JP5174457B2 - Neisseria meningitidis lgtBLOS as an adjuvant - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、免疫賦活作用が増強された、ナイセリア属菌の(Neisserial)リポオリゴ糖(LOS)に関する。本発明のナイセリア属菌LOSは、樹状細胞上の受容体への結合性の増強を示す三糖の外部コア(outer core)を含む。前記ナイセリア属菌LOSの三糖の外部コアと毒性が低下したリピドA部分との組合せは、ワクチン製剤におけるアジュバントとして有用である。 The present invention relates to Neisserial lipooligosaccharides (LOS) with enhanced immunostimulatory activity. The Neisseria LOS of the present invention comprises a trisaccharide outer core that exhibits enhanced binding to receptors on dendritic cells. The combination of the Neisseria sp. LOS trisaccharide outer core and reduced toxicity Lipid A moiety is useful as an adjuvant in vaccine formulations.
髄膜炎菌LPS(Neisseria meningitidis LPS)は、強力なアジュバントであるだけでなく、そのLPS特異的免疫応答誘導能によっても、潜在的なワクチン候補として注目を集めている。しかし、LPSの内毒素活性のため、ワクチンにおけるその使用は今のところ限定されている。 Neisseria meningitidis LPS is attracting attention as a potential vaccine candidate not only because of its potent adjuvant, but also because of its ability to induce an LPS-specific immune response. However, due to the endotoxin activity of LPS, its use in vaccines is limited so far.
髄膜炎菌LPS(Meningococcal LPS)は、細菌の外膜に自身を固定(anchor)する疎水性リピドA部分と、細菌の表面に露出(exposed)する親水性のオリゴ糖のコアとで構成される(図1)。天然のオリゴ糖鎖は宿主の糖脂質抗原に構造的に類似しているため、ワクチン製剤に含有させることは望ましくない。LPSのオリゴ糖生合成経路の遺伝子組換えにより、切断型(truncated)オリゴ糖鎖を発現する髄膜炎菌変異体の系(series)の製造が可能となっている(図1)。LPSの内毒素及びアジュバント特性は、かかる分子のリピドA部分によって決定されると考えられる。本発明者らは先に、極めて向上した薬理学的特性を有する髄膜炎菌リピドA変異株の固有の系(unique set)を作製している。具体的には、リピドAのアシルオキシアシル化に関連するlpxL1(htrB1)遺伝子を不活化すると、ヘキサアシル化リピドAではなくペンタアシル化リピドAを発現するリピドA変異株を単離することができた。かかる変異株は、内毒素活性が低下していながら、アジュバント活性を維持していた。さらに、髄膜炎菌lpxA遺伝子の不活化により、LPSを完全に欠如する髄膜炎菌変異株も単離した。このように、髄膜炎菌LPSのオリゴ糖部分のみならず、リピドA部分の修飾によっても、髄膜炎菌ワクチンの開発における新たな可能性が拓かれた。 Meningococcal LPS consists of a hydrophobic lipid A moiety that anchors itself to the bacterial outer membrane and a hydrophilic oligosaccharide core that is exposed on the bacterial surface. (FIG. 1). Since natural oligosaccharide chains are structurally similar to host glycolipid antigens, it is undesirable to include them in vaccine formulations. Gene recombination of the oligosaccharide biosynthetic pathway of LPS makes it possible to produce a series of meningococcal mutants that express truncated oligosaccharide chains (FIG. 1). The endotoxin and adjuvant properties of LPS are thought to be determined by the lipid A portion of such molecules. The inventors have previously created a unique set of meningococcal lipid A mutants with greatly improved pharmacological properties. Specifically, when the lpxL1 (htrB1) gene associated with acyloxyacylation of lipid A was inactivated, a lipid A mutant strain expressing pentaacylated lipid A, but not hexaacylated lipid A, could be isolated. Such mutant strains maintained the adjuvant activity while reducing the endotoxin activity. In addition, a Neisseria meningitidis mutant completely lacking LPS was also isolated by inactivation of the Neisseria meningitidis lpxA gene. Thus, not only the oligosaccharide part of the meningococcal LPS but also the modification of the lipid A part has opened up new possibilities in the development of a meningococcal vaccine.
樹状細胞(DC)は、天然の感染症における免疫応答とワクチン接種に対する免疫応答との両方の開始において、その役割を果たしているため、大きな関心を集めている。細菌に対する免疫応答は、DCによって開始される。DCは、細菌性抗原を貪食して処理し、T細胞に提示する。本発明者らは近年、髄膜炎菌LPSが、ヒトDCとの相互作用の間に重要な役割を果たすことを示した。さらに、細菌の内部移行(internalization)及びDCの完全な活性化にも、LPSが必要とされる。 Dendritic cells (DC) are of great interest because they play a role in initiating both the immune response in natural infections and the immune response to vaccination. The immune response against bacteria is initiated by DC. DCs phagocytose and process bacterial antigens and present them to T cells. We have recently shown that meningococcal LPS plays an important role during interaction with human DCs. In addition, LPS is also required for bacterial internalization and complete activation of DCs.
定義
本明細書においてアジュバントとは、抗原と組み合せて用いられる場合、哺乳動物、好ましくはヒトを免疫し、免疫システムを刺激し、それにより好ましくはアジュバント自体に対する特異的免疫応答を生じさせることなく、前記抗原に対する免疫応答を誘発、増強、又は促進するあらゆる物質又は化合物を含むと定義される。好適なアジュバントは、所与の抗原に対する免疫応答を増強し、同様の但しアジュバントが非存在の条件下で前記抗原に対して生じる免疫応答に比較して、少なくとも1.5、2、2.5、5、10、又は20倍の強さに免疫応答を増強する。本技術分野においては、アジュバントによって動物又はヒトの集団に生じる、所与の抗原に対する免疫応答の統計学的な平均増強値を、対応する対照集団に照らして決定する分析法を用いることができる。前記アジュバントは、好ましくは少なくとも2つの相違する抗原に対する免疫応答増強能がある。本発明のアジュバントは通常、哺乳動物にとって外来の化合物であり、したがってインターロイキン、インターフェロン及びその他のホルモン等の、哺乳動物にとって内因性の免疫賦活化合物は除外される。
Definitions As used herein, an adjuvant, when used in combination with an antigen, immunizes a mammal, preferably a human, and stimulates the immune system, thereby preferably producing no specific immune response against the adjuvant itself, Defined as including any substance or compound that elicits, enhances or promotes an immune response to said antigen. Suitable adjuvants enhance the immune response against a given antigen, at least 1.5, 2, 2.5 compared to the immune response generated against said antigen under similar conditions but without the adjuvant. Enhances immune response to 5, 10, or 20 times stronger. In the art, analytical methods can be used that determine the statistical mean enhancement value of the immune response to a given antigen produced in an animal or human population by an adjuvant in the context of a corresponding control population. Said adjuvant is preferably capable of enhancing the immune response to at least two different antigens. The adjuvants of the present invention are usually compounds that are foreign to the mammal, thus excluding immunostimulatory compounds that are endogenous to the mammal, such as interleukins, interferons, and other hormones.
本発明は、特定の三糖の外部コア構造を有するナイセリア属菌LPSでは、ヒト樹状細胞(DC)への結合及び内部移行(internalisation)が増強するという、意外な発見に基づく。三糖を含むLPS、より厳密にいえば三糖を含むLOS(リポオリゴ糖)の結合及び内部移行は、ヒトDCに発現するC型レクチンDC−SIGN介在性であり、DCの活性化及び成熟化の速度を高める。この新規な三糖を含むナイセリア属菌LOSは、その向上した免疫賦活作用により、免疫及びワクチン接種における強力なアジュバントとして用いることができる。 The present invention is based on the surprising discovery that Neisseria LPS having a specific trisaccharide outer core structure enhances binding and internalisation to human dendritic cells (DC). Binding and internalization of LPS containing trisaccharide, more precisely LOS (lipo-oligosaccharide) containing trisaccharide is mediated by C-type lectin DC-SIGN expressed in human DC, and activation and maturation of DC Increase the speed of. This novel trisaccharide-containing Neisseria sp. LOS can be used as a powerful adjuvant in immunization and vaccination due to its improved immunostimulatory action.
