JP5207286B2 - Antimicrobial active peptide - Google Patents
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Description
本発明は、抗微生物活性ペプチドに関する。 The present invention relates to antimicrobial active peptides.
抗微生物ペプチドは、真核多細胞生物には無害であるが、微生物に対して選択的に毒性を示すことが知られている。
かかる抗微生物ペプチドとしては、乳酸菌が作るナイシンが知られている。なお、ナイシンは、乳製品等の抗菌保存剤として実用化されている。
Antimicrobial peptides are harmless to eukaryotic multicellular organisms, but are known to be selectively toxic to microorganisms.
Nisin produced by lactic acid bacteria is known as such an antimicrobial peptide. Nisin has been put into practical use as an antibacterial preservative for dairy products and the like.
ところで、近年、様々な動植物や微生物などから、新規の抗微生物ペプチドを分離し、遺伝子組み換え等を行って、抗微生物ペプチドを産生させる試みがなされている。 By the way, in recent years, attempts have been made to produce antimicrobial peptides by separating novel antimicrobial peptides from various animals and plants, microorganisms, and the like, and performing genetic recombination.
例えば、タイワンカブトムシから抽出されるペプチドのＣ末端をアミド化することにより、優れた抗菌活性を示す抗微生物活性ペプチドが得られることが知られている（例えば、特許文献１参照）。 For example, it is known that an antimicrobial activity peptide exhibiting excellent antibacterial activity can be obtained by amidating the C-terminus of a peptide extracted from a beetle (for example, see Patent Document 1).
なお、本発明者等は、平成１９年９月２７日（特願２００７−２５１２８５号）に、それ自体は抗微生物活性を示さず、抗微生物活性を増強する抗微生物活性増強ペプチドの特許出願を行っている。
しかしながら、細菌等の微生物は、従来の抗微生物剤に耐性を獲得すべく変異していることが知られている。このことにより、近年においては、従来は有効であった抗微生物剤の使用においても十分な抗微生物活性が得られない事態が生じている。
一方で、探索が進んだ今日では、既知のカテゴリーに属する抗微生物ペプチドしか見つからなくなっている。
However, it is known that microorganisms such as bacteria are mutated to acquire resistance to conventional antimicrobial agents. Due to this, in recent years, there has been a situation in which sufficient antimicrobial activity cannot be obtained even with the use of antimicrobial agents that have been effective in the past.
On the other hand, now that the search has advanced, only antimicrobial peptides belonging to known categories can be found.
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、グラム陽性および陰性の病原細菌を含む微生物に対して強い抗微生物活性を示し、既知の抗微生物ペプチドとは全く異なる新規な抗微生物活性ペプチドを提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and exhibits a novel antimicrobial activity peptide that exhibits strong antimicrobial activity against microorganisms including Gram-positive and negative pathogenic bacteria and is completely different from known antimicrobial peptides. The purpose is to provide.
本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意検討したところ、動植物が抗微生物ペプチド前駆体を産生する際に除かれる前駆領域ペプチドが抗微生物活性をコントロールしていることに着目した。
そして、一般に抗微生物ペプチド前駆体は塩基性であるのに対し、前駆領域ペプチドにおいては酸性アミノ酸残基であるカルボン酸が多く存在していることを見出した。
そこで、本発明者等は、Ｃ末端以外の側鎖のカルボン酸をアミド基へ変換することを試みた結果、意外にも、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
The inventors of the present invention have made extensive studies in order to solve the above problems, and have focused on the fact that the precursor region peptide removed when animals and plants produce the antimicrobial peptide precursor controls the antimicrobial activity.
In general, the antimicrobial peptide precursor is basic, whereas the precursor region peptide has a large amount of carboxylic acid which is an acidic amino acid residue.
Thus, as a result of trying to convert a carboxylic acid in a side chain other than the C-terminal to an amide group, the present inventors have unexpectedly found that the above problems can be solved, and have completed the present invention. It was.
すなわち、本発明は、（１）抗微生物ペプチド前駆体の前駆領域ペプチドのアミノ酸配列を改変した抗微生物活性を示す抗微生物活性ペプチドであって、前駆領域ペプチドに含まれる酸性アミノ酸残基の側鎖にあるカルボキシル基がアミド基に変換されたものであり、前駆領域ペプチドが下記（Ａ）〜（Ｃ）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド断片を有するものである抗微生物活性ペプチドに存する。
（Ａ）
ArgArgArgPheValAlaGluGlnAspAlaIleHisSerArgValSerArgGluValProThrLeuSerAspSerVal（配列番号１）
（Ｂ）
ArgArgArgPheValValGlnGlnAspThrIleSerProArgLeuGluValAspGluArgPheLeuProAsnSerValGlnGluGlnIle（配列番号２）
（Ｃ）
ArgArgArgSerValGlyGluGluAspAlaIleProSerHisIleGluValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGluHisIle（配列番号３）
That is, the present invention relates to (1) an antimicrobial activity peptide having antimicrobial activity obtained by modifying the amino acid sequence of a precursor region peptide of an antimicrobial peptide precursor, wherein the side chain of an acidic amino acid residue contained in the precursor region peptide all SANYO carboxyl group has been converted to an amide group in the precursor region peptide following (a) ~ der Ru antimicrobial activity having a peptide fragment consisting of any amino acid sequence of one of (C) Exists in the peptide.
(A)
ArgArgArgPheValAlaGluGlnAspAlaIleHisSerArgValSerArgGluValProThrLeuSerAspSerVal (SEQ ID NO: 1)
(B)
ArgArgArgPheValValGlnGlnAspThrIleSerProArgLeuGluValAspGluArgPheLeuProAsnSerValGlnGluGlnIle (SEQ ID NO: 2)
(C)
ArgArgArgSerValGlyGluGluAspAlaIleProSerHisIleGluValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGluHisIle (SEQ ID NO: 3)
本発明は、（２）微生物の細胞膜を破壊する上記（１）記載の抗微生物活性ペプチドに存する。 The present invention resides in (2) the antimicrobial activity peptide according to the above (1), which destroys cell membranes of microorganisms.
本発明は、（３）最小殺菌濃度が５０μＭ以下である上記（１）記載の抗微生物活性ペプチドに存する。 The present invention resides in (3) the antimicrobial activity peptide according to the above (1), wherein the minimum bactericidal concentration is 50 μM or less.
