JP5169294B2 - Method for optical resolution of lactate ester - Google Patents
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Description
本発明は、乳酸エステルを光学分割する方法に関する。また、本発明は、前記乳酸エステルを光学分割する方法を用いて、乳酸発酵で得られたＤＬ−乳酸アンモニウムから光学的に純粋なラクチドを製造する方法、及び光学的に純粋なポリ乳酸を製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for optical resolution of lactic acid esters. The present invention also provides a method for producing optically pure lactide from DL-ammonium lactate obtained by lactic acid fermentation, and an optically pure polylactic acid, using the method for optical resolution of the lactic acid ester. On how to do.
ポリ乳酸は、トウモロコシ、サトウキビ、サトウ大根などのバイオマスを乳酸発酵させて生成した乳酸を化学的に重合して製造したプラスチックである。最近では、これらの所謂バイオマスだけでなく、木質を糖化したり、生ゴミを原料としたりして乳酸を製造する研究も進められている。乳酸にはＬ体とＤ体という光学異性体が存在し、Ｌ−乳酸を重合するとポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）が得られ、Ｄ−乳酸を重合するとポリ−Ｄ−乳酸（ＰＤＬＡ）が得られる。 Polylactic acid is a plastic produced by chemically polymerizing lactic acid produced by lactic acid fermentation of biomass such as corn, sugarcane and sugar beet. Recently, not only these so-called biomasses, but also research on producing lactic acid by saccharifying wood or using raw garbage as a raw material is underway. Lactic acid has L and D optical isomers, and when L-lactic acid is polymerized, poly-L-lactic acid (PLLA) is obtained, and when D-lactic acid is polymerized, poly-D-lactic acid (PDLA) is obtained. It is done.
ポリ乳酸はバイオマスを原料としていることから、石油に依存しないプラスチックとして、また自然界で分解するプラスチックとして注目されている。同時に、分解物が人体に対しても安全な乳酸であることから、骨固定用のボルト等に利用されている。このような使用は、部位の治癒と共に分解消滅するのでボルトの除去手術が不要であり、患者への負担を低減するというメリットがある。人体内の乳酸はＬ−乳酸であることから、このような使用においてはＰＬＬＡが特に好ましい。一方、ポリ乳酸は結晶性のポリマーであり、その結晶化度は、ポリマーを構成する乳酸ユニットの光学純度に依存する。例えば、Ｌ体の光学純度（ＯＰ）は、ＯＰ（％ｅｅ）＝１００×（［Ｌ］−［Ｄ］）／（［Ｌ］＋［Ｄ］）で算出される。ここで、［Ｌ］及び［Ｄ］はそれぞれ任意の単位で表されたＬ−乳酸、及びＤ−乳酸の濃度である。すなわち、ポリマーを構成する乳酸ユニットの光学純度が高いほど、結晶性が高いポリ乳酸となる。 Since polylactic acid uses biomass as a raw material, it is attracting attention as a plastic that does not depend on petroleum and as a plastic that decomposes in nature. At the same time, since the decomposition product is lactic acid that is safe for the human body, it is used for bolts for bone fixation. Such use has the merit of reducing the burden on the patient because the operation of removing the bolt is unnecessary because it decomposes and disappears with the healing of the site. Since lactic acid in the human body is L-lactic acid, PLLA is particularly preferred for such use. On the other hand, polylactic acid is a crystalline polymer, and its crystallinity depends on the optical purity of the lactic acid unit constituting the polymer. For example, the optical purity (OP) of the L-form is calculated by OP (% ee) = 100 × ([L] − [D]) / ([L] + [D]). Here, [L] and [D] are the concentrations of L-lactic acid and D-lactic acid expressed in arbitrary units, respectively. That is, the higher the optical purity of the lactic acid unit constituting the polymer, the higher the crystallinity of polylactic acid.
このように、高結晶性のポリ乳酸を得るためには、原料として高い光学純度の乳酸を用いる必要がある。高い光学純度の乳酸を得るに際しての従来技術の問題を、微生物と培地という観点から、また、光学分割法という観点から説明する。 Thus, in order to obtain highly crystalline polylactic acid, it is necessary to use lactic acid with high optical purity as a raw material. The problems of the prior art in obtaining lactic acid with high optical purity will be described from the viewpoint of microorganisms and culture medium and from the viewpoint of optical resolution.