すなわち本発明の第一の態様は、抗原で哺乳動物を免疫又はワクチン接種する方法であって、前記方法が、(哺乳動物に対して)抗原を投与することを含み、ナイセリア属菌LOSが、次式(I)
式(1)中、GlcNAcはD−グルコサミン、GalはD−ガラクトース、GlcはD−グルコース、HepはD−ヘプトース、KDOは3−デオキシ−D−マンノオクツロソン酸、PEAはホスホエタノールアミン、β1→4は、1位と4位との間のβ−グリコシド結合、β1→3は、1位と3位との間のβ−グリコシド結合、α1→5は、1位と5位との間のα−グリコシド結合、α1→3は、1位と3位との間のα−グリコシド結合、α1→2は、1位と2位との間のα−グリコシド結合、α2→4は、2位と4位との間のα−グリコシド結合であり、さらにPEA(3又は6)は、ホスホエタノールアミンが、ヘプトースの3位若しくは6位で結合していてもよく、又は全く存在しなくてもよいことを示している。 In the formula (1), GlcNAc is D-glucosamine, Gal is D-galactose, Glc is D-glucose, Hep is D-heptose, KDO is 3-deoxy-D-mannococtulosonic acid, PEA is phosphoethanolamine, β1 → 4 is a β-glycoside bond between the 1st and 4th positions, β1 → 3 is a β-glycoside bond between the 1st and 3rd positions, and α1 → 5 is a position between the 1st and 5th positions. Α-glycoside bond, α1 → 3 is the α-glycoside bond between the 1st and 3rd positions, α1 → 2 is the α-glycoside bond between the 1st and 2nd positions, and α2 → 4 is It is an α-glycoside bond between the 2 and 4 positions, and also PEA (3 or 6) may have phosphoethanolamine bonded at the 3 or 6 position of heptose or not present at all It shows that it may be.
すなわち本発明は、哺乳動物の免疫又はワクチン接種用の薬剤の製造における上記に定義されるナイセリア属菌LOSの使用に関する。本発明のナイセリア属菌LOSは、好ましくはアジュバントとして使用される。前記ナイセリア属菌LOSは、より好ましくは哺乳動物における抗原(又は抗原を用いたワクチンの接種)に対する免疫応答を惹起するための薬剤の製造において、抗原と組み合せて用いられる。 The invention thus relates to the use of Neisseria LOS as defined above in the manufacture of a medicament for immunization or vaccination of mammals. The Neisseria LOS of the present invention is preferably used as an adjuvant. Said Neisseria spp. LOS is more preferably used in combination with an antigen in the manufacture of a medicament for eliciting an immune response to an antigen (or vaccination with an antigen) in a mammal.
本発明の方法及び使用において、哺乳動物は好ましくはヒトであり、抗原は好ましくは細菌、ウイルス、真菌類(fungus)、寄生虫、がん細胞、若しくは下記に定義されるアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生される。前記抗原及びナイセリア属菌LOSは、細菌、ウイルス、真菌類若しくは寄生虫によって惹起される感染症、がん細胞によって生じる腫瘍、又はアレルゲンによって惹起されるアレルギーの治療及び/又は予防に用いられることが好ましい。 In the methods and uses of the present invention, the mammal is preferably a human and the antigen is preferably derived from a bacterium, virus, fungus, parasite, cancer cell, or allergen as defined below, Or produced from them. The antigen and Neisseria LOS may be used for the treatment and / or prevention of infections caused by bacteria, viruses, fungi or parasites, tumors caused by cancer cells, or allergies caused by allergens. preferable.
本発明の好適な実施形態において、本発明のナイセリア属菌LOSは、毒性が低下した、修飾されたリピドA部分(LA)を有する。かかる修飾されたLAの毒性は、好ましくは対応する野生型LAの毒性よりも低く、より好ましくは野生型LAの毒性の90、80、60、40、20、10、5、2、1、0.5又は0.2%未満である。前記野生型の毒性、及び毒性が低下した種々の修飾LAの毒性は、当技術分野で公知の適切なアッセイを用いて決定することができる。前記毒性、即ち本発明のLA又はナイセリア属菌LOSの生物活性を決定するための好適なアッセイは、MM6マクロファージ細胞株におけるTNF−アルファ誘導を調べるWEHI試験である(Espevik and Niessen, 1986, J. Immunol. Methods 95:99-105; Ziegler-Heitbrock et al., 1988, Int. J. Cancer 41:456-461)。 In a preferred embodiment of the invention, the Neisseria LOS of the invention has a modified lipid A moiety (LA) with reduced toxicity. The toxicity of such modified LA is preferably lower than that of the corresponding wild type LA, more preferably 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2, 1, 0 of the wild type LA toxicity. .5 or less than 0.2%. The toxicity of the wild type and various modified LAs with reduced toxicity can be determined using appropriate assays known in the art. A suitable assay for determining said toxicity, ie the biological activity of the LA or Neisseria LOS of the present invention, is the WEHI test examining TNF-alpha induction in the MM6 macrophage cell line (Espevik and Niessen, 1986, J. Immunol. Methods 95: 99-105; Ziegler-Heitbrock et al., 1988, Int. J. Cancer 41: 456-461).
毒性が低下したLAを有する本発明のナイセリア属菌LOSは、一方で十分な免疫賦活活性、即ちアジュバント活性を維持している。毒性が低下した本発明のナイセリア属菌LOSは、野生型LAをもった対応するナイセリア属菌LOSの、少なくとも10、20、40、80、90、又は100%の免疫賦活活性を有することが好ましく、かかる免疫賦活活性は、本明細書の実施例3に記載の少なくとも一つのサイトカインの産生又は少なくとも一つの共刺激分子の発現を測定することにより決定される。 The Neisseria LOS of the present invention having LA with reduced toxicity, on the other hand, maintains sufficient immunostimulatory activity, ie, adjuvant activity. The Neisseria spp. LOS of the present invention with reduced toxicity preferably has at least 10, 20, 40, 80, 90, or 100% immunostimulatory activity of the corresponding Neisseria spp. LOS with wild-type LA. Such immunostimulatory activity is determined by measuring the production of at least one cytokine or the expression of at least one costimulatory molecule as described in Example 3 herein.
毒性が低下したリピドA部分を有する、但しアジュバント特性を(部分的に)維持するナイセリア属菌LOSは、例えばWO02/09746に概説される遺伝的に改変したグラム陰性病原菌から得ることができる。毒性が低下したLAを有するナイセリア属菌LOSの好適な例として具体的には、(a)lpxL1遺伝子及びlpxL2遺伝子(以前の呼称はhtrB遺伝子及びmsbB遺伝子)又はそれらの相同体の、1又は2以上の発現を低下又は不活化する変異を有するナイセリア属菌株から得ることができるリピドA部分を有するLOS(例えばEP1,127,137及びUS5,997,881参照)、(b)アシルオキシ加水分解酵素(acyloxyhydrolase)を用いた処理又はアルカリ加水分解処理により、野生型リピドA部分から1又は2以上の二級O結合型エステル化脂肪酸を除去することにより得ることができるリピドA部分を有するLOS(US5,103,661及びErwin et al., 1991, Infect, Immun, 59:1881-87)、(c)野生型リピドA部分をヒドラジン処理することにより得ることができるリピドA部分を有するLOS(Gu et al., 1996, Infect. Immun. 64:4047-53、Polotsky et al., 1994, Infect Immun, 62:210-14、及びGu et al., 1998, Infect, Immun, 66:1891-97, 1998)、(d)アルカリホスファターゼを用いてリピドA部分を脱リン酸化することにより得ることができるリピドA部分を有するLOS(US6,290,952)、及び(e)非相同の(heterologous)lpxE遺伝子又はpagL遺伝子が発現しているナイセリア属菌宿主において産生されたLOSを酵素的に脱リン酸化又は脱アシル化することにより得ることができるLOSが挙げられる。本明細書において発現の低下とは、対応する野生型菌株と比較した場合の増減を意味すると理解され、発現レベルは、好ましくは対応する野生型菌株と、少なくとも2倍、5倍又は10倍相違する。
Neisseria LOS having a lipid A portion with reduced toxicity but maintaining (partially) adjuvant properties can be obtained from genetically modified Gram-negative pathogens outlined in, for example,
したがって、毒性が低下した好適なLAとしては、還元グルコサミンにのみ二級C12−アシルを有するLA、非還元グルコサミンにのみ二級C12−アシルを有するLA、いずれの二級C12−アシル基も欠如するLA、1又は4’位のいずれかで、1又は2以上のリン酸基を欠如するLA、及び上記脱アシル化と脱リン酸化との組合せを有するLAが挙げられる。 Thus, suitable LA toxicity is decreased, only secondary C 12 to the reducing glucosamine - LA having an acyl, non-reducing glucosamine only secondary C 12 - LA having an acyl, any secondary C 12 - acyl group LA that also lacks, LA that lacks one or more phosphate groups at either the 1 or 4 ′ position, and LA that has a combination of the above deacylation and dephosphorylation.
