JP5180978B2 - Screening method for anti-obesity substances - Google Patents

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Description

本発明は、抗肥満物質のスクリーニング方法、詳しくは小腸における脂質代謝関連酵素遺伝子の発現変動を指標とする抗肥満物質のスクリーニング方法に関する。   The present invention relates to a screening method for anti-obesity substances, and more particularly to a screening method for anti-obesity substances using changes in expression of a lipid metabolism-related enzyme gene in the small intestine as an index.

近年、過剰な脂質エネルギーの摂取に代表される食生活の欧米化や、運動不足などの社会環境の変化により、肥満人口が増加し、社会問題となっている。肥満は、食物由来のエネルギーが、脂肪細胞に中性脂肪（トリアシルグリセロール）として過剰に蓄積された結果である。   In recent years, the obese population has increased due to the westernization of diets represented by excessive intake of lipid energy and changes in the social environment such as lack of exercise, which has become a social problem. Obesity is the result of excessive accumulation of food-derived energy as neutral fat (triacylglycerol) in fat cells.

肥満は、しばしば、糖尿病、高血圧、高脂血症等の生活習慣病を合併し、動脈硬化症の発症の原因となる。そのため、肥満の予防・改善は、生活習慣病のリスクを低減する上で極めて重要であると考えられ、これまでに、肥満及び肥満に関連する脂質代謝異常の予防・改善のために種々の方法が提案されている。例えば、運動、カロリー制限、生活習慣の改善などの方法は、一般には、肥満予防・改善に有効とされているが、これらの方法のみでは大抵の場合十分な効果が得られないことが多い。最近ではダイエット食品としてＬ−カルニチン、カプサイシン、共役リノール酸、ヒドロキシクエン酸、ギムネマ、ガルシニア等様々な化合物を配合したものが開発されている。これらの作用機構は十分明らかとはなっていないが、脂質代謝の活性化、糖吸収の抑制、脂肪合成の抑制等が考えられている。また一方で、多くの肥満改善剤や脂質代謝促進剤の開発がなされ、薬理学的な介入も試みられ、これまでに、栄養成分の吸収、空腹感及び満腹感を制御するホルモンの産生、エネルギーの消費を対象とする薬剤が開発されてきた。その中でもエネルギーの消費を対象とする薬剤の評価は、一般にその薬剤が肝臓、筋肉の脂質燃焼を促進するか否か、あるいは、肝臓や脂肪組織等への脂肪蓄積を抑制するか否かを検討することにより行われる。これまで、脂質燃焼の促進を評価する際の分子指標としては、ペルオキシソームβ酸化酵素であるAcyl-Coenzyem A oxidase (ACO) （非特許文献１、非特許文献２参照）、ミトコンドリアβ酸化酵素であるmedium-chain acyl-Coenzyme A dehydrogenase （MCAD)（非特許文献２参照）、脂質等のエネルギーを熱に変換し体外に放出する働きを有するuncoupling protein-2 (UCP-2) （非特許文献３参照）、β酸化と関連する脂肪酸輸送タンパクfatty acid binding protein 1 (FABP1)（非特許文献４参照）等の分子が広く用いられている。   Obesity often accompanies lifestyle-related diseases such as diabetes, hypertension, and hyperlipidemia, and causes the onset of arteriosclerosis. Therefore, obesity prevention / improvement is considered to be extremely important in reducing the risk of lifestyle-related diseases. So far, various methods have been proposed for the prevention / improvement of obesity and lipid metabolism abnormalities related to obesity. Has been proposed. For example, methods such as exercise, calorie restriction, and lifestyle improvement are generally effective for preventing and improving obesity, but these methods alone often do not provide sufficient effects. Recently, diet foods containing various compounds such as L-carnitine, capsaicin, conjugated linoleic acid, hydroxycitric acid, gymnema, and garcinia have been developed. Although the mechanism of these actions is not sufficiently clear, activation of lipid metabolism, suppression of sugar absorption, suppression of fat synthesis, and the like are considered. On the other hand, many obesity-improving agents and lipid metabolism promoters have been developed, and pharmacological interventions have been attempted. So far, the production of hormones that control the absorption of nutrients, hunger and satiety, energy Drugs targeting the consumption of food have been developed. Among them, the evaluation of drugs targeting energy consumption generally examines whether the drug promotes lipid burning of the liver and muscles, or suppresses fat accumulation in the liver and adipose tissue. Is done. Until now, as a molecular index for evaluating the promotion of lipid burning, acyl-Coenzyem A oxidase (ACO) (see Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2), which is a peroxisome β-oxidase, is a mitochondrial β-oxidase. medium-chain acyl-Coenzyme A dehydrogenase (MCAD) (see Non-patent document 2), uncoupling protein-2 (UCP-2) that converts lipid energy into heat and releases it outside the body (see Non-patent document 3) ), Fatty acid transport protein fatty acid binding protein 1 (FABP1) (see Non-patent Document 4) related to β-oxidation is widely used.

しかしながら、これらの一般に用いられるACO、MCAD、UCP-2、FABP1等の分子指標の遺伝子発現は、肥満改善や脂質代謝促進効果を有する既存の食材、薬剤によっても、鋭敏には変化しないことから、感度的にも限界があった。また、肝臓、筋肉、脂肪組織における脂質代謝を指標としたin vivo評価は、大抵の場合、１ヶ月以上の長い評価期間を必要とする。従って、肥満改善や脂質代謝促進をより高感度で短期間に評価できる指標が望まれるところである。   However, the gene expression of these commonly used molecular indicators such as ACO, MCAD, UCP-2, and FABP1 does not change sharply, even with existing foods and drugs that have an effect of improving obesity and promoting lipid metabolism, There was a limit in sensitivity. Further, in vivo evaluation using lipid metabolism in liver, muscle, and adipose tissue as an index usually requires a long evaluation period of one month or more. Therefore, an index that can evaluate obesity improvement and lipid metabolism promotion with higher sensitivity in a short time is desired.

Roglans Nら, J. Pharmacol. Exp Ther., 2002, 302, 232-239.Roglans N et al., J. Pharmacol. Exp Ther., 2002, 302, 232-239. Egawa T ら, Lipids, 2003, 38, 519-523.Egawa T et al., Lipids, 2003, 38, 519-523. Tsuboyama-Kasaoka Nら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, 257, 879-885.Tsuboyama-Kasaoka N et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, 257, 879-885. Brandes Rら, Biochim. Biophys. Acta., 1990, 1034, 53-61.Brandes R et al., Biochim. Biophys. Acta., 1990, 1034, 53-61.

本発明の課題は、肥満改善及び／又は脂質代謝促進効果のある物質（食材や薬剤）に対して発現量が有意に変動し、肥満改善及び／又は脂質代謝促進の新たな指標となりうる遺伝子を見出し、これらの遺伝子を利用して抗肥満物質を高感度にかつ短期間にスクリーニングする手段を提供することにある。   An object of the present invention is to provide a gene whose expression level significantly varies with respect to a substance (foodstuff or drug) having an effect of improving obesity and / or lipid metabolism, and can be a new index for improving obesity and / or promoting lipid metabolism. It is an object of the present invention to provide a means for screening anti-obesity substances with high sensitivity and in a short time using these genes.

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、小腸における特定の脂質代謝関連酵素遺伝子が、肥満改善及び／又は脂質代謝促進効果のある物質の存在により有意に増加することを見出した。さらに、これらの脂質代謝関連酵素遺伝子、又はその遺伝子産物であるタンパク質は、これまで用いられてきた肥満改善及び／又は脂質代謝促進の指標よりも発現変動が鋭敏であり、抗肥満物質をスクリーニングするのに有効であることが確認された。本発明はかかる知見をもとに完成されたものである。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a specific lipid metabolism-related enzyme gene in the small intestine is significantly increased due to the presence of a substance having an effect of improving obesity and / or promoting lipid metabolism. I found. Furthermore, these lipid metabolism-related enzyme genes, or proteins that are gene products thereof, are more sensitive to changes in expression than previously used indicators for improving obesity and / or promoting lipid metabolism, and screen for anti-obesity substances. It was confirmed that it was effective. The present invention has been completed based on such knowledge.

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
[1] 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞と接触させる工程
(b) 上記小腸培養組織又は細胞における、チトクロームP450 4A遺伝子の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を接触させない哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞における、チトクロームP450 4A遺伝子の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 That is, the present invention includes the following inventions.
[1] A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of bringing a test substance into contact with a mammal-derived small intestine cultured tissue or cells
(b) measuring the expression level of cytochrome P450 4A gene in the small intestine cultured tissue or cells
(c) a step of measuring the expression level of the cytochrome P450 4A gene in a cultured small intestine tissue or cell derived from a mammal not contacted with a test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c)

[2] 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程
(b) 上記非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、チトクロームP450 4A遺伝子の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を投与しない非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、チトクロームP450 4A遺伝子の発現量を測定する工程
(d) 上記（b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 [2] A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of administering a test substance to a non-human mammal
(b) measuring the expression level of cytochrome P450 4A gene in the small intestine collected from the non-human mammal
(c) a step of measuring the expression level of cytochrome P450 4A gene in the small intestine collected from a non-human mammal not administered with the test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c)

[3] チトクロームP450 4A遺伝子が、下記のポリヌクレオチドのうち、少なくとも１種以上のポリヌクレオチドである、[1]又は[2]に記載のスクリーニング方法。
(N1) 配列番号１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
(N2) 配列番号１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、脂質代謝促進物質に応答して発現が増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド [3] The screening method according to [1] or [2], wherein the cytochrome P450 4A gene is at least one of the following polynucleotides.
(N1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15
(N2) a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and whose expression increases in response to a lipid metabolism promoting substance Polynucleotide encoding

[4] 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞と接触させる工程
(b) 上記小腸培養組織又は細胞における、チトクロームP450 4Aタンパク質の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を接触させない哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞における、チトクロームP450 4Aタンパク質の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記（c）で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 [4] A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of bringing a test substance into contact with a mammal-derived small intestine cultured tissue or cells
(b) measuring the expression level of cytochrome P450 4A protein in the small intestine cultured tissue or cells
(c) a step of measuring the expression level of cytochrome P450 4A protein in a cultured small intestine tissue or cells derived from a mammal not contacted with a test substance
(d) A step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c)

[5] 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程
(b) 上記非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、チトクロームP450 4Aタンパク質の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を投与しない非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、チトクロームP450 4Aタンパク質の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 [5] A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of administering a test substance to a non-human mammal
(b) measuring the expression level of cytochrome P450 4A protein in the small intestine collected from the non-human mammal
(c) measuring the expression level of cytochrome P450 4A protein in the small intestine collected from a non-human mammal not administered with the test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c)

[6] チトクロームP450 4Aタンパク質が、下記のポリペプチドのうち、少なくとも１種以上のポリペプチドである、[4]又は[5]に記載のスクリーニング方法。
(P1) 配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
(P2) 配列番号１６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、脂質代謝促進物質に応答して発現が増加するポリペプチド [6] The screening method according to [4] or [5], wherein the cytochrome P450 4A protein is at least one of the following polypeptides.
(P1) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16
(P2) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and the expression thereof increases in response to a lipid metabolism promoting substance

[7] 前記タンパク質の発現量を、チトクロームP450 4A活性を測定することにより行なう、[4]〜[6]のいずれかに記載の抗肥満物質のスクリーニング方法。 [7] The method for screening an anti-obesity substance according to any one of [4] to [6], wherein the expression level of the protein is measured by measuring cytochrome P450 4A activity.

[8] 配列番号１５に示す塩基配列を増幅するための、１５塩基から４０塩基の長さを有するプライマーセット。 [8] A primer set having a length of 15 to 40 bases for amplifying the base sequence shown in SEQ ID NO: 15.

