JP5187883B2 - Antigenic peptides and uses thereof - Google Patents
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Description
本発明は、インフルエンザウイルスに対する抗体に関するものであり、より詳細には、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識し得る抗体を惹起し得るペプチドおよびその利用に関するものである。 The present invention relates to an antibody against influenza virus, and more particularly to a peptide capable of raising an antibody capable of cross-recognizing a plurality of subtypes of influenza A virus and use thereof.
インフルエンザウイルスはコア蛋白質（核蛋白（ＮＰ蛋白）および膜蛋白（Ｍ１蛋白））の抗原性に基づいて分類される。１９４０年に、それまでに知られていたインフルエンザウイルスとは全く異なる抗原性を有するインフルエンザウイルスが分離され、前者をＡ型、後者をＢ型と規定した。さらに、１９４９年にＴａｙｌｏｒによって新たなインフルエンザウイルス（Ｃ型）が発見されている。 Influenza viruses are classified based on the antigenicity of core proteins (nuclear protein (NP protein) and membrane protein (M1 protein)). In 1940, an influenza virus having completely different antigenicity from previously known influenza viruses was isolated, and the former was defined as type A and the latter as type B. Furthermore, a new influenza virus (type C) was discovered by Taylor in 1949.
Ａ型インフルエンザウイルスは、ウイルス粒子の表面糖蛋白であるヘマグルチニン（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ））およびノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＮＡ））の抗原性に基づいてサブタイプ（亜型）に分類される。ＨＡタンパク質は、ヒト等の細胞表面のシアル酸と結合して、ウイルス粒子が細胞内に取り込まれる際の重要な役割を担っている。ＮＡタンパク質は、ウイルス粒子が感染後期に細胞表面から離れる際にシアル酸を切断する働きを有しており、感染性を獲得するのに役だっている。 Influenza A viruses are classified into subtypes (subtypes) based on the antigenicity of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), which are surface glycoproteins of virus particles. HA protein binds to sialic acid on the surface of cells such as humans and plays an important role when virus particles are taken up into cells. The NA protein has a function of cleaving sialic acid when the virus particle leaves the cell surface in the late stage of infection, and is useful for acquiring infectivity.
インフルエンザウイルスの流行は社会的に大きな問題となっている。過去に大流行を起こしたのは１型サブタイプ、２型サブタイプまたは３型サブタイプのＨＡタンパク質を有するウイルスであり、近年問題となっているトリインフルエンザウイルスはＨ５型サブタイプのＨＡタンパク質を有している。インフルエンザウイルスの感染は終生免疫を獲得し得ないので、これらのインフルエンザに対する予防策として、流行予測に基づいて毎年ワクチンを作製し、そのワクチンを接種する。 The influenza virus epidemic has become a major social problem. A virus that has a type 1 subtype, type 2 subtype, or type 3 subtype HA protein has caused a pandemic in the past, and avian influenza virus that has recently become a problem is a type of HA protein of the H5 type subtype. Have. Since infection with influenza virus cannot acquire lifelong immunity, as a preventive measure against these influenza, a vaccine is prepared and vaccinated every year based on the epidemic prediction.
具体的には、以下の手順に従って、脱脂・不活化したワクチン（ＨＡワクチン）を得る：（１）次のシーズンに流行するであろうウイルスの抗原性を予測する；（２）この予測に基づいて、ワクチンとして適したインフルエンザウイルス株を選択する；（３）選択した株を発育鶏卵に摂取して増殖させ、漿尿液からウイルスを精製する；（４）精製したウイルスを濃縮し、エーテルおよびホルマリンを用いて処理する。 Specifically, a defatted and inactivated vaccine (HA vaccine) is obtained according to the following procedure: (1) Predicting the antigenicity of a virus that will be prevalent in the next season; (2) Based on this prediction Select an influenza virus strain suitable as a vaccine; (3) ingest the selected strain into a growing chicken egg to grow and purify the virus from chorioallantoic fluid; (4) concentrate the purified virus with ether and Treat with formalin.
ＨＡには１６種類のサブタイプがあり、型によって抗原性が大きく異なる。また、ウイルスは宿主の免疫機構から逃れるために絶えずＨＡタンパク質に小さな変異を起こしているので、同一のサブタイプであっても株によってＨＡタンパク質のアミノ酸配列は異なっている。ＨＡおよび／またはＮＡの変異に起因して、現在用いられているＨＡワクチンは、抗原型に適合したものを生産することが困難である。 HA has 16 subtypes, and antigenicity varies greatly depending on the type. In addition, since the virus constantly makes small mutations in the HA protein in order to escape from the host immune mechanism, the amino acid sequence of the HA protein varies from strain to strain even in the same subtype. Due to HA and / or NA mutations, currently used HA vaccines are difficult to produce that are compatible with the serotype.
また、得られたＨＡワクチンは、長期間にわたって強い感染防御免疫を誘導することができない。また、実際に流行しているウイルスと異なる型のウイルスから作製されたワクチンを用いても効果を期待し得ないので、流行に対する正確な予測が必要となる。さらに、ウイルス培養によってワクチンを作製するので、予想を上回る規模で流行が発生した場合には、十分なワクチン供給が困難である。また、ワクチンへ混入する鶏卵成分を完全に除去することは非常に困難であるので、卵アレルギーを有するヒトへは投与し得ない。ＨＡタンパク質の複数のサブタイプ（すなわち、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプ）を交差認識し得る抗体を、鶏卵を用いることなく簡便に取得することが望まれている。 Moreover, the obtained HA vaccine cannot induce strong protective immunity over a long period of time. Moreover, since it cannot be expected that a vaccine produced from a virus of a different type from the virus that is actually prevalent will be expected, it is necessary to accurately predict the epidemic. Furthermore, since a vaccine is produced by virus culture, it is difficult to supply a sufficient vaccine when an epidemic occurs on a scale larger than expected. Moreover, since it is very difficult to completely remove the egg component mixed in the vaccine, it cannot be administered to humans having egg allergy. It is desired to easily obtain an antibody capable of cross-recognizing a plurality of subtypes of HA protein (that is, a plurality of subtypes of influenza A virus) without using chicken eggs.
特許文献１〜３には、ＨＡタンパク質のアミノ酸配列に基づいて所望の抗体を作製することが開示されている。特許文献１には、ＨＡタンパク質のＨ１型サブタイプおよびＨ２型サブタイプを交差認識するがＨ３型サブタイプを認識しない抗体ならびにその抗原部位が開示されている。また、特許文献２には、ＨＡタンパク質のＨ３型サブタイプを認識するがＨ１型サブタイプおよびＨ２型サブタイプを認識しない抗体ならびにその抗原部位が開示されている。特許文献３では、ＨＡタンパク質のＨ３型サブタイプの部分断片からなるポリペプチドによるＣＰＥ阻害活性を確認している。 Patent Documents 1 to 3 disclose that a desired antibody is produced based on the amino acid sequence of the HA protein. Patent Document 1 discloses an antibody that cross-recognizes the H1 type and H2 type subtypes of the HA protein but does not recognize the H3 type subtype, and its antigenic site. Patent Document 2 discloses an antibody that recognizes the H3 type subtype of the HA protein but does not recognize the H1 type subtype and the H2 type subtype, and its antigenic site. Patent Document 3 confirms the CPE inhibitory activity of a polypeptide comprising a partial fragment of the H3 type subtype of the HA protein.
