JP5191386B2 - 歯周硬組織再生用組成物及び歯周硬組織を再生する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、脂肪前駆細胞を歯周硬組織に分化させる培養方法に関する。更に、本発明は、骨、軟骨、歯周靱帯を含む歯周硬組織を再生させるために使用される歯周硬組織再生用組成物に関する。更に、本発明は、歯周疾患の治療方法に関する。
近年、歯槽骨、セメント質、歯根膜を含む歯周硬組織の破壊を伴う歯周疾患の治療において、内在性の組織由来幹細胞の持つ自己修復力を何らかの方法（スキャフォールドや細胞成長因子等）で活性化することにより再生を図るアプローチが進められている。一方、上記歯周疾患の治療方法として、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ＥＳ（多能性幹細胞）をはじめとする幹細胞を歯周組織に細胞移入する再生療法もまた注目を集めている。
幹細胞は、自己複製能を有する一方で、多くの種類の細胞に分化する分化能を有していることから、再生医療のための細胞ソースとしても注目されているが、未だその実用性、有用性の詳細は十分に解明されていない。また、歯周硬組織は、歯槽骨、セメント質、軟骨、歯周靱帯等の複数の組織により構成されており、歯周硬組織が破損された場合には、これらの組織を総合的に修復させるという高度な再生医療技術が要求される。
また、従来、再生医療のための幹細胞ソースとしては、骨髄から採取されたものが広く使用されている。しかしながら、骨髄からの幹細胞の採取は、身体への侵襲がおおきく、また採取できる細胞数も限定されるという問題点がある。このような骨髄由来の幹細胞に代わる細胞として、近年、脂肪組織由来の脂肪前駆細胞が報告されている。脂肪前駆細胞は、採取する際の身体への負担が少なく、増殖能に優れているという利点に加えて、更に、骨や軟骨への分化能を備えていることも本発明者等により確認している。
しかしながら、脂肪前駆細胞を利用して、歯周硬組織を効率的且つ効果的に再生させるための具体的な技術的手段については明らかにされていない。また、従来、間葉系幹細胞を骨や軟骨に分化誘導させるには、デキサメタゾン等の副腎皮質ホルモンを含む培地での培養が採用されているが、このような方法では、脂肪前駆細胞は歯周硬組織に効率的に分化できないことが、本発明者等により明らかにされている。
特表２００２−５３７８４９号公報
本発明は、脂肪前駆細胞を利用し、骨、軟骨、歯周靱帯を総合的に修復して歯周硬組織を再生させるための技術を提供することを目的とする。
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、(i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含み、且つ脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含んでいない培地を用いて、脂肪前駆細胞を培養することによって、当該細胞を歯周硬組織細胞に効率的に分化誘導させることが可能になることを見出した。更に、上記培地で培養された脂肪前駆細胞と共にスキャフォールドを組み合わせて、再生が必要とされる歯周組織に移植すると、骨、軟骨、歯周靱帯を総合的に修復して歯周硬組織を再生させることが可能になることを見出した。このような歯周硬組織の再生効果は、特に、スキャフォールドとして、ヒドロシキアパタイト及び／又はフィブリンゲルを選択し、これを上記培地で培養された脂肪前駆細胞と組み合わせて使用することによって、一層高められることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。
即ち、本発明は、下記に掲げる培養方法、歯周硬組織再生用組成物、歯周疾患の治療方法、及び使用を提供するものである。
項１． (i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で、脂肪前駆細胞を培養することを特徴とする、脂肪前駆細胞を歯周硬組織細胞に分化させる培養方法。
項２． 脂肪前駆細胞がヒト由来である、項１に記載の方法。
項３． 前記(i)成分がβグリセロリン酸であり、且つ前記(ii)成分がアルコルビン酸である、項１に記載の方法。
項４． 前記培地が、前記(i)成分を０．１〜１００mg/mL、及び前記(ii)成分を１〜１０００μg/mL含有するものである、項１に記載の方法。
