターする必要がなく、簡便にｐＨを調整することができるので、緩衝液を加える方法も好ましい。反応混合物に酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレン、酢酸ブチルなどの溶媒を加えた後に、上記緩衝液で洗浄してもよい。使用する緩衝液としては、リン酸（リン酸２水素ナトリウム＋リン酸水素２ナトリウム）、トリス塩酸緩衝液（塩酸＋（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、酢酸緩衝液（酢酸＋ 酢酸ナトリウム）などが挙げられる。緩衝液の濃度は特に限定されず、０．５〜５Ｍの範囲から適宜選択すればよい。 Further, a method of adding a buffer solution is also preferable because it is not necessary to monitor the pH and the pH can be easily adjusted. A solvent such as ethyl acetate, chloroform, methylene chloride, or butyl acetate may be added to the reaction mixture, followed by washing with the above buffer solution. Examples of the buffer used include phosphoric acid (sodium dihydrogen phosphate + disodium hydrogen phosphate), tris hydrochloric acid buffer (hydrochloric acid + (hydroxymethyl) aminomethane), and acetic acid buffer (acetic acid + sodium acetate). It is done. The concentration of the buffer solution is not particularly limited, and may be appropriately selected from the range of 0.5 to 5M.
ｐＨ調整後、反応混合物を攪拌し、液相を分離後、水層を除去する。有機層は必要に応じてさらに水洗し、濃縮することにより、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）を得ることができ、そのまま容器から取り出すことなく、次のペプチド伸長反応に供することができる。また、濃縮することなく、Ｃ−保護ペプチド（Ｐｎ＋１）の溶液として次のペプチド伸長反応に用いてもよい。After pH adjustment, the reaction mixture is stirred, the liquid phase is separated, and the aqueous layer is removed. The organic layer can be further washed with water and concentrated as necessary to obtain a C-protected peptide (P n + 1 ), which can be used for the next peptide elongation reaction without being taken out from the container. Moreover, you may use for the following peptide elongation reaction as a solution of C-protection peptide ( Pn + 1 ), without concentrating.
本発明のペプチド合成において、ＢｏｃおよびＺ以外のＮ末端保護基を使用したＮ末端脱保護工程が含まれる場合は、ペプチド合成化学で常用されるアミノ基保護基の種類に応じた一般的なＮ−末端脱保護方法により行えばよい。 In the peptide synthesis of the present invention, when an N-terminal deprotection step using an N-terminal protecting group other than Boc and Z is included, a general N depending on the type of amino group protecting group commonly used in peptide synthesis chemistry -An end deprotection method may be used.
以上のように、カップリング工程後に、反応混合物にクエンチ剤が添加されることで、酸性水溶液洗浄および／または塩基性水溶液洗浄により簡便に不純物が除去され、さらにＮ末端脱保護工程の後に、反応混合物がｐＨ調整されることで、抽出により簡便に不純物等が除去されるため、ペプチドの液相合成法において、次の縮合工程、すなわち次のペプチド伸長反応を、中間体ペプチドを反応容器から取り出すことなく行うことができる。すなわち、得られた中間体ペプチドを晶析等により固体として単離せずに次の縮合工程を行うことができる。このように本発明の方法によれば、ペプチドの液相合成法により、目的とする最終ペプチドをワンポット合成することが可能である。 As described above, by adding a quenching agent to the reaction mixture after the coupling step, impurities can be easily removed by washing with acidic aqueous solution and / or washing with basic aqueous solution, and after the N-terminal deprotection step, By adjusting the pH of the mixture, impurities and the like can be easily removed by extraction. Therefore, in the liquid phase synthesis method of peptides, the next condensation step, that is, the next peptide extension reaction, is taken out of the intermediate peptide from the reaction vessel. Can be done without. That is, the next condensation step can be performed without isolating the obtained intermediate peptide as a solid by crystallization or the like. Thus, according to the method of the present invention, the final peptide of interest can be synthesized in one pot by the liquid phase synthesis method of peptides.