また、特許文献４には、ペプチド抗原を用いない技術として、コンビナトリアルケミストリー法およびファージディスプレイ法を用いて単離した遺伝子にコードされるヒトＦａｂがＨＡタンパク質のＨ３型サブタイプに効果的な中和活性を有していることが記載されている。
上述したように、特許文献１に記載の抗体はＨ３型サブタイプを認識しない。また、特許文献２〜４に記載の抗体はＨ３型サブタイプ特異的である。このように、Ｈ３型サブタイプと他のサブタイプとの両方を認識する抗体は得られていない。また、ＨＡタンパク質のＨ３型サブタイプに由来するポリペプチドのいくつかがＣＰＥ阻害活性を有していることが特許文献３に記載されているが、特許文献１および２には、特許文献３に記載のポリペプチドは中和活性が弱い上に、抗原性の点でも問題があると記載されている。 As described above, the antibody described in Patent Document 1 does not recognize the H3 type subtype. The antibodies described in Patent Documents 2 to 4 are specific to the H3 type subtype. Thus, an antibody that recognizes both the H3 type subtype and other subtypes has not been obtained. In addition, Patent Document 3 describes that some of polypeptides derived from the H3 type subtype of HA protein have CPE inhibitory activity. It is described that the described polypeptide has a weak neutralizing activity and also has a problem in antigenicity.
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、スペクトルの広いインフルエンザワクチンを提供することことにあり、より詳細には、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識し得る抗体およびこのような抗体を効率よく惹起し得る抗原を提供することにある。 The present invention has been made in view of the above problems, and its object is to provide a broad spectrum influenza vaccine. More specifically, the present invention crosses multiple subtypes of influenza A virus. It is to provide an antibody that can be recognized and an antigen that can efficiently raise such an antibody.
本発明に係るペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでいることを特徴としている。本発明に係るペプチドを用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識する抗体を惹起し得る。 The peptide according to the present invention is characterized by including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. By using the peptide according to the present invention, an antibody that cross-recognizes a plurality of subtypes of influenza A virus can be raised.
本発明に係るワクチンは、上記のペプチドを有していることを特徴としている。本発明に係るワクチンを用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスを予防または治療し得る。 The vaccine according to the present invention is characterized by having the above peptide. With the vaccine according to the present invention, influenza A virus can be prevented or treated.
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ペプチドをコードすることを特徴としている。 The polynucleotide according to the present invention is characterized by encoding the above peptide.
本発明に係る発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドが作動可能に連結されていることを特徴としている。本発明に係る発現ベクターを用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識する抗体を惹起し得る抗原を提供し得る。 The expression vector according to the present invention is characterized in that the polynucleotide is operably linked. By using the expression vector according to the present invention, an antigen capable of raising an antibody that cross-recognizes a plurality of subtypes of influenza A virus can be provided.
本発明に係るワクチンは、上記のポリヌクレオチドを有していることを特徴としている。本発明に係るワクチンを用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスを予防または治療し得る。 The vaccine according to the present invention is characterized by having the above-mentioned polynucleotide. With the vaccine according to the present invention, influenza A virus can be prevented or treated.
本発明に係るペプチド作製方法は、上記ポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を用いる工程を包含することを特徴としている。本発明に係るペプチド作製方法を用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識する抗体を惹起し得る抗原を提供し得る。 The peptide production method according to the present invention is characterized by including a step of using a transformant into which the polynucleotide is introduced. By using the peptide production method according to the present invention, an antigen capable of raising an antibody that cross-recognizes a plurality of subtypes of influenza A virus can be provided.
本発明に係るペプチド作製キットは、上記ポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を備えていることを特徴としている。本発明に係るペプチド作製キットを用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識する抗体を惹起し得る抗原を提供し得る。 The peptide production kit according to the present invention is characterized by comprising a transformant into which the polynucleotide is introduced. By using the peptide production kit according to the present invention, an antigen capable of raising an antibody that cross-recognizes a plurality of subtypes of influenza A virus can be provided.
本発明に係る抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質のＨ１型サブタイプおよびＨ３型サブタイプを交差認識することを特徴としている。本発明に係る抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識することが好ましい。 The antibody according to the present invention is characterized by cross-recognizing the H1 type subtype and the H3 type subtype of the hemagglutinin protein of influenza A virus. It is preferable that the antibody according to the present invention specifically recognizes a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
本発明に係る抗体は、重鎖可変領域が、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、または（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列、または（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含むことを特徴としている。本発明に係る抗体は、重鎖可変領域が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。 In the antibody according to the present invention, the heavy chain variable region is substituted or deleted in (1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or (2) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 1 or several light chain variable regions (3) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or (4) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 In which the amino acid sequence comprises a substituted, deleted, inserted, and / or added amino acid sequence. In the antibody according to the present invention, the heavy chain variable region preferably consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the light chain variable region preferably consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
本発明に係るワクチンは、上記の抗体を有していることを特徴としている。本発明に係るワクチンを用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスを予防または治療し得る。 The vaccine according to the present invention is characterized by having the above-described antibody. With the vaccine according to the present invention, influenza A virus can be prevented or treated.
本発明に係る検出キットは、上記の抗体を備えていることを特徴としている。本発明に係る検出キットを用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを簡便に検出し得る。 The detection kit according to the present invention includes the above-described antibody. By using the detection kit according to the present invention, a plurality of subtypes of influenza A virus can be easily detected.
本発明に係る検出方法は、上記の抗体を用いることを特徴としている。本発明に係る検出方法を用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを簡便に検出し得る。 The detection method according to the present invention is characterized by using the above-mentioned antibody. By using the detection method according to the present invention, a plurality of subtypes of influenza A virus can be easily detected.
本発明に係るペプチドは非常に高い抗原性を有している。また、本発明に係るペプチドを用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識し得る抗体を得ることができるので、スペクトルの広いインフルエンザワクチンを提供することができる。 The peptide according to the present invention has a very high antigenicity. Moreover, if the peptide which concerns on this invention is used, since the antibody which can cross-recognize the several subtype of influenza A virus can be obtained, an influenza vaccine with a wide spectrum can be provided.
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、従来技術からは容易に想到し得ないアミノ酸配列からなるペプチドが非常に効率よく抗体を惹起し、惹起された抗体がＡ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。 As a result of intensive investigations, the present inventors have found that peptides consisting of amino acid sequences that cannot be easily conceived from the prior art induce antibodies very efficiently, and the induced antibodies are a plurality of influenza A viruses. The inventors have found that subtypes can be cross-recognized, and have completed the present invention.