項５． 前記培地の副腎皮質ホルモン含有量が１０nM未満である、項１に記載の方法。
項６． (i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドを含む、歯周硬組織再生用組成物。
項７． 前記スキャフォールドが、ヒドロシキアパタイト及び／又はフィブリンゲルである、項６に記載の歯周硬組織再生用組成物。
項８． 前記脂肪前駆細胞がヒト由来である、項６に記載の歯周硬組織再生用組成物。
項９． 前記脂肪前駆細胞１．０×１０６cells当たり、前記スキャホールドを１〜４０００mg含む、項６に記載の歯周硬組織再生用組成物。
項１０． 歯周疾患を罹患している患者の歯周患部に、(i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドを治療有効量投与することを特徴する、歯周疾患の治療方法。
項１１． 歯周疾患を罹患している患者の歯周患部に、項６に記載の歯周硬組織再生用組成物を治療有効量投与する、項１０に記載の歯周疾患の治療方法。
項１２． (i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）の、脂肪前駆細胞を歯周硬組織細胞に分化させるための使用。
項１３． (i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドの、歯周硬組織再生用組成物の製造のための使用。
項１． (i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で、脂肪前駆細胞を培養することを特徴とする、脂肪前駆細胞を歯周硬組織細胞に分化させる培養方法。
項２． 脂肪前駆細胞がヒト由来である、項１に記載の方法。
項３． 前記(i)成分がβグリセロリン酸であり、且つ前記(ii)成分がアルコルビン酸である、項１に記載の方法。
項４． 前記培地が、前記(i)成分を０．１〜１００mg/mL、及び前記(ii)成分を１〜１０００μg/mL含有するものである、項１に記載の方法。
項５． 前記培地の副腎皮質ホルモン含有量が１０nM未満である、項１に記載の方法。
項６． (i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドを含む、歯周硬組織再生用組成物。
項７． 前記スキャフォールドが、ヒドロシキアパタイト及び／又はフィブリンゲルである、項６に記載の歯周硬組織再生用組成物。
項８． 前記脂肪前駆細胞がヒト由来である、項６に記載の歯周硬組織再生用組成物。
項９． 前記脂肪前駆細胞１．０×１０６cells当たり、前記スキャホールドを１〜４０００mg含む、項６に記載の歯周硬組織再生用組成物。
項１０． 歯周疾患を罹患している患者の歯周患部に、(i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドを治療有効量投与することを特徴する、歯周疾患の治療方法。
項１１． 歯周疾患を罹患している患者の歯周患部に、項６に記載の歯周硬組織再生用組成物を治療有効量投与する、項１０に記載の歯周疾患の治療方法。
項１２． (i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）の、脂肪前駆細胞を歯周硬組織細胞に分化させるための使用。
項１３． (i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドの、歯周硬組織再生用組成物の製造のための使用。
本発明の培養方法によれば、脂肪組織から得られる脂肪前駆細胞を、効率的に歯周硬組織を構成する細胞に分化誘導させることができる。
また、本発明の歯周硬組織再生用組成物によれば、脂肪組織から得られる脂肪前駆細胞とスキャフォールドを組み合わせて使用することにより、骨、軟骨、歯周靱帯を総合的に修復して歯周硬組織を再生させることが可能になる。特に、このような歯周硬組織を再生させる効果は、スキャフォールドとして、ヒドロシキアパタイト及び／又はフィブリンゲルを採用することによって、格別顕著に奏される。
従って、本発明の歯周硬組織再生用組成物によれば、歯槽骨、セメント質、歯周靱帯の破壊を伴い、従来回復が困難であった重度の歯周炎に対しても、効果的に歯周硬組織の再生を行うことができる。即ち、本発明によれば、患者のＱＯＬ（Quolity of life）の向上に寄与する新規な治療方法を提供でき、患者にとっては大きな福音となり、もって国民福祉の向上に資することになる。