本発明は、（４）抗微生物ペプチド前駆体がセクロピン型に由来するものである上記（１）記載の抗微生物活性ペプチドに存する。 The present invention resides in (4) the antimicrobial activity peptide according to the above (1), wherein the antimicrobial peptide precursor is derived from the cecropin type.
本発明は、（５）抗微生物ペプチド前駆体が線虫由来のものである上記（１）記載の抗微生物活性ペプチドに存する。 The present invention resides in (5) the antimicrobial activity peptide according to the above (1), wherein the antimicrobial peptide precursor is derived from a nematode.
本発明は、（６）側鎖にあるすべてのカルボキシル基がアミド基に変換されている上記（１）記載の抗微生物活性ペプチドに存する。 The present invention resides in (6) the antimicrobial activity peptide according to the above (1), wherein all carboxyl groups in the side chain are converted to amide groups.
本発明は、（７）下記（Ｄ）〜（Ｆ）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド断片を有する抗微生物活性ペプチドに存する。
（Ｄ）
ArgArgArgPheValAlaGlnGlnAsnAlaIleHisSerArgValSerArgGlnValProThrLeuSerAsnSerVal（配列番号４）
（Ｅ）
ArgArgArgPheValValGlnGlnAsnThrIleSerProArgLeuGlnValAsnGlnArgPheLeuProAsnSerValGlnGlnGlnIle（配列番号５）
（Ｆ）
ArgArgArgSerValGlyGlnGlnAsnAlaIleProSerHisIleGlnValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGlnHisIle（配列番号６）
The present invention resides in ( 7 ) an antimicrobial activity peptide having a peptide fragment consisting of any one amino acid sequence of the following (D) to (F).
(D)
ArgArgArgPheValAlaGlnGlnAsnAlaIleHisSerArgValSerArgGlnValProThrLeuSerAsnSerVal (SEQ ID NO: 4)
(E)
ArgArgArgPheValValGlnGlnAsnThrIleSerProArgLeuGlnValAsnGlnArgPheLeuProAsnSerValGlnGlnGlnIle (SEQ ID NO: 5)
(F)
ArgArgArgSerValGlyGlnGlnAsnAlaIleProSerHisIleGlnValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGlnHisIle (SEQ ID NO: 6)
なお、本発明の目的に添ったものであれば、上記（１）〜（７）を適宜組み合わせた構成も採用可能である。 In addition, as long as the objective of this invention is met, the structure which combined suitably said (1)-( 7 ) is also employable.
本発明の抗微生物活性ペプチドは、グラム陽性および陰性の病原細菌を含む微生物に対して強い抗微生物活性を示す。
また、抗微生物ペプチド前駆体の前駆領域ペプチドに含まれる酸性アミノ酸残基の側鎖にあるカルボキシル基をアミド基に変換して得られる。換言すると、天然の抗微生物ペプチドとは無関係の配列を限定的に改変して得られる。このため、これらは新規な抗微生物活性ペプチドであり、既知の天然由来の抗微生物ペプチドとは配列に類似性がない。
なお、上記抗微生物活性ペプチドは、側鎖にあるすべてのカルボキシル基がアミド基に変換されていると、より強い抗微生物活性を示す。
The antimicrobial activity peptide of the present invention exhibits strong antimicrobial activity against microorganisms including Gram-positive and negative pathogenic bacteria.
It can also be obtained by converting a carboxyl group in the side chain of an acidic amino acid residue contained in the precursor region peptide of the antimicrobial peptide precursor into an amide group. In other words, it is obtained by limited modification of a sequence unrelated to the natural antimicrobial peptide. For this reason, these are novel antimicrobially active peptides and have no sequence similarity to known naturally occurring antimicrobial peptides.
In addition, the said antimicrobial activity peptide shows stronger antimicrobial activity, when all the carboxyl groups in a side chain are converted into the amide group.
本発明の抗微生物活性ペプチドは、微生物の細胞膜を破壊することにより、抗微生物活性を発揮する。すなわち、上記抗微生物活性ペプチドは、細胞膜の破壊が抗微生物作用の分子機序である。 The antimicrobial activity peptide of this invention exhibits antimicrobial activity by destroying the cell membrane of microorganisms. That is, in the above-mentioned antimicrobial activity peptide, destruction of the cell membrane is a molecular mechanism of antimicrobial action.
本発明の抗微生物活性ペプチドは、最小殺菌濃度が５０μＭ以下であると、微量で抗微生物活性を示すので、食品保存料、現行の抗生物質と同様の投与量における抗菌剤としての使用、遺伝子組換え動植物の作出による耐病性の付与等の用途に適用が可能となる。 Since the antimicrobial activity peptide of the present invention exhibits antimicrobial activity in a trace amount when the minimum bactericidal concentration is 50 μM or less, it is used as an antibacterial agent at the same dosage as food preservatives and current antibiotics, It can be applied to uses such as the provision of disease resistance by the production of replacement animals and plants.
本発明の抗微生物活性ペプチドは、抗微生物ペプチド前駆体がセクロピン型に由来するもの、若しくは、抗微生物ペプチド前駆体が線虫由来のものであると、より強い抗微生物活性を示す。 The antimicrobial activity peptide of the present invention exhibits stronger antimicrobial activity when the antimicrobial peptide precursor is derived from the cecropin type or the antimicrobial peptide precursor is derived from a nematode.
本発明の抗微生物活性ペプチドは、前駆領域ペプチドが上記（Ａ）〜（Ｃ）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド断片を有するものであると、カルボキシル基をアミド基に変換することにより、より一層強い抗微生物活性を示す新規な抗微生物活性ペプチドが得られる。 The antimicrobial activity peptide of the present invention converts a carboxyl group into an amide group when the precursor region peptide has a peptide fragment consisting of any one of the amino acid sequences (A) to (C) above. As a result, a novel antimicrobial activity peptide showing even stronger antimicrobial activity can be obtained.
本発明の抗微生物活性ペプチドは、上記（Ｄ）〜（Ｆ）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド断片を有するので、既知の抗微生物ペプチドとは全く異なる新規な抗微生物活性ペプチドであり、グラム陽性および陰性の病原細菌を含む微生物に対して強い抗微生物活性を示す。 Since the antimicrobial active peptide of the present invention has a peptide fragment consisting of any one of the amino acid sequences of (D) to (F) above, it is a novel antimicrobial active peptide that is completely different from known antimicrobial peptides. Yes, showing strong antimicrobial activity against microorganisms including Gram positive and negative pathogenic bacteria.