（微生物と培地）
従来より、発酵乳酸の光学純度を向上させる努力がなされている。発酵乳酸の光学純度を向上させる方法としては、微生物が生産する乳酸の光学純度を向上させることが、まず先決である。Ｌ−乳酸を選択的に生産する微生物としては、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、リゾプスやアスペルギルス等のカビ、ラクトバチルス属の一部が知られており、Ｄ−乳酸を生産する菌体としては、ラクトバチルスデルブルッキーが代表的な菌体として知られている。しかし、これらいずれの菌株も、目的とする光学的に純粋な乳酸を生産するわけではなく、多かれ少なかれ、目的とする光学異性体以外の対掌体を含んでいる。
(Microorganism and medium)
Conventionally, efforts have been made to improve the optical purity of fermented lactic acid. As a method for improving the optical purity of fermented lactic acid, first of all, improving the optical purity of lactic acid produced by microorganisms is the first priority. As microorganisms that selectively produce L-lactic acid, Streptococcus genus, Lactococcus genus, molds such as Rhizopus and Aspergillus, and some Lactobacillus genus are known. Lactobacillus del brooki is known as a representative cell. However, none of these strains produce the target optically pure lactic acid, and more or less contain antipodes other than the target optical isomer.
また、生産される乳酸の光学純度は菌株だけでなく、培地にも依存する。例えば、アプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー、４０巻、ｐ２５８−２６０（１９９３）には、ストレプトコッカスフェーカリスが産生するＬ−乳酸の光学純度が、培地にリン酸アンモニウムを加えることにより改善されるという結果が報告されている。 Moreover, the optical purity of the lactic acid produced depends not only on the strain but also on the medium. For example, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 40, p258-260 (1993) shows that the optical purity of L-lactic acid produced by Streptococcus faecalis is improved by adding ammonium phosphate to the medium. It has been reported.
また、生ゴミはわが国の貴重なバイオマス資源であり、その利用が図られている。例えば、Journal of Industrial Ecology, 7: 63-73, 2004 には、都市の生ゴミからＬ−乳酸を生産する研究が報告されている。このとき問題となるのは、生ゴミに当初から含有されている微生物がＤ−乳酸とＬ−乳酸を生産するので、発酵培地として用いると生産する乳酸の光学純度が低下することである。この問題を解決するため、特開２００１−２５８５８４号公報では、生ゴミにプロピオン酸菌を作用させ、糖質を資化することなく、乳酸だけを資化させ、培地当初に混在する乳酸をリセットする方法が開示されている。 In addition, raw garbage is a valuable biomass resource in Japan and is being used. For example, in Journal of Industrial Ecology, 7: 63-73, 2004, a study for producing L-lactic acid from municipal garbage is reported. The problem at this time is that since the microorganisms contained in the garbage from the beginning produce D-lactic acid and L-lactic acid, the optical purity of the produced lactic acid is reduced when used as a fermentation medium. In order to solve this problem, in Japanese Patent Laid-Open No. 2001-258484, propionic acid bacteria are allowed to act on garbage, and only lactic acid is assimilated without assimilating carbohydrates, and lactic acid mixed at the beginning of the medium is reset. A method is disclosed.
また、コーンスティープリカーはトウモロコシからグルコースを生産する際に得られる副産物であり、たんぱく質やミネラルを豊富に含む優れた発酵培地原料であるが、生ゴミと同様の理由でラセミ乳酸を含んでいる（生物工学会誌、第７９巻、第５号、１４２−１４８、２００１）。 Corn steep liquor is a by-product obtained when producing glucose from corn, and is an excellent fermentation medium material rich in proteins and minerals, but contains racemic lactic acid for the same reason as garbage ( Journal of Biotechnology, Vol. 79, No. 5, 142-148, 2001).
（従来の光学分割法）
一方、一般的に光学活性な物質の分割法としては、結晶化法、酵素法、クロマトグラフィー法などがある。さらに、結晶化法には、優先晶出法、ジアステレオマー法、包接錯体法、優先富化がある。
(Conventional optical resolution method)
On the other hand, as a method for dividing an optically active substance, there are a crystallization method, an enzyme method, a chromatography method and the like. Further, the crystallization method includes a preferential crystallization method, a diastereomer method, an inclusion complex method, and a preferential enrichment.
結晶化法は、ラセミ体に光学活性な試薬（光学分割剤）を作用させてジアステレオマーを形成させ、ジアステレオマー同士の物理的性質の差を利用して、それぞれのジアステレオマーに分割し、再び光学分割剤の部分を取り除き、光学活性体を得る方法である。例えば、ラセミ体に光学活性なアミン（塩基性光学分割剤）を作用させて分割するが、光学分割剤分子との反応を伴うため、コストアップとなり、また、結晶化プロセスは多大な冷却エネルギーの消費を伴う。クロマトグラフィー法は装置の大型化が困難であり、生成物が希釈される、カラムの再生に多量の水（または溶媒）を使用するなどの問題点がある。 In the crystallization method, an optically active reagent (optical resolving agent) is allowed to act on the racemate to form diastereomers, and the diastereomers are separated into each diastereomer by utilizing the difference in physical properties between the diastereomers. Then, the part of the optical resolution agent is removed again to obtain an optically active substance. For example, an optically active amine (basic optical resolution agent) is allowed to act on the racemate for resolution, but the reaction with the optical resolution agent molecule increases the cost, and the crystallization process requires a large amount of cooling energy. With consumption. In the chromatography method, it is difficult to increase the size of the apparatus, and there are problems such that the product is diluted and a large amount of water (or solvent) is used for regeneration of the column.