[9] 配列番号１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１５に示す塩基配列の相補配列に対して９０％以上の相同性を有す塩基配列からなる、該ポリヌクレオチドを検出するためのプローブ。
[10] [9]に記載のプローブを固定化した固定化担体。
[11] 配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体。 [9] From a nucleotide sequence that hybridizes to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 under stringent conditions and has 90% or more homology to a complementary sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15. A probe for detecting the polynucleotide.
[10] An immobilization carrier on which the probe according to [9] is immobilized.
[11] An antibody against the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16.

[12] 下記の(i)又は（ii)の少なくとも1種を含む、抗肥満物質のスクリーニング用キット。
(i) 配列番号１５に示す塩基配列を増幅するための、１５塩基から４０塩基の長さを有するプライマーセット
(ii) 配列番号１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１５に示す塩基配列の相補配列に対して９０％以上の相同性を有す塩基配列からなる、該ポリヌクレオチドを検出するためのプローブ。 [12] A kit for screening an anti-obesity substance, comprising at least one of the following (i) or (ii):
(i) A primer set having a length of 15 to 40 bases for amplifying the base sequence shown in SEQ ID NO: 15
(ii) From a nucleotide sequence that hybridizes to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 under stringent conditions and has 90% or more homology to a complementary sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15. A probe for detecting the polynucleotide.

[13] 配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体と該抗体に対する二次抗体を含む、抗肥満物質のスクリーニング用キット。 [13] A kit for screening an anti-obesity substance, comprising an antibody against a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a secondary antibody against the antibody.

[14] 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞と接触させる工程
(b) 上記小腸培養組織又は細胞における、ピルビン酸デヒロゲナーゼキナーゼ アイソザイム4遺伝子、ミトコンドリア アシル-CoA チオエステラーゼ１遺伝子、サイトソル アシル-CoAチオエステラーゼ１遺伝子、3-ケトアシル-CoAチオラーゼＢ遺伝子、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA シンターゼ２遺伝子、及び脂肪酸トランスロカーゼ遺伝子の中から選ばれる少なくとも1種以上の脂質代謝関連酵素遺伝子の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を接触させない哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞における、対応する脂質代謝関連酵素遺伝子の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 [14] A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of bringing a test substance into contact with a mammal-derived small intestine cultured tissue or cells
(b) in the above small intestine cultured tissue or cells, pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4 gene, mitochondrial acyl-CoA thioesterase 1 gene, cytosol acyl-CoA thioesterase 1 gene, 3-ketoacyl-CoA thiolase B gene, A step of measuring the expression level of at least one lipid metabolism-related enzyme gene selected from 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2 gene and fatty acid translocase gene
(c) a step of measuring the expression level of a corresponding lipid metabolism-related enzyme gene in a cultured small intestine tissue or cell derived from a mammal not contacted with a test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c)

[15] 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程
(b) 上記非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、ピルビン酸デヒロゲナーゼキナーゼ アイソザイム4遺伝子、ミトコンドリア アシル-CoA チオエステラーゼ１遺伝子、サイトソル アシル-CoAチオエステラーゼ１遺伝子、3-ケトアシル-CoAチオラーゼＢ遺伝子、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA シンターゼ２遺伝子、及び脂肪酸トランスロカーゼ遺伝子の中から選ばれる少なくとも1種以上の脂質代謝関連酵素遺伝子の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を投与しない非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、対応する脂質代謝関連酵素遺伝子の発現量を測定する工程
(d) 上記（b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 [15] A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of administering a test substance to a non-human mammal
(b) In the small intestine collected from the non-human mammal, pyruvate dehirogenase kinase isozyme 4 gene, mitochondrial acyl-CoA thioesterase 1 gene, cytosol acyl-CoA thioesterase 1 gene, 3-ketoacyl-CoA thiolase Measuring the expression level of at least one lipid metabolism-related enzyme gene selected from the B gene, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2 gene, and fatty acid translocase gene
(c) measuring the expression level of the corresponding lipid metabolism-related enzyme gene in the small intestine collected from a non-human mammal not administered with the test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c)

[16] 脂質代謝関連酵素遺伝子が、下記のポリヌクレオチドのうち、少なくとも１種以上のポリヌクレオチドである、[14]又は[15]に記載のスクリーニング方法。
(N1）配列番号３、５、７、９、１１、及び１３のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチド
(N2) 配列番号３、５、７、９、１１、及び１３のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、脂質代謝促進物質に応答して発現が増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチド [16] The screening method according to [14] or [15], wherein the lipid metabolism-related enzyme gene is at least one of the following polynucleotides.
(N1) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by any of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, and 13
(N2) hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to a polynucleotide consisting of the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, and 13, and , A polynucleotide encoding a protein whose expression increases in response to a lipid metabolism promoter

[17] 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞と接触させる工程
(b) 上記小腸培養組織又は細胞における、ピルビン酸デヒロゲナーゼキナーゼ アイソザイム4、ミトコンドリア アシル-CoA チオエステラーゼ１、サイトソル アシル-CoAチオエステラーゼ１、3-ケトアシル-CoAチオラーゼＢ、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA シンターゼ２、及び脂肪酸トランスロカーゼの中から選ばれる少なくとも1種以上の脂質代謝関連酵素タンパク質の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を接触させない哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞における、対応する脂質代謝関連酵素タンパク質の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記（c）で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 [17] A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of bringing a test substance into contact with a mammal-derived small intestine cultured tissue or cells
(b) Pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4, mitochondrial acyl-CoA thioesterase 1, cytosolic acyl-CoA thioesterase 1, 3-ketoacyl-CoA thiolase B, 3-hydroxy- A step of measuring the expression level of at least one lipid metabolism-related enzyme protein selected from 3-methylglutaryl-CoA synthase 2 and fatty acid translocase
(c) a step of measuring the expression level of the corresponding lipid metabolism-related enzyme protein in a cultured small intestine tissue or cell derived from a mammal not contacted with a test substance
(d) A step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c)

[18] 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程
(b) 上記非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、ピルビン酸デヒロゲナーゼキナーゼ アイソザイム4、ミトコンドリア アシル-CoA チオエステラーゼ１、サイトソル アシル-CoAチオエステラーゼ１、3-ケトアシル-CoAチオラーゼＢ、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA シンターゼ２、及び脂肪酸トランスロカーゼの中から選ばれる少なくとも1種以上の脂質代謝関連酵素タンパク質の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を投与しない非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、対応する脂質代謝関連酵素タンパク質の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 [18] A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of administering a test substance to a non-human mammal
(b) In the small intestine collected from the non-human mammal, pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4, mitochondrial acyl-CoA thioesterase 1, cytosol acyl-CoA thioesterase 1, 3-ketoacyl-CoA thiolase B, 3 Measuring the expression level of at least one lipid metabolism-related enzyme protein selected from 2-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2 and fatty acid translocase
(c) measuring the expression level of the corresponding lipid metabolism-related enzyme protein in the small intestine collected from a non-human mammal not administered with the test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c)

[19] 脂質代謝関連酵素タンパク質が、下記のポリペプチドのうち、少なくとも１種以上のポリペプチドである、[17]又は[18]に記載のスクリーニング方法。
(a) 配列番号４、６、８、１０、１２、及び１４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b) 配列番号４、６、８、１０、１２、及び１４のいずれかに示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、脂質代謝促進物質に応答して発現が増加するポリペプチド [19] The screening method according to [17] or [18], wherein the lipid metabolism-related enzyme protein is at least one of the following polypeptides.
(a) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, and 14
(b) a substance that promotes lipid metabolism, comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, and 14 Polypeptides whose expression increases in response to

[20] 配列番号３、５、７、９、１１、及び１３のいずれかに示す塩基配列を増幅するための、１５塩基から４０塩基の長さを有するプライマーセット。 [20] A primer set having a length of 15 to 40 bases for amplifying the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, and 13.

[21] 配列番号３、５、７、９、１１、及び１３のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号３、５、７、９、１１、及び１３のいずれかに示す塩基配列の相補配列に対して９０％以上の相同性を有す塩基配列からなる、該ポリヌクレオチドを検出するためのプローブ。 [21] It hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, and 13, and SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 And a probe for detecting the polynucleotide, comprising a base sequence having 90% or more homology to a complementary sequence of the base sequence shown in any one of.

[22] [21]に記載のプローブを固定化した固定化担体。
[23] 配列番号４、６、８、１０、１２、及び１４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体。 [22] An immobilization carrier on which the probe according to [21] is immobilized.
[23] An antibody against a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, and 14.

[24] 下記の(i)又は（ii)の少なくとも1種を含む、抗肥満物質のスクリーニング用キット。
(i) 配列番号３、５、７、９、１１、及び１３のいずれかに示す塩基配列を増幅するための、１５塩基から４０塩基の長さを有するプライマーセット
(ii) 配列番号３、５、７、９、１１、及び１３のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号３、５、７、９、１１、及び１３のいずれかに示す塩基配列の相補配列に対して９０％以上の相同性を有す塩基配列からなる、該ポリヌクレオチドを検出するためのプローブ。
[25] 配列番号４、６、８、１０、１２、及び１４のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体と該抗体に対する二次抗体を含む、抗肥満物質のスクリーニング用キット。 [24] A kit for screening an anti-obesity substance, comprising at least one of the following (i) or (ii):
(i) A primer set having a length of 15 to 40 bases for amplifying the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, and 13
(ii) It hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, and 13, and SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 And a probe for detecting the polynucleotide, comprising a base sequence having 90% or more homology to a complementary sequence of the base sequence shown in any one of.
[25] A kit for screening an anti-obesity substance, comprising an antibody against a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, and 14 and a secondary antibody against the antibody.

本発明によれば、肥満改善及び／又は脂質代謝促進効果のある物質の存在によって小腸において有意に発現量が変動する脂質代謝酵素遺伝子を用いた抗肥満物質のスクリーニング方法が提供される。本発明において用いる脂質代謝酵素遺伝子は、従来の肥満改善及び／又は脂質代謝促進の指標とされていたものより、より高感度にかつ短期間に、抗肥満物質をスクリーニングすることができる。   According to the present invention, there is provided a method for screening an anti-obesity substance using a lipid metabolism enzyme gene whose expression level varies significantly in the small intestine due to the presence of a substance having an effect of improving obesity and / or lipid metabolism. The lipid metabolizing enzyme gene used in the present invention can screen for anti-obesity substances with higher sensitivity and in a shorter period of time than those conventionally used as indicators for improving obesity and / or promoting lipid metabolism.

魚油食又はコントロール食を摂取させたマウス（db/dbマウス)の小腸における遺伝子発現変化を示す。The gene expression change in the small intestine of the mouse | mouth (db / db mouse) which ingested the fish oil diet or the control diet is shown. 魚油食又はコントロール食を摂取させたマウス（db/dbマウス）の肝臓における遺伝子発現変化を示す。The gene expression change in the liver of a mouse (db / db mouse) fed with a fish oil diet or a control diet is shown. 魚油食又はコントロール食を摂取させたマウス（db/dbマウス）の肝臓脂質（TG)含量変化を示す。The change in liver lipid (TG) content of mice (db / db mice) fed with fish oil diet or control diet is shown. 魚油食又はコントロール食を摂取させたマウス（C57BL/6マウス）の小腸における遺伝子発現変化を示す。The gene expression change in the small intestine of the mouse | mouth (C57BL / 6 mouse) which ingested the fish oil diet or the control diet is shown. 魚油食又はコントロール食を摂取させたマウス（C57BL/6マウス）の小腸β酸化活性変化を示す。The small intestine beta-oxidation activity change of the mouse | mouth (C57BL / 6 mouse) which ingested the fish oil diet or the control diet is shown. 魚油食又はコントロール食を摂取させたマウス（C57BL/6マウス）の小腸ME活性変化を示す。The small intestine ME activity change of the mouse | mouth (C57BL / 6 mouse) which ingested the fish oil diet or the control diet is shown. ベザフィブラートを投与したマウス（A/Jマウス）の小腸における遺伝子発現変化を示す。The gene expression change in the small intestine of the mouse | mouth (A / J mouse | mouth) which administered bezafibrate is shown. ベザフィブラートを投与したマウス（A/Jマウス）の小腸β酸化活性変化を示す。3 shows changes in small intestinal β-oxidation activity in mice administered with bezafibrate (A / J mice). ベザフィブラートを投与したマウス（A/Jマウス）の小腸ME活性変化を示す。The small intestine ME activity change of the mouse | mouth (A / J mouse | mouth) which administered bezafibrate is shown. ベザフィブラートを投与したマウス（A/Jマウス）の小腸CYP4A活性変化を示す。The small intestine CYP4A activity change of the mouse | mouth (A / J mouse | mouth) which administered bezafibrate is shown. DHAと培養したマウス（db/dbマウス）由来の小腸組織片における遺伝子発現変化を示す。The gene expression change in the small intestine tissue piece derived from the mouse | mouth (db / db mouse) cultured with DHA is shown. DHAと培養した小腸培養細胞（Caco-2細胞）における遺伝子発現変化を示す。The gene expression change in the small intestine culture cell (Caco-2 cell) cultured with DHA is shown.