I. 歯周硬組織細胞に分化させる培養方法
第１に、本発明は、脂肪前駆細胞を歯周硬組織細胞に分化させる培養方法を提供する。
第１に、本発明は、脂肪前駆細胞を歯周硬組織細胞に分化させる培養方法を提供する。
本発明で使用される脂肪前駆細胞は、ほ乳動物から分離されたもの、例えば内臓脂肪組織又は皮下脂肪組織から公知の手法に従って分離されたものであってもよく、間葉系幹細胞又はＥＳ細胞等の幹細胞から分化誘導されたものであってもよい。
本発明で使用される脂肪前駆細胞の由来についても特に制限されず、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ネコ、ウシ、サル等が例示される。これらの中でも、ヒト由来のものは、臨床上の応用が可能であるため本発明に好適である。
本発明の培養方法において、上記脂肪前駆細胞を培養する培地は、グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種（以下、これを単に(i)成分と表記することもある）、並びにアスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種（以下、これを単に(ii)成分と表記することもある）を含む培地が使用される。
ここで、(i)成分として使用されるグリセロリン酸としては、α−グリセロリン酸及びβ−グリセロリン酸の何れであってもよいが、好ましくはβ−グリセロリン酸である。
また、(i)成分として使用されるグリセロリン酸の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マンガン塩、マグネシウム塩、鉄塩等が挙げられる。本発明において、これらの塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
上記(i)成分の内、好ましくはβ−グリセロリン酸及びその塩であり、更に好ましくはβ−グリセロリン酸である。
上記(i)成分として、グリセロリン酸及びその塩の中から１種の化合物を単独で使用してもよいが、２種以上の化合物を組み合わせて使用してもよい。
また、(ii)成分として使用されるアスコルビン酸の誘導体としては、例えば、アスコルビン酸２−グルコシド、アスコルビン酸−２リン酸、アスコルビン酸−２硫酸、アスコルビン酸２，６−ジパルミテート、アスコルビン酸６−ステアレート、アスコルビン酸グルコサミン、Ｌ−デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸６−パルミテート、テトライソパルミチン酸Ｌ−アスコルビン等が挙げられる。
また、(ii)成分として使用されるアスコルビン酸及びその誘導体の塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。本発明において、これらの塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
上記(ii)成分の内、好ましくはアスコルビン酸及びその塩であり、更に好ましくはアスコルビン酸である。
上記(i)成分として、アスコルビン酸、その誘導体及びその塩の中から１種の化合物を単独で使用してもよいが、これらの中から２種以上の化合物を組み合わせて使用してもよい。
本発明に使用される培地中の上記(i)及び(ii)成分の濃度としては、特に制限されるものではないが、具体的には、上記(i)成分を０．１〜１００mg/mL及び上記(ii)成分を１〜１０００μg/mL含む培地；好ましくは上記(i)成分を０．５〜５０mg/mL及び上記(ii)成分を２０〜１５０μg/を含む培地；更に好ましくは上記(i)成分を０．５〜１０mg/mL及び上記(ii)成分を２０〜８０μg/mLを含む培地が例示される。このような濃度で培地中に上記(i)及び(ii)成分を含有させることにより、歯周硬組織細胞（骨形成細胞、軟骨形成細胞、歯周靱帯形成細胞等）への分化誘導を一層効率的に実施することが可能になる。
また、上記の培地は、通常の細胞培養（浮遊培養）に使用される培地に、上記(i)及び(ii)成分が所定量添加されていればよい。当該培地の好適なものとして、例えば、ヒト血清又は牛血清アルブミンを５〜２０容量％含むＤＭＥＭ培地に上記(i)及び(ii)成分が所定量添加されたものが挙げられる。