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明の抗微生物活性ペプチドは、抗微生物ペプチド前駆体の前駆領域ペプチドのアミノ酸配列を改変した抗微生物活性ペプチドである。
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail.
The antimicrobial activity peptide of the present invention is an antimicrobial activity peptide obtained by modifying the amino acid sequence of the precursor region peptide of the antimicrobial peptide precursor.
ここで、本発明において、抗微生物ペプチド前駆体とは、動植物が免疫機構の一部として抗微生物ペプチドを産生するときに最初に作られるプロセシングを受ける以前の翻訳産物を意味し、前駆領域ペプチドとは、抗微生物ペプチド前駆体がプロセシングされて成熟した抗微生物ペプチドが生ずる際に、除去される前駆部分のペプチドを意味する。 Here, in the present invention, the antimicrobial peptide precursor means a translation product before processing that is first made when animals and plants produce an antimicrobial peptide as part of the immune mechanism, Means the precursor portion of the peptide that is removed when the antimicrobial peptide precursor is processed to yield a mature antimicrobial peptide.
上記動植物としては、例えば、節足動物（昆虫、甲殻類など）、軟体動物（貝など）、脊椎動物、原索動物、線虫等が挙げられる。
これらの中でも、線虫であることがより好ましい。換言すると、抗微生物活性ペプチドは、抗微生物ペプチド前駆体が線虫由来のものであることが好ましい。
この場合、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性をより確実にさせることができる。
Examples of the animals and plants include arthropods (insects, crustaceans, etc.), molluscs (shellfish, etc.), vertebrates, protozoa, nematodes and the like.
Among these, nematodes are more preferable. In other words, it is preferable that the antimicrobial active peptide is derived from a nematode.
In this case, the antimicrobial activity of the peptidic antimicrobial substance can be ensured.
上記抗微生物ペプチド前駆体としては、例えば、アルファヘリクス型（セクロピン型を含む）、富システイン型、富プロリン型、富トリプトファン型、富ヒスチジン型、富グリシン型等に由来するものが挙げられ、これらの中でも、セクロピン型に由来するものであることが好ましい。 Examples of the antimicrobial peptide precursor include those derived from alpha helix type (including cecropin type), cysteine rich type, rich proline type, rich tryptophan type, rich histidine type, rich glycine type, etc. Among these, those derived from the cecropin type are preferable.
すなわち、抗微生物ペプチド前駆体は、線虫セクロピン由来のものであることがより好ましい。 That is, the antimicrobial peptide precursor is more preferably derived from nematode cecropin.
前駆領域ペプチドは、例えば、以下の方法によってアミノ酸配列が決定される。
例えば、動植物の抽出液から、抗微生物ペプチド前駆体を精製し、アミノ酸配列を決定する。そのアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によって、精製した抗微生物ペプチド前駆体に対応するｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡから予測された前駆体のアミノ酸配列と、精製した抗微生物ペプチド前駆体とから直接決定された配列を比較して、ペプチドの成熟過程で除かれる前駆領域ペプチドのアミノ酸配列を決定する。
For example, the amino acid sequence of the precursor region peptide is determined by the following method.
For example, the antimicrobial peptide precursor is purified from the extract of animals and plants, and the amino acid sequence is determined. Based on the amino acid sequence, a cDNA corresponding to the purified antimicrobial peptide precursor is cloned by RT-PCR using degenerate primers. The amino acid sequence of the precursor region peptide that is removed during the maturation process of the peptide is determined by comparing the amino acid sequence of the precursor predicted from the cDNA with the sequence determined directly from the purified antimicrobial peptide precursor.
なお、このとき、前駆領域ペプチドは、抗微生物ペプチド前駆体のＣ末端で除去されたものであることが好ましい。換言すると、上記前駆領域ペプチドは、Ｃ末端前駆領域ペプチドであることが好ましい。 At this time, the precursor region peptide is preferably one removed at the C-terminus of the antimicrobial peptide precursor. In other words, the precursor region peptide is preferably a C-terminal precursor region peptide.
こうして得られる前駆領域ペプチドは、酸性アミノ酸残基を複数有しており、例えば、下記（Ａ）〜（Ｃ）（配列番号１〜配列番号３）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド断片を有するものであることが好ましい。
（Ａ）
ArgArgArgPheValAlaGluGlnAspAlaIleHisSerArgValSerArgGluValProThrLeuSerAspSerVal（配列番号１）
（Ｂ）
ArgArgArgPheValValGlnGlnAspThrIleSerProArgLeuGluValAspGluArgPheLeuProAsnSerValGlnGluGlnIle（配列番号２）
（Ｃ）
ArgArgArgSerValGlyGluGluAspAlaIleProSerHisIleGluValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGluHisIle（配列番号３）
The precursor region peptide thus obtained has a plurality of acidic amino acid residues, for example, a peptide comprising any one amino acid sequence of the following (A) to (C) (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3) It is preferable that it has a fragment.
(A)
ArgArgArgPheValAlaGluGlnAspAlaIleHisSerArgValSerArgGluValProThrLeuSerAspSerVal (SEQ ID NO: 1)
(B)
ArgArgArgPheValValGlnGlnAspThrIleSerProArgLeuGluValAspGluArgPheLeuProAsnSerValGlnGluGlnIle (SEQ ID NO: 2)
(C)
ArgArgArgSerValGlyGluGluAspAlaIleProSerHisIleGluValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGluHisIle (SEQ ID NO: 3)
ここで、上記アミノ酸配列において、Argはアルギニン、Pheはフェニルアラニン、Valはバリン、Alaはアラニン、Glnはグルタミン、Asnはアスパラギン、Ileはイソロイシン、Hisはヒスチジン、Serはセリン、Proはプロリン、Thrはトレオニン、Leuはロイシン、Glyはグリシン、Lysはリジン、Gluはグルタミン酸、Aspはアスパラギン酸を意味する。なお、グルタミンは、グルタミン酸側鎖のカルボキシル基をアミド基に変換したものであり、アスパラギンは、アスパラギン酸側鎖のカルボキシル基をアミド基に変換したものである。 In the above amino acid sequence, Arg is arginine, Phe is phenylalanine, Val is valine, Ala is alanine, Gln is glutamine, Asn is asparagine, Ile is isoleucine, His is histidine, Ser is serine, Pro is proline, Thr is Threonine, Leu means leucine, Gly means glycine, Lys means lysine, Glu means glutamic acid, Asp means aspartic acid. Glutamine is obtained by converting the carboxyl group of the glutamic acid side chain into an amide group, and asparagine is obtained by converting the carboxyl group of the aspartic acid side chain into an amide group.