さらなる態様において本発明は、次式(I)
本発明のさらに別の態様は、本明細書において上記に定義したナイセリア属菌LOSと薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。前記組成物は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、がん細胞、若しくはアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生される抗原をさらに含むことが好ましい。前記医薬組成物は、薬学的に許容される安定化剤、浸透圧薬剤(osmotic agent)、緩衝剤、分散剤等をさらに含む場合がある。前記医薬組成物の好適な形態は、所望の投与方法及び治療の用途によって決まる。前記医薬用担体は、有効成分、即ちナイセリア属菌LOS及び抗原を患者に投与(deliver)するのに適した相溶性(compatible)かつ無毒な物質であれば、どのようなものでもよい。鼻腔内投与用の薬学的に許容される担体の例としては、水、緩衝生理食塩水、グリセリン、ポリソルベート20(polysorbate 20)、クレモフォルEL(cremophor EL)、カプリル酸/カプリン酸グリセリドの混合水溶液を挙げることができ、中性のpH環境をもたらすために、緩衝液で処理してもよい。非経口投与用の薬学的に許容される担体の例としては、必要に応じて20%のアルブミンを添加した0.9%の塩化ナトリウム無菌緩衝液又は5%のグルコース緩衝液が挙げられる。非経口投与用の調製剤は、無菌でなくてはならない。周知の方法による有効成分の非経口の投与経路としては、例えば皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内若しくは病巣内の経路による注射又は注入が挙げられる。本発明の組成物は、好ましくはボーラス注入法(bolus injection)により投与される。筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は、例えば1〜10mlのリン酸緩衝生理食塩水、1〜100μg、好ましくは15〜45μgの抗原、及び1〜100μg、好ましくは15〜45μgの本発明のナイセリア属菌LOSを含有する。経口投与の場合、有効成分は、エリキシル剤、シロップ剤、及び懸濁剤等の液剤の形態で投与することができる。経口投与用の液剤は、患者の許容性を高めるために、着色剤及び香料を含有させることができる。非経口、経口、又は鼻腔内投与が可能な組成物の調製方法は、当技術分野で周知であり、例えばRemington’s Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)(参照により該文献全体を本明細書に援用する)を含む各種の出典に詳細が記載されている。
Yet another aspect of the present invention relates to a composition comprising a Neisseria LOS as defined herein above and a pharmaceutically acceptable carrier. Preferably, the composition further comprises an antigen derived from or produced from bacteria, viruses, fungi, parasites, cancer cells, or allergens. The pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable stabilizer, an osmotic agent, a buffer, a dispersant and the like. The preferred form of the pharmaceutical composition depends on the desired mode of administration and therapeutic application. The pharmaceutical carrier may be any compatible and non-toxic substance suitable for delivering active ingredients, namely Neisseria LOS and antigen, to a patient. Examples of pharmaceutically acceptable carriers for intranasal administration include water, buffered saline, glycerin,
本発明の組成物における抗原は、細菌、ウイルス、真菌類、寄生虫、がん細胞、若しくはアレルゲンに由来するか、又はそれらから産生される抗原であることが好ましい。本発明のナイセリア属菌LOSと組み合せることができるウイルス抗原は、あらゆるウイルスから得ることができる。限定するものではないが、前記ウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)等のレトロウイルス科と、風疹ウイルスと、インフルエンザウイルス、麻疹、流行性耳下炎、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタ肺炎ウイルス等のパラミクソウイルス科と、黄熱病ウイルス、デング・ウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ダニ媒介脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、又は西ナイルウイルス等のフラビ・ウイルス科(flaviviridae)と、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス等のヘルペスウイルス科(herpesviridae)と、ブニヤウイルス科と、アレナウイルス科と、ハンターン等のハンタウイルス科と、コロナウイルス科と、ヒト乳頭腫ウイルス等のパポバウイルス科と、狂犬病ウイルス等のラブドウイルス科と、ヒトコロナウイルス等のコロナウイルス科と、アルファウイルス科と、アルテリウイルス科と、エボラウイルス等のフィロウイルス科と、アレナウイルス科と、天然痘ウイルス等のポックスウイルス科と、アフリカブタ熱ウイルスとが挙げられる。同様に、本発明のナイセリア属菌LOSは、病原菌、(酵母を含む)真菌類、又は寄生虫由来の抗原と組み合せる場合がある。かかる抗原としては、例えば、ヘリコバクター・ピロリ等のヘリコバクター属、髄膜炎菌等のナイセリア属、ヘモフィルス・インフルエンザ等のヘモフィルス属、百日咳菌等のボルデテラ属、クラミジア属、A血清型レンサ球菌(streptococcus sp. serotype A)等のストレプトコッカス属、ビブリオ・コレラ等のビブリオ属、例えばサルモネラ属、シゲラ属、カンピロバクター属、及びエシェリキア属等を含むグラム陰性腸内病原菌の細菌性抗原、並びに炭疽病、ハンセン病、結核、ジフテリア、ライム病、梅毒、腸チフス、及び淋病の原因菌由来の抗原が挙げられる。寄生虫由来の抗原としては例えば、バベオシス・ボビス(Babeosis bovis)、プラズモディウム属、リーシュマニア属、トキソプラズマ原虫、及びクルーズ・トリパノソーマ等のトリパノソーマ属等の原生動物が挙げられる。真菌類の抗原としては、アスペルギルス属、カンジダ・アルビカンス、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス等のクリプトコッカス属、及びヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)といった真菌類由来の抗原を挙げることができる。 The antigen in the composition of the present invention is preferably an antigen derived from or produced from bacteria, viruses, fungi, parasites, cancer cells, or allergens. Viral antigens that can be combined with the Neisseria LOS of the present invention can be obtained from any virus. Examples of the virus include, but are not limited to, retroviridae such as human immunodeficiency virus (HIV), rubella virus, influenza virus, measles, mumps, respiratory syncytial virus, human metabolite Paramyxoviridae such as pneumonia virus and flavis such as yellow fever virus, dengue virus, hepatitis C virus (HCV), Japanese encephalitis virus (JEV), tick-borne encephalitis virus, St. Louis encephalitis virus or West Nile virus Viridae (flaviviridae), Herpesviridae (herpesviridae) such as herpes simplex virus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, Bunyaviridae, Arenaviridae, Hantaviridae such as hunter, and coronavirus And papobau of human papilloma virus Irsidae, Rhabdoviridae such as rabies virus, Coronaviridae such as human coronavirus, Alphaviridae, Arteriviridae, Filoviridae such as Ebola virus, Arenavirus, and smallpox virus Poxviridae and African swine fever virus. Similarly, the Neisseria LOS of the present invention may be combined with antigens from pathogenic bacteria, fungi (including yeast), or parasites. Examples of the antigen include Helicobacter genus such as Helicobacter pylori, Neisseria genus such as Neisseria meningitidis, Haemophilus genus such as Haemophilus influenza, Bordetella genus such as Bordetella pertussis, Chlamydia genus, Streptococcus sp. bacterial antigens of Gram-negative enteric pathogens including Streptococcus genus such as serotype A), Vibrio genus such as Vibrio cholera, Salmonella genus, Shigella genus, Campylobacter genus and Escherichia genus, and anthrax, leprosy, tuberculosis , Antigens from causative bacteria of diphtheria, Lyme disease, syphilis, typhoid, and gonorrhea. Parasite-derived antigens include, for example, protozoa such as Babesis bovis, Plasmodium, Leishmania, Toxoplasma gondii, and Trypanosoma such as Cruise Trypanosoma. Examples of fungal antigens include antigens derived from fungi such as Aspergillus, Candida albicans, Cryptococcus genus such as Cryptococcus neoformans, and Histoplasma capsulatum.