但し、本発明で使用される上記培地には、デキサメタゾン等の副腎皮質ホルモンを、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する有効量で含んでいないことを必須とする。従来、幹細胞を軟骨細胞や骨形成細胞や軟骨形成細胞等に分化させるには、一般的に、副腎皮質ホルモンを含む培地が使用されている。しかしながら、本発明では、従来技術の知見とは異なり、上記(i)及び(ii)成分含み、且つ副腎皮質ホルモンの含有量が脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する有効量未満である培地を使用することによって、脂肪前駆細胞に対して短時間で効率的に歯周硬組織細胞への分化させることが可能にしている。これに対して、上記(i)及び(ii)成分と共に、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する有効量の副腎皮質ホルモンを含む従来の分化促進用培地を使用すると、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化は認められるものの、その分化速度は遅く、短時間で効率的に歯周硬組織細胞への分化させることはできない。
本発明で使用される上記培地として、具体的には、副腎皮質ホルモンが１０nM未満、好ましくは２nM未満、更に好ましくは１nM、特に好ましくは０．５nMである培地、より好ましくは副腎皮質ホルモンを実質的に含まない培地が例示される。
上記脂肪前駆細胞を培養する条件については特に制限されないが、通常、３７℃、５％二酸化炭素存在下で、１〜３０日間、好ましくは２〜１４日間培養を行えばよい。このように培養を行うことによって、上記脂肪前駆細胞を歯周硬組織細胞に分化誘導させることができる。
なお、上記脂肪前駆細胞の培養は、培地中で当該脂肪前駆細胞が基材に付着させた状態で実施してもよく、また低接着培養皿内で当該脂肪前駆細胞を浮遊させた状態で実施してもよい。
II. 歯周硬組織再生用組成物
第二に、本発明は、上記(i)及び(ii)成分を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、及びスキャフォールドを含む、歯周硬組織再生用組成物を提供する。
第二に、本発明は、上記(i)及び(ii)成分を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、及びスキャフォールドを含む、歯周硬組織再生用組成物を提供する。
本発明の歯周硬組織再生用組成物に使用される脂肪前駆細胞及びその培養方法は、上記「I. 歯周硬組織細胞に分化させる培養方法」の項で記載したものと同様である。
本発明の歯周硬組織再生用組成物に使用されるスキャフォールドとしては、硬組織の再生に使用できる限り、特に制限されないが、例えば、ゲル状体又は多孔体で、生体分解性（biodegradable）又は生体吸収性（bioresorbable）の材料が使用される。スキャフォールドは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。
当該スキャフォールドとして、特に、ヒドロシキアパタイト及び／又はフィブリンゲルを使用した場合には、脂肪前駆細胞による歯周硬組織の再生効果が特に顕著に奏されるため、本発明の歯周硬組織再生用組成物において、ヒドロシキアパタイト及び／又はフィブリンゲルは特に好適なスキャフォールドである。
本発明の歯周硬組織再生用組成物に含まれるスキャフォールドの配合割合としては、スキャフォールドの種類等に応じて適宜設定すればよいが、一例として、歯周硬組織再生用組成物に含まれる上記脂肪前駆細胞１．０×１０６cells当たり、１〜４０００ｍｇ、好ましくは５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜８００ｍｇとなる割合が例示される。
また、本発明の歯周硬組織再生用組成物には、脂肪前駆細胞及びスキャフォールド以外に、必要に応じて、薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。ここで、薬学的に許容される担体としては、例えば、生理食塩水、緩衝液等が例示される。
また、本発明の歯周硬組織再生用組成物には、上記するものの他に、フィブリノゲン、トロンビン等を適当量添加していてもよい。