本発明は、抗肥満物質をスクリーニングする方法であって、小腸における特定の脂質代謝関連酵素遺伝子の発現量を測定し、対照の対応する遺伝子発現量と比較して、上記遺伝子の発現量を増加させる物質を、抗肥満物質として選択することを特徴とする。   The present invention is a method for screening an anti-obesity substance, which measures the expression level of a specific lipid metabolism-related enzyme gene in the small intestine and increases the expression level of the gene compared to the corresponding gene expression level of a control The substance to be made is selected as an anti-obesity substance.

本発明のスクリーニング方法は、in vitroで行うことも、in vivoで行うこともできる。   The screening method of the present invention can be performed in vitro or in vivo.

本発明のin vitroでのスクリーニング方法は、例えば、以下の工程により行うことができる。
(a) 被験物質を哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞と接触させる工程
(b) 上記小腸培養組織又は細胞における、少なくとも１種以上の脂質代謝関連酵素遺伝子の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を接触させない哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞における、対応する脂質代謝関連酵素遺伝子の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 The in vitro screening method of the present invention can be performed, for example, by the following steps.
(a) A step of bringing a test substance into contact with a mammal-derived small intestine cultured tissue or cells
(b) a step of measuring the expression level of at least one lipid metabolism-related enzyme gene in the small intestine cultured tissue or cells.
(c) a step of measuring the expression level of a corresponding lipid metabolism-related enzyme gene in a cultured small intestine tissue or cell derived from a mammal not contacted with a test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c)

また、本発明のin vivoでのスクリーニング方法は、例えば、以下の工程により行うことができる。
(a) 被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程
(b) 上記非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、少なくとも１種以上の脂質代謝関連酵素遺伝子の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を投与しない非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、対応する脂質代謝関連酵素遺伝子の発現量を測定する工程
(d) 上記（b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程
本発明のスクリーニング方法に用いる脂質代謝関連酵素遺伝子はいずれも公知であり、それぞれの塩基配列情報も入手可能である。 In addition, the in vivo screening method of the present invention can be performed, for example, by the following steps.
(a) A step of administering a test substance to a non-human mammal
(b) measuring the expression level of at least one lipid metabolism-related enzyme gene in the small intestine collected from the non-human mammal;
(c) measuring the expression level of the corresponding lipid metabolism-related enzyme gene in the small intestine collected from a non-human mammal not administered with the test substance
(d) A step of selecting a test substance whose expression level measured in (b) is higher than that measured in (c) above. Any lipid metabolism-related enzyme gene used in the screening method of the present invention is known. Each base sequence information is also available.

具体的には、脂質代謝関連酵素遺伝子として、配列番号１に示す塩基配列を有するリンゴ酸酵素（Malic Enzyme：ME)遺伝子、配列番号３に示す塩基配列を有するピルビン酸デヒロゲナーゼキナーゼ アイソザイム4（Pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4:PDK4）遺伝子、配列番号５に示す塩基配列を有するミトコンドリア アシル-CoA チオエステラーゼ１(Mitochondrial acyl-CoA thioesterase 1:MTE-1）遺伝子、配列番号７に示す塩基配列を有するサイトソル アシル-CoAチオエステラーゼ１(Cytosolic acyl-CoA thioesterase 1：CTE-1）遺伝子、配列番号９に示す塩基配列を有する3-ケトアシル-CoAチオラーゼＢ(3-Ketoacyl-CoA thiolase B：THIO）遺伝子、配列番号11に示す塩基配列を有する3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA シンターゼ２（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2：HMGCS2）遺伝子、配列番号13に示す塩基配列を有する脂肪酸トランスロカーゼ（Fatty acid translocase：FAT）遺伝子、配列番号15に示す塩基配列を有するチトクロームP450 4A（Cytochrome P450 4A：CYP4A）遺伝子が挙げられる。   Specifically, as a lipid metabolism-related enzyme gene, malic enzyme (Malic Enzyme: ME) gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 (Pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4: PDK4) gene, mitochondrial acyl-CoA thioesterase 1 (MTE-1) gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 Cytosolyl-CoA thioesterase 1 (CTEosolic acyl-CoA thioesterase 1: CTE-1) gene, 3-ketoacyl-CoA thiolase B (THIO) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 The gene, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2 (HMGCS2) gene, SEQ ID NO: having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 Fatty acid translocase having the nucleotide sequence shown in 13 (Fatty acid translocase: FAT) gene, cytochrome P450 4A having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15 (Cytochrome P450 4A: CYP4A) include genes.

本発明のスクリーニング方法は、上記の脂質代謝関連酵素遺伝子と、該遺伝子によりコードされるタンパク質を基礎とするものである。   The screening method of the present invention is based on the lipid metabolism-related enzyme gene and the protein encoded by the gene.

なお、本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリン又はピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ATP、GTP、CTP、UTP；又はdATP、dGTP、dCTP、dTTP）が100個以上結合した分子をいい。「オリゴヌクレオチド」とは2-99個連結した分子を言う。また、「ポリ（オリゴ）ヌクレオチド」は、DNA及びRNAのいずれも含み、合成されたものであったも、天然のものであってもよい。また、「タンパク質」及び「（ポリ）ペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。   In the present invention, “polynucleotide” means a nucleoside phosphate ester (ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP) in which purine or pyrimidine is β-N-glycoside-linked to a sugar. A molecule with 100 or more bonds. “Oligonucleotide” refers to 2-99 linked molecules. The “poly (oligo) nucleotide” includes both DNA and RNA, and may be synthesized or natural. “Protein” and “(poly) peptide” mean a molecule composed of a plurality of amino acid residues linked to each other by amide bonds (peptide bonds).

本発明のスクリーニング方法に用いる上記の脂質代謝関連酵素遺伝子（以下、「指標遺伝子」という）は、実質的に同一の機能・活性を有する限り、変異遺伝子であってもよい。例えば、変異遺伝子としては、配列番号１、３、５、７、１１、１３、及び１５のいずれかに示す塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、脂質代謝促進物質に応答して発現が増加するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。   The lipid metabolism-related enzyme gene (hereinafter referred to as “index gene”) used in the screening method of the present invention may be a mutant gene as long as it has substantially the same function / activity. For example, as a mutant gene, a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide of any one of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, and 15 and a stringent condition are used. And a polynucleotide encoding a protein whose expression increases in response to a lipid metabolism promoting substance.

ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件、例えば、高い相同性（相同性が80％以上、好ましくは90％以上）を有するポリヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、例えば、0.5〜1.0 M 程度の NaClを含むハイブリダイゼーション溶液中、60℃〜68℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で0.1１〜1×SSC中（1×SSC: 150mM NaCl, 15mMクエン酸ナトリウムからなる）で１時間洗浄する条件をいう。   Here, the stringent condition is a condition in which a specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed, for example, a polymorphism having high homology (homology is 80% or more, preferably 90% or more). The conditions under which nucleotides hybridize. More specifically, for example, hybridization is performed at 60 ° C. to 68 ° C. in a hybridization solution containing about 0.5 to 1.0 M NaCl, and then in 0.11 to 1 × SSC (1 × at the same temperature as hybridization). SSC: consisting of 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate).

また、上記の「脂質代謝促進物質に応答して発現が増加する」とは、脂質代謝促進物質（例えばＤＨＡなど）の存在下における遺伝子発現量が非存在下における遺伝子発現量より有意に増加することをいい、その増加程度が、上記各塩基配列で示されるポリヌクレチドが有する活性と実質的に同等であることをいう。   In addition, the expression “increasing expression in response to a lipid metabolism promoting substance” means that the gene expression level in the presence of a lipid metabolism promoting substance (such as DHA) is significantly higher than the gene expression level in the absence. The increase degree is substantially equivalent to the activity of the polynucleotide represented by each of the above base sequences.

上記変異遺伝子の機能確認は、例えば該変異遺伝子を含む組換えベクター作成し、これを適当な宿主細胞に導入して、公知の脂質代謝促進物質存在下または非存在下で培養し、培養後の細胞内における遺伝子発現量を比較することによって確認できる。なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法又は Gapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異が導入される。   For confirmation of the function of the mutant gene, for example, a recombinant vector containing the mutant gene is prepared, introduced into an appropriate host cell, and cultured in the presence or absence of a known lipid metabolism promoting substance. This can be confirmed by comparing gene expression levels in cells. In order to introduce a mutation into a gene, a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a similar method can be used. For example, a mutation introduction kit (for example, Mutant using a site-directed mutagenesis method) is used. -K (manufactured by TAKARA) or Mutant-G (manufactured by TAKARA)), or the LA PCR in vitro Mutagenesis series kit from TAKARA.

スクリーニング(in vitro)に用いる小腸培養組織又は細胞としては、前記の指標遺伝子のいずれかを発現する哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞を用いることができ、例えば、小腸培養細胞としては、Caco-2細胞、IEC-6 細胞、IEC-18細胞などが挙げられる。哺乳動物としては、特に限定されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ等が好ましく、その中でもマウスが好ましい。   As a small intestine cultured tissue or cell used for screening (in vitro), a small intestine cultured tissue or cell derived from a mammal that expresses any of the above-described indicator genes can be used. For example, as a small intestine cultured cell, Caco- Examples include 2 cells, IEC-6 cells, and IEC-18 cells. Although it does not specifically limit as a mammal, A human, a monkey, a mouse | mouth, a rat, a rabbit, etc. are preferable, Among these, a mouse | mouth is preferable.

また、スクリーニング（in vivo)に用いる被験動物としては、非ヒト哺乳動物であればよく、肥満モデル動物または健常動物のいずれでもよい。肥満モデル動物としては、肥満責任遺伝子として同定されているob遺伝子、db遺伝子、tub遺伝子、Avy遺伝子、fat遺伝子をホモで有する非ヒト肥満モデル動物、例えば、ob/obマウス、db/dbマウス、Wistar fattyラット、Zucker fattyラット、あるいは非ヒト糖尿病モデル動物を用いることができる。   The test animal used for screening (in vivo) may be any non-human mammal, and may be an obese model animal or a healthy animal. As an obesity model animal, a non-human obesity model animal having a homozygous ob gene, db gene, tub gene, Avy gene, fat gene identified as an obesity responsible gene, for example, ob / ob mouse, db / db mouse, Wistar fatty rats, Zucker fatty rats, or non-human diabetes model animals can be used.

このような非ヒト肥満及び／又は糖尿病モデル動物として、具体的には、C57BL/6J ob/obマウス、C57BL/6J Ham Slc-Ayマウス、Crj:(ZUC)-fa/faラット、Slc:Zucker-fa/faラット、Hos:Zucker-fa/faラット、SHR/NDmc-cpラット、KK-Ay/Ta Jclマウス、B6.V-Lepob/Jマウス、C57BL/6J Ham Slc-Lepobマウス、BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/Jclマウス、NSYマウス、ZDF/Gmi-fa/faラット等を挙げることができ、これらはいずれも市販されている。 As such non-human obesity and / or diabetes model animals, specifically, C57BL / 6J ob / ob mice, C57BL / 6J Ham Slc-A y mice, Crj: (ZUC) -fa / fa rats, Slc: Zucker-fa / fa rat, Hos: Zucker-fa / fa rat, SHR / NDmc-cp rat, KK-A y / Ta Jcl mouse, B6.V-Lep ob / J mouse, C57BL / 6J Ham Slc-Lep ob Examples thereof include mice, BKS.Cg- + Lepr db / + Lepr db / Jcl mice, NSY mice, ZDF / Gmi-fa / fa rats, etc., all of which are commercially available.