特許文献３では、広いスペクトルのインフルエンザ抗血清を得るための免疫原ペプチドを得るためにＨＡタンパク質のＨ３型サブタイプの部分断片が用いられている。特許文献３によれば、Ｈ３型サブタイプ（ＨＡ１サブユニットのＣ末端領域〜ＨＡ２サブユニットのＮ末端領域）に由来するペプチド２０〜２６は、ＨＡ２サブユニットのアミノ酸第１５〜２８位からなるペプチド２５を除けばいずれも免疫原ペプチドとして良好である。このように、特許文献３には、ペプチド２５が、本発明者らの見出したペプチドのアミノ酸配列（ＧＭＶＤＧＷＹＧ：配列番号１）と類似する配列を含んでいるにもかかわらず免疫原性が低いことが記載されている。このような従来技術に基づけば、本発明者らの見出したペプチドが非常に効率よく抗体を惹起することは、全く予想され得なかった。しかも、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識する抗体を、本発明者らの見出したペプチドが惹起し得ることは、全く予想され得なかった。 In Patent Document 3, a partial fragment of the H3 type subtype of the HA protein is used to obtain an immunogenic peptide for obtaining a broad spectrum of influenza antiserum. According to Patent Document 3, peptides 20 to 26 derived from H3 type subtype (C-terminal region of HA1 subunit to N-terminal region of HA2 subunit) are peptides consisting of amino acid positions 15 to 28 of HA2 subunit. All except 25 are good as immunogenic peptides. Thus, in Patent Document 3, peptide 25 has low immunogenicity even though it contains a sequence similar to the amino acid sequence of the peptide found by the present inventors (GMVDGWYG: SEQ ID NO: 1). Is described. Based on such prior art, it could not be expected at all that the peptide found by the present inventors raises an antibody very efficiently. Moreover, it has never been expected that the peptides found by the present inventors can elicit antibodies that cross-recognize multiple subtypes of influenza A virus.
〔１：ペプチドおよびポリヌクレオチド〕
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識し得る抗体を惹起し得るペプチドを提供する。
[1: Peptides and polynucleotides]
The present invention provides peptides capable of raising antibodies capable of cross-recognizing multiple subtypes of influenza A virus.
本明細書中において使用される場合、「Ａ型インフルエンザウイルスの（複数の）サブタイプ」は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質のサブタイプに基づく分類であることが意図され、「Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質のサブタイプ」と交換可能に使用される。Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質がＨ１型、Ｈ２型またはＨ３型のサブタイプである場合、それぞれＨ１ウイルス、Ｈ２ウイルスまたはＨ３ウイルスとも称する。また、単にＨ１型サブタイプと称する場合、「Ｈ１型サブタイプのＨＡタンパク質」または「Ｈ１型サブタイプのＨＡタンパク質を有するＡ型インフルエンザウイルス」が意図される。 As used herein, “subtype (s) of influenza A virus” is intended to be a classification based on the subtype of the HA protein of influenza A virus and “influenza A virus” Used interchangeably with “subtype of HA protein”. When the HA protein of influenza A virus is a subtype of H1, H2 or H3, it is also referred to as H1, H2 or H3 virus, respectively. In addition, when simply referred to as an H1 type subtype, “H1 type subtype HA protein” or “H1 type influenza virus having HA type subtype HA protein” is intended.
１つの局面において、本発明に係るペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むペプチドであり得る。なお、本明細書中において使用される場合、用語「ペプチド」は、「タンパク質」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。 In one aspect, the peptide according to the present invention may be a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. As used herein, the term “peptide” is used interchangeably with “protein” or “polypeptide”.
本明細書中において使用される場合、「配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むペプチド」は、「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド」であることが好ましいが、「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド」の機能が阻害されない限り、「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド」にリンカーペプチドが付加されたものや他のアミノ酸またはタンパク質が連結されたもの（例えば、タグ化されたタンパク質または融合タンパク質）であってもよい。 As used herein, “the peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1” is preferably “the peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1”. As long as the function of the “peptide consisting of the amino acid sequence shown” is not inhibited, the “peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1” added with a linker peptide or another amino acid or protein linked (for example, A tagged protein or a fusion protein).
本発明に係るペプチドの作製方法は、化学合成であっても発現ベクターを用いるものであってもよい。化学合成による場合は、本発明に係るペプチドは、公知のペプチド合成法によって製造することができる。ペプチド合成法としては、液相ペプチド合成法、固相ペプチド合成法等の化学合成法が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターを用いる場合は、発現ベクターを導入した形質転換体からペプチドを生成しても、インビトロ翻訳系を用いてペプチドを生成してもよい。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを導入した宿主細胞中にて目的のペプチドを生成することができる。本明細書中において使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体もまた意図される。形質転換体の作製方法としては、当該分野で周知の手順が採用されればよく、例えば、組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。形質転換の対象となる生物としても、特に限定されないが、各種微生物、植物および動物が挙げられる。また、遺伝子が導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などの当該分野において周知の手順に従って行うことができる。 The method for producing a peptide according to the present invention may be chemical synthesis or may use an expression vector. In the case of chemical synthesis, the peptide according to the present invention can be produced by a known peptide synthesis method. Examples of peptide synthesis methods include, but are not limited to, chemical synthesis methods such as liquid phase peptide synthesis methods and solid phase peptide synthesis methods. When using an expression vector, the peptide may be generated from a transformant introduced with the expression vector, or the peptide may be generated using an in vitro translation system. For example, a target peptide can be produced in a host cell into which an expression vector into which a polynucleotide encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has been inserted. As used herein, the term “transformant” is intended not only to a cell, tissue or organ, but also to an individual organism. As a method for producing a transformant, a procedure well known in the art may be employed, and examples thereof include a method for transformation by introducing a recombinant vector into a host. The organism to be transformed is not particularly limited, but includes various microorganisms, plants and animals. Whether or not a gene has been introduced can be confirmed according to procedures well known in the art such as PCR, Southern hybridization, Northern hybridization and the like.
なお、本発明に係るペプチドは、宿主細胞中において安定的に発現していることが好ましいが、一過性に発現していてもよい。このようにして生成されたペプチドを、公知の方法に従って精製することができる。ペプチドの精製方法としては、特に限定されないが、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等が挙げられる。このような工程を包含するペプチド作製方法もまた本発明の範囲内であり、このペプチド作製方法を実践するためのツール（例えば、発現ベクター、抗体または形質転換体）が備えられたペプチド作製キットもまた本発明の範囲内であることを、当業者は容易に理解する。 The peptide according to the present invention is preferably stably expressed in the host cell, but may be transiently expressed. The peptide thus generated can be purified according to a known method. Although it does not specifically limit as a purification method of a peptide, For example, a gel filtration chromatography, an ion exchange chromatography, an affinity chromatography etc. are mentioned. A peptide production method including such steps is also within the scope of the present invention, and a peptide production kit equipped with a tool (for example, an expression vector, an antibody or a transformant) for practicing this peptide production method is also available. Those skilled in the art will easily understand that the present invention is within the scope of the present invention.
本発明はまた、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ペプチドをコードすればよく、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に限定されない。なお、本明細書中において使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。 The present invention also provides a polynucleotide encoding a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The polynucleotide according to the present invention only has to encode the above peptide, and is not limited to the base sequence of the gene encoding the HA protein of influenza A virus. As used herein, the term “base sequence” is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence”, and deoxyribonucleotides (abbreviated as A, G, C, and T). Shown as an array of
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であってもよく、当業者であれば、本発明に係るペプチドのアミノ酸配列情報、およびこのペプチドをコードする塩基配列情報に基づけば容易に製造することができる。具体的には、一般的なＤＮＡ合成法、ＰＣＲ増幅等によって製造することが可能である。 The polynucleotide according to the present invention may be in the form of DNA or RNA, and those skilled in the art will know the amino acid sequence information of the peptide according to the present invention and the base sequence information encoding this peptide. If it is based, it can be manufactured easily. Specifically, it can be produced by a general DNA synthesis method, PCR amplification or the like.