本発明の歯周硬組織再生用組成物は、歯科治療材料として使用でき、特に歯周硬組織の破壊を伴う歯周疾患の治療に有用である。具体的には、治療対象となる歯周患部に、本発明の歯周硬組織再生用組成物の適当量をシリンジ等を使用して投与することにより、骨、軟骨、歯周靱帯を総合的に修復して歯周硬組織全体を再生させることができる。
歯周疾患の治療において、本発明の歯周硬組織再生用組成物の投与量については、疾患の症状の程度、患者の性別や年齢等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、上記歯周硬組織再生用組成物の投与量を、上記脂肪前駆細胞の適用量が１．０×１０５〜１．０×１０７cells程度となるように設定すればよい。
III. 歯周疾患の治療方法
更に、本発明は、歯周硬組織の再生方法として有用である「歯周疾患の治療方法」をも提供する。当該治療方法は、歯周疾患を罹患している患者の歯周患部に、(i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドを治療有効量投与することを特徴するものである。
更に、本発明は、歯周硬組織の再生方法として有用である「歯周疾患の治療方法」をも提供する。当該治療方法は、歯周疾患を罹患している患者の歯周患部に、(i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドを治療有効量投与することを特徴するものである。
本発明の治療方法に使用される脂肪前駆細胞及びその培養方法は、上記「I. 歯周硬組織細胞に分化させる培養方法」の項で記載したものと同様である。また、本発明の治療方法に使用されるスキャフォールドは、上記「II. 歯周硬組織再生用組成物」の項で記載したものと同様である。更に、投与されるスキャフォールドと脂肪前駆細胞との割合、これらの投与量、これらの投与方法、対象となる歯周疾患についても、「II. 歯周硬組織再生用組成物」の項で記載した内容が援用される。
本発明の治療方法は、上記脂肪前駆細胞と上記スキャフォールドをそれぞれ順次又は同時に歯周患部に投与してもよいが、上記歯周硬組織再生用組成物を用いてこれを歯周患部に投与することが簡便で好ましい。
以下、実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
試験例１ 細胞分化誘導
＜試験方法＞
公知の方法に従ってヒトの脂肪組織から採取した脂肪前駆細胞を、10 mM β-グリセロリン酸、50 μg/mlアスコルビン酸及び10容量% FCS（子牛胎児血清）を含むD-MEM培地（以下、「硬組織誘導培地１」と略す）或いは硬組織誘導培地１に10ｎＭとなるようにデキサメタゾンを添加した培地（以下、「硬組織誘導培地２」と略す）にて３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養し、培養14及び21日目において、以下に記す方法に従って、各培養液中の細胞に対してアリザリンレッド染色を行い、石灰化ノジュールの形成状況を評価した。また、培養0、7、14、21、28日目の各時点において、以下に記す方法に従って、DNA量及びアルカリフォスファターゼ（以下ALPaseと略す）活性の測定を行った。なお、培養中、硬組織誘導培地１及び硬組織誘導培地２は、３日毎に交換した。
試験例１ 細胞分化誘導
＜試験方法＞
公知の方法に従ってヒトの脂肪組織から採取した脂肪前駆細胞を、10 mM β-グリセロリン酸、50 μg/mlアスコルビン酸及び10容量% FCS（子牛胎児血清）を含むD-MEM培地（以下、「硬組織誘導培地１」と略す）或いは硬組織誘導培地１に10ｎＭとなるようにデキサメタゾンを添加した培地（以下、「硬組織誘導培地２」と略す）にて３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養し、培養14及び21日目において、以下に記す方法に従って、各培養液中の細胞に対してアリザリンレッド染色を行い、石灰化ノジュールの形成状況を評価した。また、培養0、7、14、21、28日目の各時点において、以下に記す方法に従って、DNA量及びアルカリフォスファターゼ（以下ALPaseと略す）活性の測定を行った。なお、培養中、硬組織誘導培地１及び硬組織誘導培地２は、３日毎に交換した。
アリザリンレッド染色