３．最終脱保護工程
本発明のペプチド合成で、目的のペプチドまで構築されたＣ−保護ペプチド（Ｐｍ）のＰＧ０や側鎖保護基を脱保護することにより、目的のペプチド（Ｐ）を得ることができる。
最終脱保護工程は、ＰＧ０または側鎖保護基の種類に応じた自体公知の脱保護法を特に制限なく採用することができる。
例えば、Ｍｅ、Ｅｔなどの低級アルキル基の場合は、水性有機溶媒や極性有機溶媒などの溶媒中、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの塩基と、０〜４０℃で、０．５〜１０時間反応させることにより脱保護することができる。
ｔＢｕの場合は、クロロホルム、酢酸エチルなどの溶媒中、トリフルオロ酢酸、塩酸などの酸と、０〜４０℃で、０．５〜１０時間反応させることにより脱保護することができる。
Ｂｚｌの場合は、メタノールやＤＭＦなどの溶媒中、パラジウム炭素などの触媒を用いて、０〜５０℃で、１〜５０時間、水素化反応させるか、あるいは、フッ化水素、トリフルオロメタンスルホン酸、ＨＢｒなどの強酸と、−２０〜４０℃で、０．５〜１０時間反応させることにより脱保護することができる。
最終脱保護工程において、Ｂｏｃ基またはＺ基で保護された側鎖アミノ基を脱保護する場合も、Ｎ末端脱保護工程と同様にワークアップにおいて反応混合物のｐＨを調整して行うことができる。3. Final deprotection step In the peptide synthesis of the present invention, the target peptide (P) is obtained by deprotecting the PG 0 and side chain protecting groups of the C-protected peptide (P m ) constructed up to the target peptide. Can do.
In the final deprotection step, a deprotection method known per se according to the type of PG 0 or the side chain protecting group can be adopted without particular limitation.
For example, in the case of a lower alkyl group such as Me or Et, in a solvent such as an aqueous organic solvent or a polar organic solvent, a base such as sodium hydroxide or potassium hydroxide and 0 to 40 ° C. for 0.5 to 10 hours It can deprotect by making it react.
In the case of tBu, it can be deprotected by reacting with an acid such as trifluoroacetic acid or hydrochloric acid in a solvent such as chloroform or ethyl acetate at 0 to 40 ° C. for 0.5 to 10 hours.
In the case of Bzl, a hydrogenation reaction is performed at 0 to 50 ° C. for 1 to 50 hours using a catalyst such as palladium carbon in a solvent such as methanol or DMF, or hydrogen fluoride, trifluoromethanesulfonic acid, It can deprotect by making it react with strong acids, such as HBr, at -20-40 degreeC for 0.5 to 10 hours.
In the final deprotection step, the side chain amino group protected with the Boc group or the Z group can be deprotected by adjusting the pH of the reaction mixture in the work-up as in the N-terminal deprotection step.
本発明の方法により、合成されたペプチド（Ｐ）は、ペプチド化学で常用される方法に従って単離精製することができる。例えば、最終脱保護工程のワークアップにおいて、反応混合物を濃縮、沈殿化、イオン交換、ＨＰＬＣ精製などのクロマト精製などによって、ペプチド（Ｐ）を単離精製することができる。 The peptide (P) synthesized by the method of the present invention can be isolated and purified according to a method commonly used in peptide chemistry. For example, in the workup of the final deprotection step, the peptide (P) can be isolated and purified by concentration, precipitation, ion exchange, chromatographic purification such as HPLC purification, and the like.
以下、本発明について、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
ＨＰＬＣ分析は以下の条件で行った。
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ−ＯＤＳ-Ａ−３０２ １５０×４．６ｍｍ １２ｎｍ， １５μｍ
溶離液：Ａ液 ０．１％ＴＦＡ水
Ｂ液 ０．１％ＴＦＡ／ＭｅＣＮ
カラム温度：４０℃
流速 １ｍｌ／ｍｉｎ
波長：２２０ｎｍHereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. The present invention is not limited by these.
HPLC analysis was performed under the following conditions.
Column: YMC-Pack-ODS-A-302 150 × 4.6 mm 12 nm, 15 μm
Eluent: A solution 0.1% TFA water B solution 0.1% TFA / MeCN
Column temperature: 40 ° C
Flow rate 1ml / min
Wavelength: 220nm
参考例１
Ｈ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ．ＴｓＯＨ（１０．０ ｇ， ２８．４６ ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（６．７４ ｇ， ３１．３０ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．４３ ｇ， ３．１３ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ ｍｌ）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ（５．３５ ｇ， ３４．４６ｍｍｏｌ）を加えて３時間攪拌した。 酢酸エチル（１５０ ｍｌ）を加え、混合物を５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し有機層を濃縮した。残渣にヘキサンを加えて攪拌して析出物を濾取し減圧乾燥させて、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ（９．３８ｇ， ２４．９１ｍｍｏｌ）を得た。Reference example 1
H-Ala-OBzl. TsOH (10.0 g, 28.46 mmol), Boc-Pro-OH (6.74 g, 31.30 mmol) and HOBt (0.43 g, 3.13 mmol) were dissolved in DMF (30 ml). Then, EDC (5.35 g, 34.46 mmol) was added under ice cooling, and the mixture was stirred for 3 hours. Ethyl acetate (150 ml) was added, the mixture was washed successively with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, 1N aqueous hydrochloric acid and saturated brine, and the organic layer was concentrated. Hexane was added to the residue and stirred, and the precipitate was collected by filtration and dried under reduced pressure to obtain Boc-Pro-Ala-OBzl (9.38 g, 24.91 mmol).