本発明はさらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを提供する。上述したペプチドの作製方法に用いられる場合は、上記ベクターは、上記ポリヌクレオチドを作動可能に連結した発現ベクターであることが好ましい。本明細書中において使用される場合、用語「作動可能に連結」は、目的のペプチド（またはタンパク質）をコードするポリヌクレオチドが、プロモータなどの制御領域の制御下にあって、このペプチド（またはタンパク質）を宿主細胞中で発現し得る形態にあることが意図される。目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに「作動可能に連結」して所望のベクターを構築する手順は当該分野において周知である。また、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法もまた、当該分野において周知である。よって、当業者は、容易に所望のペプチドを宿主細胞内に生成させることができる。 The present invention further provides a vector comprising a polynucleotide encoding a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. When used in the above-described method for producing a peptide, the vector is preferably an expression vector in which the polynucleotide is operably linked. As used herein, the term “operably linked” means that a polynucleotide encoding a peptide (or protein) of interest is under the control of a control region such as a promoter and the peptide (or protein). ) In a form that can be expressed in a host cell. Procedures for “operably linking” a polynucleotide encoding a peptide of interest to an expression vector to construct the desired vector are well known in the art. A method for introducing an expression vector into a host cell is also well known in the art. Therefore, those skilled in the art can easily produce a desired peptide in a host cell.
上述したように、本発明に係るペプチドおよびポリヌクレオチドを用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識し得る抗体を惹起することができる。この抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスに対する中和活性を有している可能性が非常に高い。すなわち、本発明に係るペプチドおよびポリヌクレオチドは、Ａ型インフルエンザウイルスに対するワクチンとして機能し得る。 As described above, by using the peptides and polynucleotides according to the present invention, an antibody capable of cross-recognizing a plurality of subtypes of influenza A virus can be raised. This antibody is very likely to have neutralizing activity against influenza A virus. That is, the peptide and polynucleotide according to the present invention can function as a vaccine against influenza A virus.
〔２：抗体〕
上述したように、本発明に係るペプチドまたはポリヌクレオチドを用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識し得る抗体を得ることができる。すなわち、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識し得る抗体を提供する。本発明に係る抗体は少なくともＨ１型サブタイプおよびＨ３型サブタイプを認識する。
[2: Antibody]
As described above, when the peptide or polynucleotide according to the present invention is used, an antibody capable of cross-recognizing a plurality of subtypes of influenza A virus can be obtained. That is, the present invention provides an antibody capable of cross-recognizing a plurality of subtypes of influenza A virus. The antibody according to the present invention recognizes at least the H1 type subtype and the H3 type subtype.
本明細書中において使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）が意図され、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。 As used herein, “antibody” is intended to be an immunoglobulin (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM and their Fab fragments, F (ab ′) 2 fragments, Fc fragments), for example Include, but are not limited to, polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, single chain antibodies and anti-idiotype antibodies.
本発明に係る抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むペプチドによって惹起される。すなわち、本発明に係る抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むペプチドに特異的に結合し得る。本明細書中において使用される場合、「ペプチドと特異的に結合する抗体」は、本発明に係るペプチドに特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことが意図される。このような抗体は、組換えＤＮＡ技術の適用または化学合成によって産生され得る。 The antibody according to the present invention is raised by a peptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. That is, the antibody according to the present invention can specifically bind to a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. As used herein, “an antibody that specifically binds to a peptide” refers to a complete antibody molecule and antibody fragment (eg, Fab and F (ab ′)) that can specifically bind to a peptide of the invention. 2 fragments). Such antibodies can be produced by the application of recombinant DNA technology or chemical synthesis.
一実施形態において、本発明に係るペプチドを用いて生成したマウスモノクローナル抗体は、特定のアミノ酸配列を含む抗体であり得る。本実施形態に係る抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）が配列番号２に示されるアミノ酸配列またはその変異体を含む抗体であり得、軽鎖可変領域（ＶＬ）が配列番号４に示されるアミノ酸配列またはその変異体を含む抗体であり得る。 In one embodiment, a mouse monoclonal antibody produced using a peptide according to the present invention may be an antibody comprising a specific amino acid sequence. The antibody according to this embodiment may be an antibody in which the heavy chain variable region (VH) comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a variant thereof, and the light chain variable region (VL) is shown in SEQ ID NO: 4. It can be an antibody comprising a sequence or a variant thereof.
本明細書中においてポリペプチドまたはタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」は、具体的に明示されたポリペプチドとそのアミノ酸配列が異なっていても、その明示されたポリペプチドの有する活性を保持しているポリペプチド（またはタンパク質）が意図される。すなわち、本明細書中において使用される場合、重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）の変異体は、それぞれ配列番号２または４に示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。 As used herein with respect to a polypeptide or protein, the term “variant” retains the activity of the specified polypeptide even if the amino acid sequence differs from the specifically specified polypeptide. Polypeptide (or protein) is contemplated. That is, as used herein, one or several variants of the heavy chain variable region (VH) or light chain variable region (VL) are present in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, respectively. In which the amino acid sequence is deleted, substituted or added.
ペプチドを構成するアミノ酸のいくつかが、このペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに人為的に改変させるだけではなく、天然のペプチドにおいて、当該ペプチドの構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。当業者は、周知技術を使用してペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。また、当業者は、本明細書に記載の方法に従えば、作製したペプチドが所望の活性を有しているか否かを容易に確認し得る。 It is well known in the art that some of the amino acids that make up a peptide can be easily modified without significantly affecting the structure or function of the peptide. It is also well known that there are variants that not only artificially modify but also do not significantly alter the structure or function of the peptide in the natural peptide. One skilled in the art can readily mutate one or several amino acids in the amino acid sequence of the peptide using well-known techniques. Moreover, those skilled in the art can easily confirm whether the produced peptide has a desired activity according to the method described in the present specification.
本実施形態に係る抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）が、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、または（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含む抗体であり得、軽鎖可変領域（ＶＬ）が、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列、または（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を含む抗体であり得る。なお、配列番号２および４に示されるアミノ酸配列に対応する塩基配列はそれぞれ配列番号３および５に示される。よって、当業者は、これらの配列情報に従って、本実施形態に係る抗体を容易に作製することができる。 In the antibody according to this embodiment, the heavy chain variable region (VH) has (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or (2) one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. The antibody may comprise an amino acid sequence with substitutions, deletions, insertions and / or additions, wherein the light chain variable region (VL) is (3) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or (4) SEQ ID NO: 4 In the amino acid sequence shown in FIG. 1, the antibody may comprise an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added. The base sequences corresponding to the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 4 are shown in SEQ ID NOs: 3 and 5, respectively. Therefore, those skilled in the art can easily produce the antibody according to the present embodiment according to the sequence information.
本発明に係る抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスに対する中和活性を有している可能性が非常に高い。すなわち、本発明に係る抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスに対するワクチンとして機能し得る。また、本発明に係る抗体を用いれば、本発明に係るペプチドの精製を容易にすることができる。例えば、本発明に係る発現ベクターまたは形質転換体を用いて生成させたペプチドを、本発明に係る抗体を用いてアフィニティ精製すればよい。さらに、本発明に係る抗体を用いれば、Ａ型インフルエンザウイルスを簡便に検出することができる。 The antibody according to the present invention is very likely to have neutralizing activity against influenza A virus. That is, the antibody according to the present invention can function as a vaccine against influenza A virus. Moreover, if the antibody according to the present invention is used, the purification of the peptide according to the present invention can be facilitated. For example, a peptide produced using the expression vector or transformant according to the present invention may be affinity purified using the antibody according to the present invention. Furthermore, if the antibody according to the present invention is used, influenza A virus can be easily detected.