ワクチン接種は通常、病原菌に対する予防的防御、又は病原性感染症に引き続く疾患の治療に適用されるが、ワクチンが腫瘍の治療に適用されることも当業者には周知である。さらに、ヒト又はヒト化された抗体により標的とされ得る適切な存在(entity)として、多くの腫瘍特異的タンパク質が見い出されている。かかる腫瘍特異的タンパク質もまた、本発明の範囲に含まれる。当技術分野においては、多くの腫瘍特異的抗原が周知である。したがって、一つの好適な実施形態において本発明は、腫瘍特異的抗原と上記に定義したナイセリア属菌LOSとを含む組成物を提供する。適切な腫瘍抗原としては例えば、がん胎児性抗原、前立腺特異的膜抗原、前立腺特異的抗原、MZ2−Eタンパク質、多形上皮性ムチン(PEM)、葉酸結合タンパク質LK26、切断型(truncated)表皮増殖因子受容体(EGRF)、HER2、Thomasen-Friedenreich (T) 抗原、GM−2及びGD2ガングリオシド、Ep−CAM、ムチン−1、上皮糖タンパク質−2、及び結腸特異的抗原(colon specific antigen)が挙げられる。 Vaccination is usually applied to preventive protection against pathogenic bacteria or treatment of diseases following pathogenic infections, but it is also well known to those skilled in the art that vaccines are applied to the treatment of tumors. In addition, many tumor-specific proteins have been found as suitable entities that can be targeted by human or humanized antibodies. Such tumor specific proteins are also included within the scope of the present invention. Many tumor-specific antigens are well known in the art. Accordingly, in one preferred embodiment, the present invention provides a composition comprising a tumor specific antigen and a Neisseria sp. LOS as defined above. Suitable tumor antigens include, for example, carcinoembryonic antigen, prostate specific membrane antigen, prostate specific antigen, MZ2-E protein, polymorphic epithelial mucin (PEM), folate binding protein LK26, truncated epidermis Growth factor receptor (EGRF), HER2, Thomasen-Friedenreich (T) antigen, GM-2 and GD2 ganglioside, Ep-CAM, mucin-1, epithelial glycoprotein-2, and colon specific antigen Can be mentioned.
さらに自己免疫疾患の予防において寛容を誘導するために、樹状細胞を抗原の標的とすることもできる。かかるアレルゲンもまた、本発明の範囲に含まれる。 Furthermore, dendritic cells can be targeted by antigens in order to induce tolerance in the prevention of autoimmune diseases. Such allergens are also included within the scope of the present invention.
本発明の別の態様は、上記に定義されたナイセリア属菌LOSの製造方法に関する。好適な方法は、(a)免疫型L2、L3、若しくはL4のナイセリア属菌LOSを発現し、且つ活性のlgtB遺伝子を欠如する髄膜炎菌株、又は免疫型L6のナイセリア属菌LOSを発現する髄膜炎菌株であって、加えて1又は2以上のlpxL1遺伝子若しくはlpxL2遺伝子又はそれらの相同体の発現を不活化又は低減する変異を有する髄膜炎菌株を培養するステップと、(b)前記ナイセリア属菌LOSを回収するステップとを含む。別法として前記方法は、(a)免疫型L2、L3、若しくはL4のナイセリア属菌LOSを発現し、且つ活性のlgtB遺伝子を欠如する髄膜炎菌株、又は、免疫型L6のナイセリア属菌LOSを発現する髄膜炎菌株を培養するステップと、(b)前記ナイセリア属菌LOSを回収するステップと、(c)ヒドラジン、アルカリホスファターゼ、又はアシルオキシ加水分解酵素からなる群から選択される少なくとも1つを用いてナイセリア属菌LOSを処理し、リピドA部分の毒性を低下させるステップとを含む。前記方法において、ステップ(b)及びステップ(c)の順番を入れ替える場合がある。好適な方法では、ステップ(c)において毒性は、上記のWEHIアッセイで決定された、野生型ナイセリア属菌LOSの毒性の80%未満まで低下する。 Another aspect of the present invention relates to a method for producing the Neisseria LOS defined above. Preferred methods are: (a) expressing an immunotype L2, L3, or L4 Neisseria LOS and a meningococcal strain lacking an active lgtB gene, or an immunotype L6 Neisseria LOS Culturing a meningococcal strain additionally having a mutation that inactivates or reduces the expression of one or more lpxL1 gene or lpxL2 gene or homologues thereof, (b) Recovering Neisseria LOS. Alternatively, the method may comprise: (a) a Neisseria spp. LOS expressing an immunotype L2, L3, or L4 and lacking an active lgtB gene, or a Neisseria spp. LOS of immunotype L6 At least one selected from the group consisting of: (b) recovering the Neisseria spp. LOS; (c) hydrazine, alkaline phosphatase, or acyloxyhydrolase Treating the Neisseria genus LOS with a reducing the toxicity of the lipid A moiety. In the method, the order of step (b) and step (c) may be changed. In a preferred method, toxicity in step (c) is reduced to less than 80% of the toxicity of wild type Neisseria LOS as determined in the WEHI assay described above.
本発明のさらに別の態様は、上記に定義したナイセリア属菌LOSを含むグラム陰性OMV(外膜小胞)又はブレブ(blebs)に関する。グラム陰性OMV又はブレブの製造手段及び方法は、WO02/09746に記載されている。このようにして得られたグラム陰性ブレブを本発明のナイセリア属菌LOSと組み合せ、ナイセリア属菌LOSを含むグラム陰性ブレブを製造することができる。別法として前記ブレブは、上記に定義した、本発明のナイセリア属菌LOSを産生する能力を有するナイセリア株から製造される場合がある。ナイセリア属菌LOSを含むグラム陰性ブレブは、上記の抗原及び/又は上記の薬学的に許容される担体とさらに組み合せる場合がある。 Yet another aspect of the invention relates to a Gram negative OMV (outer membrane vesicle) or blebs comprising a Neisseria LOS as defined above. Means and methods for producing Gram negative OMVs or blebs are described in WO 02/09746. The gram negative bleb thus obtained can be combined with the Neisseria sp. LOS of the present invention to produce a Gram negative bleb containing the Neisseria sp. LOS. Alternatively, the bleb may be produced from a Neisseria strain having the ability to produce the Neisseria LOS of the present invention as defined above. Gram negative blebs containing Neisseria spp. LOS may be further combined with the antigen and / or the pharmaceutically acceptable carrier.
1 材料及び方法
1.1 菌株
先に記載の髄膜炎菌野生株(WT)H44/76集団Bからオリゴ糖のコア変異体及びリピドA変異体を得た。
1 Materials and Methods 1.1 Strains Oligosaccharide core mutants and lipid A mutants were obtained from the meningococcal wild strain (WT) H44 / 76 population B described above.
