JP5208105B2 - ＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路のダウンレギュレーションの有無を判定する方法、抗癌剤による治療の要否の判断を補助する方法、およびシグナル伝達阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、シグナル伝達阻害方法、それに用いるシグナル伝達阻害剤およびその用途に関する。

シグナル伝達経路の受容体チロシンキナーゼが、癌の発症に関与することが、広く知られている。中でも、ＥｒｂＢファミリーに属するＥｒｂＢ２は、細胞膜に発現する、チロシンキナーゼ活性を有する受容体型タンパク質であり、種々の癌での過剰発現が報告されている。ＥｒｂＢ２は、ＨＥＲ２、ｎｅｕとも呼ばれており、乳癌（１０〜３０％）、卵巣癌（約３０％）、膀胱癌（３０〜４０％）等で、過剰発現が確認されている。このようにＥｒｂＢ２の過剰発現が癌の発症と関連していることから、この受容体に対する抗体を分子標的抗癌剤として使用することが試みられている。具体例としては、ＥｒｂＢ２タンパク質を標的とし、一般的に乳癌の治療薬として使用される抗体ＥｒｂＢ２抗体（一般名トラスツマブ、商品名ハーセプチン）があげられる。しかしながら、ＥｒｂＢ２を標的とする抗癌剤の投与は、前記受容体を過剰発現している癌症例に限られている。したがって、新たな抗癌剤の提供が望まれている。

また、乳癌患者の治療方針を決定するにあたっては、例えば、予め、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）の過剰発現の有無が確認される。前述のハーセプチンが適応される患者が、ＥｒｂＢ２過剰発現の認められる症例に限られるためである。前記ＥｒｂＢ２の過剰発現の検査方法としては、従来、ハーセプテスト（Hercep Test）が採用されている。これは、細胞表面に発現したＥｒｂＢ２をモノクローナル抗体で免疫染色する方法であり、０、１＋、２＋および３＋の４段階で判定し、２＋および３＋を過剰発現と評価するものである。このＥｒｂＢ２の検出においては、チロシンリン酸化によって活性化したＥｒｂＢ２の検出が望まれる。しかし、リン酸化部位の特異的な検出を試みると、他のリン酸化されたＥｒｂＢファミリーも検出してしまうという問題がある。このため、過剰発現したＥｒｂＢ２がリン酸化を受けることによって、実際に、シグナル伝達経路が働いているか否かは、判断し難いという問題がある。さらに、ＥｒｂＢ２が過剰発現している場合であっても、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達が実際に働いていなければ、ハーセプチンによる治療は、不適切となってしまう。

Oncology vol.20，p1763−1771，2006 Journal of Clinical Oncology，vol.25，p587−595，2007

そこで、本発明は、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介したシグナル伝達経路の活性化を阻害する方法、ならびにそれに用いるシグナル伝達阻害剤の提供を目的とする。また、本発明は、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介したシグナル伝達が関与する癌に対する抗癌剤ならびに癌の治療方法の提供を目的とする。さらに、本発明は、ヒト細胞において、前記ＥｒｂＢ２を介したシグナル伝達経路が働いているか否かを判定する方法の提供を目的とする。

前記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
１．シグナル伝達経路のダウンレギュレーションの有無を判定する方法であって、
前記シグナル伝達経路が、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路であり、
ヒトＦＲＳ２βおよびヒトＦＲＳ２β遺伝子の転写産物の少なくとも一方を検出する工程を含む、ダウンレギュレーション判定方法；
２．前記検出する工程における検出量が、予め設定されたカットオフ値よりも大きい場合に、ＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路のダウンレギュレーションが存在すると判定する、上記１に記載のダウンレギュレーション判定方法。
３．前記ヒト細胞がＥｒｂＢ２を発現している、上記１または２に記載のダウンレギュレーション判定方法；
４．ヒト癌細胞に対する抗ＥｒｂＢ２抗体を標的とする抗癌剤による治療の要否の判断を補助する方法であって、
ヒト癌細胞由来の生体試料において、ヒトＦＲＳ２βおよびヒトＦＲＳ２β遺伝子の転写産物の少なくとも一方を検出する工程を含む、方法；
５．前記検出する工程における検出量が、予め設定されたカットオフ値よりも大きい場合に、前記抗ＥｒｂＢ２抗体による治療を要しないと判定する、上記４に記載の方法；
６．前記ヒト癌細胞がＥｒｂＢ２を発現している、上記４または５に記載の方法；
７．シグナル伝達経路の活性化を阻害するシグナル伝達阻害剤であって、
前記シグナル伝達経路は、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路であり、
核酸を含み、
前記核酸は、配列番号２に記載の塩基配列における１番目〜５５５番目の領域を含む塩基配列からなる核酸であり、
前記核酸は、コードするポリペプチドを細胞内で発現する、シグナル伝達阻害剤。
８．前記シグナル伝達阻害剤が、さらにベクターを含み、前記核酸が前記ベクターに連結されている、上記７に記載のシグナル伝達阻害剤；
９．シグナル伝達経路の活性化を阻害するシグナル伝達阻害剤であって、
前記シグナル伝達経路は、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路であり、
ポリペプチドを含み、
前記ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１番目〜１８５番目の領域を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドである、シグナル伝達阻害剤。

本発明者等は、鋭意研究の結果、ＦＲＳ２βが、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達をダウンレギュレーションすることを見出した。そして、さらに、ＦＲＳ２βのＰＴＢドメイン（リン酸化チロシン結合ドメイン）、および、ＦＲＳ２βのＥＲＫ２（細胞外シグナル制御キナーゼ２）との結合ドメイン（以下、「ＥＲＫ２結合ドメイン」という）の少なくとも一方を有するポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」という）であれば、前記ダウンレギュレーションが生じることを見出した。なお、ＦＲＳ２βのＥＲＫ２結合ドメインは、本発明者らが決定したドメインである。

このように、本発明のポリペプチドによれば、前記ＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路がダウンレギュレーションされる。このため、例えば、目的のヒト細胞に、本発明のポリペプチドを導入したり、本発明のポリペプチドを発現する核酸を導入することによって、前記細胞における前記シグナル伝達を抑制できる。さらに、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達は、前述のように、癌の発症に関与していることから、本発明によりシグナル伝達を阻害することで、癌の発症を予防し、また、癌の治療を行うことができる。また、前記シグナル伝達の阻害によって、例えば、細胞の癌化ならびに細胞の増殖や生育を抑制できることからも、本発明は癌の予防や治療に有用といえる。

また、ＦＲＳ２βによりＥｒｂＢ２のシグナル伝達がダウンレギュレーションされることから、目的の細胞におけるＦＲＳ２βを検出することによって、前記シグナル伝達が働いているか否かも判定できる。そして、その判断結果に基づけば、例えば、ＥｒｂＢ２の機能を阻害する、ハーセプチン等の分子標的薬による治療の要否も判断できる。このように本発明は、例えば、医療分野や、分子細胞学等の分野において、非常に有用な技術といえる。

図１は、本発明の一実施例において、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のコロニー形態を示す写真である。 図２は、前記実施例において、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のコロニー数を示すグラフである。 図３は、本発明のその他の実施例において、ＦＲＳ２βを発現させた細胞の経時的な増殖を示すグラフである。 図４は、本発明のさらにその他の実施例において、ＥｒｂＢ２およびＦＲＳ２βを発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。 図５は、本発明のさらにその他の実施例において、ＭＣＦ−７細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。 図６は、本発明のさらにその他の実施例において、ＦＲＳ２βを発現させたＢＴ４７４細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。 図７は、本発明のさらにその他の実施例において、ＥｒｂＢ２およびＦＲＳ２βを発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。 図８において、(Ａ)は、本発明のさらにその他の実施例における、内因性にＥｒｂＢ２を過剰発現しているヒト乳癌細胞株ＢＴＢ４７４に対するレンチウイルスによる感染効率を調べるため、ｄ２Ｖｅｎｕｓ発現レンチウイルスを感染させ、ｄ２Ｖｅｎｕｓ発現細胞をＦＡＣＳにて分離した結果を示す図であり、（Ｂ）は、ＦＲＳ２βを発現するレンチウイルスおよびコントロールｄ２Ｖｅｎｕｓ発現細胞ライセートの電気泳動の写真であり、（Ｃ）は、ハーセプチンの濃度と培養細胞の吸光度との関係を示すグラフである。 図９は、本発明のさらにその他の実施例において、乳癌細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。 図１０において、（Ａ）は、本発明のさらにその他の実施例における、各種癌細胞のマイクロアレイ解析の結果を示す写真であり、（Ｂ）は、乳癌細胞のマイクロアレイ解析の結果を示す写真である。

＜シグナル伝達阻害方法＞
本発明のシグナル伝達阻害方法は、前述のように、シグナル伝達経路の活性化を阻害するシグナル伝達の阻害方法であって、前記シグナル伝達経路は、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路であり、前記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ｂ１）および（Ｂ２）からなる群から選択された少なくとも一つのポリペプチドにより、前記シグナル経路の活性化を阻害する方法である。
（Ａ１） 配列番号１に記載のアミノ酸配列における１番目〜１８５番目の領域を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ａ２） 前記（Ａ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ヒトＦＲＳ２βのＰＴＢドメインと同等の機能を有するポリペプチド
（Ｂ１） 配列番号１に記載のアミノ酸配列における２３２番目〜２５２番目または２３７番目〜２５２番目の領域を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ２） 前記（Ｂ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ヒトＥＲＫ２と結合する機能を有するポリペプチドである。