このように、本発明に係る抗体は、本発明に係るペプチドと特異的に結合する抗体であればよく、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等によって限定されるべきではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。また、本発明に係る抗体を用いるワクチン、ペプチド生成方法（ペプチド生成キット）およびＡ型インフルエンザウイルスの検出方法（検出キット）もまた、本発明の範囲内であることを当業者は容易に理解する。 As described above, the antibody according to the present invention may be an antibody that specifically binds to the peptide according to the present invention, and each immunoglobulin type (IgA, IgD, IgE) specifically described in the present specification. , IgG or IgM), chimeric antibody production methods, peptide antigen production methods and the like. Therefore, it should be noted that antibodies obtained by methods other than the above methods also belong to the scope of the present invention. Those skilled in the art will easily understand that vaccines using the antibodies of the present invention, peptide production methods (peptide production kits), and influenza A virus detection methods (detection kits) are also within the scope of the present invention. .
〔３：ワクチン〕
上述したように、本発明に係るペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスに対するワクチンの有効成分となり得る。すなわち、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスに対するワクチンを提供する。
[3: Vaccine]
As described above, the peptides, polynucleotides and antibodies according to the present invention can be active ingredients of vaccines against influenza A virus. That is, the present invention provides a vaccine against influenza A virus.
本発明に係るワクチンは、ワクチン組成物として提供されても、ワクチンキットとして提供されてもよい。本明細書中では、「有効成分を含有しているワクチン組成物」と「有効成分を備えているワクチンキット」を総称して、「有効成分を有しているワクチン」という。なお、ワクチン組成物およびワクチンキットについては、以下に詳述する。 The vaccine according to the present invention may be provided as a vaccine composition or a vaccine kit. In the present specification, “a vaccine composition containing an active ingredient” and “a vaccine kit comprising an active ingredient” are collectively referred to as “a vaccine having an active ingredient”. The vaccine composition and vaccine kit will be described in detail below.
本明細書中において使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図される。また、本明細書中において使用される場合、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であることが意図される。 As used herein, a “composition” is intended to be in a form in which various components are contained in one substance. Further, as used herein, a “kit” is intended to be in a form in which at least one of various components is contained in another substance.
一般に、組成物は「二種以上の成分が全体として均質に存在し、一物質として把握されるもの」が意図され、例えば、物質Ａを主成分として含有する単一物、主成分としての物質Ａと物質Ｂとを含有する単一物であり得る。このような組成物は、物質Ａおよび物質Ｂ以外に他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）を含有してもよい。本発明に係るワクチン組成物は、後述する有効成分を物質Ａとして含有していることを特徴としており、単独で使用されても、他の物質または組成物と併用されてもよい。この場合、併用されるべき他の物質または組成物が本発明に係るワクチン組成物中に提供されてもされなくてもよい。後者の場合は、これらを全体として一組成物として認識し得ないが、この場合は、後述する「キット」の範疇に入り得、組成物としてではなくキットとして提供され得ることを当業者は容易に理解する。 In general, a composition is intended to be "a substance in which two or more components are present homogeneously as a whole and grasped as one substance", for example, a single substance containing substance A as a main component, a substance as a main component It may be a single substance containing A and substance B. Such a composition may contain other components (for example, a pharmaceutically acceptable carrier) in addition to the substances A and B. The vaccine composition according to the present invention is characterized by containing an active ingredient described later as substance A, and may be used alone or in combination with other substances or compositions. In this case, other substances or compositions to be used together may or may not be provided in the vaccine composition according to the present invention. In the latter case, these cannot be recognized as a composition as a whole, but in this case, those skilled in the art can easily fall into the category of “kits” described later and be provided as a kit rather than as a composition. To understand.
１つの局面において、本発明は、ワクチン組成物を提供する。一実施形態において、本発明に係るワクチン組成物は、本発明に係るペプチドを含有していることを特徴としている。他の実施形態において、本発明に係るワクチン組成物は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有していることを特徴としている。本実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドはコードするペプチドを発現し得る形態であることが好ましく、本発明に係るポリヌクレオチドが作動可能に連結されている発現ベクターの形態であることがより好ましい。さらなる実施形態において、本発明に係るワクチン組成物は、本発明に係る抗体を含有していることを特徴としている。このように、本発明に係るペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体が、ワクチンの有効成分としてＡ型インフルエンザウイルスに対する治療ワクチンまたは予防ワクチンの調製において使用される。 In one aspect, the present invention provides a vaccine composition. In one embodiment, the vaccine composition according to the present invention is characterized by containing the peptide according to the present invention. In another embodiment, the vaccine composition according to the present invention is characterized by containing the polynucleotide according to the present invention. In the present embodiment, the polynucleotide according to the present invention is preferably in a form capable of expressing the encoded peptide, and more preferably in the form of an expression vector to which the polynucleotide according to the present invention is operably linked. . In a further embodiment, the vaccine composition according to the invention is characterized in that it contains an antibody according to the invention. Thus, the peptide, polynucleotide or antibody according to the present invention is used in the preparation of a therapeutic or prophylactic vaccine against influenza A virus as an active ingredient of a vaccine.
本明細書中において使用される場合、「予防ワクチン」は、疾患発生を予防するために未処置の個体に投与されるワクチンであり、「治療ワクチン」は、既に罹患している個体に、その感染を低減もしくは最小にするか、またはこの疾患の免疫病理的結果を排除するために投与されるワクチンである。 As used herein, a “prophylactic vaccine” is a vaccine that is administered to an untreated individual to prevent disease occurrence, and a “therapeutic vaccine” A vaccine that is administered to reduce or minimize infection or eliminate the immunopathological consequences of the disease.
有効成分としての物質を含むワクチンの調製は、当業者に公知である。代表的には、本発明に係るワクチン組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかの注射可能物として調製されるが、注射前に液体に溶解もしくは懸濁するために適切な固体形態としてもまた調製され得る。この調製物は、乳化され得るか、またはリポソーム中に乳化されたタンパク質であり得る。 The preparation of vaccines containing substances as active ingredients is known to those skilled in the art. Typically, a vaccine composition according to the present invention is prepared as an injectable, either a liquid solution or suspension, but in a solid form suitable for dissolving or suspending in a liquid prior to injection. Can also be prepared. The preparation can be emulsified or can be a protein emulsified in liposomes.
本発明に係るワクチン組成物の有効成分は、薬学的に受容可能かつ有効成分と適合性の賦形剤と混合され得る。好ましい賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの混合物が挙げられる。さらに、所望される場合、本発明に係るワクチン組成物は、微量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤およびｐＨ緩衝剤）を含み得る。 The active ingredients of the vaccine composition according to the invention can be mixed with excipients that are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredients. Preferred excipients include, for example, water, saline, dextrose, glycerol, ethanol and the like and mixtures thereof. Furthermore, if desired, the vaccine composition according to the invention may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents and pH buffering agents.
本発明に係るワクチン組成物の処方形態は、種々の経路（鼻腔内投与、粘膜投与、経口投与、腟内投与、尿道投与または眼内投与）による注射（皮下および筋肉内注射を含む。）や、坐剤のような非経口投与形態であり得る。 The dosage form of the vaccine composition according to the present invention includes injections (including subcutaneous and intramuscular injections) by various routes (intranasal administration, mucosal administration, oral administration, intravaginal administration, urethral administration or intraocular administration). Or a parenteral dosage form such as a suppository.