本研究において用いたオリゴ糖のコア変異体の構造を、図1に示す。菌株は全て、6%のCO2を含む空気の雰囲気下で、ビトックス(英国ベージングストーク、Oxoid社製)を添加した淋菌寒天培地(英国ベージングストーク、Difco社製)において、36℃で増殖させた。前記細菌は、18時間培養した後の静止期で使用した。フェノールレッド不含RPMI1640培地(英国ペーズリー、Gibco社製)で細菌を懸濁し、その吸光度を540nmで測定した。吸光度1は、1ml当たり109の微生物に相当すると算出された。0.5%のパラホルムアルデヒド(PFA)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に細菌を15分間固定し、RPMI培地で十分に洗浄した。0.5mg/mlのFITC(英国プール、Sigma社製)を用いて37℃で20分間インキュベートし、その後十分に洗浄し、FITC標識細菌を調製した。
The structure of the oligosaccharide core mutant used in this study is shown in FIG. All strains were grown at 36 ° C. on an aspergillus agar medium (Baging Stoke, UK, manufactured by Difco) supplemented with Vitox (Baging Stoke, UK, manufactured by Oxoid) under an air atmosphere containing 6% CO 2. I let you. The bacteria were used in the stationary phase after 18 hours of culture. Bacteria were suspended in a phenol red-free RPMI 1640 medium (Paisley, UK, manufactured by Gibco), and the absorbance was measured at 540 nm.
1.2 細胞
先に記載のように、ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)からDCを製造した(F. Sallusto and A. Lanzavecchia, 1994, J. Exp. Med. 179:1109-1118; H. Uronen-Hansson et al., 2004, Immunology 111: 173-178)。簡潔にいえば、多段パーコール勾配遠心法により、PBMCから単球を調製した。かかる単球の画分は、>95%CD14+/CD3−/CD19−であった。10%の加熱不活化FCS、2.4mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン−ストレプトマイシン(全て英国ペーズリー、Gibco社製)、100ng/mlのヒト組換えGM−CSF及び50ng/mlのヒト組換えIL4(英国ハーツ、ウェルウィンガーデンシティ、Schering-Plough社製、)を添加したRPMIにて単球を7日間インキュベートし、DCを作出した。このようにして調製した未成熟DCは、CD14low、CD83−ve、CD86low、CD25−veであった。これらのCDはまた、HLA、DR、HLA、DQ、HLAクラスI、CD40及びCD1aを発現し、CD19及びCD3の両方については陰性であった。
1.2 Cells DCs were prepared from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) as previously described (F. Sallusto and A. Lanzavecchia, 1994, J. Exp. Med. 179: 1109-1118; H Uronen-Hansson et al., 2004, Immunology 111: 173-178). Briefly, monocytes were prepared from PBMC by multi-stage Percoll gradient centrifugation. The fraction of such monocytes was> 95% CD14 + / CD3- / CD19-. 10% heat inactivated FCS, 2.4 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin-streptomycin (all from Paisley, UK, Gibco), 100 ng / ml human recombinant GM-CSF and 50 ng / ml human population Monocytes were incubated for 7 days in RPMI supplemented with IL4 (Hearts, Welwyn Garden City, UK, manufactured by Schering-Plough) to produce DC. The immature DCs prepared in this way were CD14 low , CD83- ve , CD86 low , CD25- ve . These CDs also expressed HLA, DR, HLA, DQ, HLA class I, CD40 and CD1a, and were negative for both CD19 and CD3.
10%FCSを添加したRPMI1640にて、(図面の説明に述べるように)DC/細菌比率1:50及び1:200で、5×105/mlの濃度のDCを髄膜炎菌H44/76菌体とともに培養した。細胞内サイトカインの測定時に、10μg/mLのタンパク質輸送阻害剤ブレフェルディンA(英国プール、Sigma社製)を添加した。 In RPMI 1640 supplemented with 10% FCS, DC at a concentration of 5 × 10 5 / ml at a DC / bacterial ratio of 1:50 and 1: 200 (as described in the figure description) was meningococcal H44 / 76. It was cultured with the cells. When measuring intracellular cytokines, 10 μg / mL protein transport inhibitor Brefeldin A (Pool, UK, Sigma) was added.
未成熟DCを、20μg/mlの抗DC−SIGN mAb AZN−D1と共に37℃で30分間インキュベートし、その後、野生型細菌及び変異細菌と共に37℃で45分間インキュベートすることにより、lgtB変異細菌のDCに対する結合特異性を検討した。 Immature DCs were incubated with 20 μg / ml anti-DC-SIGN mAb AZN-D1 for 30 minutes at 37 ° C., followed by incubation with wild type and mutant bacteria for 45 minutes at 37 ° C. The binding specificity for was investigated.
1.3 DCへの結合及び内部移行
DCに対する細菌の結合及び内部移行は、フローサイトメトリー法と共焦点顕微鏡法とを併用して検討した。フローサイトメトリー法による検出では、DCをFITC標識細菌とともに30分〜24時間の間で異なる時間インキュベートし、FACSFix(Becton Dickinson社製)に固定し、FACSカリバー上で洗浄及び解析した。ゲートをかけたDC集団(DC gated population)では、細菌が結合したDCは、蛍光により容易に同定できた。共焦点顕微鏡法では、FITCで標識した髄膜炎菌で刺激したDCを、接着スライド(adhesion slide)(英国ハーツBio-Rado Laboratories 社製)に10分間置き接着させた。内部移行を停止させるため、4%のPFAで10分間DCを固定した。5μg/mlの抗MHCクラスIIモノクローナル抗体(デンマーク、グロストラップ、Dako社製)で染色し、DCを視覚化した。洗浄後、結合した抗体について、テキサスレッドコンジュゲートヤギ抗マウス抗体(Molecular probes社製)5μg/mlで1時間の検出を行った。前記スライドを洗浄し、Citifluor(英国、Citifluor社製)に配置した。適切なフィルターセットを備えた、ライカSP2共焦点レーザー走査顕微鏡システム(英国ミルトンキーンズ、Leica社製)を用い、共焦点画像を得た。細胞内細菌を同定するため、ライカ共焦点画像ソフトウェアを用いてDC全域の15〜20の光学切片(0.2〜0.5μm)を写し、重ね合わせた。
1.3 Binding to DC and internalization Bacterial binding to DC and internalization were examined using a combination of flow cytometry and confocal microscopy. For detection by flow cytometry, DCs were incubated with FITC-labeled bacteria for different times between 30 minutes and 24 hours, fixed on FACSFix (Becton Dickinson), washed and analyzed on a FACS caliber. In a gated DC population, bacteria-bound DC could be easily identified by fluorescence. In confocal microscopy, DC stimulated with FITC-labeled meningococci were placed on an adhesion slide (manufactured by Hertz Bio-Rado Laboratories, UK) for 10 minutes and allowed to adhere. To stop internalization, DC was fixed with 4% PFA for 10 minutes. DCs were visualized by staining with 5 μg / ml anti-MHC class II monoclonal antibody (Grostrap, Denmark, Dako). After washing, the bound antibody was detected with Texas Red conjugate goat anti-mouse antibody (Molecular probes) at 5 μg / ml for 1 hour. The slide was washed and placed in Citifluor (Citifluor, UK). Confocal images were obtained using a Leica SP2 confocal laser scanning microscope system (Leica, Milton Keynes, UK) equipped with an appropriate filter set. In order to identify intracellular bacteria, 15-20 optical sections (0.2-0.5 μm) across the DC were copied and superimposed using Leica confocal imaging software.