遺伝子の発現量は、遺伝子の転写物であるmRNAの量、該mRNAから逆転写したcDNAの量のいずれを測定してもよい。小腸培養組織又は細胞からのRNAの抽出は、当該技術分野において通常用いられる手法、例えば、グアニジン／塩化セシウム法、グアニジン／チオシアネート法（グアニジン／セシウムＴＦＡ法）、塩化リチウム／尿素法、ホットフェノール法、ＡＧＰＣ法（アシッドグアニジウム−フェノール−クロロホルム法）などに従って行うことができる。RNA抽出に際しては、RNeasy等の市販のRNA抽出用キットに添付される抽出プロトコルを改良した独自のプロトコルに従って行うことが好ましい。mRNAの調製は、得られた全RNA画分をオリゴ(dT)セルロースカラムやセファロース２Bを担体とするポリU−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により処理することによって行う。また、cDNAの調製は、得られたmRNAを鋳型として、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合成し、該一本鎖cDNAからDNA合成酵素Ｉ、DNAリガーゼ及びRnaseH等を用いて二本鎖cDNAを合成することにより行う。   The gene expression level may be determined by measuring either the amount of mRNA that is a transcript of the gene or the amount of cDNA reverse-transcribed from the mRNA. RNA extraction from cultured tissue or cells of small intestine is usually performed in the art, for example, guanidine / cesium chloride method, guanidine / thiocyanate method (guanidine / cesium TFA method), lithium chloride / urea method, hot phenol method. , AGPC method (acid guanidinium-phenol-chloroform method) and the like. RNA extraction is preferably performed according to a unique protocol obtained by improving the extraction protocol attached to a commercially available RNA extraction kit such as RNeasy. The mRNA is prepared by treating the obtained total RNA fraction by an affinity column method using an oligo (dT) cellulose column or poly U-sepharose using Sepharose 2B as a carrier. In addition, cDNA is prepared by synthesizing a single-stranded cDNA using the obtained mRNA as a template using an oligo dT primer and reverse transcriptase, and then synthesizing DNA synthase I, DNA ligase, RnaseH, etc. from the single-stranded cDNA. Used to synthesize double-stranded cDNA.

本発明において、遺伝子の発現量の測定は、公知の遺伝子発現解析方法に従って行うこができる。例えば、上記の指標遺伝子にハイブリダイズするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドをプローブとしたハイブリダイゼーション法、又は指標遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとした遺伝子増幅法等を利用することができる。具体的には、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法、RT-PCR法、Real−Time PCR法、DNAマイクロアレイ法などが挙げられる。   In the present invention, the gene expression level can be measured according to a known gene expression analysis method. For example, a hybridization method using an oligo (poly) nucleotide that hybridizes to the indicator gene as a probe or a gene amplification method using an oligonucleotide that hybridizes to the indicator gene as a primer can be used. Specifically, dot blot method, Northern blot method, RNase protection assay method, RT-PCR method, Real-Time PCR method, DNA microarray method and the like can be mentioned.

本発明には上記測定に用いられるプローブ又はプライマー（セット）をも包含する。
プライマー（セット）は、前記の指標遺伝子の各塩基配列に基づき設計し、合成・精製の各工程を経て調製することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、鋳型DNAとの間の特異的なアニーリングが可能とするために、15〜40塩基、好ましくは20〜30塩基である。プライマーの設計は、センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる１組あるいは１対（２本）のプライマーが互いにアニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、鋳型DNAとの安定な結合を確保するため、GC含量を約50％にし、プライマー内においてGC-richあるいはAT-richが偏在しないようにする。アニーリング温度はTm（melting temperature）に依存するので、特異性の高いPCR産物を得るため、Tm値が55〜65℃で互いに近似したプライマーを選定する。また、PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約0.1〜1μMになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。 The present invention also includes probes or primers (sets) used for the above measurement.
A primer (set) can be designed based on each base sequence of the above-mentioned index gene, and can be prepared through each step of synthesis and purification. The size (number of bases) of the primer is 15 to 40 bases, preferably 20 to 30 bases, in order to enable specific annealing with the template DNA. The primer is designed so that a pair of primers consisting of a sense strand (5 ′ end) and an antisense strand (3 ′ end) or a pair (two) of primers does not anneal with each other. Avoid self-complementary sequences as well as avoid hairpin structures in the primer. Furthermore, in order to ensure stable binding to the template DNA, the GC content is set to about 50% so that GC-rich or AT-rich is not unevenly distributed in the primer. Since the annealing temperature depends on Tm (melting temperature), primers that are close to each other at a Tm value of 55 to 65 ° C. are selected in order to obtain a highly specific PCR product. It is also necessary to pay attention to adjusting the final concentration of primers used in PCR to be about 0.1 to 1 μM. Also, commercially available software for primer design such as Oligo ™ [manufactured by National Bioscience Inc. (USA)], GENETYX [manufactured by Software Development Co., Ltd. (Japan)], etc. can be used.

本発明における上記の各指標遺伝子を増幅できるプライマーとして、具体的には後記実施例に示す配列番号17〜38、41〜46に示す塩基配列を有するプライマーが例示できる。   Specific examples of primers capable of amplifying each of the above indicator genes in the present invention include primers having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 17 to 38 and 41 to 46 shown in Examples below.

また、プローブとしては、指標遺伝子の塩基配列の連続する部分配列からなるポリ（オリゴ）ヌクレオチド、あるいは、指標遺伝子の塩基配列に対する相補配列の連続する部分配列からなるポリ（オリゴ）ヌクレオチド断片が用いられる。プローブの長さは特に限定されないが、例えば15塩基以上、好ましくは20塩基以上であれば目的とする遺伝子の間で特異的なハイブリッドを形成できる。上記ヌクレオチド断片は、例えば、各塩基配列を有するポリヌクレオチド（cDNA)を適当な制限酵素で切断するか、あるいは、周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することができる。   In addition, as the probe, a poly (oligo) nucleotide consisting of a continuous partial sequence of the base sequence of the indicator gene or a poly (oligo) nucleotide fragment consisting of a continuous partial sequence of a complementary sequence to the base sequence of the indicator gene is used. . The length of the probe is not particularly limited. For example, a specific hybrid can be formed between target genes as long as it is 15 bases or more, preferably 20 bases or more. The nucleotide fragment can be synthesized in vitro, for example, by cleaving a polynucleotide (cDNA) having each base sequence with an appropriate restriction enzyme, or by a well-known chemical synthesis technique.

上記ヌクレオチド断片をプローブとして使用する場合、標識物質により標識化する。標識物質は、特に限定はされないが、例えば、蛍光物質、放射性同位体、酵素、アビジン若しくはビオチンなどを用いることができる。蛍光物質としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRIC)、シアニン色素（例えば、Cy DyeTMシリーズのCy3、Cy5等）、アセチルアミノフルオレン（AFF)などが挙げられ、酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどが挙げられ、放射性同位体としては、１２５Ｉや３Ｈなどが挙げられる。 When the nucleotide fragment is used as a probe, it is labeled with a labeling substance. The labeling substance is not particularly limited, and for example, a fluorescent substance, a radioisotope, an enzyme, avidin, or biotin can be used. Examples of fluorescent substances include fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRIC), cyanine dyes (eg Cy3, Cy5 of Cy Dye TM series), acetylaminofluorene (AFF), etc. Examples include peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase and the like, and examples of the radioisotope include 125 I and 3 H.

上記のプローブとして用いるポリ（オリゴ）ヌクレオチド断片は、前記指標遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることを特徴とする。ここで、ストリンジェントな条件とは、前記指標遺伝子とポリ（オリゴ）ヌクレオチド断片との選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件によって定義される。ストリンジェンシーは、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによって増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、NaCl約750 mM以下及びクエン酸三ナトリウム約75mM以下、より好ましくはNaCl約500 mM以下及びクエン酸三ナトリウム約50 mM以下、最も好ましくはNaCl約250 mM以下及びクエン酸三ナトリウム約25 mM以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約35%以上、好ましくは約50%以上である。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上、好ましくは約37℃以上、より好ましくは約42℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、及びキャリアーDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。   The poly (oligo) nucleotide fragment used as the probe is characterized by hybridizing with the indicator gene under stringent conditions. Here, the stringent condition is a condition that enables selective and detectable specific binding between the indicator gene and the poly (oligo) nucleotide fragment. Stringent conditions are defined by salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. Stringency is increased by decreasing the salt concentration, increasing the organic solvent concentration, or increasing the hybridization temperature. For example, stringent salt concentrations are typically about 750 mM or less NaCl and about 75 mM or less trisodium citrate, more preferably about 500 mM or less NaCl and about 50 mM or less trisodium citrate, most preferably about 250 mM NaCl. And about 25 mM or less of trisodium citrate. The stringent organic solvent concentration is about 35% or more, preferably about 50% or more of formamide. The stringent temperature condition is about 30 ° C. or higher, preferably about 37 ° C. or higher, more preferably about 42 ° C. or higher. Other conditions include the hybridization time, the concentration of the detergent (for example, SDS), the presence or absence of carrier DNA, and various stringencies can be set by combining these conditions.

また、プローブはマイクロアレイなどの固定化担体に固定化して用いてもよい。マイクロアレイの形成方法は特に限定されず、当業者が利用可能ないかなる方法を用いてもよく、例えば、固相担体表面で直接プローブを合成する方法（オン・チップ法）、又は予め調製したプローブを固相担体表面に結合する方法などがある。固相担体表面で直接プローブを合成する場合には、光照射で選択的に除去される保護基を用い、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術及び固相合成技術を組み合わせて所定の微少なマトリックス領域でのオリゴヌクレオチドの選択的な合成を行う方法が一般的である。一方、予めプローブを調製して固相担体表面に結合する方法では、プローブ核酸の種類や固相担体の種類に応じて、スポッタ装置によりポリ陽イオン化合物やアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有するシランカップリング剤などで表面処理した固相担体の表面に点着する方法、反応活性基を導入したプローブ核酸を合成し、予め反応性基を形成させるように表面処理した固相担体表面に該プローブ核酸を点着して該プローブ核酸を固相担体表面に共有結合により結合固定させる方法などが利用できる。   The probe may be used by being immobilized on an immobilization carrier such as a microarray. The microarray formation method is not particularly limited, and any method available to those skilled in the art may be used. For example, a method of directly synthesizing a probe on the surface of a solid support (on-chip method), or a probe prepared in advance There are methods for binding to the surface of a solid support. When a probe is directly synthesized on the surface of a solid support, a protective matrix that is selectively removed by light irradiation is used, and a predetermined micromatrix is formed by combining photolithography technology and solid phase synthesis technology used for semiconductor manufacturing. A method for selective synthesis of oligonucleotides in a region is common. On the other hand, in the method of preparing the probe in advance and binding it to the surface of the solid phase carrier, depending on the type of probe nucleic acid or the type of solid phase carrier, a polycation compound, an amino group, an aldehyde group, an epoxy group, etc. can be used with a spotter device. A method of spotting on the surface of a solid phase carrier surface-treated with a silane coupling agent or the like, and synthesizing a probe nucleic acid into which a reactive group has been introduced and preliminarily forming a reactive group on the surface of the solid phase carrier surface For example, a method of spotting the probe nucleic acid and covalently binding and fixing the probe nucleic acid to the surface of the solid phase carrier can be used.