また、本発明に係るワクチン組成物の処方形態は、経口投与形態であってもよい。経口投与に用いられる場合、本発明に係るワクチン組成物は、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような賦形剤が併用される。経口投与形態の組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物、または散剤の形態であり得る。ワクチン組成物が凍結乾燥形態にて提供される場合、この凍結乾燥物質は、投与前に、例えば、懸濁液として再構成され得、再構成は、好ましくは緩衝液中で行われる。 Further, the formulation form of the vaccine composition according to the present invention may be an oral administration form. When used for oral administration, the vaccine composition according to the present invention is used in combination with excipients such as pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate and the like. Compositions for oral dosage forms can be in the form of solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release formulations, or powders. Where the vaccine composition is provided in lyophilized form, the lyophilized material can be reconstituted, eg, as a suspension, prior to administration, the reconstitution preferably taking place in a buffer.
本発明に係るワクチン組成物はまた、ワクチンの有効性を増強するためのアジュバントを含み得る。有効であり得るアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型乳化物、水中油型乳化物、ムラミルジペプチド、細菌内毒素、リピドＸ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ（Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニン、リポソーム、レバミゾール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックコポリマーまたは他の合成アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。このようなアジュバントは、種々の供給元から市販されている。代表的には、水中油型アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、またはこれらとの混合物のようなアジュバントが使用される。なお、ヒトへの適用のためには、水酸化アルミニウムが認可されている。 The vaccine composition according to the present invention may also include an adjuvant to enhance the effectiveness of the vaccine. Examples of adjuvants that may be effective include: aluminum hydroxide, aluminum phosphate, potassium aluminum sulfate (alum), beryllium sulfate, silica, kaolin, carbon, water-in-oil emulsion, oil-in-water emulsion, muramyl dipeptide , Bacterial endotoxin, lipid X, Bordetella pertussis, Corynebacterium parvum (Propionobacterium acnes), polyribonucleotide, sodium alginate, lanolin, lysolecithin, vitamin A, saponin, liposome, levamisole, DEAE-dextran, block copolymer For example, but not limited to. Such adjuvants are commercially available from various suppliers. Typically, adjuvants such as oil-in-water adjuvants, aluminum hydroxide adjuvants, or mixtures thereof are used. Aluminum hydroxide is approved for human use.
他の局面において、本発明は、ワクチンキットを提供する。本発明に係るワクチンキットは、上述したワクチン組成物に対応するものであり、本発明に係るペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体をワクチンの有効成分として備えていればよく、上述したワクチン組成物の成分をさらに備えていてもよい。 In another aspect, the present invention provides a vaccine kit. The vaccine kit according to the present invention corresponds to the above-described vaccine composition, and may comprise the peptide, polynucleotide or antibody according to the present invention as an active ingredient of the vaccine. Furthermore, you may provide.
一実施形態において、本発明に係るワクチンキットは、本発明に係るペプチドを備えていることを特徴としている。他の実施形態において、本発明に係るワクチンキットは、本発明に係るポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。本実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドはコードするペプチドを発現し得る形態であることが好ましく、本発明に係るポリヌクレオチドが作動可能に連結されている発現ベクターの形態であることがより好ましい。別の実施形態において、本発明に係るワクチンキットは、本発明に係る抗体を備えていることを特徴としている。 In one embodiment, the vaccine kit according to the present invention is characterized by comprising the peptide according to the present invention. In another embodiment, the vaccine kit according to the present invention comprises the polynucleotide according to the present invention. In the present embodiment, the polynucleotide according to the present invention is preferably in a form capable of expressing the encoded peptide, and more preferably in the form of an expression vector to which the polynucleotide according to the present invention is operably linked. . In another embodiment, the vaccine kit according to the present invention is characterized by comprising the antibody according to the present invention.
本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは各材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えていても別々の容器に備えていてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、インフルエンザ予防／治療に適用するために必要な器具をあわせて備えていてもよい。 As used herein, the term “kit” intends a package with a container (eg, bottle, plate, tube, dish, etc.) containing a particular material. Preferably, instructions for using each material are provided. As used herein, in the aspect of a kit, “comprising” is intended to mean being contained in any of the individual containers that make up the kit. In addition, the kit according to the present invention may be a package in which a plurality of different compositions are packed together, where the form of the composition may be as described above, and in the case of a solution form, in a container It may be included. The kit according to the present invention may comprise substance A and substance B mixed in the same container or in separate containers. The “instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc. . The kit according to the present invention may also include a container containing a diluent, a solvent, a washing solution or other reagent. Furthermore, the kit according to the present invention may be provided with an instrument necessary for application to influenza prevention / treatment.
このように、本発明に係るワクチンを用いれば、毎年生じる抗原変異に干渉されないインフルエンザ予防／治療を提供し得る。 Thus, the use of the vaccine according to the present invention can provide influenza prevention / treatment that is not interfered with by antigenic mutations that occur every year.
以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、請求項および上記実施形態に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. However, the present invention is not limited to these examples, and various modifications are possible within the scope shown in the claims and the above embodiments. Embodiments obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments are also included in the technical scope of the present invention.
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。 Moreover, all the academic literatures and patent literatures described in this specification are incorporated herein by reference.
〔１：ペプチドの作製〕
各サブタイプ間のｈｏｍｏｌｏｇｙ解析に、ＮＢＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅに登録されている配列を用いた。Ｈ１型として１９９４〜２００５年にヒトから分離された６４株、Ｈ２型として１９００〜２００５年にヒトから分離された１３株、Ｈ３型として１９９０〜２００５年に日本でヒトから分離された７株および２００３〜２００５年に日本以外（主に米国）でヒトから分離された１４４株、ならびにＨ５型として１９００〜２００５年にヒトから分離された１１８株の配列をこのデータベースから抽出して用いた。複数のサブタイプを交差認識する抗体を惹起し得ると考えられるペプチド配列を、複数設計した。
[1: Preparation of peptide]
For homology analysis between each subtype, a sequence registered in the Influenza Virus Resource of NBCI (National Center for Biotechnology Information) was used. 64 strains isolated from humans in 1994-2005 as H1, 13 strains isolated from humans in 1900-2005 as H2, 7 strains isolated from humans in Japan in 1990-2005 as H3 The sequences of 144 strains isolated from humans outside Japan (mainly the United States) in 2003-2005 and 118 strains isolated from humans in 1900-2005 as H5 were extracted from this database and used. A plurality of peptide sequences that were thought to be able to raise antibodies that cross-recognize multiple subtypes were designed.