細胞の培養上清を除去後、回収した細胞をPBSにて二回洗浄後、100%エチルアルコールにて10分間固定した。斯くして固定化された細胞に対して、アリザリンレッドS溶液にて5分間染色した後、蒸留水にて洗浄した。アリザリンレッドSにて染色された部分を位相差顕微鏡にて観察した。
細胞の培養上清を除去後、回収した細胞をPBSにて二回洗浄後、100%エチルアルコールにて10分間固定した。斯くして固定化された細胞に対して、アリザリンレッドS溶液にて5分間染色した後、蒸留水にて洗浄した。アリザリンレッドSにて染色された部分を位相差顕微鏡にて観察した。
ALPase活性の測定
細胞の培養上清を除去後、回収した細胞をPBSにて二回洗浄後、蒸留水中にてハンディ−ソニックで超音波粉砕し液体画分を回収した。この液体画分に、パラニトロフェノール-2-リン酸ナトリウム（pNPP）を500μMとなるように添加し、37℃で30分間反応させた後、同溶液のO.D.415 nm吸光度を測定し、水解されたpNPP量を求めた。なお、30分間に1 nmolのpNPPを水解するALPase活性を1ユニット（U）とし、DNA量1 μg当たりのユニット値で示した。
細胞の培養上清を除去後、回収した細胞をPBSにて二回洗浄後、蒸留水中にてハンディ−ソニックで超音波粉砕し液体画分を回収した。この液体画分に、パラニトロフェノール-2-リン酸ナトリウム（pNPP）を500μMとなるように添加し、37℃で30分間反応させた後、同溶液のO.D.415 nm吸光度を測定し、水解されたpNPP量を求めた。なお、30分間に1 nmolのpNPPを水解するALPase活性を1ユニット（U）とし、DNA量1 μg当たりのユニット値で示した。
＜試験結果＞
アリザリンレッド染色した結果を図１に、またALPase活性の測定結果を図２に示す。この結果から、硬組織誘導培地１で培養した脂肪前駆細胞は、培養１４日目でも、アリザリンレッドで染色された細胞の割合が高く、石灰化のジュールを形成して硬組織細胞に分化していることが確認できた（図１）。一方、デキサメタゾンを含む硬組織誘導培地２では、培養１４日目では、アリザリンレッドで染色された細胞が殆ど観察されず、石灰化のジュールを形成していないことが分かった（図１）。また、硬組織誘導培地１及び硬組織誘導培地２では、硬組織細胞への分化を示す１つの指標であるALPaseの発現量は、若干異なる挙動を示した（図２参照）。
アリザリンレッド染色した結果を図１に、またALPase活性の測定結果を図２に示す。この結果から、硬組織誘導培地１で培養した脂肪前駆細胞は、培養１４日目でも、アリザリンレッドで染色された細胞の割合が高く、石灰化のジュールを形成して硬組織細胞に分化していることが確認できた（図１）。一方、デキサメタゾンを含む硬組織誘導培地２では、培養１４日目では、アリザリンレッドで染色された細胞が殆ど観察されず、石灰化のジュールを形成していないことが分かった（図１）。また、硬組織誘導培地１及び硬組織誘導培地２では、硬組織細胞への分化を示す１つの指標であるALPaseの発現量は、若干異なる挙動を示した（図２参照）。
試験例２ SCIDマウスを用いたin vivo分化誘導
公知の方法に従ってヒトの脂肪組織から採取した脂肪前駆細胞を、硬組織誘導培地１又は硬組織誘導培地２を用いて３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養し、培養７日目に細胞を回収した。回収した細胞1.5x106cellsとハイドロキシアパタイト又はβ-TCP 40 mgを混和し、37oCにて90分間培養後、フィブリノゲン及びトロンビンを各15 μl添加し、６週齢のSCIDマウスの背中皮下に移植した。移植後4週間目に移植体を取り出し、移植体中のヒトオステオカルシンmRNA発現量をRT-PCR法にて測定した。なお、コントロールとしてHPRT（Hypoxanthine phosphoribosyl taransferase）のmRNA発現量についても同様に測定した。
公知の方法に従ってヒトの脂肪組織から採取した脂肪前駆細胞を、硬組織誘導培地１又は硬組織誘導培地２を用いて３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養し、培養７日目に細胞を回収した。回収した細胞1.5x106cellsとハイドロキシアパタイト又はβ-TCP 40 mgを混和し、37oCにて90分間培養後、フィブリノゲン及びトロンビンを各15 μl添加し、６週齢のSCIDマウスの背中皮下に移植した。移植後4週間目に移植体を取り出し、移植体中のヒトオステオカルシンmRNA発現量をRT-PCR法にて測定した。なお、コントロールとしてHPRT（Hypoxanthine phosphoribosyl taransferase）のmRNA発現量についても同様に測定した。