本発明の抗微生物活性ペプチドは、前駆領域ペプチドの酸性アミノ酸残基の側鎖にあるカルボキシル基がアミド基に変換されたものである。
例えば、前駆ペプチドが上記配列番号１〜３のアミノ酸配列からなるペプチド断片を有する場合、配列番号１〜３のアミノ酸配列中のGlu（グルタミン酸）及び／又はAsp（アスパラギン酸）のカルボキシル基がアミド基に変換されたものである。
The antimicrobial activity peptide of the present invention is obtained by converting a carboxyl group in the side chain of an acidic amino acid residue of a precursor region peptide into an amide group.
For example, when the precursor peptide has a peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 3, the carboxyl group of Glu (glutamic acid) and / or Asp (aspartic acid) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 3 is an amide group Converted to.
これらのカルボキシル基からアミド基への変換は、抗微生物活性ペプチドを化学的および生物的に合成する場合において、GluをGlnに、AspをAsnに置換することによって達成される。なお、かかる合成方法については後述する。 Conversion from these carboxyl groups to amide groups is achieved by substituting Glu for Gln and Asp for Asn in the chemical and biological synthesis of antimicrobially active peptides. Such a synthesis method will be described later.
こうして得られる本発明の抗微生物活性ペプチドは、グラム陽性および陰性の病原細菌を含む微生物に対して強い抗微生物活性を示す。なお、上記配列番号１〜配列番号３のペプチド断片を有する前駆領域ペプチドは、線虫セクロピン由来のものであり、それ自体は抗微生物活性を示さない。 The antimicrobial activity peptide of the present invention thus obtained exhibits strong antimicrobial activity against microorganisms including Gram-positive and negative pathogenic bacteria. The precursor region peptide having the peptide fragments of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 is derived from nematode cecropin and does not exhibit antimicrobial activity itself.
上記抗微生物活性ペプチドは、抗微生物ペプチド前駆体の前駆領域ペプチドに含まれる酸性アミノ酸残基の側鎖にあるカルボキシル基をアミド基に変換して得られる。換言すると、天然の抗微生物ペプチドとは無関係の配列を限定的に改変して得られる。このため、これらは既知の天然由来の抗微生物ペプチドとは配列に類似性がない。 The antimicrobial active peptide is obtained by converting a carboxyl group in the side chain of an acidic amino acid residue contained in the precursor region peptide of the antimicrobial peptide precursor into an amide group. In other words, it is obtained by limited modification of a sequence unrelated to the natural antimicrobial peptide. For this reason, they have no sequence similarity to known naturally occurring antimicrobial peptides.
上記抗微生物活性ペプチドにおいて、側鎖にあるすべてのカルボキシル基がアミド基に変換されていることが好ましい。なお、このときＣ末端カルボキシル基を有する場合は、かかるＣ末端カルボキシル基もアミド基に変換されていることが好ましい。
また、前駆領域ペプチドが上記配列番号１〜３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド断片を有する場合は、すべてのGluをGlnに、AspをAsnに置換することが好ましい。
これらの場合の抗微生物活性ペプチドは、より強い抗微生物活性を示す。
In the above-mentioned antimicrobial activity peptide, it is preferable that all carboxyl groups in the side chain are converted to amide groups. In addition, when it has a C terminal carboxyl group at this time, it is preferable that this C terminal carboxyl group is also converted into the amide group.
When the precursor region peptide has a peptide fragment consisting of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3, it is preferable to substitute all Glu for Gln and Asp for Asn.
The antimicrobial activity peptides in these cases show stronger antimicrobial activity.
また、本発明の抗微生物活性ペプチドは、化学的又は生物的に合成により、下記（Ｄ）〜（Ｆ）（配列番号４〜配列番号６）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド断片を有するものである。
（Ｄ）
ArgArgArgPheValAlaGlnGlnAsnAlaIleHisSerArgValSerArgGlnValProThrLeuSerAsnSerVal（配列番号４）
（Ｅ）
ArgArgArgPheValValGlnGlnAsnThrIleSerProArgLeuGlnValAsnGlnArgPheLeuProAsnSerValGlnGlnGlnIle（配列番号５）
（Ｆ）
ArgArgArgSerValGlyGlnGlnAsnAlaIleProSerHisIleGlnValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGlnHisIle（配列番号６）
The antimicrobially active peptide of the present invention is a peptide fragment comprising any one amino acid sequence of the following (D) to (F) (SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 6) by chemical or biological synthesis. It is what has.
(D)
ArgArgArgPheValAlaGlnGlnAsnAlaIleHisSerArgValSerArgGlnValProThrLeuSerAsnSerVal (SEQ ID NO: 4)
(E)
ArgArgArgPheValValGlnGlnAsnThrIleSerProArgLeuGlnValAsnGlnArgPheLeuProAsnSerValGlnGlnGlnIle (SEQ ID NO: 5)
(F)
ArgArgArgSerValGlyGlnGlnAsnAlaIleProSerHisIleGlnValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGlnHisIle (SEQ ID NO: 6)
上述したGluをGlnに、AspをAsnに置換する化学的な合成方法としては、固相法や液相法が挙げられる。
ここで、固相法とは、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズ等を固相として用い、ここから脱水反応によって1つずつアミノ酸鎖を伸長していき、目的とするペプチドの配列が出来上がったら固相表面から切り出し、目的の物質を得る方法である。
また、液相法とは、合成しようするペプチドを固相に固定せず、液相で合成を行なうものであり、アミノ酸残基を１つ伸長するたびに精製を行なう方法である。
Examples of the chemical synthesis method for substituting Glu for Gln and Asp for Asn include the solid phase method and the liquid phase method.
Here, the solid phase method uses polystyrene polymer gel beads having a diameter of about 0.1 mm whose surface is modified with an amino group as the solid phase, and from there, the amino acid chain is extended one by one by dehydration reaction. In this method, when the sequence of the target peptide is completed, it is cut out from the solid surface to obtain the target substance.
The liquid phase method is a method in which synthesis is performed in the liquid phase without fixing the peptide to be synthesized on the solid phase, and purification is performed every time one amino acid residue is extended.