設計したアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端にＣｙｓを導入したものからなるペプチドを、オペロンバイオテクノジーの推奨する手順に従って、Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体を用いる固相合成法によって合成した。合成装置には、島津製作所製自動ペプチド合成機ＰＳＳＭ−８を用いた。固相樹脂上でＦｍｏｃ伸長反応を実施した後、アミノ酸側鎖保護基および固相からの脱離をＴＦＡベースの脱保護剤によって実施した。引き続き、島津製作所ＬＣ−１０Ａｉシステムを用いてペプチドをＨＰＬＣ精製した。精製条件は下記の通りである：
ＨＰＬＣ精製条件
・システム：島津製作所製 ＬＣ−１０Ａｉ
・流速 ９．０ ｍｌ／ｍｉｎ
・カラム ワイエムシィ社製 ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ ２０×１５０ｍｍ
・検出波長 ２１０ｎｍ
・グラジエント 移動相Ａ：０．１Ｎ ＨＣｌ
移動相Ｂ：アセトニトリル
・分取時のグラジエント条件：２０分間にＢ２０〜４０％。
Peptides composed of Cys introduced at the N-terminal or C-terminal of the designed amino acid sequence were synthesized by solid phase synthesis using Fmoc amino acid derivatives according to the procedure recommended by operon biotechnology. As the synthesizer, an automatic peptide synthesizer PSSM-8 manufactured by Shimadzu Corporation was used. After the Fmoc extension reaction was performed on the solid phase resin, the amino acid side chain protecting group and elimination from the solid phase were performed with a TFA-based deprotecting agent. Subsequently, the peptide was HPLC purified using Shimadzu LC-10Ai system. The purification conditions are as follows:
HPLC purification conditions and system: LC-10Ai manufactured by Shimadzu Corporation
・ Flow rate: 9.0 ml / min
・ Column YMC YMC-Pack ODS-AM 20 × 150mm
・ Detection wavelength 210nm
Gradient mobile phase A: 0.1N HCl
Mobile phase B: acetonitrile. Gradient conditions during fractionation: B20-40% in 20 minutes.
精製したペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製質量分析装置Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥを用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによる質量分析を実施して、理論分子量の近似値を示すピークが含まれることを確認した後に、凍結乾燥した。 The purified peptide was subjected to mass analysis by MALDI-TOF MS using a mass spectrometer Voyager DE manufactured by Applied Biosystems, and after confirming that a peak showing an approximate value of the theoretical molecular weight was contained, it was lyophilized.
〔２：ペプチドとキャリアタンパク質との複合体化〕
続いて、キャリアタンパク質としてＢＳＡを用い、架橋剤にＥＭＣＳを用いるＭＢＳ法によって、ペプチドとキャリアタンパク質との複合体化を行った。
[2: Complexation of peptide and carrier protein]
Subsequently, the peptide and the carrier protein were complexed by MBS method using BSA as the carrier protein and EMCS as the cross-linking agent.
バイアル瓶の中で２０ｍｇのＢＳＡを２ｍｌのｄＨ２Ｏに溶解した。２．０ｍｇのＥＭＣＳを０．５ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。ＢＳＡ溶液を攪拌しながら、ＤＭＦに溶解したＥＭＣＳを滴下した（０．４ｍｌ）。室温で４５〜６０分間、穏やかに攪拌して、ＥＭＣＳとＢＳＡとを結合させた。結合体を、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２−７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５）にアプライし、Ａ２８０のピークを回収した。回収したＢＳＡ−ＭＢＳの濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整した。また、ペプチドを水またはリン酸緩衝液に溶解して、１０ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液を調製した。調製したＢＳＡ−ＭＢＳおよびペプチド溶液を、重量が等量になるように混合し、攪拌しながら室温で２時間または４℃で一晩反応させた。反応の完了後に、リン酸緩衝液を反応液に添加して濃度を１．０ｍｇ／ｍｌに調整した。 In a vial, 20 mg BSA was dissolved in 2 ml dH 2 O. 2.0 mg EMCS was dissolved in 0.5 ml dimethylformamide. While stirring the BSA solution, EMCS dissolved in DMF was added dropwise (0.4 ml). The EMCS and BSA were combined with gentle agitation at room temperature for 45-60 minutes. The conjugate was applied to the gel filtration column equilibrated with 0.05M phosphate buffer (pH7.2-7.4) (Sephadex G-25 ), it was collected peak of A 280. The concentration of recovered BSA-MBS was adjusted to 5 mg / ml. The peptide was dissolved in water or phosphate buffer to prepare a 10 mg / ml peptide solution. The prepared BSA-MBS and peptide solution were mixed so that the weight was equal, and allowed to react for 2 hours at room temperature or overnight at 4 ° C. with stirring. After completion of the reaction, phosphate buffer was added to the reaction solution to adjust the concentration to 1.0 mg / ml.
次いで、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に未反応のペプチド溶液５μｌを添加し、２ｍｇ／ｍｌ ＤＴＮＢ［５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）］を１００μｌ添加して、室温で約１５分間反応させた後にペプチド中のＳＨ基とＢＳＡ−ＭＢＳとの結合率を定量した。結合率の定量を、ＤＴＮＢによる発色の吸光度変化を用いて行った。具体的には、Ａ４１２を測定し（Ａｐ４１２）、反応後のＫＬＨ−ペプチド溶液５０μｌ（反応前で使用したペプチドと同じ量）を用いて同様にＡ４１２を測定し（Ａｋ４１２）、式（結合効率（％）＝（Ａｐ４１２−Ａｋ４１２）／Ａｐ４１２×１００）に従って結合効率を測定した。 Next, 5 μl of unreacted peptide solution was added to 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0), 100 μl of 2 mg / ml DTNB [5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)] was added, After reacting at room temperature for about 15 minutes, the binding rate between SH groups in the peptide and BSA-MBS was quantified. The binding rate was quantified using the change in absorbance of the color developed by DTNB. Specifically, A 412 was measured (Ap 412 ), A 412 was similarly measured using 50 μl of the KLH-peptide solution after the reaction (the same amount as the peptide used before the reaction) (Ak 412 ), and the formula The binding efficiency was measured according to (binding efficiency (%) = (Ap 412 -Ak 412 ) / Ap 412 × 100).
〔３：免疫〕
上記２に従ってキャリアタンパク質と複合体化させたペプチドを免疫原として用いてＢａｌｂ／Ｃマウス（雌）の免疫を行った。２週間間隔での４回の腹部皮下への免疫を繰り返し、尾静脈からの最終免疫の３日後に、ポリエチレングリコールによる細胞融合法を定法に従って行い、Ａ型インフルエンザウイルスに対するモノクローナル抗体を作製した。抗体の選択、得られた抗体の免疫学的性質の検討を、主にＥＬＩＳＡ法によって行った。
[3: Immunity]
Balb / C mice (female) were immunized using a peptide complexed with a carrier protein according to 2 above as an immunogen. Immunization into the abdomen subcutaneously was repeated 4 times at intervals of 2 weeks, and 3 days after the final immunization from the tail vein, a cell fusion method using polyethylene glycol was performed according to a standard method to produce a monoclonal antibody against influenza A virus. The selection of antibodies and the examination of the immunological properties of the obtained antibodies were mainly performed by ELISA.
具体的には、Ｂａｌｂ／Ｃマウス（雌６週齢）に対し、初回免疫としてＦＣＡ（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）と抗原（ＢＳＡとの複合体）とを混合して得られたエマルジョンを、マウスの腹部皮下の２箇所に５０μｌずつ投与した（１００μｇ抗原／マウス）。初回免疫から１０日後にマウスの眼窩静脈叢より部分採血し、抗血清における力価測定をＥＬＩＳＡ法にて定法に従って行った。 Specifically, an emulsion obtained by mixing FCA (Freund's complete adjuvant) and antigen (complex of BSA) as an initial immunization against Balb / C mice (6 weeks old female) 50 μl each was administered to two sites subcutaneously in the abdomen (100 μg antigen / mouse). Ten days after the first immunization, partial blood collection was performed from the orbital venous plexus of the mouse, and titer measurement in the antiserum was performed according to a conventional method by ELISA.