比較例１
Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ （２．５０ ｇ， ６．６４ ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸（２１ ｍｌ）を氷冷下で加えて１．５時間攪拌させた。反応液を減圧濃縮して、残渣油状物に酢酸エチル（３３ ｍｌ）を加え、１０％炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層にＢｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ （１．７５ ｇ， ７．３０ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．１０ ｇ， ０．７４ ｍｍｏｌ）を溶解し、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１．５４ ｇ， ８．０３ ｍｍｏｌ）を氷冷下で添加して２時間攪拌した。反応液をＨＰＬＣ分析したところ、目的物であるＢｏｃ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌは痕跡量しか認められなかった。Comparative Example 1
Trifluoroacetic acid (21 ml) was added to Boc-Pro-Ala-OBzl (2.50 g, 6.64 mmol) under ice cooling and allowed to stir for 1.5 hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, ethyl acetate (33 ml) was added to the residual oil, and the mixture was washed with 10% aqueous sodium carbonate. Boc-Ile-OH (1.75 g, 7.30 mmol) and HOBt (0.10 g, 0.74 mmol) were dissolved in the organic layer, and EDC. HCl (1.54 g, 8.03 mmol) was added under ice cooling and stirred for 2 hours. As a result of HPLC analysis of the reaction solution, only a trace amount of Boc-Ile-Pro-Ala-OBzl as a target product was observed.
比較例２
Ｈ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＭｅ．２ＨＣｌ(Ｄ−３−ピリジルアラニンメチルエステル塩酸塩)（１．０ ｇ， ３．９７ ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｃｐａ−ＯＨ（Ｂｏｃ−Ｄ−４−クロロフェニルアラニン）（１．１９ ｇ， ３．９７ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．０５３ ｇ， ０．４０ ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドン（６ ｍｌ）と水 （０．６ ｍｌ）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ（０．６８ ｇ， ４．３７ ｍｍｏｌ）を加え、１６時間攪拌させた。反応液に酢酸エチル（３０ ｍｌ）を加え、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、有機層を濃縮した。残渣にトリフルオロ酢酸 （１０ ｍｌ）を加え、２時間攪拌させ、減圧濃縮した。残渣油状物に酢酸エチル（２０ ｍｌ）を加え、１０％炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、有機層を濃縮したところ、Ｈ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＭｅが得られたが、ＨＰＬＣ分析したところ、加水分解したＨ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＨが含まれていた。Comparative Example 2
HD-Pal-OMe. 2HCl (D-3-pyridylalanine methyl ester hydrochloride) (1.0 g, 3.97 mmol), Boc-D-Cpa-OH (Boc-D-4-chlorophenylalanine) (1.19 g, 2. 97 mmol) and HOBt (0.053 g, 0.40 mmol) were dissolved in N-methylpyrrolidone (6 ml) and water (0.6 ml), and EDC (0.68 g, 4. 37 mmol) was added and allowed to stir for 16 hours. Ethyl acetate (30 ml) was added to the reaction mixture, and the mixture was washed successively with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, 1N aqueous hydrochloric acid and saturated brine, and the organic layer was concentrated. To the residue was added trifluoroacetic acid (10 ml), and the mixture was stirred for 2 hours and concentrated under reduced pressure. Ethyl acetate (20 ml) was added to the residual oil, washed with 10% aqueous sodium carbonate solution, and the organic layer was concentrated to obtain HD-Cpa-D-Pal-OMe, which was analyzed by HPLC. , Hydrolyzed HD-Cpa-D-Pal-OH.