1.4 サイトカイン測定
細胞内のサイトカイン産生を測定するため、4%のPFAを含むPBSでDCを固定し、0.1%のアジ化ナトリウム及び0.5%のBSA(全てSigma社製)を含有するPBS中で洗浄し、25μlの浸透化溶液(Caltag社製)で浸透処理した。次に細胞を、抗TNF−αモノクローナル抗体(英国オックスフォード、Becton Dickinson社製)及びIL−12 p40/70(Pharmingen社製)又はアイソタイプ(isotype)が適合する対照を用いて室温の暗室で30分間インキュベートした。続いてPBS中で前記細胞を2回洗浄し、セルフィックス(CellFix(Becton Dickinson社製))中で固定し、セル・クエスト・ソフトウェア(Cell Quest Software(Becton Dickinson社製))を用いてFACSカリバー上でフローサイトメトリー法により解析した。DCは、前方及び右方向(forward and right angle)の分散によって同定される顕著な集団を構成した。かかる集団の細胞の少なくとも95%は、MHCII、CD1a、CD25、CD80、CD83及びCD86の発現によりDCと確定した。DCに対応するゲートにおいて、少なくとも3000のイベント(event)についてデータ収集して解析した。可溶性サイトカインのELISAアッセイのため、ヒトIL−12、TNF−α、IL−10、IL6及びIL1βについて、サイトセット(CytoSets(商標))ELISAキット(ベルギー、ニベル、Biosource Europe S.A. 社製)を製造元の取扱説明書に従って用いた。
1.4 Cytokine measurement To measure intracellular cytokine production, DCs were fixed with PBS containing 4% PFA, 0.1% sodium azide and 0.5% BSA (all manufactured by Sigma) were added. It was washed in the contained PBS, and permeabilized with 25 μl of permeabilizing solution (Caltag). The cells are then incubated for 30 minutes in a dark room at room temperature with an anti-TNF-α monoclonal antibody (Oxford, UK, Becton Dickinson) and IL-12 p40 / 70 (Pharmingen) or isotype matched controls. Incubated. Subsequently, the cells were washed twice in PBS, fixed in Cellfix (CellFix (Becton Dickinson)), and FACS Caliber using Cell Quest Software (Cell Quest Software (Becton Dickinson)). The above was analyzed by flow cytometry. DC constituted a prominent population identified by variance in the forward and right angles. At least 95% of the cells of this population were determined to be DC by expression of MHCII, CD1a, CD25, CD80, CD83 and CD86. Data was collected and analyzed for at least 3000 events at the gate corresponding to DC. Manufacturer of CytoSets ™ ELISA kit (manufactured by Biosource Europe SA, Belgium) for human IL-12, TNF-α, IL-10, IL6 and IL1β for soluble cytokine ELISA assays Used according to the instruction manual.
1.5 可溶性C型レクチンFc接着アッセイ
C型レクチンFc分子は、COOH末端においてヒトIgG1−Fc断片に融合するC型レクチン受容体(DC−SIGN、MGL及びデクチン−1B)の細胞外部分からなる(T. Geijtenbeek et al., 2003, J. Exp. Med. 197:7-17)。可溶性C型レクチンFc接着アッセイを次のように行った。全ての細胞(OD540=0.1)を、室温で18時間、ELISAプレート(100μl/ウェル)上にコーティングした。次に1%のBSAを用い、37℃で30分間ブロッキングした。可溶性C型レクチンFcの上清を添加し、室温に2時間置いた。結合していないC型レクチンFcを洗い流し、抗IgG1抗体を用い、ELIZA法で結合を測定した。
1.5 Soluble C-type lectin Fc adhesion assay The C-type lectin Fc molecule consists of the extracellular portion of a C-type lectin receptor (DC-SIGN, MGL and Dectin-1B) fused to a human IgG1-Fc fragment at the COOH terminus ( T. Geijtenbeek et al., 2003, J. Exp. Med. 197: 7-17). Soluble C-type lectin Fc adhesion assay was performed as follows. All cells (OD540 = 0.1) were coated on ELISA plates (100 μl / well) for 18 hours at room temperature. Next, 1% BSA was used and blocked at 37 ° C. for 30 minutes. Soluble C-type lectin Fc supernatant was added and placed at room temperature for 2 hours. Unbound C-type lectin Fc was washed away, and binding was measured by an ELIZA method using an anti-IgG1 antibody.
1.6 DCによるTh1/Th2の分化
10%のFCS(ベルギー、ベルビエ、Bio Withaker社製)、500U/mlのIL−4及び800U/mlのGM−CSF(共にSchering-Plough社製)を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地(Gibco社製)において、健常ドナーの単球からDCを培養した。6日目に、感染多重度10で、髄膜炎菌野生株及びlgtB変異株を用いてDCの成熟を誘導した。(i)混合Th1/Th2反応アッセイでは、10ng/mlの大腸菌LPS(ミズーリ州セントルイス、Sigma-Aldrich社製)(ii)Th1の分化アッセイでは、20μg/mlのpolyI:C(Sigma-Aldrich社製)、及び(iii)Th2の分化アッセイでは、10μg/mlのPEG2、10ng/mlのLPS(Sigma-Aldrich社製)を陽性対照(positive control)として用いた。2日目に、フローサイトメトリー法により、DCの成熟マーカー(CD80、CD83、CD86及びHLA−DR)を解析した。T細胞の分化を評価するため、成熟DCを、CD45RA+/CD4+T細胞とともにインキュベートした(5.103T細胞/20.103DC)。12〜15日目に、10ng/mlのPMA(Sigma-Aldrich社製)及び1μg/mlのイオノマイシン(Sigma-Aldrich社製)で、静止T細胞を6時間再刺激した。1時間後、前記T細胞に10μg/mlのブレフェルディンA(Sigma-Aldrich社製)を添加した。IL−4及びIFN−γの単一細胞産生を、細胞内フローサイトメトリー解析で測定した。細胞を2%のPFA中で固定し、0.5%のサポニン(Sigma-Aldrich社製)で浸透処理し、抗ヒトIFN−γ−FITC及び抗ヒトIL−4−PE(カルフォルニア州サンディエゴ、Becton Dickinson Pharmigen社製)で染色した。
1.6 Differentiation of Th1 / Th2 with
髄膜炎菌のオリゴ糖コア変異株の樹状細胞への結合及び内部移行
フローサイトメトリー法を用い、髄膜炎菌野生株、オリゴ糖変異株、及びLPS欠損変異株のヒトDCへの結合及び内部移行について調べた。未成熟DCを、髄膜炎菌野生株H44/76由来のFITC標識変異株とともに、DC/細菌比率1:50(図2)及び1:200(データ示さず)で共培養し、DCに結合したFITC標識細菌の存在を、FACSにより解析した。野生株及びオリゴ糖変異株の両方について、時間及び用量依存的なDCとの結合が観察された。LPS欠損変異株については、時間経過の最初の6時間において、DCとの結合がほとんど見られなかった。lgtB変異株はどちらの濃度でも一貫して、野生株又はgalE変異株よりも、DCへの結合性が高かった。
Binding and internalization of meningococcal oligosaccharide core mutants to dendritic cells Using flow cytometry, binding of wild meningococcal strains, oligosaccharide mutants, and LPS-deficient mutants to human DCs And internalization were investigated. Immature DCs are co-cultured with FITC-labeled mutants from Neisseria meningitidis wild strain H44 / 76 at DC / bacterial ratios 1:50 (FIG. 2) and 1: 200 (data not shown) and bind to DCs The presence of the FITC-labeled bacteria was analyzed by FACS. For both wild-type and oligosaccharide mutants, time- and dose-dependent binding to DC was observed. The LPS-deficient mutant showed almost no binding to DC in the first 6 hours of the time course. The lgtB mutant was consistently more binding to DC than the wild or galE mutant at both concentrations.
次に、細菌の結合と内部移行とを区別するために、共焦点顕微鏡を用い、髄膜炎菌野生株及び変異株のDCへの内部移行について検討した(データは示さず)。FITC細菌は、スライド上で緑色の小粒子として容易に認めることができた。DCを可視化するために、MHCクラスIIによる染色を用いた。大部分のDCでは、1時間のインキュベート後すでに、野生型細菌又はgalE変異細菌に比較してより多くのlgtBが内部移行していた。LPS欠損変異細菌については、ほとんど内部移行がみられなかった。lgtB変異細菌については、高レベルの内部移行に加え、時間的経過中を通じて、高い表面接着を維持するのが典型であった。これらの結果は、FACSによる結果、即ちDCに対する細菌の結合性の増強は、細菌の内部移行の増強をもたらすという結果を裏付けるものである。 Next, in order to distinguish between bacterial binding and internalization, confocal microscopy was used to examine internalization of Neisseria meningitidis wild type and mutant strains into DC (data not shown). FITC bacteria could be easily recognized as small green particles on the slide. Staining with MHC class II was used to visualize DCs. Most DCs had already internalized more lgtB after 1 hour incubation compared to wild type or galE mutant bacteria. Almost no internalization was observed for LPS-deficient mutant bacteria. For lgtB mutant bacteria, it was typical to maintain high surface adhesion over time, in addition to high levels of internalization. These results support the results from FACS, ie, that enhanced bacterial binding to DC results in enhanced bacterial internalization.