初回免疫から２週間後に追加免疫を行った。３回目からは不完全フロイントアジュバンド（ＦＩＡ）と抗原（ＢＳＡとの複合体）とを混合して得られたエマルジョンを使用した。方法は初回免疫と同様に行い、マウス１匹あたり１００μｌずつ投与した。１０日後に採血し、同様に力価測定を行った。免疫を合計４回行った。 Booster immunization was performed 2 weeks after the first immunization. From the third time, an emulsion obtained by mixing incomplete Freund's adjuvant (FIA) and antigen (complex with BSA) was used. The method was the same as in the first immunization, and 100 μl was administered per mouse. Ten days later, blood was collected and the titer was measured in the same manner. A total of 4 immunizations were performed.
免疫したマウスにおいて、追加免疫に応じて力価の上昇が確認された。特に、ＩｎｆＡペプチドを用いた追加免疫後に力価が十分に上がったマウスにのみ最終免疫を行った。最終免疫としてアジュバントの代わりに滅菌ＰＢＳと抗原との混合液をマウスに尾静脈投与した。最終免疫の３日後にＰＥＧ法による細胞融合を行い、ハイブリドーマを作製した。なお、ＩｎｆＡペプチドは、ＨＡ２サブユニットのアミノ酸１６〜２３位のＮ末端にＣｙｓを導入したものからなるペプチドである。このように短いペプチドであるにもかかわらずＩｎｆＡペプチドは非常に高い免疫原性を有していることがわかった。 In immunized mice, an increase in titer was confirmed in response to the boost. In particular, the final immunization was carried out only to mice whose titers were sufficiently increased after boosting with InfA peptide. As a final immunization, mice were administered with a mixed solution of sterile PBS and antigen instead of an adjuvant. Three days after the final immunization, cell fusion by the PEG method was performed to prepare a hybridoma. The InfA peptide is a peptide comprising Cys introduced at the N-terminus of amino acids 16 to 23 of the HA2 subunit. In spite of such a short peptide, the InfA peptide was found to have a very high immunogenicity.
〔４：スクリーニング〕
細胞融合から約３日後にＨＡＴ培地（約１００μｌ）を添加した。その７日後にコロニーを確認し得たウエルについて１次スクリーニングを行った。次いで、限界希釈法に従って２次スクリーニングを行った。スクリーニングおよびクローニングを繰り返した後に、ＩｎｆＡペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を８クローン確立した。得られたモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列（アミノ酸配列およびコードする塩基配列）を、それぞれ配列番号２および３（ＶＨ）、配列番号４および５（ＶＬ）に示す。また、得られた抗体のアイソタイプは６クローンがＩｇＧ１（κ）であり２クローンがＩｇＧ２ｂ（κ）あった（表１参照）。
[4: Screening]
About 3 days after cell fusion, HAT medium (about 100 μl) was added. Seven days later, primary screening was performed on wells in which colonies could be confirmed. Subsequently, secondary screening was performed according to the limiting dilution method. After repeated screening and cloning, 8 mouse monoclonal antibodies against InfA peptide were established. The heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) sequences (amino acid sequence and encoding base sequence) of the obtained monoclonal antibody were respectively represented by SEQ ID NOs: 2 and 3 (VH), SEQ ID NOs: 4 and 5 ( VL). As for the isotype of the obtained antibody, 6 clones were IgG 1 (κ) and 2 clones were IgG 2b (κ) (see Table 1).
〔５：交差反応性〕
得られた抗体の免疫学的反応性を、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティングに調べた。ＩｎｆＡペプチド（配列番号６）以外に、ＨＡ領域のペプチドであるＨＡｃペプチド（配列番号７）およびＩＡＨペプチド（配列番号８）、ならびにｇｐ４１−１の高度保存領域からなるＴＰ４１−１ペプチド（配列番号９）を使用した（表２参照）。ＨＡ以外のタンパク質として、ＢＳＡ、ＴＨＹ、ＨＳＡ、ＫＬＨおよびヘモグロビンを使用した。
[5: Cross reactivity]
The immunological reactivity of the obtained antibody was examined by ELISA and Western blotting. In addition to the InfA peptide (SEQ ID NO: 6), HAc peptide (SEQ ID NO: 7) and IAH peptide (SEQ ID NO: 8), which are peptides in the HA region, and TP41-1 peptide (SEQ ID NO: 9) consisting of a highly conserved region of gp41-1 ) Was used (see Table 2). BSA, THY, HSA, KLH and hemoglobin were used as proteins other than HA.
交差反応性試験の結果を図１に示す。取得したモノクローナル抗体８クローンはいずれもＩｎｆＡペプチドに特異的に反応することがわかった。 The results of the cross-reactivity test are shown in FIG. It was found that all 8 monoclonal antibody clones obtained specifically reacted with the InfA peptide.
〔６：免疫学的反応性〕
さらに、Ｈ１型ウイルス（Ｈ１Ｎ１）およびＨ３型ウイルス（Ｈ３Ｎ２）の破砕液を用いたウエスタンブロッティングを行い、得られた抗体のＨＡに対する反応性を調べた。Ｈ１型ウイルスに対する結果を図２に示し、Ｈ３型ウイルスに対する結果を図３に示す。また、それぞれの図において、還元したウイルスをサンプルに用いた結果を上段に示し、還元していない（非還元の）ウイルスをサンプルに用いた結果を下段に示した。ポジティブコントロールとして、ＨＡ２と反応することが知られているＪＮ１−１抗体およびＪＮ１−２抗体を用いた。
[6: Immunological reactivity]
Furthermore, Western blotting using a disrupted solution of H1 type virus (H1N1) and H3 type virus (H3N2) was performed, and the reactivity of the obtained antibody to HA was examined. The results for the H1 type virus are shown in FIG. 2, and the results for the H3 type virus are shown in FIG. Moreover, in each figure, the result of using the reduced virus for the sample is shown in the upper part, and the result of using the unreduced (non-reduced) virus for the sample is shown in the lower part. As positive controls, JN1-1 antibody and JN1-2 antibody known to react with HA2 were used.
その結果、ＩｇＧ２ｂ（κ）アイソタイプの２クローン（ＩｎｆＡ−１５およびＩｎｆＡ−１７）はインフルエンザウイルスのＨ１型およびＨ３型と免疫学的に反応することがわかった。 As a result, it was found that two clones (InfA-15 and InfA-17) of IgG 2b (κ) isotype react immunologically with influenza virus H1 type and H3 type.
Ａ型インフルエンザウイルスの複数のサブタイプを交差認識し得る抗体を得ることができるので、毎年生じる抗原変異に干渉されないインフルエンザ予防／治療が可能になる。このため、本発に係るペプチドおよび抗体は、医療業、製薬産業、試薬産業等に利用することができ、非常に有用である。 Since an antibody capable of cross-recognizing a plurality of subtypes of influenza A virus can be obtained, influenza prevention / treatment that does not interfere with antigenic mutations that occur annually becomes possible. Therefore, the peptides and antibodies according to the present invention can be used in the medical industry, the pharmaceutical industry, the reagent industry, etc., and are very useful.
Claims (12)
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列、または
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列
を含み、
軽鎖可変領域（ＶＬ）が、
（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列、または
（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列
を含む、Ａ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質のＨ１型サブタイプおよびＨ３型サブタイプを交差認識する、抗体。 The heavy chain variable region (VH) is
(1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; or (2) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, wherein one or several amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added. ,
The light chain variable region (VL) is
(3) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or (4) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added An antibody that cross-recognizes the H1 and H3 subtypes of the hemagglutinin protein of influenza A virus.
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