また本発明スクリーニング方法の別の態様として、指標遺伝子によりコードされるタンパク質（以下、指標タンパク質という）の検出することにより行うこともできる。   Further, as another aspect of the screening method of the present invention, it can also be carried out by detecting a protein encoded by an indicator gene (hereinafter referred to as indicator protein).

かかる指標タンパク質としては、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するリンゴ酸酵素（Malic Enzyme：ME)、配列番号４に示すアミノ酸を有するピルビン酸デヒロゲナーゼキナーゼ アイソザイム4（Pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4:PDK4）、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するミトコンドリア アシル-CoA チオエステラーゼ１(Mitochondrial acyl-CoA thioesterase 1:MTE-1）、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するサイトソル アシル-CoAチオエステラーゼ１(Cytosolic acyl-CoA thioesterase 1：CTE-1）、配列番号10に示すアミノ酸配列を有する3-ケトアシル-CoAチオラーゼＢ(3-Ketoacyl-CoA thiolase B：THIO）、配列番号12に示すアミノ酸配列を有する3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA シンターゼ２（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2：HMGCS2）、配列番号14に示すアミノ酸配列を有する脂肪酸トランスロカーゼ（Fatty acid translocase：FAT）、配列番号16に示すアミノ酸配列を有するチトクロームP450 4A（Cytochrome P450 4A：CYP4A）が挙げられる。   As such an indicator protein, malic enzyme (Malic Enzyme: ME) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 4 having the amino acid shown in SEQ ID NO: 4 (Pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4: PDK4), mitochondrial acyl-CoA thioesterase 1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 (Mitochondrial acyl-CoA thioesterase 1: MTE-1), cytosol acyl-CoA thioesterase 1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 ( Cytosolic acyl-CoA thioesterase 1: CTE-1), 3-ketoacyl-CoA thiolase B (THIO) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, 3 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 -Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2 (HMGCS2), which has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 Fatty acid translocase (Fatty acid translocase: FAT), cytochrome P450 4A having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 (Cytochrome P450 4A: CYP4A) and the like.

本発明のスクリーニング方法に用いる上記の指標タンパク質は、実質的に同一の機能・活性を有する限り、変異タンパク質であってもよい。例えば、変異タンパク質としては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、及び１８のいずれかに示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、脂質代謝促進物質に応答した発現活性を有するポリペプチドが挙げられる。ここで、1若しくは数個とは、例えば、１〜10個、好ましくは１〜５個をいう。   The indicator protein used in the screening method of the present invention may be a mutant protein as long as it has substantially the same function / activity. For example, as a mutant protein, an amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, and 18. Examples thereof include a polypeptide comprising a sequence and having an expression activity in response to a lipid metabolism promoting substance. Here, 1 or several means, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5.

本発明において、指標タンパク質の発現量の測定は、公知のタンパク質発現解析方法に従って行うことができる。例えば、該指標タンパクに結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、ドットブロット法、免疫沈降法、酵素免疫測定法 (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay）、放射線免疫測定法（RIA；radioimmuno assay）、蛍光抗体法、免疫細胞染色等が挙げられる。   In the present invention, the expression level of the indicator protein can be measured according to a known protein expression analysis method. For example, Western blotting, dot blot, immunoprecipitation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence using antibodies that bind to the indicator protein, fluorescence Examples thereof include antibody methods and immune cell staining.

上記測定に用いられる指標タンパク質に対する抗体は、当業者に周知の方法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、抗体としては、抗体の活性フラグメントであってもよい。活性フラグメントとしては、F(ab')2、Fab'、Fab、Fvなどが挙げられる。   An antibody against the indicator protein used in the above measurement can be obtained by a method well known to those skilled in the art. The antibody used in the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Further, the antibody may be an active fragment of an antibody. Active fragments include F (ab ′) 2, Fab ′, Fab, Fv and the like.

例えば、指標タンパク質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物（例えば、ウサギ、ラット、マウスなど）から血液を採取し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から抗体産生細胞（脾臓細胞、リンパ節細胞など）を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。   For example, with a polyclonal antibody against an indicator protein, blood is collected from a mammal (eg, rabbit, rat, mouse, etc.) sensitized with an antigen, and serum is separated from the blood by a known method. As the polyclonal antibody, serum containing the polyclonal antibody can be used. In order to obtain a monoclonal antibody, antibody-producing cells (spleen cells, lymph node cells, etc.) are taken out of the mammal sensitized with the antigen and fused with myeloma cells. The thus obtained hybridoma can be cloned, and the antibody can be recovered from the culture to obtain a monoclonal antibody.

抗原に用いるタンパク質もしくはその部分ペプチドは、例えば前記の塩基配列を有する標的遺伝子又はその部分遺伝子を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換えタンパク質を発現させ、発現させた組み換えタンパク質を培養体又は培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。   A protein used for an antigen or a partial peptide thereof is prepared by, for example, incorporating a target gene having the above-described base sequence or a partial gene thereof into an expression vector, introducing the gene into an appropriate host cell, creating a transformant, It can be obtained by culturing the body to express the recombinant protein, and purifying the expressed recombinant protein from the culture or culture supernatant. Alternatively, an oligopeptide consisting of an amino acid sequence encoded by these genes or a partial amino acid sequence of an amino acid sequence encoded by a full-length cDNA can be chemically synthesized and used as an immunogen.

指標タンパク質の検出には、これらの抗体を適宜標識すればよい。標識物質は、前記の酵素、放射性同位体、蛍光色素を使用することができる。また、抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。   For detection of the indicator protein, these antibodies may be appropriately labeled. As the labeling substance, the aforementioned enzyme, radioisotope, or fluorescent dye can be used. Further, a substance that specifically binds to the antibody, for example, protein A or protein G, can be labeled and detected indirectly without labeling the antibody.

さらに、タンパク質の発現量は、該タンパク質の酵素活性の測定により行ってもよい。本発明における指標タンパク質の酵素活性測定方法（例えば、後記実施例に示すβ酸化活性、リンゴ酸酵素（ME)活性）は、公知である。   Furthermore, the protein expression level may be determined by measuring the enzyme activity of the protein. The method for measuring the enzyme activity of the indicator protein in the present invention (for example, β-oxidation activity and malate enzyme (ME) activity shown in Examples below) is known.

発現量の比較は、通常、被験物質が存在しない状態における前記指標遺伝子（タンパク質）の発現量を対照値として行う。本発明における指標遺伝子（タンパク質）は、肥満改善及び／又は脂質代謝促進効果を有する物質（後記実施例に示す魚油、ＤＨＡなど）の存在下で有意量が上昇する。従って、被験物質存在下における該指標遺伝子（タンパク質）の発現量が、対照値の１．１倍以上、好ましくは１．５倍以上の場合、その被験物質は、肥満を抑制し、または肥満を改善する作用を有していると評価できる。また、被験物質存在下における該指標遺伝子（タンパク質）の発現量が、上記の範囲に満たない場合又は対照値より減少した場合は、肥満改善効果がない、または肥満を増進する作用を有していると評価できる。   Comparison of expression levels is usually performed using the expression level of the indicator gene (protein) in the absence of the test substance as a control value. The indicator gene (protein) in the present invention is significantly increased in the presence of substances having an effect of improving obesity and / or promoting lipid metabolism (fish oil, DHA, etc. shown in Examples below). Accordingly, when the expression level of the indicator gene (protein) in the presence of the test substance is 1.1 times or more, preferably 1.5 times or more of the control value, the test substance suppresses obesity or obesity. It can be evaluated that it has an improving effect. Further, when the expression level of the indicator gene (protein) in the presence of the test substance is less than the above range or decreased from the control value, there is no effect of improving obesity or an action to promote obesity. Can be evaluated.

本発明において遺伝子の発現量を増加させる物質とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップに対して促進作用を持つ物質である。このような物質には、指標遺伝子の転写活性を増加させる作用、指標遺伝子の転写産物からの翻訳を増加させる作用、指標遺伝子の翻訳産物の活性を促進する作用、指標遺伝子の転写産物の安定化を促進または分解を抑制する作用等を有する物質が含まれ得る。   In the present invention, a substance that increases the expression level of a gene is a substance that has a promoting action on any of the steps of gene transcription, translation, and protein activity expression. Such substances have the effect of increasing the transcription activity of the indicator gene, the effect of increasing the translation from the transcription product of the indicator gene, the activity of promoting the activity of the translation product of the indicator gene, the stabilization of the transcription product of the indicator gene The substance which has the effect | action etc. which accelerate | stimulate or suppress decomposition | disassembly may be contained.

指標遺伝子（タンパク質）の発現量は、公知の方法によって補正することが好ましい。測定値の補正には、小腸に発現し、かつ細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値を用いればよい。   The expression level of the indicator gene (protein) is preferably corrected by a known method. For the correction of the measured value, a measured value of the expression level of a gene (housekeeping gene) that is expressed in the small intestine and whose expression level does not vary greatly regardless of the state of the cell may be used.

本発明のスクリーニング方法の対象となる被験物質の種類は特に限定されない。例えば、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品；天然に生じる分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体(例えば、ペプチド擬態物など)；及び天然に生じない分子(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成した低分子有機化合物)；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなどが挙げられる。   The type of the test substance that is the subject of the screening method of the present invention is not particularly limited. For example, a mixture containing a plurality of compounds such as extracts of animal and plant tissues or microbial cultures, and preparations purified from them; naturally occurring molecules (eg, amino acids, peptides, oligopeptides, polypeptides, proteins, Nucleic acids, lipids, steroids, glycoproteins, proteoglycans, etc.); or synthetic analogs or derivatives of naturally occurring molecules (eg, peptidomimetics); and non-naturally occurring molecules (eg, combinatorial chemistry techniques) Low molecular organic compounds); and mixtures thereof. In addition, as a test substance, a single test substance may be tested independently, or a mixture of several candidate test substances (including a library) may be tested. Examples of the library containing a plurality of test substances include a synthetic compound library and a peptide library.

in vitroでは、小腸培養組織又は細胞への被験物質との接触は、被験物質を添加した培地で小腸培養組織又は細胞を培養することにより行う。   In vitro, the small intestine cultured tissue or cells are contacted with the test substance by culturing the small intestine cultured tissue or cells in a medium to which the test substance is added.

in vivoでは、被験物質の動物への投与は、例えば、被験物質を含有する飼料を与えて飼育する、あるいは、被験物質を含有する溶液を経口投与することにより行う。   In vivo, administration of a test substance to an animal is carried out, for example, by feeding a feed containing the test substance or raising it, or by orally administering a solution containing the test substance.

被験物質の投与量や濃度は適宜設定することができるが、例えば、希釈系列を作成するなどして複数の投与量を設定してもよい。被験物質の投与期間も適宜設定することができるが、例えば、１日から数週間までの期間に渡って投与することができる。また、被験物質を投与する場合の投与経路は特に限定されず、被験物質の種類に応じて経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を適宜使用することができる。   The dose and concentration of the test substance can be set as appropriate. For example, a plurality of doses may be set by creating a dilution series. The administration period of the test substance can also be set as appropriate. For example, it can be administered over a period from 1 day to several weeks. In addition, the administration route for administering the test substance is not particularly limited, and administration forms such as oral administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, and subcutaneous injection may be appropriately used depending on the type of the test substance. it can.

本発明によるスクリーニング方法において指標遺伝子（指標タンパク質）の発現量を測定するための試薬を予め組み合わせてキット化することもできる。例えば、キットには、前記のプライマー、プローブとして用いるポリ（オリゴ）ヌクレオチド又は抗体のいずれかを少なくとも含んでいればよい。また、該キットには、固定化担体、細胞株、モデル動物を含んでいてもよく、さらに、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、キットの使用方法を記載した指示書等を含めることもできる。   In the screening method according to the present invention, a reagent for measuring the expression level of the indicator gene (index protein) can be combined in advance to form a kit. For example, the kit may contain at least any of the above-described primers, poly (oligo) nucleotides or antibodies used as probes. In addition, the kit may contain an immobilization carrier, a cell line, a model animal, and further, a labeling substance, a substrate compound used for detection of the label, a medium or container for cell culture, positive or negative Standard samples, instructions describing how to use the kit, etc. can also be included.