ＥｒｂＢ２は、前述のように、シグナル伝達に関与するＥｒｂＢファミリーに属する受容体型チロシンキナーゼである。ＥｒｂＢ２は、同じファミリーであってＥＧＦ（上皮増殖因子）等をリガンドとするＥｒｂＢ１とは異なり、対応するリガンドを有さない受容体である。このＥｒｂＢ２は、外部からの刺激により、ホモ二量体化や他の受容体とのヘテロ二量体化が誘導され、これによって、ＥｒｂＢ２の細胞内ドメインにおけるキナーゼドメインが活性化される。ＥｒｂＢ２は、ＨＥＲ２、または、ｎｅｕとも呼ばれる。

ヒトＦＲＳ２βは、ＳＮＴ−２またはＦＲＳ３とも呼ばれる。ＦＲＳ２βは、ＦＧＦＲ（繊維芽細胞成長因子受容体）やニュートロフィン受容体のシグナル伝達に関与するドッキングタンパク質であり、以下のことが知られている。ＦＲＳ２βは、Ｎ末端にミリスチレーションシグナルを持つことにより、細胞膜の脂質に結合している。そして、前記ＦＧＦＲやニュートロフィン受容体が活性化すると、ＦＲＳ２βは、ＦＲＳ２βのＰＴＢドメイン（リン酸化チロシン結合ドメイン）を介して、前記受容体の細胞内ドメインに結合する。前記受容体に結合したＦＲＳ２βは、さらに、チロシン残基にリン酸化を受ける。ＦＲＳ２βがリン酸化を受けると、このチロシンリン酸化ドメインに、各種シグナル伝達分子（例えば、Ｓｈｐ２、Ｇｒｂ２等）が結合し、これらのシグナル伝達分子が活性化する。そして、これらのシグナル伝達分子の活性化により、例えば、Ｒａｓ−ＥＲＫ経路等の活性化が引き起こされる。しかしながら、ＦＲＳ２βは、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達において、すでに報告されている前記ＦＧＦＲのシグナル伝達における機能とは、全く異なる機能を示す。そして、このことは何ら報告されていない。ＥｒｂＢ２のシグナル伝達において、ＦＲＳ２βが、シグナル伝達の活性化ではなく、ダウンレギュレーションを引き起こすことは、前述のように、本発明者らがはじめて見出したことである。そして、本発明者らは、さらに、ＦＲＳ２βにおけるＰＴＢドメイン、および、ＥＲＫ２と結合するドメイン（ＥＲＫ２結合ドメイン）の少なくとも一方によれば、前記ダウンレギュレーションを実現できることを見出した。具体的には、例えば、ＥｒｂＢ２の自己リン酸化や下流分子のリン酸化が阻害されるというような、シグナル伝達のダウンレギュレーションが生じる。

ヒトＦＲＳ２βのアミノ酸配列、ヒトＦＲＳ２β遺伝子の完全長配列、および、ヒトＦＲＳ２βをコードするＣＤＳ配列（終止コドンを含む）等は、例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００６６５３に登録されている。ヒトＦＲＳ２βのアミノ酸配列を配列番号１に、ヒトＦＲＳ２β遺伝子のＣＤＳ配列（ｃＤＮＡ）を配列番号２に、それぞれ示す。ヒトＦＲＳ２βのＰＴＢドメインは、配列番号１のアミノ酸配列における１番目〜１８５番目の領域（配列番号３）であり、そのコード配列は、配列番号２のｃＤＮＡ配列における１番目〜５５５番目の領域（配列番号４）である。また、ヒトＦＲＳ２βのＥＲＫ２結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列における２３７番目〜２５２番目の領域（配列番号５）であり、そのコード配列は、配列番号２のｃＤＮＡ配列における７０９番目〜７５６番目の領域（配列番号６）である。

本発明におけるポリペプチドは、ＰＴＢドメインの機能、および、ヒトＥＲＫ２と結合する機能の少なくも一方を有するポリペプチドであればよい。

まず、ＰＴＢドメインの機能を有するポリペプチドとしては、例えば、下記（Ａ１）〜（Ａ２）に示すポリペプチドがあげられる。
（Ａ１） 配列番号１に記載のアミノ酸配列における１番目〜１８５番目の領域を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ａ２） 前記（Ａ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ヒトＦＲＳ２βのＰＴＢドメインと同等の機能を有するポリペプチド

前記（Ａ２）における「ＰＴＢドメインと同様の機能」とは、例えば、ヒトＥｒｂＢ２と結合する機能があげられる。前記（Ａ２）において、欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、例えば、ヒトＦＲＳ２βのＰＴＢドメインの機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。前記欠失等が可能なアミノ酸残基数は、例えば、５０アミノ酸残基に対して、１〜４個が好ましく、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。また、前記（Ａ１）のポリペプチドに対するアミノ酸配列の相同性は、例えば、７０％以上である。

前記（Ａ１）のポリペプチドは、例えば、前述のように、ＰＴＢドメインを含むポリペプチドでもよいし、下記（Ａ３）に示す、ＰＴＢドメインのみからなるポリペプチドであってもよい。
（Ａ３） 配列番号１に記載のアミノ酸配列における１番目〜１８５番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（配列番号３）

つぎに、ＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドとしては、例えば、下記（Ｂ１）〜（Ｂ２）に示すポリペプチドがあげられる。
（Ｂ１） 配列番号１に記載のアミノ酸配列における２３２番目〜２５２番目または２３７番目〜２５２番目の領域を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ２） 前記（Ｂ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ヒトＥＲＫ２と結合する機能を有するポリペプチド

前記（Ｂ２）において、欠失、置換または付加が可能なアミノ酸残基数は、例えば、ヒトＥＲＫ２結合ドメインの機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。前記欠失等が可能なアミノ酸残基数は、例えば、５０アミノ酸残基に対して、１〜４個が好ましく、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個である。また、前記（Ｂ１）のポリペプチドに対するアミノ酸配列の相同性は、例えば、７０％以上である。

前記ＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドは、例えば、前述のようにＥＲＫ２結合ドメインを含むポリペプチドでもよいし、下記（Ｂ３）に示す、ＥＲＫ２結合ドメインのみからなるポリペプチドであってもよい。
（Ｂ３） 配列番号１に記載のアミノ酸配列における２３２番目〜２５２番目または２３７番目〜２５２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（配列番号５）

また、前記ＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドは、例えば、下記（Ｂ４）に示すポリペプチドであってもよい。
（Ｂ４） 配列番号１に記載のアミノ酸配列における２５０、２５１、３１５および３１６番目のアミノ酸の少なくとも１つを含むアミノ酸配列からなるポリペプチド

配列番号１において、２５０、２５１、３１５、３１６番目のアミノ酸は、ＦＲＳ２βにおけるＥＲＫ２との結合部位であり、本発明者らによって決定された。前記ポリペプチドとしては、例えば、２５０−２５１番目のアミノ酸を含むペプチドや、３１５―３１６番目のアミノ酸を含むペプチド、２５０−３１６番目のアミノ酸を含むペプチドがあげられる。また、本発明においては、前記ＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドに代えて、配列番号１に記載のアミノ酸配列における２５０、２５１、３１５または３１６番目のアミノ酸であってもよい。

本発明におけるポリペプチドは、前述のようなＰＴＢドメインの機能を有するポリペプチドおよびＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドのいずれか一方でもよいし、両者であってもよい。また、本発明におけるポリペプチドは、ＰＴＢドメインおよびＥＲＫ２結合ドメインの両方の機能を有するポリペプチドであってもよい。前記両ドメインの機能を有するポリペプチドとしては、例えば、下記（Ｃ１）〜（Ｃ３）に示すポリペプチドがあげられる。なお、下記（Ｃ３）において、欠失等のアミノ酸数は、例えば、前述と同様である。
（Ｃ１） 配列番号１のアミノ酸配列からなるヒトＦＲＳ２β
（Ｃ２） 前記（Ａ１）および（Ａ２）の少なくも一方のポリペプチドと前記（Ｂ１）および（Ｂ２）の少なくとも一方のポリペプチドとを含む融合ポリペプチド
（Ｃ３） 前記（Ｃ１）または（Ｃ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＰＴＢドメインと同等の機能とヒトＥＲＫ２と結合する機能とを有するポリペプチド

前述のように、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路は、少なくともＰＴＢドメインの機能を有するポリペプチドおよびＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドの少なくとも一方が存在することによって、ダウンレギュレーションが生じる。したがって、本発明においては、少なくともいずれかのドメインを有するポリペプチドが、目的とするヒト細胞に存在すればよい。このため、本発明においては、例えば、前記ポリペプチドをコードする核酸を目的細胞に投与し、細胞内で前記ポリペプチドを発現させてもよいし、ポリペプチドを目的細胞に投与してもよい。そこで、以下に、第１の実施形態として、核酸を含むシグナル伝達阻害剤を導入する形態を、第２の実施形態として、ポリペプチドを含むシグナル伝達阻害剤を導入する形態を、それぞれ説明する。なお、これらは例示であり、本発明は、これらの実施形態には制限されない。

第１の実施形態（核酸の投与）
本発明のシグナル伝達阻害方法は、例えば、ヒト細胞に、核酸を含むシグナル伝達阻害剤を投与する工程を含み、前記核酸は、前記ポリペプチドをコードする核酸であり、前記核酸は、ヒト細胞内で前記ポリペプチドを発現する。なお、前記核酸を含むシグナル伝達阻害剤を、以下、本発明における「第１のシグナル伝達阻害剤」ともいう。

前記核酸としては、前述のようなポリペプチドをコードする核酸であればよい。核酸の種類は、制限されず、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等があげられる。また、前記核酸は、例えば、天然由来であっても、遺伝子工学により合成したものであってもよい。

まず、ＰＴＢドメインの機能を有するポリペプチドをコードする核酸としては、例えば、下記（ａ１）および（ａ２）に示す核酸があげられる。
（ａ１） 配列番号２に記載の塩基配列における１番目〜５５５番目の領域を含む塩基配列からなる核酸
（ａ２） 前記（ａ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸であり、ヒトＦＲＳ２βのＰＴＢドメインと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸

前記（ａ２）において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、例えば、核酸がコードするポリヌクレオチドが、ＰＴＢドメインの機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。前記塩基数としては、特に制限されないが、例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。

前記（ａ２）に示す核酸は、例えば、ＰＴＢドメインの機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（ａ１）の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であってもよいし、前記（ａ１）の核酸との相同性が９０％以上の核酸でもよい。ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、前記（ａ１）の核酸のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。

前記（ａ１）の核酸は、例えば、前述のようにＰＴＢドメインのコード配列を含む核酸でもよいし、下記（ａ３）に示す、ＰＴＢドメインのコード配列のみからなる核酸であってもよい。
（ａ３） 配列番号２に記載の塩基配列における１番目〜５５５番目塩基配列からなる核酸（配列番号４）

また、前記ＰＴＢドメインの機能を有するポリペプチドをコードする核酸としては、例えば、下記（ａ４）または（ａ５）に示す核酸であってもよい。
（ａ４） 配列番号１に記載のアミノ酸配列における１番目〜１８５番目の領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸
（ａ５） 前記（ａ４）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸であり、ヒトＦＲＳ２βのＰＴＢドメインと同等の機能を有するポリペプチドをコードする核酸

つぎに、ＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドをコードする核酸としては、例えば、下記（ｂ１）および（ｂ２）に示す核酸があげられる。
（ｂ１） 配列番号２に記載の塩基配列における７０９番目〜７５６番目の領域を含む塩基配列からなる核酸
（ｂ２） 前記（ｂ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸であり、ヒトＥＲＫ２と結合する機能を有するポリペプチドをコードする核酸

前記（ｂ２）において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、例えば、核酸がコードするポリヌクレオチドが、ＥＲＫ２結合ドメインの機能を喪失しない範囲であれば特に制限されない。前記塩基数は、例えば、前述と同様である。

前記（ｂ２）に示す核酸は、例えば、ＥＲＫ２結合ドメインの機能を喪失しない範囲であれば、例えば、前記（ｂ１）の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であってもよいし、前記（ｂ１）の核酸との相同性が９０％以上の核酸でもよい。前記ストリンジェントな条件は、前述と同様であり、前記相同性の好ましい範囲も、前述と同様である。

前記ＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドをコードする核酸としては、例えば、前述のようにＥＲＫ２結合ドメインのコード配列を含む核酸でもよいし、下記（ｂ３）に示す、ＥＲＫ２結合ドメインのコード配列のみからなる核酸であってもよい。
（ｂ３） 配列番号２に記載の塩基配列における７０９番目〜７５６番目塩基配列からなる核酸（配列番号６）

また、前記ＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドをコードする核酸としては、例えば、下記（ｂ４）〜（ｂ６）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸であってもよい。
（ｂ４） 配列番号１に記載のアミノ酸配列における２３２番目〜２５２番目または２３７番目〜２５２番目の領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸
（ｂ５） 配列番号１に記載のアミノ酸配列における２５０、２５１、３１５および３１６番目のアミノ酸の少なくとも１つを含むアミノ酸配列をコードする核酸であり、ヒトＥＲＫ２と結合する機能を有するポリペプチドをコードする核酸
（ｂ６） 前記（ｂ４）または（ｂ５）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸であり、ヒトＥＲＫ２と結合する機能を有するポリペプチドをコードする核酸

前記（ｂ５）の核酸としては、例えば、２５０−２５１番目のアミノ酸を含むペプチドや、３１５―３１６番目のアミノ酸を含むペプチド、２５０−３１６番目のアミノ酸を含むペプチドをコードする核酸があげられる。

前記核酸は、例えば、前述のようなＰＴＢドメインの機能を有するポリペプチドをコードする核酸およびＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドをコードする核酸のいずれか一方でもよいし、両者であってもよい。また、本発明において、前記核酸は、ＰＴＢドメインおよびＥＲＫ２結合ドメインの両方の機能を有するポリペプチド（タンパク質を含む）をコードする核酸であってもよい。後者のポリペプチドとしては、例えば、下記（ｃ１）〜（ｃ３）に示すポリペプチドがあげられる。なお、下記（ｃ３）において、欠失等の塩基数は、例えば、前述と同様である。また、ヒトＦＲＳ２β遺伝子の完全長配列やその部分配列であってもよい。
（ｃ１） 配列番号２の塩基配列からなるヒトＦＲＳ２β遺伝子
（ｃ２） 前記（ａ１）〜（ａ５）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸と前記（ｂ１）〜（ｂ６）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸とを含むキメラ核酸
（ｃ３） 前記（ｃ１）および（ｃ２）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなる核酸であり、ヒトＰＴＢドメインの機能とヒトＥＲＫ２と結合する機能とを有するポリペプチドをコードする核酸

本実施形態におけるシグナル伝達阻害剤は、前述のような核酸を含んでいればよい。そして、目的とする細胞への前記核酸の導入方法に応じて、例えば、適宜、さらなる物質を含んでいてもよい。前記核酸の導入方法としては、制限されず、従来公知の方法が使用できる。具体例としては、例えば、ベクターを用いる方法と、ベクターを用いない方法があげられる。

前記ベクターを用いる方法の場合、前記シグナル伝達阻害剤は、例えば、さらにベクターを有し、前記ベクターに前記核酸が連結されていることが好ましい。前記ベクターは、制限されず、従来公知のベクターが使用できる。前記ベクターとしては、例えば、非ウイルスベクターとウイルスベクターとがあげられ、目的の細胞や生体内で前記核酸を発現できるベクターを選択することが好ましい。前記非ウイルスベクターとしては、例えば、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen社）、ｐＺｅｏＳＶ（Invitrogen社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Stratagene社）、ｐＣＡＧＧＳ等の発現ベクターが使用できる。また、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶベクター；adeno associated virus）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルスがあげられる。通常、これらのベクターのプロモーターの下流に、発現可能なように前記核酸を挿入すればよい。このようにベクターに前記核酸を挿入した組換えベクターを、前記シグナル伝達阻害剤として使用できる。

前記組換えベクターは、さらに、前記遺伝子の発現を調節する調節配列を含んでもよい。前記調節配列としては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等の構成プロモーター、チミヂンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーターや調節性プロモーターがあげられる。前記調節配列は、例えば、従来公知の方法に基づいて、前記遺伝子の発現を機能的に調節できる部位に配置または結合させればよい。この他にも、例えば、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル、複製起点配列（ｏｒｉ）等を含んでもよい。

また、前記組換えベクターは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等の選択マーカーをコードする配列を有してもよい。

ベクターを用いない方法の場合、前記シグナル伝達阻害剤は、例えば、さらに、リポソームや遺伝子銃用の粒子（金属粒子）を含むことが好ましい。例えば、前記核酸をリポソーム内に取り込ませることによって、前記リポソーム中の核酸を細胞内に取り込ませることができる。また、例えば、前記核酸で被覆した前記粒子を遺伝子銃で細胞に打ち込むことによって、細胞内に前記核酸を導入することができる。このような場合、前記核酸が、細胞内で目的のポリペプチドを発現するように、例えば、プロモーター等の調節配列をさらに含むことが好ましい。

前記核酸を含むシグナル伝達阻害剤を被検体に導入する方法は、制限されない。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで直接体内に導入する方法や、被検体から取り出した目的の細胞や組織にｅｘ ｖｉｖｏで前記シグナル伝達阻害剤を導入し、導入後の細胞等を被検体の体内に戻す方法等がある。

前者のｉｎ ｖｉｖｏ法の場合、例えば、前記シグナル伝達阻害剤に、適宜滅菌処理を施した後、被検体に導入すればよい。導入方法は、特に制限されず、例えば、注射や、遺伝子銃による投与、液浸等、従来公知の方法が適宜採用できる。

後者のｅｘ ｖｉｖｏ法の場合、例えば、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、前述のようなウイルスベクターを用いた方法等があげられる。

このように前記核酸を含むシグナル伝達阻害剤を細胞に投与すれば、細胞内で前述のようなポリペプチドが発現される。この発現したポリペプチドによって、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達経路がダウンレギュレーションされる。

第２の実施形態（ポリペプチドの投与）
本発明のシグナル伝達阻害方法は、例えば、ヒト細胞に、前記ポリペプチドを含むシグナル伝達阻害剤を投与する工程を含む。このように、目的の細胞に直接前記ポリペプチドを投与することによっても、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達経路をダウンレギュレーションできる。なお、前記ポリペプチドを含むシグナル伝達阻害剤を、以下、本発明の「第２のシグナル伝達阻害剤」ともいう。

前記ポリペプチドは、例えば、天然物でもよいし、化学合成による合成物でもよい。容易に大量調製が可能であることから、組換えＤＮＡ技術を用いて発現させたポリペプチドやタンパク質が好ましい。このような組換えＤＮＡ技術を用いる調製方法としては、特に制限されないが、例えば、前記第１の実施形態で述べた組換えベクターが使用できる。前記組換えベクターを、例えば、宿主−ベクター系に基づいて、適当な宿主に導入することにより、前記ポリペプチドを発現させることができる。このような方法により得られたポリペプチドは、例えば、遠析、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の精製処理を必要に応じて施し、回収した精製ポリペプチドを、本実施形態のシグナル伝達阻害剤として使用できる。

前記ポリペプチドを含むシグナル伝達阻害剤を被検体に投与する方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。例えば、目的の細胞や組織等の種類に応じて適宜採用できるが、例えば、注射、液浸等があげられる。

前記シグナル伝達阻害剤は、さらに、リポソームやポリマーを含んでもよく、前記リポソーム中に前記ポリペプチドを封入したり、前記ポリペプチドに前記ポリペプチドを接合させてもよい。