髄膜炎菌変異株に対する応答としてのDCの活性化及び成熟化
細菌の内部移行とサイトカイン産生との関係について検討するため、野生株及び変異株に対する応答として樹状細胞が産生したIL12及びTNF−αについて細胞内測定を行い、内部移行について一斉分析(simultaneous analysis)した(図3)。DCを、1:50の比率でFITC標識細菌とともに18時間共培養し、次にTNF−α及びIL12の細胞内産生を調べるために染色した。FITC細菌が結合した細胞とFITC細菌が結合していない細胞とを区別するために、四象限(quadrants)を設定した。パーセンテージは、細菌の内部移行後に細胞内サイトカインを産生しているDC(右上象限)又は産生していないDC(右下象限)の割合である。野生株、lgtB及びgalE変異株は全て、DCによるTNF−α及びIL−12産生の強力な誘導因子であったが、LPS欠損型変異株は違った。髄膜炎菌野生株、lgtB、及びgalE変異株が内部移行したDCでは実質的にその全てが、高レベルのTNF−αを産生していた。IL−12については、FITC標識細菌が内部移行したDCの約50%で産生がみられた。
Activation and maturation of DC as a response to meningococcal mutants To investigate the relationship between bacterial internalization and cytokine production, IL12 and TNF- produced by dendritic cells in response to wild and mutant strains Intracellular measurement was performed for α, and internal analysis was performed for simultaneous analysis (FIG. 3). DCs were co-cultured with FITC-labeled bacteria at a ratio of 1:50 for 18 hours and then stained to examine intracellular production of TNF-α and IL12. Four quadrants were set in order to distinguish between cells bound by FITC bacteria and cells not bound by FITC bacteria. The percentage is the percentage of DCs that produce intracellular cytokines after bacterial internalization (upper right quadrant) or non-produced DCs (lower right quadrant). Wild strains, lgtB and galE mutants were all strong inducers of TNF-α and IL-12 production by DC, but LPS-deficient mutants were different. Substantially all of the DCs in which the Neisseria meningitidis wild, lgtB, and galE mutants were internalized produced high levels of TNF-α. As for IL-12, production was observed in about 50% of DC in which FITC-labeled bacteria were internalized.
細胞内のサイトカインの測定に加え、髄膜炎菌に対する応答としてDCから分泌されたサイトカインのレベルも測定した(図4)。DCを、1:200の比率で変異細菌及び野生型細菌とともに18時間共培養し、上清を回収して分泌されたIL12、IL10、TNF−α、IL6及びIL−1βについて解析した。野生型(野生型=100%)と比較したサイトカイン産生のパーセンテージを、結果として示す。lgtB及びgalE変異細菌はともに、IL12、TNF−α、及びIL−1βの誘導について、野生型細菌をやや下回った。IL−10及びIL−6については、lgtB及びgalEともに、野生株と同様であった。LPS欠損株には、サイトカイン産生がほとんどみられなかった。 In addition to measuring intracellular cytokines, the levels of cytokines secreted from DCs in response to meningococci were also measured (FIG. 4). DCs were co-cultured with mutant and wild type bacteria at a ratio of 1: 200 for 18 hours, and the supernatants were collected and analyzed for secreted IL12, IL10, TNF-α, IL6 and IL-1β. The percentage of cytokine production compared to the wild type (wild type = 100%) is shown as a result. Both lgtB and galE mutant bacteria were slightly below wild type bacteria for induction of IL12, TNF-α, and IL-1β. For IL-10 and IL-6, both lgtB and galE were similar to the wild type. In the LPS-deficient strain, cytokine production was hardly observed.
最後に、共刺激分子CD40及びCD86の発現を測定し(図5)、野生型細菌及び変異細菌で刺激したDCの成熟化について検討した。野生型細菌又はgalE変異細菌で刺激したDCと比較して、lgtB変異細菌で刺激したDCの場合には、CD40及び特にCD86の発現が高かった。lpxA変異細菌で刺激したDCでは、CD40及びCD86の発現はほとんどみられなかった。 Finally, the expression of the costimulatory molecules CD40 and CD86 was measured (FIG. 5), and the maturation of DCs stimulated with wild type and mutant bacteria was examined. CD40 and especially CD86 expression was higher in DCs stimulated with lgtB mutant bacteria compared to DCs stimulated with wild type or galE mutant bacteria. In DCs stimulated with lpxA mutant bacteria, almost no expression of CD40 and CD86 was seen.
結論としてこれらのデータは、lgtB変異細菌がDCに結合及び内部移行すると、野生型細菌が誘導するDC活性化及び成熟化のレベルと同程度のDC活性化及び成熟化をもたらすことを示している。 In conclusion, these data indicate that binding and internalization of lgtB mutant bacteria results in DC activation and maturation comparable to the level of DC activation and maturation induced by wild-type bacteria. .
lgtB変異細菌の結合及び内部移行を仲介する受容体の同定
DCがlgtB変異細菌を高度に結合及び吸収するということが、かかる結合及び内部移行が、特異的なDC受容体によって仲介されているかどうかを調べるきっかけとなった。したがって本発明者らは、野生株及び変異株について、オリゴ糖認識能を有し、未成熟DCに高度に発現するC型レクチン受容体を結合する能力を解析した。野生型細菌及び変異型細菌の細胞全体に対するC型レクチンFcキメラのパネル(panel)の結合を、可溶性接着アッセイ(soluble adhesion assay)において検討した(図6)。前記C型レクチンFcキメラは、野生型細菌、galE変異細菌、及びLPS欠損変異細菌には結合しなかったが、lgtB変異細菌はDC−SIGN−Fcを強く結合した。lgtB変異細菌とDC−SIGNとの結合は、DC−SIGN又はDC−SIGNを安定的に発現するK562細胞を一過性に形質移入したHEK293T細胞にもみられた(データ示さず)。さらに、抗DC−SIGN遮断抗体AZN−D1の存在下又は非存在下で、DCによるlgtB変異細菌の貪食について検討したところ、DC−SIGNに対するlgtB LPSの特異性が実証された(図7)。AZN−D1の存在下では、DCによるlgtBの貪食は、野生型についてみられる結合のレベルまで減少し、これは明らかに、DC−SIGNがlgtB変異細菌を結合及び内部移行させることを実証するものである。
Identification of receptors that mediate binding and internalization of lgtB mutant bacteria DC is highly binding and absorbing lgtB mutant bacteria, whether such binding and internalization is mediated by specific DC receptors It became a chance to investigate. Therefore, the present inventors analyzed the ability to bind to a C-type lectin receptor that has oligosaccharide recognition ability and is highly expressed in immature DCs for wild and mutant strains. Binding of a panel of C-type lectin Fc chimera to whole cells of wild-type bacteria and mutant bacteria was examined in a soluble adhesion assay (FIG. 6). The C-type lectin Fc chimera did not bind to wild-type bacteria, galE mutant bacteria, and LPS-deficient mutant bacteria, whereas lgtB mutant bacteria strongly bound DC-SIGN-Fc. Binding of lgtB mutant bacteria to DC-SIGN was also observed in HEK293T cells transiently transfected with K562 cells stably expressing DC-SIGN or DC-SIGN (data not shown). Furthermore, when the phagocytosis of lgtB mutant bacteria by DC was examined in the presence or absence of the anti-DC-SIGN blocking antibody AZN-D1, the specificity of lgtB LPS for DC-SIGN was demonstrated (FIG. 7). In the presence of AZN-D1, lgtB phagocytosis by DC is reduced to the level of binding seen for the wild type, clearly demonstrating that DC-SIGN binds and internalizes lgtB mutant bacteria. It is.