結果を図３に示す。図３から明らかなように、スキャフォールドとしてハイドロキシアパタイトを使用して、硬組織誘導培地１を用いて培養した脂肪前駆細胞を移植した場合に、顕著なヒトオステオカルシン（骨芽細胞の分化マーカー）の発現が認められた。この結果から、脂肪前駆細胞とハイドロキシアパタイトとを組合わせて使用することによって、硬組織誘導培地１を用いて培養した脂肪前駆細胞による歯周硬組織の再生を、より一層効果的に行い得ることが明らかになった。
試験例３ ビーグル犬歯周病モデルへの脂肪前駆細胞の移植とその解析
２歳のビーグル犬の下顎人工的2級根分岐部病変を作製し、同時に腹部より大網を採取した。採取した大網から脂肪前駆細胞を単離し保存した。単離保存した脂肪前駆細胞を硬組織誘導培地１で３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養し、培養７日目に細胞を回収した。回収した細胞１．５×１０５cellsとフィブリンゲル１００μｌを混和し、これを手術後4週間目の上記ビーグル犬の根分岐部病変の実験側に移植した。また、根分岐部病変の対照側には、フィブリンゲルのみを填入した。移植後4週間目に下顎骨を採取し、マイクロCTにて歯周硬組織を撮影し、その再生の程度を評価した。
２歳のビーグル犬の下顎人工的2級根分岐部病変を作製し、同時に腹部より大網を採取した。採取した大網から脂肪前駆細胞を単離し保存した。単離保存した脂肪前駆細胞を硬組織誘導培地１で３７℃、５％二酸化炭素存在下で培養し、培養７日目に細胞を回収した。回収した細胞１．５×１０５cellsとフィブリンゲル１００μｌを混和し、これを手術後4週間目の上記ビーグル犬の根分岐部病変の実験側に移植した。また、根分岐部病変の対照側には、フィブリンゲルのみを填入した。移植後4週間目に下顎骨を採取し、マイクロCTにて歯周硬組織を撮影し、その再生の程度を評価した。
結果を図４及び５に示す。図４において、(A)には脂肪前駆細胞及びフィブリンゲルを投与した結果を示し、(B)にはフィブリンゲルのみを投与した結果（コントロール）を示す。また、図５において、(A)には脂肪前駆細胞及びフィブリンゲルを投与した結果を示し、(B)にはフィブリンゲルのみを投与した結果（コントロール）を示す。この結果から、脂肪前駆細胞及びフィブリンゲルを投与した根分岐部病変部位において、骨再生と共に、軟骨及び歯周靱帯の再生も認められ、根分岐部病変部位が歯周硬組織として再生されていることが分かった。一方、単にフィブリンゲルを投与した場合では、歯周硬組織の再生は認められなかった。
Claims (7)
- (i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドを含む、歯周硬組織再生用組成物。
- 前記スキャフォールドが、ヒドロシキアパタイト及び／又はフィブリンゲルである、請求項１に記載の歯周硬組織再生用組成物。
- 前記脂肪前駆細胞がヒト由来である、請求項１に記載の歯周硬組織再生用組成物。
- 前記脂肪前駆細胞１．０×１０６cells当たり、前記スキャホールドを１〜４０００mg含む、請求項１に記載の歯周硬組織再生用組成物。
- 歯周疾患を罹患している患者（但し、ヒトを除く）の歯周患部に、
(i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドを治療有効量投与することを特徴する、歯周疾患の治療方法。 - 歯周疾患を罹患している患者（但し、ヒトを除く）の歯周患部に、請求項１に記載の歯周硬組織再生用組成物を治療有効量投与する、請求項５に記載の歯周疾患の治療方法。
- (i)グリセロリン酸、及びその塩よりなる群から選択される少なくとも１種、及び(ii)アスコルビン酸、その誘導体、及びその塩よりよりなる群から選択される少なくとも１種を含む培地（但し、脂肪前駆細胞の歯周硬組織細胞への分化を促進する量の副腎皮質ホルモンを含まない）で培養された脂肪前駆細胞、並びにスキャフォールドの、歯周硬組織再生用組成物の製造のための使用。
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