本発明のスクリーニング方法によって選択される抗肥満物質は、脂肪細胞における脂肪蓄積の抑制、脂質代謝促進効果を有する。従って、該抗肥満物質は、肥満（内臓脂肪の増大や体脂肪増大）、肥満に伴う各種疾患、例えば糖尿病、高グリセリド血症、高脂血症、高血圧症、動脈硬化、心臓病、脂肪肝等の治療及び／又は予防用医薬組成物や、食品（特に特定保健用食品）などの有効成分として利用できる。かかる医薬組成物は、選択された抗肥満物質と通常の製剤担体を用い、常法により製造できる。例えば、経口用製剤を調製する場合は、必要に応じて結合剤、崩壊剤、潤滑剤、着色剤などを加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。非経口用製剤を調製する場合は、必要によりＰＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により注射剤とする。   The anti-obesity substance selected by the screening method of the present invention has the effect of suppressing fat accumulation in lipid cells and promoting lipid metabolism. Therefore, the anti-obesity substance is obese (increased visceral fat or increased body fat), various diseases associated with obesity such as diabetes, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, heart disease, fatty liver It can be used as an active ingredient such as a pharmaceutical composition for treatment and / or prevention of food and the like, and food (especially food for specified health use). Such a pharmaceutical composition can be produced by a conventional method using the selected anti-obesity substance and a conventional pharmaceutical carrier. For example, when an oral preparation is prepared, a binder, a disintegrant, a lubricant, a colorant and the like are added as necessary, and then a tablet, granule, powder, capsule or the like is prepared by a conventional method. When preparing a parenteral preparation, a pH adjusting agent, a buffering agent, a stabilizer, a solubilizing agent and the like are added as necessary, and an injection is prepared by a conventional method.

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these.

（実施例１） 魚油食摂取後の小腸及び肝臓における遺伝子発現変動解析
肥満モデルマウス(BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/Jcl（db/dbマウス））に、下記表１に示すコントロール食（10％ TG）、又は魚油食（6％TG＋4％FO）を与えて飼育した。 (Example 1) gene expression variation analysis obese model mice in the small intestine and liver after fish oil diet (BKS.Cg- + Lepr db / + Lepr db / Jcl (db / db mice)), the control shown in the following Table 1 They were fed with a diet (10% TG) or a fish oil diet (6% TG + 4% FO).

Figure 0005180978
Figure 0005180978

２週間後、ジエチルエーテルによる麻酔下でマウスを開腹し、小腸及び肝臓を採取した。さらに、採取した小腸及び肝臓よりRNA抽出試薬を用いてtotal RNAを抽出し、リアルタイムPCR解析法により、脂質代謝関連酵素遺伝子（ME、PDK4、MTE-1、CTE-1、HMGCS2、THIO、FAT、CYP4A）と一般の脂質代謝促進の指標として用いられる遺伝子（ACO、MCAD、UCP-2）の発現量を測定した。   Two weeks later, the mouse was opened under anesthesia with diethyl ether, and the small intestine and liver were collected. Furthermore, total RNA was extracted from the collected small intestine and liver using an RNA extraction reagent, and lipid metabolism-related enzyme genes (ME, PDK4, MTE-1, CTE-1, HMGCS2, THIO, FAT, CYP4A) and the expression levels of genes (ACO, MCAD, UCP-2) used as indicators for general lipid metabolism promotion were measured.

なお、各遺伝子のPCR増幅のために用いたプライマーは以下の通りである。
ME遺伝子増幅用プライマー：
5'側：CTATCCTCCTTTGAATACCATTCGA（配列番号17）
3'側：CTTCTGCAGGCCACGGATAACAATC（配列番号18）
PDK4遺伝子増幅用プライマー：
5'側：GATCAGGGCAGTGACTTTCACAG（配列番号19）
3'側：TCAGAGCTGAAATTTCAATGGAAAC（配列番号20）
MTE-1遺伝子増幅用プライマー：
5'側：AGTGCCTATGAAGGACTGAGGA（配列番号21）
3'側：GGCAGAAAGCACCTTTACCA（配列番号22）
CTE-1遺伝子増幅用プライマー：
5'側：GGCTGGGAATGGAGTTTCAT（配列番号23）
3'側：CCTGGCACTTTTCTTGGATAGC（配列番号24）
HMGCS2遺伝子増幅用プライマー：
5'側：TGTCCCCTGAGGAATTCACAGAA（配列番号25）
3'側：CGATGCATCTCATCCACTCGTT（配列番号26）
THIO遺伝子増幅用プライマー：
5'側：TAATTGCAGCATGGGTACACGT（配列番号27）
3'側：ACCGTCCCACAGAAATGAATGT（配列番号28）
FAT遺伝子増幅用プライマー：
5'側：GCAAAGAAGGAAAGCCTGTGT（配列番号29）
3'側：GCCACAGTATAGGTACAATGT（配列番号30）
CYP4A遺伝子増幅用プライマー：
5'側：AAAGCTCCAAGATAGTTTTCCCATC（配列番号31）
3'側：CAATGATGTTCAGGCCTTGGAT（配列番号32）
ACO遺伝子増幅用プライマー：
5'側：CTCTCTATGGGATCAGCCAGAA（配列番号33）
3'側：CCACTCAAACAAGTTTTCATACACA（配列番号34）
MCAD遺伝子増幅用プライマー：
5'側：TGCTCGCAGAAATGGCGATGA（配列番号35）
3'側：CAATGTGCTCACGAGCTATGA（配列番号36）
UCP-2遺伝子増幅用プライマー：
5'側： TCTCCTGAAAGCCAACCTCAT（配列番号37）
3'側：GCTGCTCATAGGTGACAAACAT（配列番号38） The primers used for PCR amplification of each gene are as follows.
Primer for amplification of ME gene:
5 'side: CTATCCTCCTTTGAATACCATTCGA (SEQ ID NO: 17)
3 'side: CTTCTGCAGGCCACGGATAACAATC (SEQ ID NO: 18)
PDK4 gene amplification primers:
5 'side: GATCAGGGCAGTGACTTTCACAG (SEQ ID NO: 19)
3 'side: TCAGAGCTGAAATTTCAATGGAAAC (SEQ ID NO: 20)
Primers for MTE-1 gene amplification:
5 'side: AGTGCCTATGAAGGACTGAGGA (SEQ ID NO: 21)
3 'side: GGCAGAAAGCACCTTTACCA (SEQ ID NO: 22)
CTE-1 gene amplification primers:
5 'side: GGCTGGGAATGGAGTTTCAT (SEQ ID NO: 23)
3 'side: CCTGGCACTTTTCTTGGATAGC (SEQ ID NO: 24)
HMGCS2 gene amplification primer:
5 'side: TGTCCCCTGAGGAATTCACAGAA (SEQ ID NO: 25)
3 'side: CGATGCATCTCATCCACTCGTT (SEQ ID NO: 26)
Primers for THIO gene amplification:
5 'side: TAATTGCAGCATGGGTACACGT (SEQ ID NO: 27)
3 'side: ACCGTCCCACAGAAATGAATGT (SEQ ID NO: 28)
FAT gene amplification primers:
5 'side: GCAAAGAAGGAAAGCCTGTGT (SEQ ID NO: 29)
3 'side: GCCACAGTATAGGTACAATGT (SEQ ID NO: 30)
CYP4A gene amplification primers:
5 'side: AAAGCTCCAAGATAGTTTTCCCATC (SEQ ID NO: 31)
3 'side: CAATGATGTTCAGGCCTTGGAT (SEQ ID NO: 32)
ACO gene amplification primers:
5 'side: CTCTCTATGGGATCAGCCAGAA (SEQ ID NO: 33)
3 'side: CCACTCAAACAAGTTTTCATACACA (SEQ ID NO: 34)
MCAD gene amplification primers:
5 'side: TGCTCGCAGAAATGGCGATGA (SEQ ID NO: 35)
3 'side: CAATGTGCTCACGAGCTATGA (SEQ ID NO: 36)
UCP-2 gene amplification primers:
5 'side: TCTCCTGAAAGCCAACCTCAT (SEQ ID NO: 37)
3 'side: GCTGCTCATAGGTGACAAACAT (SEQ ID NO: 38)

また、それぞれの遺伝子発現量は、CTGATCATCCAGCAGGTGTT（配列番号39）とCCAGGAAGGCCTTGACCTTT（配列番号40）をプライマーとして用いたリアルタイムPCR解析で調べた36B4の発現量を基準として補正を行い比較した。   Each gene expression level was corrected and compared based on the expression level of 36B4 examined by real-time PCR analysis using CTGATCATCCAGCAGGTGTT (SEQ ID NO: 39) and CCAGGAAGGCCTTGACCTTT (SEQ ID NO: 40) as primers.

２週間飼育後のマウス（db/dbマウス）の小腸における遺伝子の変化を図１に、肝臓における遺伝子の変化を図２に示す。また、肝臓における脂質(TG)蓄積量を図３に示す。   FIG. 1 shows gene changes in the small intestine of mice (db / db mice) reared for 2 weeks, and FIG. 2 shows gene changes in the liver. Moreover, the amount of lipid (TG) accumulation in the liver is shown in FIG.

図１に示すように、従来指標としてきたACO、MCAD、UCP-2の発現は魚油食摂取により変化しないのに対し、ME、PDK4、MTE-1、CTE-1、HMGCS2、THIO、FAT 、CYP4Aの発現量は、魚油食摂取により有意に増加し、敏感に反応することが確認された。   As shown in Fig. 1, the expression of ACO, MCAD, and UCP-2, which have been conventionally used as indicators, does not change with fish oil intake, whereas ME, PDK4, MTE-1, CTE-1, HMGCS2, THIO, FAT, CYP4A It was confirmed that the expression level increased significantly with fish oil intake and responded sensitively.

また、肝臓では魚油食摂取により脂肪蓄積の抑制効果が認められたが（図３）、ME、PDK4、MTE-1、HMGCS2、THIOの発現量は増加しないことがわかった（図２）。   In addition, it was found that, in the liver, an effect of suppressing fat accumulation was observed by intake of fish oil diet (FIG. 3), but the expression levels of ME, PDK4, MTE-1, HMGCS2, and THIO did not increase (FIG. 2).

魚油は従来から肥満改善・脂質代謝促進効果を有する油脂であることが知られている。従って、上記試験において、小腸における上記脂質代謝関連酵素遺伝子が魚油食摂取に応答して発現量が増加することが示されたことから、これらの遺伝子は肥満改善・脂質代謝促進の指標として用いることができるといえる。   Fish oil is conventionally known to be an oil and fat having an effect of improving obesity and promoting lipid metabolism. Therefore, in the above tests, it was shown that the expression level of the above lipid metabolism-related enzyme genes in the small intestine increased in response to the intake of fish oil diet, so these genes should be used as indicators of obesity improvement and lipid metabolism promotion. Can be said.

（実施例２） 魚油食摂取後の小腸における遺伝子発現変動解析と酵素活性測定
食餌依存性肥満モデルマウス (C57BL/6、雄性、6週齢)に、前記表１に示すコントロール食（10％ TG)、又は魚油食（6％TG＋4％FO)を与えて飼育した。 (Example 2) Gene expression fluctuation analysis and enzyme activity measurement in the small intestine after ingestion of fish oil diet Diet-dependent obese model mice (C57BL / 6, male, 6 weeks old) were fed control food (10% TG) shown in Table 1 above. ) Or a fish oil diet (6% TG + 4% FO).