このように前記ポリペプチドを含むシグナル伝達阻害剤を細胞に投与することによって、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達経路をダウンレギュレーションができる。

本発明のシグナル伝達阻害方法において、対象となるヒト細胞は、制限されないが、例えば、ＥｒｂＢ２が過剰発現した細胞に有用である。本発明において、ＥｒｂＢ２が発現とは、ｅｒｂＢ２遺伝子からのＲＮＡへの転写や、ＥｒｂＢ２タンパク質の発現を含む。ＥｒｂＢ２の過剰発現は発癌と関連していることから、例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、口腔癌、食道癌、脳腫瘍、肺癌、頭頚部癌、皮膚癌、子宮癌、大腸癌、膵臓癌等の癌細胞に、本発明を適用することが有効である。これらの中でも、特に、乳癌は、ＥｒｂＢ２の過剰発現が発癌に関与していることが知られているため、乳癌細胞への適用に有効である。また、前述の癌が発生する可能性がある細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、膀胱、口腔、食道、脳、肺、頭頚部、皮膚、子宮、大腸、膵臓等の正常細胞への適用も有用である。また、対象となるヒト細胞は、生体から採取した細胞でもよいし、生体内の細胞であってもよい。

このような本発明のシグナル伝達阻害方法によれば、細胞におけるＥｒｂＢ２を介したシグナル伝達を阻害できる。これによって、例えば、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達経路の活性化による細胞の癌化を抑制したり、細胞（例えば、癌細胞）の増殖を抑制できる。なお、本発明は、ヒト以外の動物や、動物細胞にも同様に適用できる（以下、同様）。

＜シグナル伝達阻害剤＞
本発明のシグナル伝達阻害剤は、前述のように、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路の活性化を阻害する阻害剤である。本発明のシグナル伝達阻害剤としては、まず、前述のような、核酸を含む第１のシグナル伝達阻害剤があげられる。前記第１の阻害剤は、前記ＰＴＢドメインの機能を有するポリペプチドおよびＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドの少なくとも一方をコードし、細胞内でこれを発現する核酸を含んでいればよい。このような核酸を含む第１のシグナル伝達阻害剤は、前述の通りである。つぎに、本発明のシグナル伝達阻害剤としては、前述のようなポリペプチドを含む第２のシグナル伝達阻害剤があげられる。前記第２の阻害剤は、前記ＰＴＢドメインの機能を有するポリペプチドおよびＥＲＫ２結合ドメインの機能を有するポリペプチドの少なくとも一方を含んでいればよい。このようなポリペプチドを含む第２のシグナル伝達阻害剤は、前述の通りである。

本発明のシグナル伝達阻害剤によれば、細胞のシグナル伝達を阻害できる。これによって、例えば、ＥｒｂＢ２を介したシグナル伝達経路の活性化による細胞の癌化を抑制したり、細胞（例えば、癌細胞）の増殖を抑制できる。したがって、本発明のシグナル伝達阻害剤は、例えば、抗癌剤や細胞増殖阻害剤としても、有用である。

＜癌の治療方法＞
本発明の治療方法は、ヒトの癌の治療方法であって、本発明のシグナル伝達阻害剤を投与する工程を含む。本発明の治療方法においては、本発明のシグナル伝達阻害剤を使用すること自体が特徴であって、その他の工程や条件は制限されない。本発明のシグナル伝達阻害剤の投与方法は、例えば、前述と同様である。具体的には、ヒトの癌化部位に、ｉｎ ｖｉｖｏで、前記シグナル阻害剤を直接投与してもよいし、取り出した目的細胞や組織に、ｅｘ ｖｉｖｏで、前記シグナル阻害剤を導入し、導入後の細胞等をヒトの体内に戻す方法等があげられる。また、本発明を適用する癌は、例えば、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達経路が関与するものが好ましく、例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、口腔癌、食道癌、脳腫瘍、肺癌、頭頚部癌、皮膚癌、子宮癌、大腸癌、膵臓癌等があげられる。また、前述の癌が発生する可能性がある細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、膀胱、口腔、食道、脳、肺、頭頚部、皮膚、子宮、大腸、膵臓、頭頚部等の正常細胞への適用も有用である。なお、本発明の治療方法は、例えば、癌化の予防も含む。

＜抗癌剤＞
本発明の抗癌剤は、ヒトの抗癌剤であって、本発明のシグナル伝達阻害剤を含む。本発明の抗癌剤は、前記シグナル伝達阻害剤を含んでいればよく、その形態は制限されない。また、その使用方法等も、前述の通りである。

前述のように、シグナル伝達経路の受容体であるＥｒｂＢ２の過剰発現が、癌化に関係することが知られている。このため、本発明のシグナル伝達阻害剤を含む抗癌剤は、ＥｒｂＢ２が過剰発現する細胞や、これらのシグナル伝達経路が関与する癌細胞を処理するのに有用である。前記癌細胞としては、例えば、乳癌、卵巣癌、胃癌、膀胱癌、口腔癌、食道癌、脳腫瘍、肺癌、頭頚部癌、皮膚癌、子宮癌、大腸癌、膵臓癌等の癌細胞があげられる。また、前述の癌が発生する可能性がある細胞、例えば、乳房、卵巣、胃、膀胱、口腔、食道、脳、肺、頭頚部、皮膚、子宮、大腸、膵臓、頭頚部等の正常細胞への適用も有用である。なお、本発明の抗癌剤は、例えば、癌化の予防剤も含む。

本発明の抗癌剤は、さらに、従来公知の抗癌剤を含んでもよい。前記抗癌剤としては、ハーセプチン、イレッサ(gefitinib)、タルセバ(erlotinib)、スニチニブ、ラパチニブ等があげられる。

本発明者らの研究より、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達が、ＦＲＳ２βによってダウンレギュレートされている場合、前記モノクローナル抗体によるシグナル伝達阻害効果を促進することがわかった。そこで、本発明のシグナル伝達阻害剤は、従来公知の抗癌剤の薬効促進剤ともいえる。前記抗癌剤としては、ハーセプチン、イレッサ(gefitinib)、タルセバ(erlotinib)、スニチニブ、ラパチニブ等があげられる。この場合、例えば、本発明の薬効促進剤と公知の抗癌剤を併用してもよいし、予め本発明の薬効促進剤を投与した後に、公知の抗癌剤を投与して、治療や予防を行うこともできる。

＜細胞増殖阻害剤＞
本発明の細胞増殖阻害剤は、本発明のシグナル伝達阻害剤を含む。本発明の細胞増殖阻害剤は、前記シグナル伝達阻害剤を含んでいればよく、その形態は制限されない。また、その使用方法等も、前述の通りである。また、本発明の細胞増殖阻害剤を適用する細胞も、制限されないが、前述のような癌細胞や正常細胞があげられる。

＜マーカー＞
本発明のマーカーは、前述のように、シグナル伝達経路のダウンレギュレーションの有無を判定するためのマーカーであって、前記シグナル伝達経路が、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路であり、ヒトＦＲＳ２βおよびヒトＦＲＳ２β遺伝子の転写産物の少なくとも一方を含む。

前述のように、発明者らによって、ヒトＦＲＳ２βが、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達経路をダウンレギュレーションすることが明らかとなった。このため、目的のヒト細胞における、ヒトＦＲＳ２βの発現の有無または発現量を測定すれば、前記シグナル伝達経路がダウンレギュレーションを受けているか否かを判断できる。ヒトＦＲＳ２β遺伝子の転写の有無または転写量（例えば、ｍＲＮＡ量）によっても、同様に判断できる。具体例としては、例えば、ＦＲＳ２βｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ ｖａｌｕｅ 1.452×10^−２をカットオフ値として、ダウンレギュレーションを受けているか否か判断可能である。

ダウンレギュレーションの有無を判断することによって、さらに、以下のようなことが可能になる。
（１）前述のように、ＥｒｂＢ２の過剰発現、および、過剰発現したＥｒｂＢ２の活性化が、癌化の一因であることが知られている。したがって、ヒト細胞について本発明のマーカーを検出し、ダウンレギュレーションの有無を判断すれば、例えば、ヒト細胞の癌化の危険性を判断できる。すなわち、ダウンレギュレーションが起こっていれば、前記シグナル伝達経路に起因する癌化の可能性は低いと判断でき、ダウンレギュレーションが起こっていなければ、前記シグナル伝達に起因する癌化の可能性があると判断できる。
（２）ヒト癌細胞について本発明のマーカーを検出し、ダウンレギュレーションの有無を判断すれば、前記癌細胞の癌化が、前記シグナル伝達経路に起因するものか、他のメカニズムに起因するものかを判断できる。
（３）さらに、前記（２）のように、癌化の原因が前記シグナル伝達経路に起因するか否かを判断すれば、癌の治療方針を決定することも可能となる。一例として、乳癌の治療方針をあげる。乳癌は、約１０〜３０％の患者で、ＥｒｂＢ２の過剰発現が確認されており、このような患者に有効な抗癌剤として、ＥｒｂＢ２の機能を阻害する前記ハーセプチン等のモノクローナル抗体が使用されている。しかし、ＥｒｂＢ２が強陽性でも、ハーセプチンが奏功する症例は約４０％に満たないことが問題になっている。今回、本発明者らの研究より、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達が、ＦＲＳ２βによってダウンレギュレートされている場合、前記モノクローナル抗体によるシグナル伝達阻害効果を促進することがわかった。そこで、患者の乳癌細胞について本発明のマーカーを検出し、ダウンレギュレーションの有無を確認することによって、ハーセプチン等の低分子化合物による治療が適切であるかを判断できる。
（４）また、乳癌に関しては、前述のようにＥｒｂＢ２の過剰発現を検出するハーセプテストが行われている。しかしながら、ＥｒｂＢ２のリン酸化を検出する必要があるものの、この方法では、他のＥｒｂファミリーも検出してしまう。このため、実際に、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達が働いているか否かを判断し難いという問題がある。これに対して、本発明のマーカーを検出して、ダウンレギュレーションの有無を確認すれば、ＥｒｂＢ２自体を検出するのではなく、実際に、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達が働いているか否かを検出することが可能となる。