また、GluをGlnに、AspをAsnに置換する生物的な合成方法とは、大量発現にふさわしいプロモーターの支配下に合成しようとするペプチドの遺伝暗号をもつ翻訳領域を結合させた人工的なＤＮＡを構築し、大腸菌、酵母、昆虫もしくは脊椎動物の培養細胞に合成させる方法である。なお、必ずしも生きた細胞を用いるとは限らず、遺伝子の転写および翻訳に関わる因子を全て含む細胞抽出物を用いた無細胞転写翻訳系を用いる場合を含む。 The biological synthesis method of substituting Glu for Gln and Asp for Asn is an artificial DNA in which a translation region having the genetic code of a peptide to be synthesized under the control of a promoter suitable for mass expression is combined. Is synthesized in cultured cells of E. coli, yeast, insects or vertebrates. In addition, it does not necessarily use a living cell, but includes the case of using a cell-free transcription translation system using a cell extract containing all factors involved in gene transcription and translation.
上記（Ｄ）〜（Ｆ）のアミノ酸配列を有する抗微生物活性ペプチドは、既知の抗微生物ペプチドとは全く異なる新規な抗微生物活性ペプチドであり、グラム陽性および陰性の病原細菌を含む微生物に対して強い抗微生物活性を示す。 The antimicrobial activity peptide having the amino acid sequence of (D) to (F) above is a novel antimicrobial activity peptide that is completely different from the known antimicrobial peptide, and against microorganisms including Gram-positive and negative pathogenic bacteria. Strong antimicrobial activity.
本発明の抗微生物活性ペプチドは、抗微生物活性を示す。かかる抗微生物活性は、微生物の細胞膜を破壊することにより、達成される。すなわち、上記抗微生物活性ペプチドは、細胞膜の破壊が抗微生物作用の分子機序であるといえる。 The antimicrobial activity peptide of the present invention exhibits antimicrobial activity. Such antimicrobial activity is achieved by disrupting the cell membrane of the microorganism. That is, it can be said that the destruction of the cell membrane is the molecular mechanism of the antimicrobial action of the antimicrobial active peptide.
本発明の抗微生物活性ペプチドは、最小殺菌濃度が１００μＭ未満であることが好ましく、５０μＭ以下であることがより好ましく、１０μＭ以下であることが特に好ましい。
ここで、最小殺菌濃度とは、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、ＯＤ６００＝０．０２の微生物懸濁液２０μｌに生存する菌体を認めないために必要な最小のペプチドの濃度を意味する。
最小殺菌濃度が５０μＭを超えると、最小殺菌濃度が上記範囲内にある場合と比較して、抗微生物活性が弱く、実用上、十分な殺菌力（抗微生物活性）とは言い難い。
The antimicrobial activity peptide of the present invention preferably has a minimum bactericidal concentration of less than 100 μM, more preferably 50 μM or less, and particularly preferably 10 μM or less.
Here, the minimum bactericidal concentration means the minimum bactericidal concentration (MBC), which is the minimum peptide concentration necessary for not observing the cells that survive in 20 μl of the microorganism suspension at OD 600 = 0.02.
When the minimum bactericidal concentration exceeds 50 μM, the antibacterial activity is weak as compared with the case where the minimum bactericidal concentration is within the above range, and it is difficult to say that the bactericidal power (antimicrobial activity) is practically sufficient.
本発明の抗微生物活性ペプチドが抗微生物活性を示す微生物（病原菌（日和見病原菌を含む））としては、例えば、各種の原核生物、又は、真核微生物が挙げられる。 Examples of microorganisms (pathogenic bacteria (including opportunistic pathogens)) in which the antimicrobial activity peptide of the present invention exhibits antimicrobial activity include various prokaryotic organisms or eukaryotic microorganisms.
上記原核生物としては、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、炭疽菌、セラチア菌、枯草菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、ジフテリア菌、乳酸桿菌、アクネ菌、放線菌、結核菌、らい菌等のグラム陽性の病原細菌、淋菌、緑膿菌、大腸菌、サルモネラ、赤痢菌、ペスト菌、レジオネラ、インフルエンザ菌、百日咳菌、コレラ菌、白葉枯病菌等のグラム陰性の病原細菌、ツツガムシ病菌、発疹チフス菌等のリケッチア、トラコーマや尿道炎等を引き起こすクラミジア、肺炎等を引き起こすマイコプラズマが挙げられる。
上記真核微生物としては、カンジダ等の酵母、白癬菌、稲熱病菌等の糸状菌、が挙げられる。
Examples of prokaryotes include staphylococcus aureus, streptococci, anthrax, serratia, bacillus subtilis, tetanus, botulinum, diphtheria, lactobacilli, acne, actinomycetes, tubercle bacilli, and leprosy. Pathogenic bacteria, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Pesto, Legionella, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Vibrio cholerae, Bacillus subtilis, etc. Examples include Chlamydia causing trachoma and urethritis, and mycoplasma causing pneumonia.
Examples of the eukaryotic microorganism include yeast such as Candida, and filamentous fungi such as ringworm and rice fever.
これらの中でも、微生物が黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ菌（Salmonella thyphimurium）、マイクロコッカス菌（Micrococcus luteus）又は大腸菌(Escherichia coli)であると、確実に抗微生物活性を示す。すなわち、微生物が黄色ブドウ球菌であると、黄色ブドウ球菌に起因する食中毒等を抑制することができ、微生物が緑膿菌であると、緑膿菌に起因する日和見感染症を抑制することができ、微生物がサルモネラ菌であると、サルモネラ菌に起因する食中毒等を抑制することができ、微生物がマイクロコッカス菌であると、マイクロコッカス菌に起因する食物腐敗等を防止でき、微生物が大腸菌であると、大腸菌に起因する腸管出血等を抑制することができる。 Among these, when the microorganism is Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella thyphimurium, Micrococcus luteus or Escherichia coli, it is surely antimicrobial activity Indicates. That is, if the microorganism is Staphylococcus aureus, food poisoning caused by Staphylococcus aureus can be suppressed, and if the microorganism is Pseudomonas aeruginosa, opportunistic infections caused by Pseudomonas aeruginosa can be suppressed. When the microorganism is Salmonella, food poisoning caused by Salmonella can be suppressed, and when the microorganism is Micrococcus, food spoilage caused by Micrococcus can be prevented, and the microorganism is Escherichia coli. Intestinal bleeding caused by E. coli can be suppressed.