２週間後、実施例１と同様にして、小腸における脂質代謝関連酵素遺伝子（ME、PDK4、MTE-1、CTE-1、HMGCS2、THIO、FAT、CYP4A）と一般の脂質代謝促進の指標として用いられる遺伝子（ACO、MCAD、UCP-2）の発現量をリアルタイムPCR法にて測定した。プライマーは実施例１に示したものと同じものを使用した。   Two weeks later, in the same manner as in Example 1, lipid metabolism-related enzyme genes (ME, PDK4, MTE-1, CTE-1, HMGCS2, THIO, FAT, CYP4A) in the small intestine and used as indicators for general lipid metabolism promotion The expression level of the resulting genes (ACO, MCAD, UCP-2) was measured by real-time PCR. The same primer as shown in Example 1 was used.

また、小腸粘膜におけるβ酸化活性、リンゴ酸酵素（ME）活性を測定した。まず、幽門から15cmの部分の小腸粘膜に、粘膜100mg当り800μlのシュークロースバッファー（0.25M シュークロース、 2mM HEPES（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）、0.1mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム）を含む）を加え、ガラス製ホモジナイザーで細胞を破砕した。このホモジナイズ液を600ｘg、10分間遠心分離し、核を沈殿させて取り除いた後、得られた上清を12,500ｘg、20分間遠心分離して、ミトコンドリアを沈殿させた。こうして得られたミトコンドリア画分をβ酸化活性測定に用いた。また、前記12,500ｘg、20分間の遠心分離により得られた上清をさらに100,000ｘg、30分間遠心分離を行い、その上清を細胞質画分としてME活性測定に使用した。上記の遠心分離操作は全て4℃で行った。β酸化活性の測定は、Aoyamaらの方法(J. Biol. Chem. 1998, 5678-5684)、また、ME活性は、Biegniewskaらの方法(Comp. Biochem. Physiol. 1987, 86B, 731-735) に従って行った。   In addition, β-oxidation activity and malate enzyme (ME) activity in the small intestinal mucosa were measured. First, 800 μl of sucrose buffer (0.25 M sucrose, 2 mM HEPES (2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid), 0.1 mM) per 100 mg of mucosa on the small intestinal mucosa 15 cm from the pylorus EDTA (containing ethylenediaminetetraacetic acid dihydrogen disodium salt) was added, and the cells were disrupted with a glass homogenizer. This homogenized solution was centrifuged at 600 × g for 10 minutes to precipitate and remove nuclei, and then the resulting supernatant was centrifuged at 12,500 × g for 20 minutes to precipitate mitochondria. The mitochondrial fraction thus obtained was used for measurement of β-oxidation activity. The supernatant obtained by centrifugation at 12,500 × g for 20 minutes was further centrifuged at 100,000 × g for 30 minutes, and the supernatant was used as a cytosolic fraction for measuring ME activity. All the above centrifugation operations were performed at 4 ° C. The β-oxidation activity was measured by the method of Aoyama et al. (J. Biol. Chem. 1998, 5678-5684), and the ME activity was measured by the method of Biegniewska et al. (Comp. Biochem. Physiol. 1987, 86B, 731-735). Went according to.

２週間飼育後のマウス（C57BL/6マウス）の小腸における遺伝子の変化を図４に、小腸粘膜におけるβ酸化活性及びME活性を、それぞれ図５及び図６に示す。   FIG. 4 shows changes in genes in the small intestine of mice (C57BL / 6 mice) after 2 weeks of breeding, and FIGS. 5 and 6 show β-oxidation activity and ME activity in the mucosa of the small intestine, respectively.

図４に示すように、本実施例に示した条件下において、従来から脂質代謝促進の指標とされているACO、MCAD、UCP-2の発現亢進は、1.2倍程度の微弱なものであった。また、飼育期間を５ヶ月間継続した場合においても、ACO、MCAD、UCP-2の発現亢進は、それぞれ、1.2、1.2、1.3倍の微弱なものであった。これに対し、ME、PDK-4、MTE-1、CTE-1、HMGCS2、THIO、FAT、CYP4Aの発現量は、魚油食摂取により有意に増加し、敏感に反応することが確認された。   As shown in FIG. 4, under the conditions shown in this example, the expression enhancement of ACO, MCAD, and UCP-2, which has been conventionally used as an index for promoting lipid metabolism, was about 1.2 times weak. . In addition, even when the breeding period was continued for 5 months, the increased expression of ACO, MCAD, and UCP-2 was 1.2, 1.2, and 1.3 times weak, respectively. In contrast, the expression levels of ME, PDK-4, MTE-1, CTE-1, HMGCS2, THIO, FAT, and CYP4A were significantly increased by the intake of fish oil diet, and it was confirmed that they respond sensitively.

また、図５及び図６に示すように、魚油食摂取により小腸β酸化活性及びME活性の増加が確認された。   Moreover, as shown in FIG.5 and FIG.6, the increase in small intestine beta oxidation activity and ME activity was confirmed by fish-oil food intake.

以上の結果から、C57BL/6を用いる系においても、実施例１と同様に、上記脂質代謝関連酵素遺伝子は魚油食摂取に応答して発現量が増加し、肥満改善・脂質代謝促進の指標として用いることができることがわかった。   From the above results, in the system using C57BL / 6, as in Example 1, the expression level of the above-mentioned lipid metabolism-related enzyme gene increases in response to intake of fish oil diet, and is used as an index for improving obesity and promoting lipid metabolism. It was found that it can be used.

（実施例３）ベザフィブラート投与による小腸における遺伝子発現変動解析と酵素活性測定
肥満抵抗性健常マウス (A/Jマウス、雄性、12週齢）に、水と固形飼料を与えて飼育した。このマウスに1.25% ベザフィブラート（シグマ社製）、1.67% ウシ血清アルブミン、0.1%タウロコール酸ナトリウム、3.5%植物油を含む脂質エマルジョン溶液（フィブラート溶液）、又は、上記エマルジョン溶液の組成物の内、ベザフィブラートを含まない脂質エマルジョン溶液（コントロール）を1日につき400μl、５日間経口投与した（ぞれぞれ、フィブラート投与群、コントロール群）。各群のマウスについて、最後の経口投与の6時間後に、ジエチルエーテルによる麻酔下で開腹し、小腸を採取した。 (Example 3) Gene expression fluctuation analysis and enzyme activity measurement in the small intestine by administration of bezafibrate An obesity resistant healthy mouse (A / J mouse, male, 12 weeks old) was fed with water and solid feed. Lipid emulsion solution (fibrate solution) containing 1.25% bezafibrate (manufactured by Sigma), 1.67% bovine serum albumin, 0.1% sodium taurocholate, 3.5% vegetable oil, or bezafibrate in the composition of the emulsion solution described above. The lipid emulsion solution (control) not containing was orally administered at 400 μl per day for 5 days (respectively, fibrate administration group, control group). Each group of mice was laparotomized under anesthesia with diethyl ether 6 hours after the last oral administration, and the small intestine was collected.

実施例１と同様にして、小腸における脂質代謝関連酵素遺伝子（ME、PDK-4、MTE-1、HMGCS2、THIO、CYP4A）の発現量をリアルタイムPCR法にて測定した。プライマーは実施例１に示したものと同じものを使用した。   In the same manner as in Example 1, the expression levels of lipid metabolism-related enzyme genes (ME, PDK-4, MTE-1, HMGCS2, THIO, CYP4A) in the small intestine were measured by real-time PCR. The same primer as shown in Example 1 was used.

さらに、小腸粘膜におけるβ酸化活性、ME活性、CYP4A活性を測定した。β酸化活性、ME活性の測定に使用する画分の採取、及び測定は実施例２に記載の方法と同様にして行った。また、CYP4A活性（ω酸化活性）の測定には、ミトコンドリア沈殿採取後の上清に対する遠心分離（100,000ｘg、30分間）により得られた沈殿（ミクロソーム画分）を用いた。また、CYP4A活性の測定は、Gieraらの方法(Fundam. Appl. Toxicol. 1991, 16, 348-355)に従って行った。   Furthermore, β-oxidation activity, ME activity, and CYP4A activity in the small intestinal mucosa were measured. Fractions used for measurement of β-oxidation activity and ME activity were collected and measured in the same manner as described in Example 2. For measurement of CYP4A activity (ω oxidation activity), a precipitate (microsome fraction) obtained by centrifugation (100,000 × g, 30 minutes) of the supernatant after collecting the mitochondrial precipitate was used. The CYP4A activity was measured according to the method of Giera et al. (Fundam. Appl. Toxicol. 1991, 16, 348-355).

上記マウス（A/Jマウス）の小腸における遺伝子の変化を図７に示す。また、小腸粘膜におけるβ酸化活性、ME活性、CYP4A活性それぞれ図８、図９、図１０に示す。   FIG. 7 shows gene changes in the small intestine of the above mouse (A / J mouse). Further, β-oxidation activity, ME activity, and CYP4A activity in the small intestinal mucosa are shown in FIGS. 8, 9, and 10, respectively.

図７に示すように、ベザフィブラートの投与群において、ME、PDK-4、MTE-1、HMGCS2、THIO、CYP4Aの発現量は有意に増加していることが確認された。また、図８、９、１０に示すように、小腸粘膜におけるβ酸化活性、ME活性、CYP4A活性の増加がそれぞれ確認された。   As shown in FIG. 7, it was confirmed that the expression levels of ME, PDK-4, MTE-1, HMGCS2, THIO, and CYP4A were significantly increased in the bezafibrate administration group. In addition, as shown in FIGS. 8, 9, and 10, increases in β-oxidation activity, ME activity, and CYP4A activity in the small intestinal mucosa were confirmed, respectively.

従来の研究において、ベザフィブラート等のフィブラート系化合物は、肥満改善・脂質代謝促進効果を有することが示されている（J. Biol. Chem., 275, 16638-16642, 2000; Mol. Cell Biochem., 216, 71-78, 2001）。従って、上記試験において、小腸における上記脂質代謝関連酵素遺伝子はベザフィブラート投与に応答して発現量が増加することが示されたことから、これらの遺伝子は肥満改善・脂質代謝促進の指標として用いることができるといえる。   Previous studies have shown that fibrate compounds such as bezafibrate have an effect of improving obesity and promoting lipid metabolism (J. Biol. Chem., 275, 16638-16642, 2000; Mol. Cell Biochem., 216, 71-78, 2001). Therefore, in the above test, it was shown that the expression level of the above-mentioned lipid metabolism-related enzyme genes in the small intestine increased in response to bezafibrate administration. Therefore, these genes can be used as indicators of obesity improvement and lipid metabolism promotion. I can say that.

（実施例４） DHA存在下で培養した小腸培養組織片を用いた遺伝子発現解析
水及び固形飼料を自由に与えて飼育したC57BL/6マウス（9週齢、雄性）を用い、Mallordyらの方法(Mol. Cell. Biochem. 1993, 123, 85-92)に準じた器官培養法により、小腸脂質代謝活性評価を実施した。15時間絶食させたマウスをジエチルエーテルによる麻酔下で開腹し、空腸部（幽門より10-11,11-12,12-13 cm）の小腸片を採取した。得られた小腸片は、縦方向に切り開き、実体顕微鏡を使って漿膜を取り除いた後、粘膜を上にした状態でアルミメッシュの上に広げた。器官培養ディッシュ（イワキ株式会社製）の内側のウェルに、小腸片をのせたアルミメッシュをセットし、組織が浸る程度（0.9 ml） の培地を添加して、80% O2, 5% CO2存在下で培養した。外側のウェルには、乾燥防止のため、PBSを適当量加えた。培地には、600 μM ドコサヘキサエン酸 (DHA)又は600 μM オレイン酸と、250 μM 脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、10% NCTC-135（シグマ社製）、10%ウシ胎児血清、0.1% Fungizone、0.1mg/ml Gentamycin、25mM HEPES (2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid; pH7.5)を含むDulbecco's Modified Eagle Medium培地を用いた。 (Example 4) Gene expression analysis using small intestine cultured tissue pieces cultured in the presence of DHA Using the method of Mallordy et al. Using C57BL / 6 mice (9 weeks old, male) fed freely with water and solid feed (Mol. Cell. Biochem. 1993, 123, 85-92), the small intestinal lipid metabolic activity was evaluated by an organ culture method. Mice fasted for 15 hours were laparotomized under anesthesia with diethyl ether, and small intestine pieces of the jejunum (10-11, 11-12, 12-13 cm from the pylorus) were collected. The obtained small intestine piece was cut open in the longitudinal direction, the serosa was removed using a stereomicroscope, and then spread on an aluminum mesh with the mucous membrane facing up. Set an aluminum mesh on which small intestine pieces are placed in the inner well of an organ culture dish (manufactured by Iwaki Co., Ltd.), add medium (0.9 ml) so that the tissue is immersed, and add 80% O 2 , 5% CO 2 Cultured in the presence. An appropriate amount of PBS was added to the outer wells to prevent drying. The medium includes 600 μM docosahexaenoic acid (DHA) or 600 μM oleic acid, 250 μM fatty acid-free bovine serum albumin, 10% NCTC-135 (Sigma), 10% fetal bovine serum, 0.1% Fungizone, 0.1 mg Dulbecco's Modified Eagle Medium medium containing / ml Gentamycin and 25 mM HEPES (2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid; pH 7.5) was used.