実施例１
Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ （２．５０ ｇ， ６．６４ ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸（２１ ｍｌ）を氷冷下で加えて１．５時間攪拌させ、反応液を減圧濃縮して残査油状物に酢酸エチル（３３ ｍｌ）を加え、ｐＨ５．５の２Ｍリン酸バッファーにて洗浄した。水層を酢酸エチル（２０ ｍｌ）で抽出し、有機層に混ぜ、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ （１．７５ ｇ，７．３０ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．１０ｇ， ０．７４ｍｍｏｌ）を加えて、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１．５４ ｇ， ８．０３ ｍｍｏｌ）を氷冷下で添加して２時間攪拌した。反応液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｍ塩酸及び飽和食塩水にて順次洗浄し、得られた有機層を濃縮し、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌを収率９４％で得た。Example 1
Trifluoroacetic acid (21 ml) was added to Boc-Pro-Ala-OBzl (2.50 g, 6.64 mmol) under ice-cooling, and the mixture was stirred for 1.5 hours. Ethyl acetate (33 ml) was added to the product and washed with 2M phosphate buffer at pH 5.5. The aqueous layer was extracted with ethyl acetate (20 ml), mixed with the organic layer, Boc-Ile-OH (1.75 g, 7.30 mmol) and HOBt (0.10 g, 0.74 mmol) were added and EDC was added. . HCl (1.54 g, 8.03 mmol) was added under ice cooling and stirred for 2 hours. The reaction solution was washed successively with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, 1M hydrochloric acid and saturated brine, and the obtained organic layer was concentrated to obtain Boc-Ile-Pro-Ala-OBzl at a yield of 94%.
実施例２
Ｈ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ．ＴｓＯＨ（２．２８ ｇ， ６．５０ ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ （１．５４ ｇ， ７．１５ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．１ ｇ， ０．７４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル （３５ ｍｌ）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ（１．２２ ｇ， ７．８７ ｍｍｏｌ）を加えて３時間攪拌した。 反応液に ＤＭＰＤＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパンジアミン）（０．１６ ｍｌ， １．５８ｍｍｏｌ）を加えて３０分間攪拌し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、有機層を濃縮した。得られた残査にトリフルオロ酢酸 （１１ ｍｌ）を加えて氷冷下で１時間攪拌して、濃縮乾固した。残渣に酢酸エチル（３５ ｍｌ）を加え、混合物をｐＨ５．５のリン酸バッファーにて洗浄した。水層を酢酸エチル（２０ ｍｌ）で抽出し、最初の有機層と混ぜて、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ （１．５６ ｇ， ６．５０ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．０８ ｇ ０．７４ ｍｍｏｌ）を加えて、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１．１１ ｇ， ７．１５ ｍｍｏｌ）を氷冷下で添加して１６時間攪拌した。反応液にＤＭＰＤＡ（０．１６ ｍｌ， １．５８ｍｍｏｌ）を加えて３０分間攪拌し、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｍ塩酸及び飽和食塩水にて順次洗浄し、得られた有機層を濃縮し、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＯＢｚｌを収率８８％(ｖｓ Ｈ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ)で得た。Example 2
H-Ala-OBzl. Dissolve TsOH (2.28 g, 6.50 mmol), Boc-Pro-OH (1.54 g, 7.15 mmol) and HOBt (0.1 g, 0.74 mmol) in ethyl acetate (35 ml). Then, EDC (1.22 g, 7.87 mmol) was added under ice cooling, and the mixture was stirred for 3 hours. DMPDA (N, N-dimethylpropanediamine) (0.16 ml, 1.58 mmol) was added to the reaction solution, stirred for 30 minutes, and sequentially with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, 1N aqueous hydrochloric acid and saturated brine. Wash and concentrate the organic layer. Trifluoroacetic acid (11 ml) was added to the resulting residue, and the mixture was stirred for 1 hour under ice cooling and concentrated to dryness. Ethyl acetate (35 ml) was added to the residue, and the mixture was washed with a phosphate buffer having a pH of 5.5. The aqueous layer was extracted with ethyl acetate (20 ml), combined with the first organic layer, and Boc-Ile-OH (1.56 g, 6.50 mmol) and HOBt (0.08 g 0.74 mmol). In addition, EDC. HCl (1.11 g, 7.15 mmol) was added under ice cooling and stirred for 16 hours. DMPDA (0.16 ml, 1.58 mmol) was added to the reaction solution, stirred for 30 minutes, washed successively with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, 1M hydrochloric acid and saturated brine, and the resulting organic layer was concentrated, Boc-Ile-Pro-Ala-OBzl was obtained in 88% yield (vs H-Ala-OBzl).