本発明の抗微生物活性ペプチドは、医薬品、食品保存料、遺伝子組換え作物等に好適に用いられる。 The antimicrobially active peptide of the present invention is suitably used for pharmaceuticals, food preservatives, genetically modified crops and the like.
例えば、本発明の抗微生物活性ペプチドは、医薬製剤担体を配合して製剤組成物の形態に調製され得る。
この製剤担体としては、製剤の具体的な形態に応じて、公知の製剤担体を適宜選択して用いることができる。かかる製剤担体としては、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、界面活性剤等の賦形剤が挙げられる。なお、これには、ｐＨバッファー、希釈剤等が含まれていてもよい。
For example, the antimicrobial active peptide of the present invention can be prepared in the form of a pharmaceutical composition by blending a pharmaceutical preparation carrier.
As the formulation carrier, a known formulation carrier can be appropriately selected and used according to the specific form of the formulation. Examples of such a preparation carrier include excipients such as a filler, a bulking agent, a binder, a moistening agent, a disintegrant, and a surfactant. This may contain a pH buffer, a diluent and the like.
かかる製剤組成物の形態は、抗微生物活性を発揮し得る形態であれば特に限定されないが、例えば、錠剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固形剤であってもよく、液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤の形態であってもよい。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品としてもよい。 The form of the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it can exhibit antimicrobial activity. For example, it may be a solid preparation such as a tablet, powder, granule, pill, etc. It may be in the form of an injection such as an agent or an emulsion. Moreover, it is good also as a dry product which can be made into a liquid state by adding a suitable support | carrier before use.
上記製剤組成物中の抗微生物活性ペプチドの投与量は、具体的な剤形、対象となる疾患の種類、症状等を勘案して、適宜選択すべきものであり、特に限定されるべきものではない。 The dosage of the antimicrobially active peptide in the above-mentioned pharmaceutical composition should be appropriately selected in consideration of the specific dosage form, the type of target disease, symptoms, etc., and should not be particularly limited. .
また、抗微生物活性ペプチドは、必須アミノ酸からなるので、経口摂取しても、ヒトに対する毒性は殆ど認められないと考えられる。
したがって、抗微生物活性ペプチドは、ヒト乃至動物用の食品や飼料等としても利用することが可能である。すなわち、抗微生物活性ペプチドは、食品や飼料添加物としての抗菌剤（可食性抗菌剤）としても有用である。
Further, since the antimicrobially active peptide consists of essential amino acids, it is considered that toxicity to humans is hardly observed even if it is taken orally.
Accordingly, the antimicrobially active peptide can be used as food or feed for humans or animals. That is, the antimicrobially active peptide is also useful as an antibacterial agent (edible antibacterial agent) as a food or feed additive.
さらに、抗微生物活性ペプチドは、遺伝子組換えにより、作物に導入することで、作物の抗微生物活性を向上させることができる。すなわち、イネであれば、白葉枯病、稲熱病等を事前に防ぐことが可能となる。 Furthermore, the antimicrobial activity peptide can be improved by introducing the antimicrobial activity peptide into the crop by genetic recombination. That is, rice can prevent white leaf blight, rice fever, etc. in advance.
以下、本発明を実施例で具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
［前駆領域ペプチドのアミノ酸配列の決定］
線虫セクロピンの成熟領域のアミノ酸配列をもとに、ＲＴ−ＰＣＲ法によって、抗微生物ペプチド前駆体に対応するｃＤＮＡをクローニングした。ｃＤＮＡから予測された前駆体のアミノ酸配列と、抗微生物ペプチド前駆体から直接決定された配列を比較して、ペプチドの成熟過程で除かれる前駆領域ペプチドのアミノ酸配列を決定した。
[Determination of amino acid sequence of precursor region peptide]
Based on the amino acid sequence of the mature region of nematode cecropin, cDNA corresponding to the antimicrobial peptide precursor was cloned by RT-PCR. The amino acid sequence of the precursor region peptide that is removed during the maturation process of the peptide was determined by comparing the amino acid sequence of the precursor predicted from the cDNA with the sequence determined directly from the antimicrobial peptide precursor.
次いで、前駆領域ペプチドをコードするｃＤＮＡのアミノ酸配列を、コンピューター上で翻訳したところ、下記配列番号１〜３のアミノ酸配列を有していることを確認した（以下、配列番号１のアミノ酸配列に相当するペプチドを「Ｐ１Ｐ」、配列番号２のアミノ酸配列に相当するペプチドを「Ｐ２Ｐ」、配列番号３のアミノ酸配列に相当するペプチドを「Ｐ３Ｐ」という。）。
ArgArgArgPheValAlaGluGlnAspAlaIleHisSerArgValSerArgGluValProThrLeuSerAspSerVal（配列番号１）
ArgArgArgPheValValGlnGlnAspThrIleSerProArgLeuGluValAspGluArgPheLeuProAsnSerValGlnGluGlnIle（配列番号２）
ArgArgArgSerValGlyGluGluAspAlaIleProSerHisIleGluValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGluHisIle（配列番号３）
Next, when the amino acid sequence of cDNA encoding the precursor region peptide was translated on a computer, it was confirmed that it had the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 3 below (corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 below). The peptide corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is referred to as “P2P”, and the peptide corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is referred to as “P3P”).
ArgArgArgPheValAlaGluGlnAspAlaIleHisSerArgValSerArgGluValProThrLeuSerAspSerVal (SEQ ID NO: 1)
ArgArgArgPheValValGlnGlnAspThrIleSerProArgLeuGluValAspGluArgPheLeuProAsnSerValGlnGluGlnIle (SEQ ID NO: 2)
ArgArgArgSerValGlyGluGluAspAlaIleProSerHisIleGluValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGluHisIle (SEQ ID NO: 3)
［抗微生物活性ペプチドのデザイン］
得られたＰ１Ｐ〜Ｐ３Ｐのアミノ酸配列に含まれる酸性アミノ酸残基であるGluおよびAspを、それぞれGlnおよびAsnに置換し、下記配列番号４〜６のアミノ酸配列をデザインした。
ArgArgArgPheValAlaGlnGlnAsnAlaIleHisSerArgValSerArgGlnValProThrLeuSerAsnSerVal（配列番号４）
ArgArgArgPheValValGlnGlnAsnThrIleSerProArgLeuGlnValAsnGlnArgPheLeuProAsnSerValGlnGlnGlnIle（配列番号５）
ArgArgArgSerValGlyGlnGlnAsnAlaIleProSerHisIleGlnValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGlnHisIle（配列番号６）
[Design of antimicrobial activity peptide]
Glu and Asn, which are acidic amino acid residues contained in the obtained amino acid sequences of P1P to P3P, were substituted with Gln and Asn, respectively, and amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 6 below were designed.