TH1の免疫応答を惹起する、DC−SIGNに対するlgtB変異細菌のターゲティング
lgtB変異細菌LPSとDC−SIGNとの相互作用に機能的関連性があるとすれば、それを評価するべく、PFAで固定した野生型細菌又はlgtB変異細菌のいずれかを未成熟DCにパルスした後、DCにより誘導されるT細胞の応答について検討した。野生型細菌又はlgtB変異細菌をパルスしたDCを、共刺激分子及び成熟マーカーの発現により評価したところ、DCの成熟に相違はみられなかった(図8a)。しかし、これらの株により誘導されるTH1/TH2のプロファイルには、顕著な相違がみられた(図8b)。髄膜炎菌の野生型細菌をパルスしたDCでは、大部分のT細胞がIL−4を産生していたため、主にTH2型の免疫応答を生じた。lgtB変異細菌をパルスしたDCは主に、IFN−γ−産生T細胞を誘起(evoke)し、したがってTH1細胞対TH2細胞の均衡を、TH1細胞寄りに変えた。かかるTH1/TH2の均衡の変化は、3つの異なるドナーで観察された。これらのデータは、lgtB LPSをDC−SIGN特異的にターゲティングすると、DCシグナルが生じ、このシグナルが、免疫応答をTH1へと誘導することを示しており、これは、アジュバントにとって非常に望ましい現象である。P. Moingeon et al. (2001) Vaccine 19:4363-4372についても参照のこと。
Targeting of lgtB mutant bacteria to DC-SIGN that elicits a
髄膜炎菌のオリゴ糖/リピドA二重変異株のDCへの結合及び内部移行
髄膜炎菌野生株、lgtA及びlgtBオリゴ糖変異株、それらのlpxL1二重変異株、及びLPS欠損変異株のヒトDCへの結合及び内部移行を、フローサイトメトリー法を用いて調べた。未成熟DCを、DC/細菌比率1:100で髄膜炎菌野生株H44/76由来のFITC標識変異株と共培養し、DCに結合したFITC標識細菌の存在について、FACSで解析した(図9)。lgtB単一変異株は一貫して、野生株及びlgtA単一変異株よりも、DCとの結合性が高かった。さらにまたlgtB変異株は、lpxL1変異背景においても野生型オリゴ糖構造体又はlgtAオリゴ糖構造体よりも高い結合性を生じた。この結果は、ペンタアシル化されたlpxL1リピドAを含むLPSでも、lgtBの仲介によるDC−SIGNへの結合が増強し得ることを示している。
Binding and internalization of Neisseria meningitidis oligosaccharide / lipid A double mutant to DC Meningococcal wild strain, lgtA and lgtB oligosaccharide mutants, their lpxL1 double mutant, and LPS deficient mutant Binding to human DCs and internalization were examined using flow cytometry. Immature DCs were co-cultured with a FITC-labeled mutant derived from Neisseria meningitidis wild strain H44 / 76 at a DC / bacterial ratio of 1: 100 and analyzed by FACS for the presence of FITC-labeled bacteria bound to DC (Figure 9). The lgtB single mutant was consistently more binding to DC than the wild and lgtA single mutants. Furthermore, the lgtB mutant strain produced higher binding than the wild-type oligosaccharide structure or lgtA oligosaccharide structure even in the lpxL1 mutation background. This result indicates that LPS containing pentaacylated lpxL1 lipid A can enhance lgtB-mediated binding to DC-SIGN.
Claims (11)
(a)lpxL1遺伝子若しくはlpxL2遺伝子又はそれらの相同体を低活性化又は不活化する変異を有するナイセリア属菌株から得ることができるリピドA部分、
(b)アシルオキシ加水分解酵素を用いた処理により、野生型リピドA部分から1又は2以上の二級O結合型エステル化脂肪酸を除去することにより得ることができるリピドA部分、
(c)野生型リピドA部分をヒドラジンで処理することにより得ることができるリピドA部分、及び
(d)アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化することにより得ることができるリピドA部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の使用。The lipid A part is
(A) a lipid A portion obtainable from a Neisseria strain having a mutation that inactivates or inactivates the lpxL1 gene or the lpxL2 gene or a homologue thereof,
(B) a lipid A moiety obtainable by removing one or more secondary O-linked esterified fatty acids from the wild-type lipid A moiety by treatment with an acyloxyhydrolase;
(C) a lipid A moiety obtainable by treating the wild type lipid A moiety with hydrazine, and (d) a lipid A moiety obtainable by dephosphorylation using alkaline phosphatase,
Use according to any of claims 1 to 4, characterized in that it is selected from the group consisting of
(a)還元グルコサミンにのみ二級C12−アシルを有するリピドA部分、
(b)非還元グルコサミンにのみ二級C12−アシルを有するリピドA部分、
(c)いずれの二級C12−アシル基も欠如するリピドA部分、
(d)1又は4’位のいずれかで、1又は2以上のリン酸基を欠如するリピドA部分、及び
(e)前記(a)、(b)又は(c)における脱アシル化と前記(d)における脱リン酸化との組合せを有するリピドA部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の使用。The lipid A part is
(A) a lipid A moiety having secondary C 12 -acyl only in reduced glucosamine;
(B) a lipid A moiety having secondary C 12 -acyl only on non-reducing glucosamine;
(C) a lipid A moiety lacking any secondary C 12 -acyl group;
(D) a lipid A moiety lacking one or more phosphate groups at either the 1 or 4 ′ position, and (e) deacylation in (a), (b) or (c) above and A lipid A moiety having a combination with dephosphorylation in (d),
Use according to any of claims 1 to 5, characterized in that it is selected from the group consisting of
(a)lpxL1遺伝子若しくはlpxL2遺伝子又はそれらの相同体を低活性化又は不活化する変異を有するナイセリア属菌株から得ることができるリピドA部分、
(b)アシルオキシ加水分解酵素を用いた処理により、野生型リピドA部分から1又は2以上の二級O結合型エステル化脂肪酸を除去することにより得ることができるリピドA部分、
(c)野生型リピドA部分をヒドラジンで処理することにより得ることができるリピドA部分、及び
(d)アルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化することにより得ることができるリピドA部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項7〜9のいずれか記載の組成物。The lipid A part is
(A) a lipid A portion obtainable from a Neisseria strain having a mutation that inactivates or inactivates the lpxL1 gene or the lpxL2 gene or a homologue thereof,
(B) a lipid A moiety obtainable by removing one or more secondary O-linked esterified fatty acids from the wild-type lipid A moiety by treatment with an acyloxyhydrolase;
(C) a lipid A moiety obtainable by treating the wild type lipid A moiety with hydrazine, and (d) a lipid A moiety obtainable by dephosphorylation using alkaline phosphatase,
The composition according to claim 7, wherein the composition is selected from the group consisting of:
(a)還元グルコサミンにのみ二級C12−アシルを有するリピドA部分、
(b)非還元グルコサミンにのみ二級C12−アシルを有するリピドA部分、
(c)いずれの二級C12−アシル基も欠如するリピドA部分、
(d)1又は4’位のいずれかで、1又は2以上のリン酸基を欠如するリピドA部分、及び
(e)前記(a)、(b)又は(c)における脱アシル化と前記(d)における脱リン酸化との組合せを有するリピドA部分、
からなる群から選択されることを特徴とする請求項7〜10のいずれか記載の組成物。The lipid A part is
(A) a lipid A moiety having secondary C 12 -acyl only in reduced glucosamine;
(B) a lipid A moiety having secondary C 12 -acyl only on non-reducing glucosamine;
(C) a lipid A moiety lacking any secondary C 12 -acyl group;
(D) a lipid A moiety lacking one or more phosphate groups at either the 1 or 4 ′ position, and (e) deacylation in (a), (b) or (c) above and A lipid A moiety having a combination with dephosphorylation in (d),
The composition according to claim 7, wherein the composition is selected from the group consisting of:
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