実施例３
Ｈ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＭｅ．２ＨＣｌ（Ｄ−３−ピリジルアラニンメチルエステル塩酸塩）（１．０ ｇ， ３．９７ ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｃｐａ−ＯＨ （Ｂｏｃ−Ｄ−４−クロロフェニルアラニン）（１．１９ ｇ， ３．９７ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．０５３ ｇ， ０．４０ ｍｍｏｌ）をＮ−メチルピロリドン（６ ｍｌ）と水（０．６ ｍｌ）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ（０．６８ ｇ， ４．３７ ｍｍｏｌ）を加え、１６時間攪拌させた。反応液に酢酸エチル（３０ ｍｌ）を加え、５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し有機層を濃縮した。残渣にトリフルオロ酢酸 （１０ ｍｌ）を加え、２時間攪拌させ、減圧濃縮した。残渣油状物に酢酸エチル（２０ ｍｌ）を加え、ｐＨ５．５のリン酸バッファーで洗浄し、有機層をＨＰＬＣ分析したところ、加水分解体のＨ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＨは検出されなかった。濃縮してＤＭＦ（６ ｍｌ）、Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−ＯＨ（アセチル−Ｄ−ナフチルアラニン）（０．９２ ｇ， ３．５６ ｍｍｏｌ）及びＨＯＯＢｔ（ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１,２,３−ベンゾトリアジン）（０．５８ ｇ， ３．５６ ｍｍｏｌ）を加えて、氷冷下にてＥＤＣ（０．６１ ｇ， ３．９１ ｍｍｏｌ）を滴下して、１６時間室温で攪拌した。反応液に水（３０ ｍｌ）を加え炭酸ナトリウムにてｐＨ８に調整して析出物を濾過して減圧乾燥させ、Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−ＯＭｅ （１．６６ ｇ， ２．７７ ｍｍｏｌ）を得た。Example 3
HD-Pal-OMe. 2HCl (D-3-pyridylalanine methyl ester hydrochloride) (1.0 g, 3.97 mmol), Boc-D-Cpa-OH (Boc-D-4-chlorophenylalanine) (1.19 g, 2. 97 mmol) and HOBt (0.053 g, 0.40 mmol) were dissolved in N-methylpyrrolidone (6 ml) and water (0.6 ml), and EDC (0.68 g, 4. 37 mmol) was added and allowed to stir for 16 hours. Ethyl acetate (30 ml) was added to the reaction mixture, and the mixture was washed successively with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution, 1N aqueous hydrochloric acid and saturated brine, and the organic layer was concentrated. To the residue was added trifluoroacetic acid (10 ml), and the mixture was stirred for 2 hours and concentrated under reduced pressure. Ethyl acetate (20 ml) was added to the residual oil, washed with a phosphate buffer having a pH of 5.5, and the organic layer was analyzed by HPLC. As a result, the hydrolyzate HD-Cpa-D-Pal-OH was detected. There wasn't. Concentrate to DMF (6 ml), Ac-D-Nal-OH (acetyl-D-naphthylalanine) (0.92 g, 3.56 mmol) and HOOBt (hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo- 1,2,3-benzotriazine) (0.58 g, 3.56 mmol) was added, and EDC (0.61 g, 3.91 mmol) was added dropwise under ice cooling, followed by 16 hours at room temperature. Stir. Water (30 ml) was added to the reaction solution, pH was adjusted to 8 with sodium carbonate, the precipitate was filtered and dried under reduced pressure, and Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-OMe (1.66 g, 2.77 mmol) was obtained.