ArgArgArgPheValAlaGlnGlnAsnAlaIleHisSerArgValSerArgGlnValProThrLeuSerAsnSerVal (SEQ ID NO: 4)
ArgArgArgPheValValGlnGlnAsnThrIleSerProArgLeuGlnValAsnGlnArgPheLeuProAsnSerValGlnGlnGlnIle (SEQ ID NO: 5)
ArgArgArgSerValGlyGlnGlnAsnAlaIleProSerHisIleGlnValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGlnHisIle (SEQ ID NO: 6)
［ペプチド合成（固相法）］
次に、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、ここから脱水反応によって1つずつアミノ酸鎖を伸長していき、上記配列番号４〜６のアミノ酸配列を合成した。そして、固相表面から切り出し、抗微生物活性ペプチドを得た（以下、配列番号４のアミノ酸配列に相当するペプチドを「ＮＰ１Ｐ」、配列番号５のアミノ酸配列に相当するペプチドを「ＮＰ２Ｐ」、配列番号６のアミノ酸配列に相当するペプチドを「ＮＰ３Ｐ」という。）。
[Peptide synthesis (solid phase method)]
Next, a polystyrene polymer gel bead having a diameter of about 0.1 mm whose surface is modified with an amino group is used as a solid phase, from which amino acid chains are extended one by one by a dehydration reaction. The amino acid sequence was synthesized. Then, the peptide was cut out from the solid surface to obtain an antimicrobial activity peptide (hereinafter, the peptide corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 was “NP1P”, the peptide corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 was “NP2P”, SEQ ID NO: The peptide corresponding to the amino acid sequence of 6 is referred to as “NP3P”).
（実施例１）
側鎖のカルボキシル基がアミド基に変換されたＮＰ１Ｐ〜ＮＰ３Ｐを実施例とした。
Example 1
NP1P to NP3P in which the side chain carboxyl group was converted to an amide group were used as examples.
（比較例１）
側鎖のカルボキシル基がアミド基に変換されていないＰ１Ｐ〜Ｐ３Ｐを比較例とした。
(Comparative Example 1)
P1P to P3P in which the side chain carboxyl group was not converted to an amide group were used as comparative examples.
（参考例１）
参考例として、下記のアミノ酸配列を合成した。かかるペプチドは、同出願人が平成１９年９月２７日（特願２００７−２５１２８５号）に出願した、それ自体は抗微生物活性を示さず、抗微生物活性を増強する抗微生物活性増強ペプチドである（以下、下記のアミノ酸配列に相当するペプチドを「ＮＰ４Ｐ」という。）。
HisArgArgSerValAlaHisGlnGlnGlnAlaSerLeuHisValLysThrAsnGlnLeuProSerProAsnThrValArgGlnGlnLeu
(Reference Example 1)
As a reference example, the following amino acid sequence was synthesized. Such a peptide is an antimicrobial activity-enhancing peptide that has been filed on September 27, 2007 (Japanese Patent Application No. 2007-251285) by the same applicant and does not exhibit antimicrobial activity per se and enhances antimicrobial activity. (Hereinafter, a peptide corresponding to the following amino acid sequence is referred to as “NP4P”).
HisArgArgSerValAlaHisGlnGlnGlnAlaSerLeuHisValLysThrAsnGlnLeuProSerProAsnThrValArgGlnGlnLeu
（評価１）
上記サンプルＮＰ１Ｐ〜ＮＰ４Ｐ及びＰ１Ｐ〜Ｐ３Ｐを用いて、最小殺菌濃度を測定した。すなわち、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に、試験する対数増殖期の微生物（表１に示す）をＯＤ６００＝０．０２の濃度に調製した。
その微生物懸濁液に、サンプルＮＰ１Ｐ〜ＮＰ４Ｐ及びＰ１Ｐ〜Ｐ３Ｐを終濃度１００μＭ（ＮＰ１Ｐ,Ｐ１Ｐ）又は８０μＭ（ＮＰ２Ｐ〜ＮＰ４Ｐ及びＰ２Ｐ〜Ｐ３Ｐ）を上限として３倍希釈列で混合した。
２時間室温で放置後、１００倍に希釈し、寒天平板培地に播種した。生存している菌をコロニーとして検出した。ペプチドの殺菌力は、対象微生物のコロニーが全く検出されない最小の濃度（最小殺菌濃度）として評価した。
得られた結果を表１に示す。表１中の「−」は、試験をしていない。
(Evaluation 1)
Using the samples NP1P to NP4P and P1P to P3P, the minimum bactericidal concentration was measured. That is, a logarithmic growth phase microorganism to be tested (shown in Table 1) was adjusted to a concentration of OD 600 = 0.02 in 10 mM Tris / HCl (pH 7.5).
Samples NP1P to NP4P and P1P to P3P were mixed with the microorganism suspension in a 3-fold dilution series with a final concentration of 100 μM (NP1P, P1P) or 80 μM (NP2P to NP4P and P2P to P3P) as the upper limit.
After standing at room temperature for 2 hours, it was diluted 100 times and seeded on an agar plate medium. Surviving bacteria were detected as colonies. The bactericidal power of the peptide was evaluated as the minimum concentration (minimum bactericidal concentration) at which no colonies of the target microorganism were detected.
The obtained results are shown in Table 1. “-” In Table 1 is not tested.
表１に示すように、ＮＰ４Ｐは、抗微生物活性を示さなかった。それに対して、ＮＰ１Ｐ〜ＮＰ３Ｐは、グラム陽性および陰性の病原細菌に対して強い抗微生物活性を示した。 As shown in Table 1, NP4P did not show antimicrobial activity. In contrast, NP1P to NP3P showed strong antimicrobial activity against Gram-positive and negative pathogenic bacteria.