ヒトＦＲＳ２βのアミノ酸配列およびヒトＦＲＳ２β遺伝子の配列は、前述のように、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００６６５３に登録されている。前記マーカーとしては、例えば、ヒトＦＲＳ２β遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）が好ましく、前記ｍＲＮＡの転写の有無または転写量を測定することが好ましい。

＜マーカーの測定方法＞
本発明のマーカーの測定は、制限されず、マーカーの種類に応じて適宜決定できる。

（１）ヒトＦＲＳ２βの測定
前記本発明のマーカーが、ヒトＦＲＳ２βの場合、例えば、特定のポリペプチドやタンパク質を検出する従来公知の測定方法が採用できる。前記測定方法は、何ら制限されない。具体例としては、例えば、抗体を用いた免疫測定法（イムノアッセイ法）があげられる。前記免疫測定法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラテックス免疫凝集法等の免疫凝集法、ラテックス免疫比朧法等の免疫比朧法、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング法等があげられる。前記免疫測定法としては、中でも、ＥＬＩＳＡが好ましい。前記ＥＬＩＳＡとしては、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法や競合ＥＬＩＳＡ法等があげられる。

免疫測定法によりヒトＦＲＳ２βを測定する場合、検出用抗体としては、例えば、抗ヒトＦＲＳ２β抗体があげられる。前記抗ヒトＦＲＳ２β抗体は、例えば、従来公知の方法によって調製できる。具体例としては、例えば、動物に、ヒトＦＲＳ２βを抗原として接種し、免疫感作することによって、ポリクローナルまたはモノクローナルの抗ヒトＦＲＳ２β抗体が得られる。免疫感作させる宿主細胞の動物の種類は、特に制限されず、例えば、ヒト、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、モルモット等のヒトを除く哺乳動物、ニワトリ、ハト、アヒル、ウズラ等の鳥類等が使用できる。また、動物に対する抗原の接種方法も、特に制限されず、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等が採用できる。このようにして得られる抗体は、通常、免疫グロブリンクラスがＩｇＭまたはＩｇＧである。また、得られた抗体は、例えば、それ自体を抗体として使用でき、さらに、酵素処理して得られるＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２等の抗体の活性フラグメントを、抗体として使用することもできる。

ヒトＦＲＳ２βの測定について、一例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。

すなわち、本発明のマーカーの測定方法は、前述のように、前記マーカーが、ＦＲＳ２βを含むマーカーであり、下記工程（１）および（２）を含む。
（１） 生体試料に、前記ヒトＦＲＳ２βに対する抗ヒトＦＲＳ２β抗体を添加し、前記生体試料中のヒトＦＲＳ２βに、前記抗ヒトＦＲＳ２β抗体を結合させて複合体を形成させる工程
（２） 前記複合体を測定する工程

取り扱い性に優れることから、前記抗体は、例えば、前記（１）工程に先立って、プレート（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）に固定（吸着）させておくことが好ましい。この場合、前記プレートに生体試料を添加し、前記プレート内で前記複合体を形成することができる。前記（２）工程において、前記複合体の測定方法は、特に制限されない。具体例として、前記複合体の抗原（生体試料中のヒトＦＲＳ２β）に、さらに標識化された抗ヒトＦＲＳ２β抗体を結合させ、前記標識化抗体を測定する方法があげられる（サンドイッチ免疫測定法）。前記標識としては、特に制限されず、例えば、酵素標識、蛍光標識、放射能標識等の従来公知の標識があげられる。標識化抗体としては、中でも、酵素標識化抗体が好ましい。

標識化物質として酵素を使用した、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一例を説明する。まず、診断対象となるヒト細胞を採取する。そして、前記細胞からタンパク質を抽出し、抽出画分を調製する。他方、測定目的のヒトＦＲＳ２βに対する抗ヒトＦＲＳ２β抗体を準備し、これを測定容器に固定化する。そして、前記測定容器に前記抽出画分を加える。これによって、固定化抗体と前記抽出画分中の抗原（ヒトＦＲＳ２β）とが反応し、両者が結合する。前記測定容器を洗浄後、さらに、酵素で標識化した抗体（標識化抗ヒトＦＲＳ２β抗体）を加える。これによって、前記固定化抗体に結合した抗原と前記標識化抗体とが反応して、両者が結合し、前記抗原を２つの抗体が挟んだ形状の複合体が形成される。そして、前記抗原と結合しなかった標識化抗体を除去した後、前記複合体における標識（酵素）の活性を測定する。この酵素活性は、前記複合体の量に比例し、前記抽出画分における測定目的の抗原の量を示すこととなる。前記酵素としては、何ら制限されず、例えば、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等が使用できる。この方法において使用する２種類の抗体は、例えば、互いに、抗原に対して異なる結合部位を持つことが好ましい。

（２）ヒトＦＲＳ２βの転写産物（ｍＲＮＡ）の測定
前記本発明のマーカーが、ヒトＦＲＳ２βの転写産物の場合、例えば、ｍＲＮＡの転写の有無や転写量を測定すればよい。これらの測定方法としては、従来公知の測定方法が採用できる。具体例としては、例えば、特異的なプライマーを用いた核酸増幅法や、検出プローブを用いた方法があげられる。前者としては、例えば、ＰＣＲ法、逆転写ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等があげられ、後者としては、例えば、サザンブロット法、ノーザンブロット法等があげられる。なお、特異的プライマーや検出プローブの配列は、ヒトＦＲＳ２β遺伝子およびｍＲＮＡの配列に基づいて適宜決定できる。

ｍＲＮＡの転写を測定する場合、一般的に、逆転写ＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法が広く利用されている。この手法は、例えば、生体試料中で発現したトータルＲＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型として、逆転写ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲによって、前記ｃＤＮＡを鋳型として、目的配列の増幅を行う。これによって、前記生体試料中で発現した目的のｍＲＮＡの量が測定できる。したがって、本発明においては、例えば、生体試料中で発現したヒトＦＲＳ２β遺伝子のｍＲＮＡ以外に、ＰＣＲ等の遺伝子工学的手法によって合成したｃＤＮＡや、増幅した目的配列（増幅ＤＮＡ産物）をマーカーということもできる。なお、トータルＲＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型として合成するｃＤＮＡは、特に制限されないが、例えば、ヒトＦＲＳ２β遺伝子の全長ｃＤＮＡまたはその部分配列を含んでいればよい。また、ｃＤＮＡを鋳型として増幅させる目的配列は、例えば、ヒトＦＲＳ２βの全長ｃＤＮＡ配列でもよいし、部分的なｃＤＮＡ配列でもよい。

＜マーカー測定キット＞
本発明のマーカー測定キットは、前記ヒトＦＲＳ２βを含むマーカーを測定するための第１のキットと、前記ヒトＦＲＳ２β遺伝子の転写物を含むマーカーを測定するための第２のキットがあげられる。前記第１のキットは、ヒトＦＲＳ２βに特異的な抗体を含む。前記抗体は、前述と同様である。また、第２のキットは、ヒトＦＲＳ２β遺伝子に特異的なプローブ、および、ヒトＦＲＳ２β遺伝子に特異的なプライマーからなる群から選択された少なくとも一つを含む。前記プローブやプライマーは、前述と同様である。本発明のマーカー測定キットは、さらに、取り扱い説明書を含んでもよい。

前述のように本発明のマーカーの検出によって、シグナル伝達経路のダウンレギュレーションを判定できる。したがって、本発明のマーカー測定キットは、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路のダウンレギュレーションの有無を判定するためのキットともいえる。また、ダウンレギュレーションの有無から、ヒト癌細胞に対する、抗癌剤による治療の要否を判定するためのキットともいえる。前記抗癌剤としては、何ら制限されず、例えば、従来公知のハーセプチン、イレッサ(gefitinib)、タルセバ(erlotinib)、スニチニブ、ラパチニブ等があげられる。

＜診断方法＞
本発明の診断方法は、ヒト癌細胞に対する抗癌剤による治療の要否を判断する診断方法であって、本発明のマーカーを検出する工程を含む。前述のように、ＥｒｂＢ２の過剰発現が原因となる癌に対しては、例えば、前述のハーセプチン等が分子標的抗癌剤として使用されている。しかし、前述のように、ＥｒｂＢ２が強陽性でも、ハーセプチンが奏功する症例は約４０％に満たないことが問題になっている。今回、本発明者らの研究より、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達が、ＦＲＳ２βによってダウンレギュレートされている場合、前記モノクローナル抗体によるシグナル伝達阻害効果を促進することがわかった。このため、本発明では、マーカーを検出し、ダウンレギュレーションの有無を判断することによって、前記分子標的抗癌剤による治療の要否を判断できる。

＜核酸・ポリペプチドの使用＞
本発明は、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路の活性化を阻害するための、前記（ａ１）〜（ａ５）および（ｂ１）〜（ｂ６）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸の使用である。また、本発明は、ヒトの癌を治療するための、前記（ａ１）〜（ａ５）および（ｂ１）〜（ｂ６）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸の使用である。また、本発明は、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路の活性化を阻害するための、前記（Ａ１）〜（Ａ３）および（Ｂ１）〜（Ｂ４）からなる群から選択された少なくとも一つのポリペプチドの使用である。また、本発明は、ヒトの癌を治療するための、前記（Ａ１）〜（Ａ３）および（Ｂ１）〜（Ｂ４）からなる群から選択された少なくとも一つのポリペプチドの使用である。

つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例によってなんら制限されない。

（組換えベクターの作製）
ＦＲＳ２βの全長ｃＤＮＡと、Ｃ末端にＦＬＡＧを付加するＦＬＡＧ−ｔａｇのコード配列とを、レトロウイルスベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏベクター：東大医科研・北村俊雄教授より供与）、プラスミドベクター（商品名ｐｃＤＮＡ：Ｓｉｇｍａ社製）、レンチウイルス（ＣＳII−ＥＦベクター、理化学研究所・バイオリソースセンターより供与）に連結した。これらを、ＦＲＳ２β発現レトロウイルスベクター、ＦＲＳ２β発現プラスミドベクター、ＦＲＳ２β発現レンチウイルスベクターという。これらのベクターから発現する目的のポリペプチドは、Ｃ末端にＦｌａｇ−ｔａｇが付加される。また、配列番号１に示すＦＲＳ２βのアミノ酸配列のうち、２３２番目〜２５２番目の領域を欠損したΔ232-252ＦＲＳ２βをコードするｃＤＮＡを調製し、同様に前記レトロウイルスベクター、前記プラスミドベクターまたは前記レンチウイルスベクターに連結した。これを、Δ232-252ＦＲＳ２β発現レトロウイルスベクター、Δ232-252ＦＲＳ２β発現プラスミドベクター、Δ232-252ＦＲＳ２β発現レンチウイルスベクターという。

ヒト野生型ＥｒｂＢ２の全長ｃＤＮＡを、ＮＣＢＩデータベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４４４８（ヒトｅｒｂＢ２）に基づいて調製した。そして、前記全長ｃＤＮＡを、プラスミドベクター（商品名ｐｃＤＮＡ−ｎｅｏ：Sigma社製）に連結した。野生型ＥｒｂＢ２のｃＤＮＡを連結した発現ベクターを、野生型ＥｒｂＢ２発現プラスミドベクターという。なお、前記ｃＤＮＡを連結していないベクターをコントロールベクターとした。

膜貫通ドメインにアミノ酸変異があるヒト活性型ＥｒｂＢ２の全長ｃＤＮＡを、ＮＣＢＩデータベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４４４８（ヒトｅｒｂＢ２）に基づいて調製した。前記変異は、ヒト野生型ＥｒｂＢ２において、６５９番目のアミノ酸バリンがグルタミン酸に変異している。そして、前記全長ｃＤＮＡを、前記プラスミドベクターに連結した。活性型ＥｒｂＢ２のｃＤＮＡを連結した発現ベクターを、活性化型ＥｒｂＢ２発現プラスミドベクターという。

ヒト野生型ＥｒｂＢ２のｃＤＮＡにラット乳癌遺伝子に存在する細胞膜貫通ドメインの変異に相当する変異を入れた、ＥｒｂＢ２変異体のｃＤＮＡを調製した。前記変異は、ヒト野生型ＥｒｂＢ２において、６５９番目のアミノ酸バリンがグルタミン酸に変異している。そして、前記全長ｃＤＮＡを、前記プラスミドベクターに連結した。変異型ＥｒｂＢ２のｃＤＮＡを連結した発現ベクターを、変異型ＥｒｂＢ２発現プラスミドベクターまたは活性型ＥｒｂＢ発現プラスミドベクターという。

ヒトＥｒｂＢ３の全長をコードするｃＤＮＡを、ＮＭ＿００１９８２（ヒトｅｒｂＢ３）に基づいて調製した。そして、前記ｃＤＮＡを、前述と同様のプラスミドベクターに連結した。ＥｒｂＢ３のｃＤＮＡを連結した発現ベクターを、ＥｒｂＢ３発現プラスミドベクターという。

１．ＦＲＳ２βによるトランスフォーミング活性の抑制
ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＥｒｂＢ２およびＦＲＳ２βを発現させて、ＦＲＳ２βによるトランスフォーミング活性の抑制を確認した。

（軟寒天コロニー形成アッセイ）
前記活性型ＥｒｂＢ２発現プラスミドベクターを用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクションし、安定形質転換株を得た（参考文献：ＢＢＲＣ１７８，ｐ７２４−7３２，１９９１）。この細胞に、ＦＲＳ２β発現レトロウイルスベクター、Δ232-252ＦＲＳ２β発現レトロウイルスベクターならびに空のレトロベクターをそれぞれ導入し、ピューロマインで処理し、安定形質転換株を選択した。これらの形質転換細胞を、１０％ウシ新生仔血清（ＮＢＣＳ）および３％アガロースを含むＤＭＥＭ培地に懸濁した。続いて、この懸濁液（細胞数：約１０００個）を、直径３．５ｃｍ培養皿の０．６％アガロース含有ＤＭＥＭ培地上に重層した。そして、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養し、３週間後、肉眼で確認できるコロニー（直径約０．２ｍｍ以上の肉眼で確認できるコロニー数をカウントした。なお、コントロールとして、各レトロベクターを導入していない活性化ＥｒｂＢ２を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞についても、同様にアッセイを行った。

アッセイの結果を、図１および図２に示す。図１は、発現レトロウイルスベクターを導入していない活性化ＥｒｂＢ２発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形態および発現レトロウイルスベクターを導入した活性化ＥｒｂＢ２発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形態を示す写真である。同図において、上の写真は、発現レトロウイルスベクターを導入していない活性化ＥｒｂＢ２発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形態の写真である。下の写真は、各種発現レトロウイルスベクターを導入した活性化ＥｒｂＢ２発現ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形態の写真であって、左が、空のレトロウイルスベクターのみを導入した細胞(コントロール)、真ん中が、ＦＲＳ２β発現ベクターを導入した細胞、右が、Δ232-252ＦＲＳ２β発現ベクターを導入した細胞の結果である。図２は、前記各細胞のコロニー数を示すグラフである。同図において、縦軸は、５×１０^４個の細胞の培養から形成されたコロニー数を示す。同図において、「Control」は、空のレトロウイルスベクターのみを導入した細胞、「ＦＲＳ２β」は、ＦＲＳ２β発現ベクターを導入した細胞、「Δ232-252ＦＲＳ２β」は、Δ232-252ＦＲＳ２β発現ベクターを導入した細胞の結果である。

両図に示すように、活性型ＥｒｂＢ２のみを発現させた細胞、または、この細胞に空のレトロウイルスベクターのみを導入した細胞（図２においてControl）からは、トランスフォームされたコロニーが観察された。これと比較して、ＦＲＳ２βを発現させた細胞は、トランスフォームされたコロニーの数は少なかった。また、ＦＲＳ２βの232番目〜252番目の領域を欠くΔ232/252ＦＲＳ２βを発現させた細胞は、トランスフォームされたコロニーの数に回復がみられた。この結果から、ＦＲＳ２βを発現させることで、ＥｒｂＢ２によるトランスフォーミング活性が抑制されること、また、２３２番目〜２５２番目の領域を欠くΔ232/252ＦＲＳ２βは、野生型ＦＲＳ２βに比較し、ＥｒｂＢ２のトランスフォーミング活性の抑制効果が減弱していることがわかった。

２．ＦＲＳ２βによるヒト乳癌細胞の増殖抑制
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７細胞にＦＲＳ２βを発現させて、その増殖の抑制を確認した。

ＭＣＦ−７細胞に、前記「１.」と同様にして、ＦＲＳ２β発現レトロウイルスベクターを導入し、安定形質転換株を得た。この形質転換細胞を、０．５％胎児牛血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭを用いて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、且つ、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で培養を行った。そして、前記ＥＧＦ刺激の刺激から所定時間（ｄａｙ）における細胞数をカウントした。また、コントロールとして、コントロールベクターを導入したＭＣＦ−７細胞（ｍｏｃｋ)についても、同様に増殖アッセイを行った。

これらの結果を図３に示す。同図は、形質転換したＭＣＦ−７細胞の増殖に関する経時変化を示すグラフである。同図において、横軸は、日数（ｄａｙ）、縦軸は、細胞数(×１０^４)を示す。同図において、「ＦＲＳ２β ＥＧＦ＋」は、ＦＲＳ２β発現ベクターを導入して、ＥＧＦ刺激を与えた形質転換体、「ＦＲＳ２β ＥＧＦ−」は、ＦＲＳ２β発現ベクターを導入して、ＥＧＦ刺激を与えていない形質転換体、「ｍｏｃｋ ＥＧＦ＋」は、ＥＧＦ刺激を与えたコントロール、「ｍｏｃｋ ＥＧＦ−」は、ＥＧＦ刺激を与えていないコントロールの結果である。同図の「ＦＲＳ２β ＥＧＦ＋」に示すように、ＥＧＦおよび血清で刺激したヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７細胞は、ＦＲＳ２βの発現によって、増殖が著しく抑制された。

３．ＦＲＳ２βとＥｒｂＢ２との結合性
ＦＲＳ２βがＥｒｂＢ２に結合するか否かを確認した。

野生型ＥｒｂＢ２発現プラスミドベクター、活性化型ＥｒｂＢ２発現プラスミドベクター、ＦＲＳ２β発現プラスミドベクター、および、コントロールベクターを、それぞれＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性に導入した。これらの形質転換体を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で培養した。得られた培養細胞を、ＴＮＥバッファーを用いて可溶化させた。回収した可溶化液と抗体（抗Ｆｌａｇ Ｍ２モノクローナル抗体：Sigma-Aldrich社）とを４℃で１時間インキュベートした後、さらに、protein G‐Agarose ビーズ（Amersham社製）を添加して、４℃で２時間インキュベートした。遠心分離で上清を除去し、回収した前記ビーズを前記ＴＮＥバッファーで５回洗浄した。洗浄後、前記ビーズに２％ドデシル硫酸含有サンプルバッファーを添加して、３分間ボイルし、免疫共沈実験のサンプルとした。そして、前記サンプルをドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、抗体を用いてイムノブロッティングを行った。イムノブロッティングの抗体としては、抗ＥＧＦＲ抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）および抗ＥｒｂＢ２抗体（OP15，Calbiochem社製）を使用した。