実施例４
Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＭｅ．ＨＣｌ（Ｄ−アラニンメチルエステル塩酸塩）（０．２５ ｇ， １．７９ ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（０．３９ ｇ， １．７９ ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（０．０２４ ｇ， ０．１８ ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ ｍｌ）に溶解し、氷冷下でＥＤＣ（０．３１ ｇ, １．９７ ｍｍｏｌ）を加え、１６時間攪拌させた。酢酸エチル（１０ ｍｌ）を加え、塩化ナトリウムを加えた５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、水層に酢酸エチルを加えて抽出して、有機層を合わせて濃縮した。残渣にトリフルオロ酢酸（５ ｍｌ）を加え、２時間攪拌し、減圧濃縮した。残渣油状物に酢酸エチル（１０ ｍｌ）を加え、ｐＨ５．５の２Ｍリン酸バッファーを加え、Ｎａ２ＣＯ３でｐＨ５．５に調整して塩化ナトリウムを加えて分層させた。有機層に、Ｚ−（ｉＰｒ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（０．６１ ｇ， １．４３ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．０２０ ｇ， ０．１４ ｍｍｏｌ）を添加して、ＥＤＣ（０．２５ ｇ， １．５７ ｍｍｏｌ）を氷冷下で加えて１６時間攪拌した。反応液を、塩化ナトリウムを加えた５％炭酸水素ナトリウム水溶液、１Ｎ塩酸水、及び、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。得られた有機層を濃縮して、Ｚ−（ｉＰｒ）Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＭｅ（０．７６ｇ， １．２５ｍｍｏｌ）を得た。Example 4
HD-Ala-OMe. HCl (D-alanine methyl ester hydrochloride) (0.25 g, 1.79 mmol), Boc-Pro-OH (0.39 g, 1.79 mmol) and HOBt (0.024 g, 0.18 mmol) ) Was dissolved in DMF (2 ml), EDC (0.31 g, 1.97 mmol) was added under ice cooling, and the mixture was stirred for 16 hours. Ethyl acetate (10 ml) was added, washed successively with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution containing sodium chloride, 1N aqueous hydrochloric acid and saturated brine, and the aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and the organic layer was extracted. Were combined and concentrated. To the residue was added trifluoroacetic acid (5 ml), stirred for 2 hours, and concentrated under reduced pressure. Ethyl acetate (10 ml) was added to the residual oil, pH 5.5 2M phosphate buffer was added, pH was adjusted to 5.5 with Na 2 CO 3 , and sodium chloride was added to separate the layers. To the organic layer, Z- (iPr) Lys (Boc) -OH (0.61 g, 1.43 mmol), HOBt (0.020 g, 0.14 mmol) were added, and EDC (0.25 g 1.57 mmol) was added under ice-cooling, and the mixture was stirred for 16 hours. The reaction solution was washed successively with 5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution added with sodium chloride, 1N aqueous hydrochloric acid and saturated brine, and dried over sodium sulfate. The obtained organic layer was concentrated to obtain Z- (iPr) Lys (Boc) -Pro-D-Ala-OMe (0.76 g, 1.25 mmol).
本発明の方法は、ペプチド医薬品などの工業的製造に好適に利用できる。 The method of the present invention can be suitably used for industrial production of peptide drugs and the like.
本出願は、日本で出願された特願２００７−１９３３３１を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
本発明がその好ましい態様を参照して提示又は記載される一方、本明細書中において、添付の請求の範囲で包含される発明の範囲を逸脱することなく、形態や詳細の様々な変更をなし得ることは当業者に理解されるであろう。本明細書中に示され又は参照されたすべての特許、特許公報及びその他の刊行物は、参照によりその全体が取り込まれる。This application is based on Japanese Patent Application No. 2007-193331 filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.
While the invention has been presented or described with reference to preferred embodiments thereof, various changes in form and detail may be made herein without departing from the scope of the invention as encompassed by the appended claims. It will be appreciated by those skilled in the art. All patents, patent publications and other publications shown or referenced herein are incorporated by reference in their entirety.
Claims (11)
（Ｉ）Ｂｏｃ−ＮＨ基を含むペプチドを酸と反応させることにより脱保護した後、または（ＩＩ）Ｚ−ＮＨ基を含むペプチドを酸性条件下で接触還元に付すことにより脱保護した後に、
反応混合物のｐＨを４〜７に調整する工程を含むことを特徴とする方法。In the method for producing a peptide by a liquid phase synthesis method,
After deprotecting (I) a peptide containing a Boc-NH group by reacting with an acid, or (II) deprotecting a peptide containing a Z-NH group by subjecting it to catalytic reduction under acidic conditions,
Adjusting the pH of the reaction mixture to 4-7.
（２）Ｃ−保護ペプチドまたはＣ−保護アミノ酸を、Ｎ−Ｂｏｃアミノ酸活性エステルまたはＮ−Ｚアミノ酸活性エステルと縮合させる工程
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。(1) a step of condensing a C-protected peptide or C-protected amino acid with an N-Boc amino acid or NZ amino acid in the presence of a condensing agent, and / or (2) a C-protected peptide or C-protected amino acid. The method as described in any one of Claims 1-4 including the process made to condense with N-Boc amino acid active ester or NZ amino acid active ester.
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