（評価２）
上記サンプルＮＰ３Ｐ及びＮＰ４Ｐを用いて、膜破壊について調査した。
グラム陽性菌の細胞膜を模した脂質組成（phosphatidyl glycerol：cardiolipin＝３：１）となるように調製したリポソーム１μＭの内部に、蛍光色素calceinを７０ｍＭ封入した。
そして、これにＮＰ３Ｐを６００秒後に３μｇ／ｍｌ（終濃度）、７００秒後に１０μｇ／ｍｌ、７７０秒後に３０μｇ／ｍｌ、加え、蛍光色素の漏出を指標に、脂質二重膜の破壊を測定した。
得られた結果を図１に示す。なお、図１中、蛍光強度（Fluorescence intensity）の増加は、膜が破壊されたことを意味する。
(Evaluation 2)
Using the samples NP3P and NP4P, the film breakage was investigated.
A fluorescent dye, calcein, was encapsulated in a concentration of 70 mM in a 1 μM liposome prepared to have a lipid composition simulating a cell membrane of a Gram-positive bacterium (phosphatidyl glycerol: cardiolipin = 3: 1).
To this, NP3P was added at 3 μg / ml (final concentration) after 600 seconds, 10 μg / ml after 700 seconds, and 30 μg / ml after 770 seconds, and the breakdown of the lipid bilayer was measured using the leakage of the fluorescent dye as an index. .
The obtained results are shown in FIG. In FIG. 1, an increase in fluorescence intensity means that the film has been destroyed.
（評価３）（参考データ）
次に、上記同様に、グラム陽性菌の細胞膜を模した脂質組成（phosphatidyl glycerol：cardiolipin＝３：１）となるように調製したリポソーム１μＭに、蛍光色素calceinを７０ｍＭ封入した。
そして、これに２０μｇ／ｍｌのＮＰ４Ｐ存在下または非存在下において、抗微生物ペプチドＡＳＡＢＦ−αを０．１μｇ／ｍｌ（終濃度）ずつ段階的に加え、蛍光色素の漏出を指標に、脂質二重膜の破壊を測定した。
得られた結果を図２に示す。なお、蛍光の増加は、膜が破壊されたことを意味する。
(Evaluation 3) (Reference data)
Next, in the same manner as described above, 70 mM of the fluorescent dye calcein was encapsulated in 1 μM of a liposome prepared to have a lipid composition (phosphatidyl glycerol: cardiolipin = 3: 1) imitating the cell membrane of Gram-positive bacteria.
Then, in the presence or absence of 20 μg / ml of NP4P, the antimicrobial peptide ASABF-α was added stepwise by 0.1 μg / ml (final concentration), and the leakage of the fluorescent dye was used as an index for lipid double Film breakage was measured.
The obtained results are shown in FIG. An increase in fluorescence means that the film was destroyed.
図１及び図２に示すように、ＮＰ３Ｐは膜を破壊する活性を示したが、ＮＰ４ＰはむしろＡＳＡＢＦ−αによる膜破壊を阻害した。
したがって、膜に対する作用において、ＮＰ１Ｐ〜ＮＰ３ＰとＮＰ４Ｐは、正反対の活性を示した。
As shown in FIGS. 1 and 2, NP3P showed an activity of disrupting the membrane, but NP4P rather inhibited the membrane disruption by ASABF-α.
Therefore, NP1P to NP3P and NP4P showed the opposite activity in the action on the membrane.
以上より、本発明の抗微生物活性ペプチドによれば、グラム陽性および陰性の病原細菌を含む微生物に対して強い抗微生物活性を示すことが確認された。 From the above, it was confirmed that the antimicrobial activity peptide of the present invention exhibits strong antimicrobial activity against microorganisms including Gram-positive and negative pathogenic bacteria.
Claims (7)
前記前駆領域ペプチドに含まれる酸性アミノ酸残基の側鎖にあるカルボキシル基がアミド基に変換されたものであり、
前記前駆領域ペプチドが下記（Ａ）〜（Ｃ）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド断片を有するものであることを特徴とする抗微生物活性ペプチド。
（Ａ）
ArgArgArgPheValAlaGluGlnAspAlaIleHisSerArgValSerArgGluValProThrLeuSerAspSerVal（配列番号１）
（Ｂ）
ArgArgArgPheValValGlnGlnAspThrIleSerProArgLeuGluValAspGluArgPheLeuProAsnSerValGlnGluGlnIle（配列番号２）
（Ｃ）
ArgArgArgSerValGlyGluGluAspAlaIleProSerHisIleGluValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGluHisIle（配列番号３） An antimicrobial activity peptide having antimicrobial activity obtained by modifying the amino acid sequence of a precursor region peptide of an antimicrobial peptide precursor,
Wherein all SANYO carboxyl groups on the side chains of acidic amino acid residues contained in the precursor region peptide was converted to an amide group,
The antimicrobial activity peptide, wherein the precursor region peptide has a peptide fragment consisting of any one of the following amino acid sequences (A) to (C):
(A)
ArgArgArgPheValAlaGluGlnAspAlaIleHisSerArgValSerArgGluValProThrLeuSerAspSerVal (SEQ ID NO: 1)
(B)
ArgArgArgPheValValGlnGlnAspThrIleSerProArgLeuGluValAspGluArgPheLeuProAsnSerValGlnGluGlnIle (SEQ ID NO: 2)
(C)
ArgArgArgSerValGlyGluGluAspAlaIleProSerHisIleGluValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGluHisIle (SEQ ID NO: 3)
（Ｄ）
ArgArgArgPheValAlaGlnGlnAsnAlaIleHisSerArgValSerArgGlnValProThrLeuSerAsnSerVal（配列番号４）
（Ｅ）
ArgArgArgPheValValGlnGlnAsnThrIleSerProArgLeuGlnValAsnGlnArgPheLeuProAsnSerValGlnGlnGlnIle（配列番号５）
（Ｆ）
ArgArgArgSerValGlyGlnGlnAsnAlaIleProSerHisIleGlnValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGlnHisIle（配列番号６） The antimicrobial activity peptide characterized by having a peptide fragment which consists of an amino acid sequence in any one of following (D)-(F).
(D)
ArgArgArgPheValAlaGlnGlnAsnAlaIleHisSerArgValSerArgGlnValProThrLeuSerAsnSerVal (SEQ ID NO: 4)
(E)
ArgArgArgPheValValGlnGlnAsnThrIleSerProArgLeuGlnValAsnGlnArgPheLeuProAsnSerValGlnGlnGlnIle (SEQ ID NO: 5)
(F)
ArgArgArgSerValGlyGlnGlnAsnAlaIleProSerHisIleGlnValAsnLysPhePheLeuArgLysProAlaLysGlnHisIle (SEQ ID NO: 6)
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