18時間培養後、小腸片からRNA抽出試薬を用いてtotal RNAを抽出し、実施例１に記載の方法に従い、脂質代謝関連酵素遺伝子としてME、MTE-1、HMGCS2、CYP4Aの発現をリアルタイムPCR解析法により測定した。   After culturing for 18 hours, total RNA was extracted from small intestine pieces using an RNA extraction reagent, and following the method described in Example 1, real-time PCR analysis was performed for the expression of ME, MTE-1, HMGCS2, and CYP4A as lipid metabolism-related enzyme genes Measured by the method.

図１１に示すように、DHAの存在下で培養した場合は、オレイン酸の存在下で培養した場合と比較して、上記遺伝子の発現が有意に上昇していることが確認された。   As shown in FIG. 11, it was confirmed that the expression of the gene was significantly increased when cultured in the presence of DHA as compared to when cultured in the presence of oleic acid.

以上の結果から、小腸培養組織片を用いた試験系においても、上記脂質代謝関連酵素遺伝子は肥満改善・脂質代謝促進の指標として用いることができることがわかった。   From the above results, it was found that the lipid metabolism-related enzyme gene can be used as an index for improving obesity and promoting lipid metabolism even in a test system using small intestine cultured tissue pieces.

（実施例５）DHA存在下で培養した小腸培養細胞における遺伝子発現量解析
12ウェルプレートに、ウェル当たり3ｘ106個のヒト由来小腸様培養細胞Caco-2細胞（American Type Culture Collection HTB37）を播種し、10%ウシ胎児血清、１%非必須アミノ酸、2mMグルタミン酸を含むMEMアール液体培地中で培養した。細胞がコンフレントに達した後、14日間培養を行い、小腸様細胞に分化したCaco-2細胞を評価に使用した。 (Example 5) Analysis of gene expression in cultured small intestine cells in the presence of DHA
A 12-well plate is seeded with 3 × 10 6 human-derived small intestine-like cultured cells, Caco-2 cells (American Type Culture Collection HTB37), and MEM is containing 10% fetal bovine serum, 1% non-essential amino acids, and 2 mM glutamic acid. Cultured in liquid medium. After the cells reached confluence, the cells were cultured for 14 days, and Caco-2 cells differentiated into small intestine-like cells were used for evaluation.

上記の分化誘導されたCaco-2細胞を、200 μM DHA又は200μM オレイン酸と、250 μM 脂肪酸不含ウシ血清アルブミン、１%非必須アミノ酸、2mMグルタミン酸を含むMEMアール液体培地で培養した。24時間培養後、Caco-2細胞よりRNA抽出試薬を用いてtotal RNAを抽出し、実施例１に記載の方法に従い、脂質代謝関連酵素遺伝子（ME、PDK4、HMGCS2）の発現をリアルタイムPCR解析法により測定した。   The differentiation-induced Caco-2 cells were cultured in MEM Earl's liquid medium containing 200 μM DHA or 200 μM oleic acid, 250 μM fatty acid-free bovine serum albumin, 1% non-essential amino acid, and 2 mM glutamic acid. After 24 hours of culture, total RNA was extracted from Caco-2 cells using an RNA extraction reagent, and the expression of lipid metabolism-related enzyme genes (ME, PDK4, HMGCS2) was analyzed in real time according to the method described in Example 1. It was measured by.

なお、各遺伝子のPCR増幅のために用いたプライマーは以下の通りである。
ME遺伝子増幅用プライマー：
5'側：GTTATTCTTGGCCTGAAGAGGTG（配列番号41)
3'側：AGGCAAAGTGAAGCAAAATTGTC（配列番号42)
PDK4遺伝子増幅用プライマー：
5'側：GGTGGCCTAGTGTTGTGGTG（配列番号43)
3'側：ATCAGAAATG CATGAGCTGG ACTC（配列番号44)
HMGCS2遺伝子増幅用プライマー：
5'側：CGTCCCGTCTAAAGGTGTTCT（配列番号45)
3'側：CGCTAGAGATGGCTCCTCACT（配列番号46) The primers used for PCR amplification of each gene are as follows.
Primer for amplification of ME gene:
5 'side: GTTATTCTTGGCCTGAAGAGGTG (SEQ ID NO: 41)
3 'side: AGGCAAAGTGAAGCAAAATTGTC (SEQ ID NO: 42)
PDK4 gene amplification primers:
5 'side: GGTGGCCTAGTGTTGTGGTG (SEQ ID NO: 43)
3 'side: ATCAGAAATG CATGAGCTGG ACTC (SEQ ID NO: 44)
HMGCS2 gene amplification primer:
5 'side: CGTCCCGTCTAAAGGTGTTCT (SEQ ID NO: 45)
3 'side: CGCTAGAGATGGCTCCTCACT (SEQ ID NO: 46)

それぞれの遺伝子発現量は、CTGATCATCCAGCAGGTGTT（配列番号39）とCCAGGAAGGCCTTGACCTTT（配列番号40）をプライマーとして用いたリアルタイムPCR解析で調べた36B4の発現量を基準として補正を行い比較した。   Each gene expression level was corrected and compared based on the expression level of 36B4 examined by real-time PCR analysis using CTGATCATCCAGCAGGTGTT (SEQ ID NO: 39) and CCAGGAAGGCCTTGACCTTT (SEQ ID NO: 40) as primers.

図12に示すように、DHAの存在下で培養した場合は、オレイン酸の存在下で培養した場合と比較して、上記遺伝子の発現が有意に上昇していることが確認された。   As shown in FIG. 12, it was confirmed that the expression of the gene was significantly increased when cultured in the presence of DHA as compared to when cultured in the presence of oleic acid.

以上の結果から、小腸培養細胞を用いた試験系においても、上記脂質代謝関連酵素遺伝子は肥満改善・脂質代謝促進の指標として用いることができることがわかった。   From the above results, it was found that the lipid metabolism-related enzyme gene can also be used as an index for improving obesity and promoting lipid metabolism in a test system using cultured cells of the small intestine.

本発明の方法によれば、肥満改善及び／又は脂質代謝促進効果のある物質を高感度にかつ短期間で簡便にスクリーニングすることができる。従って、肥満や脂質代謝異常が原因となっている各種疾患の予防及び／又は治療用の医薬や食品の開発に有用である。   According to the method of the present invention, a substance having an effect of improving obesity and / or promoting lipid metabolism can be easily screened with high sensitivity and in a short period of time. Therefore, it is useful for the development of medicines and foods for the prevention and / or treatment of various diseases caused by obesity or abnormal lipid metabolism.

Claims (12)

次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞と接触させる工程
(b) 上記小腸培養組織又は細胞における、チトクロームP450 4A遺伝子の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を接触させない哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞における、チトクロームP450 4A遺伝子の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of bringing a test substance into contact with a mammal-derived small intestine cultured tissue or cells
(b) measuring the expression level of cytochrome P450 4A gene in the small intestine cultured tissue or cells
(c) a step of measuring the expression level of the cytochrome P450 4A gene in a cultured small intestine tissue or cell derived from a mammal not contacted with a test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c) 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程
(b) 上記非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、チトクロームP450 4A遺伝子の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を投与しない非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、チトクロームP450 4A遺伝子の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of administering a test substance to a non-human mammal
(b) measuring the expression level of cytochrome P450 4A gene in the small intestine collected from the non-human mammal
(c) measuring the expression level of the cytochrome P450 4A gene in the small intestine collected from a non-human mammal not administered with the test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c) チトクロームP450 4A遺伝子が、配列番号１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。   The screening method according to claim 1 or 2, wherein the cytochrome P450 4A gene is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 15. 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞と接触させる工程
(b) 上記小腸培養組織又は細胞における、チトクロームP450 4Aタンパク質の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を接触させない哺乳動物由来の小腸培養組織又は細胞における、チトクロ
ームP450 4Aタンパク質の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of bringing a test substance into contact with a mammal-derived small intestine cultured tissue or cells
(b) measuring the expression level of cytochrome P450 4A protein in the small intestine cultured tissue or cells
(c) a step of measuring the expression level of cytochrome P450 4A protein in a cultured small intestine tissue or cells derived from a mammal not contacted with a test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c) 次の(a)〜(d)の工程を含む、抗肥満物質のスクリーニング方法。
(a) 被験物質を非ヒト哺乳動物に投与する工程
(b) 上記非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、チトクロームP450 4Aタンパク質の発現量を測定する工程
(c) 被験物質を投与しない非ヒト哺乳動物から採取した小腸における、チトクロームP450 4Aタンパク質の発現量を測定する工程
(d) 上記(b)で測定した発現量が、上記(c)で測定した発現量より増加した被験物質を選択する工程 A method for screening an anti-obesity substance, comprising the following steps (a) to (d):
(a) A step of administering a test substance to a non-human mammal
(b) measuring the expression level of cytochrome P450 4A protein in the small intestine collected from the non-human mammal
(c) measuring the expression level of cytochrome P450 4A protein in the small intestine collected from a non-human mammal not administered with the test substance
(d) a step of selecting a test substance in which the expression level measured in (b) is higher than the expression level measured in (c) チトクロームP450 4Aタンパク質が、下記のポリペプチドのうち、少なくとも１種以上
のポリペプチドである、請求項４又は５に記載のスクリーニング方法。
(P1) 配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
(P2) 配列番号１６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、脂質代謝促進物質に応答して発現が増加するポリペプチド The screening method according to claim 4 or 5, wherein the cytochrome P450 4A protein is at least one or more of the following polypeptides.
(P1) a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16
(P2) A polypeptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16, and the expression thereof increases in response to a lipid metabolism promoting substance 前記タンパク質の発現量を、チトクロームP450 4A活性を測定することにより行なう、
請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗肥満物質のスクリーニング方法。 The expression level of the protein is measured by measuring cytochrome P450 4A activity.
The method for screening an anti-obesity substance according to any one of claims 4 to 6. 配列番号１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１５に示す塩基配列の相補配列からなる、該ポリヌクレオチドを検出するための抗肥満物質のスクリーニング用プローブ。 A probe for screening an anti-obesity substance for detecting the polynucleotide, which hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 and comprises a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 . 請求項８に記載のプローブを固定化した固定化担体。   An immobilization carrier on which the probe according to claim 8 is immobilized. 配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗肥満物質のスクリーニング用抗体。   An antibody for screening an anti-obesity substance against a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16. 配列番号１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１５に示す塩基配列の相補配列からなる、該ポリヌクレオチドを検出するためのプローブを含む、抗肥満物質のスクリーニング用キット。 An anti-obesity substance comprising a probe for detecting the polynucleotide, which hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 and comprises a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 Screening kit. 配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体と該抗体に対する
二次抗体を含む、抗肥満物質のスクリーニング用キット。 A kit for screening an anti-obesity substance, comprising an antibody against a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 and a secondary antibody against the antibody.
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