これらの結果を図４に示す。同図は、ＥｒｂＢ２およびＦＲＳ２βを発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。同図において、上から、１番目のブロックは、ＥｒｂＢ２のバンド、２番目のブロックは、ＦＲＳ２βのバンドを示すイムノブロッティングの結果であり、３番目のブロックは、可溶化液の電気泳動の結果である。同図のＥｒｂＢ２のレーンにおいて、「−」は、ＥｒｂＢ２発現ベクター未導入、「ｗｔ」は、野生型ＥｒｂＢ２発現ベクターの導入、「ＶＥ」は、活性化型ＥｒｂＢ２発現ベクターの導入を示し、ＦＲＳ２βのレーンにおいて、「−」は、ＦＲＳ２β発現ベクターの未導入、「＋」は、ＦＲＳ２β発現ベクターの導入を示す。同図に示すように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で発現したＦＲＳ２βは、野生型ＥｒｂＢ２および活性化型ＥｒｂＢ２と結合することが確認できた。

４．ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３に対するＦＲＳ２βの影響
ＥｒｂＢ２は、同じＥｒｂファミリーのＥｒｂＢ３とヘテロ二量体を形成し、この二量体化の誘導によって、前記受容体（ＥｒｂＢ２やＥｒｂＢ３）の細胞内ドメインが活性化されることが知られている。そこで、ＦＲＳ２βが、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３の活性化に与える影響を確認した。

ＦＲＳ２β発現レトロウイルスベクター、および、コントロールベクターを、それぞれ、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７細胞に導入し、ピューロマイシンにて選択し、安定形質転換株を得た。これらの形質転換体を、０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で、１２時間培養した後、ＥｒｂＢ３のリガンドであるニューレギュリン（ＮＲＧ：１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、１０分間刺激を行った。そして、抗体として、抗ＥｒｂＢ２抗体（OP15、Calbiochem）および抗ＥｒｂＢ３抗体（sc-285G、Santa Cruz Biotechnology Inc.）を使用した以外は、前記「３.」と同様にして、共免疫沈降法のサンプルを調製し、抗体を用いてイムノブロッティングを行った。イムノブロッティングの抗体としては、抗ホスホチロシン抗体（4G10、Biotech社）を使用した。

これらの結果を図５に示す。同図は、各発現ベクターを導入したＭＣＦ−７細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。同図において、上のブロックから、チロシンリン酸化ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３、チロシンリン酸化ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ２のバンドを示すイムノブロッティングの結果であり、一番下のブロックが、可溶化液の電気泳動の結果である。同図のＦＲＳ２βのレーンにおいて、「−」は、ＦＲＳ２β発現ベクター未導入、「＋」は、ＦＲＳ２β発現ベクター導入をそれぞれ示し、ＮＲＧのレーンにおいて、「＋」は、ＮＲＧの添加、「−」は、ＮＲＧの無添加をそれぞれ示す。同図に示すように、ＮＲＧ刺激を受けた細胞の中でも、ＦＲＳ２βを発現する細胞（ＦＲＳ２β＋：ＮＲＧ＋）は、ＦＲＳ２β未発現の細胞（ＦＲＳ２β−：ＮＲＧ＋）と比較して、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ２の自己リン酸化（チロシンリン酸化）が抑制されていた。この結果から、ＦＲＳ２βは、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３の活性化（チロシンリン酸化）を阻害でき、これによって、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達経路をダウンレギュレーションできるといえる。

５．ＥＲＫおよびＥＧＦＲのリン酸化への影響
ＦＲＳ２βがＥＲＫおよびＥｒｂＢ３のリン酸化に与える影響を確認した。

ＦＲＳ２β発現レトロウイルスベクター、および、コントロールベクターを、それぞれ、ヒト乳癌細胞株ＢＴ４７４細胞に導入し、ピューロマイシンにて選択し、安定形質転換株を得た。これらの形質転換体を、０．５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で、１２時間培養した後、ＥｒｂＢ３のリガンドであるニューレギュリン（ＮＲＧ：１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、所定時間（０、１０分、３０分、１時間、３時間、６時間）刺激を行った。そして、細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、抗体として、抗リン酸化ＥＲＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗リン酸化ＥＧＦＲ抗体、抗リン酸化ＥｒｂＢ３抗体、抗ＳＰＲＹ２抗体を使用してイムノブロッティングを行った。また、コントロールベクターを導入したＢＴ４７4細胞（ｍｏｃｋ)についても、同様にイムノブロッティングを行った。

これらの結果を図６に示す。同図は、各発現ベクターを導入したＢＴ４７４のイムノブロッティングの結果を示す写真である。同図において、上のブロックから、チロシンリン酸化ＥＲＫ１／２、ＥＲＫ１、チロシンリン酸化ＥＧＦＲ、チロシンリン酸化ＥｒｂＢ３、ＳＰＲＹ２のバンドを示すイムノブロッティングの結果である。同図において、「ｍｏｃｋ」は、コントロールベクターを導入したＢＴ４７４細胞、「ＦＲＳ２ｂｅｔａ」は、ＦＲＳ２β発現レトロウイルスベクターを導入したＢＴ４７４細胞の結果であり、時間（ｈｒ）は、ＮＲＧ刺激の時間を示す。

同図に示すように、ＮＲＧ刺激を受けた細胞の中でも、ＦＲＳ２βを発現する細胞は、ＦＲＳ２β未発現のコントロール細胞（ｍｏｃｋ）と比較して、ＥＧＦＲの自己リン酸化（チロシンリン酸化）およびＥＲＫのリン酸化並びにＥｒｂＢ３のチロシンリン酸化が抑制されていた。この結果から、この結果から、ＦＲＳ２βは、ＥｒｂＢ２のヘテロダイマーパートナーであるＥｒｂＢ３のシグナル伝達ならびに下流のERKの活性をダウンレギュレーションできるといえる。

６．ヘテロ二量体化に対するＦＲＳ２βの影響
ＥｒｂＢ２とＥＧＦＲとのヘテロ二量体の形成に対するＦＲＳ２βの影響を確認した。

野生型ＥｒｂＢ２発現プラスミドベクター、変異型ＥｒｂＢ２発現プラスミドベクター、ＦＲＳ２β発現プラスミドベクター、および、コントロールベクターを、それぞれＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性に導入した。これらの形質転換体を、０．１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で、１２時間培養した後、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、１０分間刺激を行った。そして、抗体として、抗ＥｒｂＢ２抗体（OP15、Calbiochem）および抗ＥＧＦＲ抗体（sc-03、ポリクローナル抗体、Santa Cruz）を使用した以外は、前記「３.」と同様にして、共免疫沈降法のサンプルを調製し、抗体を用いてイムノブロッティングを行った。イムノブロッティングの抗体としては、抗ＥｒｂＢ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｆｌａｇ抗体（M2モノクローナル抗体：Sigma-Aldrich社）を使用した。

これらの結果を、図７に示す。同図は、各発現ベクターを導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真である。同図において、上の４つのブロックは、上から、ＥｒｂＢ２と沈降したＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲと沈降したＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲのバンドを示すイムノブロッティングの結果であり、下の３つのブロックは、可溶化液の電気泳動の結果である。同図において、「ＥＧＦ」と「−」は、ＥＧＦ刺激の有無を示し、ＳＮＴ−２−ＦＬＡＧ（ＦＲＳ２β）、ＭＴ−ＥｒｂＢ２、および、ＷＴ−ＥｒｂＢ２のレーンにおいて、「＋および−」は、それぞれ、ＦＲＳ２β発現ベクター、変異型（ＭＴ）ＥｒｂＢ２発現ベクター、野生型（ＷＴ）ＥｒｂＢ２発現ベクターの細胞への導入の有無を示す。同図に示すように、ＦＲＳ２βを発現する細胞（ＦＲＳ２β＋：ＥＧＦ＋）では、ＦＲＳ２β未発現の細胞（ＦＲＳ２β−：ＥＧＦ＋）と比較して、ＥＧＦ刺激により生じるＥＧＦＲとＥｒｂＢ２とのヘテロダイマーの形成が抑制された。この結果から、例えば、ＦＲＳ２βが他のＥｒｂＢファミリー分子にも相互作用し、ＥｒｂＢファミリー分子のヘテロダイマー形成やホモダイマー形成をも抑制することが示唆される。また、ＥｒｂＢファミリー分子は、ヘテロダイマー形成により活性されることから、ＥｒｂＢ４も、ＦＲＳ２βによって抑制されると考えられる。

７．ハーセプチン感受性に対するＦＲＳ２βの影響
ＦＲＳ２βの発現によるハーセプチン感受性に対する影響を確認した。

（ＭＴＳアッセイ）
ＦＲＳ２β発現レンチウイルスベクターならびにコントロールベクター（ｄｓＶｅｎｕｓを発現）を、ヒト乳癌細胞株ＢＴ４７４細胞に導入し、安定形質転換株を得た。これらの形質転換体を、１well当たり約１×１０^４個となるように９６well培養プレートに播き、２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下、１０％牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ培地で培養した。２４時間後、培地を希釈系列ハーセプチン含有培地に交換し、さらに培養を行った。培地交換から１０日後、さらに、前記培地について、ＭＴＳアッセイ用試薬（Promega）を用いて、添付されたプロトコールに従って処理を行い、４９０ｎｍにおけるwellの吸光度を測定した。

これらの結果を図８に示す。同図において、（Ａ）は、感染効率の指標となるｄ２Ｖｅｎｕｓの発現を、ｄ２Ｖｅｎｕｓの発する蛍光を指標にＦＡＣＳによりソーティングした結果を示す図であり、同図において、縦軸は、細胞数、横軸は、細胞の蛍光強度を示す。同図において、（Ｂ）は、ＦＲＳ２βを発現する細胞およびコントロールベクターを導入した細胞の電気泳動の写真であり、右のレーンが、ＦＲＳ２β発現細胞、左のレーンが、コントロールベクター導入細胞を示す。また、同図において、（Ｃ）は、ハーセプチンの濃度と培養細胞の吸光度との関係を示すグラフである。同図（Ｃ）において、縦軸は、吸光度、横軸は、ハーセプチン濃度を示し、濃度の単位（ｍｃｒｇ）は、培地１ｍｌ当たりのマイクログラムを示す。また、同図において、ｄ２Ｖは、ｄ２Ｖｅｎｕｓを示し、ｗｔは、野生型ＦＲＳ２βを示す。

同図（Ａ）の結果から、今回使用したレンチウイルスベクターの感染効率は、ほぼ１００％であることがわかった。また、同図（Ｂ）から、レンチウイルスベクター導入によって野生型ＦＲＳ２βが発現することがわかった。また、同図（Ｃ）から、ＦＲＳ２βの発現により、細胞のハーセプチンに対する感受性が増強されることがわかった。以上の結果から、乳癌細胞においてＦＲＳ２β（ＳＮＴ−２)を発現させることによって、ハーセプチン感受性が増強することがわかった。この結果に基づくと、例えば、ＦＲＳ２β陽性の癌細胞は、ハーセプチンに対する感受性が高いと判断できるため、ＦＲＳ２βは、抗癌剤に対する効果を予測するためのバイオマーカーとして有用であるといえる。

８．乳癌細胞株におけるＥｒｂＢ２とＦＲＳ２βとの傾向
乳癌細胞株におけるＥｒｂＢ２とＦＲＳ２βの発現を確認した。

３５株の乳癌細胞を、前記「３．」と同様に培養して、可溶化液を調製した。この可溶化液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗体を用いてイムノブロッティングを行った。イムノブロッティングに使用した抗体は、抗ＦＲＳ２β抗体（Oncogene，vol．25，p6457，2006）、抗ＥｒｂＢ２抗体（OP15,Calbiochem社製）、抗ＥＲＫ１／２抗体（Santa Cruz社製）を使用した。

これらの結果を、図９に示す。同図は、各乳癌細胞のイムノブロッティングの結果を示す写真で、横軸は、様々な細胞株の種類を示す番号である。その結果、同図に示すように、ヒト乳癌組織に見られると同様に、ヒト乳癌細胞株においても、ＥｒｂＢ２が過剰発現する細胞株が多数存在した。ＦＲＳ２βの発現も、いくつかの細胞株において検出された。しかし、ＥｒｂＢ２が過剰発現する細胞におけるＦＲＳ２βの発現は総じて少なく、ＥｒｂＢ２発現とＦＲＳ２βの発現とに逆相関の傾向がみられた。このことから、ＥｒｂＢ２癌遺伝子依存状態にある癌細胞においては、ＦＲＳ２βの発現が抑制されていることがわかった。つまり、ＦＲＳ２βによるＥｒｂＢ２シグナルのダウンレギュレーションが強く示唆された。

９．各種癌細胞株におけるｅｒｂＢ２とＦＲＳ２βとの傾向
各種癌細胞株におけるｅｒｂＢ２とＦＲＳ２βの発現を確認した。

乳癌細胞株（３５株）、および、肺癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、脳腫瘍、膵臓癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌等の細胞株、合計１０８株について、マイクロアレイにより、ＦＲＳ２βおよびｅｒｂＢ２の転写産物量を確認した。その結果を、図１０に示す。同図（Ａ）は、１０８株の細胞株について、ＦＲＳ２β転写産物量とｅｒｂＢ２転写産物量とをプロットしたグラフであり、同図（Ｂ）は、３５株の乳癌細胞株について、ＦＲＳ２β転写産物量とｅｒｂＢ２転写産物量とをプロットしたグラフである。同図に示すように、ＦＲＳ２β転写産物量とｅｒｂＢ２転写産物量との間には、逆相関がみられた。この結果から、ｅｒｂＢ２癌遺伝子依存状態にある乳癌のみならず、様々な癌細胞において、ＦＲＳ２βの発現が抑制されていることがわかった。つまり、様々な癌において、ＦＲＳ２βによるＥｒｂＢ２シグナルのダウンレギュレーションが強く示唆された。

１０．乳癌患者におけるＥｒｂＢ２とＦＲＳ２βとの傾向
乳癌患者の癌組織における、ＦＲＳ２βの発現を確認し、同患者における、ＥｒｂＢ２の発現との比較を行った。

患者より下記５種類の組織型の乳癌組織を採取した。これらの組織について、プロトコールに従ってハーセプトテストを行い、４段階の判定を行った。他方、同じ乳癌組織について、抗ＦＲＳ２β抗体を用いた免疫染色により、前記乳癌組織におけるＦＲＳ２βの発現の有無を確認した。具体的には、まず、各乳癌組織をホルマリン固定し、脱パラフィン処理した後、オートクレーブにより１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６）で２０分間処理した。そして、処理後の乳癌組織と、ＰＢＳで１００倍希釈した前記抗ＦＲＳ２β抗体とを、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後の乳癌組織を、商品名ＬＳＡＢＣｋｉｔ（Ｄａｋｏ Ｊａｐａｎ社製）を用いて、そのプロトコールに従って、免疫染色を行った。発色剤としては、３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅを使用した。また、Ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎｅで核染色を行った。これらの結果を下記表に示す。

以上のように、ハーセプテストによりＥｒｂＢ２が過剰発現と判断された試料（サンプル１〜３）は、ＦＲＳ２β（−）であり、ＥｒｂＢ２が非過剰発現である試料（サンプル４〜５）は、ＦＲＳ２β（＋）であった。この結果から、乳癌組織においてＦＲＳ２βの発現とＥｒｂＢ２の発現とが逆相関することが考えられる。また、ＦＲＳ２βの発現が、ＥｒｂＢの増幅に何らかのメカニズムで関与している可能性が考えられる。

このように、本発明のポリペプチドによれば、ＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路がダウンレギュレーションされる。このため、例えば、目的のヒト細胞に、本発明のポリペプチドを導入したり、本発明のポリペプチドを発現する核酸を導入することによって、前記細胞における前記シグナル伝達を抑制できる。さらに、ＥｒｂＢ２のシグナル伝達は、前述のように、癌の発症に関与していることから、本発明によりシグナル伝達を阻害することによって、癌の発症を予防し、また、癌の治療を行うことができる。また、前記シグナル伝達の阻害によって、細胞の癌化ならびに細胞の増殖を抑制できることからも、本発明は癌の治療に有用といえる。

また、ＦＲＳ２βによりＥｒｂＢ２のシグナル伝達がダウンレギュレーションされることから、目的の細胞におけるＦＲＳ２βを検出することによって、前記シグナル伝達が働いているか否かも判定することができる。そして、その判断結果に基づけば、例えば、ＥｒｂＢ２の機能を阻害する分子標的抗癌剤による治療の要否も判断することができる。このように本発明は、例えば、医療分野や、分子細胞学等の分野において、非常に有用な技術といえる。

Claims (9)

1. シグナル伝達経路のダウンレギュレーションの有無を判定する方法であって、
   前記シグナル伝達経路が、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路であり、
   ヒトＦＲＳ２βおよびヒトＦＲＳ２β遺伝子の転写産物の少なくとも一方を検出する工程を含む、ダウンレギュレーション判定方法。
2. 前記検出する工程における検出量が、予め設定されたカットオフ値よりも大きい場合に、ＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路のダウンレギュレーションが存在すると判定する、請求項１に記載のダウンレギュレーション判定方法。
3. 前記ヒト細胞がＥｒｂＢ２を発現している、請求項１または２に記載のダウンレギュレーション判定方法。
4. ヒト癌細胞に対する抗ＥｒｂＢ２抗体による治療の要否の判断を補助する方法であって、
   ヒト癌細胞由来の生体試料において、ヒトＦＲＳ２βおよびヒトＦＲＳ２β遺伝子の転写産物の少なくとも一方を検出する工程を含む、方法。
5. 前記検出する工程における検出量が、予め設定されたカットオフ値よりも大きい場合に、前記抗ＥｒｂＢ２抗体による治療を要しないと判定する、請求項４に記載の方法。
6. 前記ヒト癌細胞がＥｒｂＢ２を発現している、請求項４または５に記載の方法。
7. シグナル伝達経路の活性化を阻害するシグナル伝達阻害剤であって、
   前記シグナル伝達経路は、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路であり、
   核酸を含み、
   前記核酸は、配列番号２に記載の塩基配列における１番目〜５５５番目の領域を含む塩基配列からなる核酸であり、
   前記核酸は、コードするポリペプチドを細胞内で発現する、シグナル伝達阻害剤。
8. 前記シグナル伝達阻害剤が、さらにベクターを含み、前記核酸が前記ベクターに連結されている、請求項７に記載のシグナル伝達阻害剤。
9. シグナル伝達経路の活性化を阻害するシグナル伝達阻害剤であって、
   前記シグナル伝達経路は、ヒト細胞におけるＥｒｂＢ２を介するシグナル伝達経路であり、
   ポリペプチドを含み、
   前記ポリペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１番目〜１８５番目の領域を含むアミノ酸配列からなるポリペプチドである、シグナル伝達阻害剤。

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