菌体を用いる光学分割法について：
微生物の立体選択的なエステル分解活性を用いた光学分割の方法は報告されている。
例えば、Ｓ−体３−ヒドロキシブタン酸エステルの製法として、特開２００３−２５０５９５号公報には、エンテロバクター(Enterobacter)属又はキトロバクター(Citrobacter) 属に属する微生物菌体あるいはその抽出物を用いて、ラセミ体のカルボン酸エステルの内のいずれか一方の光学異性体を加水分解し、菌体を遠心分離で除去した後、酢酸エチル等の溶媒により、酢酸エチル相に光学活性カルボン酸アルキルエステルを、水相に光学活性カルボン酸を分画抽出する方法が開示されている。同公報によれば、Enterobacter sp. DS-S-75株の休止菌体を用いて、ラセミ体乳酸エチルと４時間反応させ、酢酸エチルで分画抽出を行ったところ、２００ｇのラセミ体乳酸エチルエステルより、５６ｇのＤ−乳酸エチルエステルが得られた。その光学純度は９８．７％ｅｅであった。また、水中から得られた乳酸は９０ｇであり、その光学純度は６５．１％ｅｅのＳ体（Ｌ−乳酸）であったと開示されている。なお、この方法では、加水分解により酸が生成し、ｐＨの低下を招くので、炭酸カルシウムを中和剤として加えている。この方法の問題点として、微生物菌体を用いるため、遠心分離などの菌体除去工程が必要であり、また菌体から溶出する微量成分は溶媒抽出によって除去できないものも含まれる。さらに、中和により一方の光学活性体は塩となるため、当該光学活性体をポリマー原料等に利用する場合に酸に戻すという工程が必要である。
About optical resolution method using bacterial cells:
A method of optical resolution using the stereoselective esterolytic activity of microorganisms has been reported.
For example, as a method for producing S-form 3-hydroxybutanoic acid ester, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-250595 uses a microbial cell belonging to the genus Enterobacter or the genus Citrobacter or an extract thereof, One of the racemic carboxylic acid esters is hydrolyzed and the cells are removed by centrifugation, and then the optically active carboxylic acid alkyl ester is added to the ethyl acetate phase with a solvent such as ethyl acetate. A method for fractional extraction of an optically active carboxylic acid in an aqueous phase is disclosed. According to the publication, the resting cells of Enterobacter sp. DS-S-75 were reacted with racemic ethyl lactate for 4 hours and fractionated with ethyl acetate to obtain 200 g of racemic ethyl lactate. 56 g of D-lactic acid ethyl ester was obtained from the ester. Its optical purity was 98.7% ee. Moreover, it is disclosed that the lactic acid obtained from water is 90g, and that the optical purity was 65.1% ee S body (L-lactic acid). In this method, since acid is generated by hydrolysis and the pH is lowered, calcium carbonate is added as a neutralizing agent. As a problem of this method, since microbial cells are used, a microbial cell removal step such as centrifugation is necessary, and trace components eluted from the microbial cells cannot be removed by solvent extraction. Furthermore, since one optically active substance becomes a salt by neutralization, a step of returning to an acid is required when the optically active substance is used as a polymer raw material or the like.
さらに、Enzyme and Microbial Technology, 24, 13-20 (1998), T. Suzuki et al. には、Enterobacter sp. DS-S-75株の休止菌体を用いて、ラセミ体methyl-4-chloro-3-hydroxybutylate を立体選択的に脱クロル化し、Ｒ体のみを(S)-3-hydroxy-γ-butyrolactoneにすることによって光学分割する方法が開示されている。この方法の問題点は、前述したことに加え、発生した塩酸を中和又は除去する必要がある点である。 In addition, Enzyme and Microbial Technology, 24, 13-20 (1998), T. Suzuki et al. Uses a resting cell of Enterobacter sp. DS-S-75, and racemic methyl-4-chloro- A method for optical resolution by stereoselectively dechlorinating 3-hydroxybutylate and converting only the R form into (S) -3-hydroxy-γ-butyrolactone is disclosed. The problem with this method is that, in addition to the above, it is necessary to neutralize or remove the generated hydrochloric acid.
Ehrler and Seebach, Helvetica Chimmica Acta, 72, 793-799 (1989) には、Halobacterium halobiumの休止菌体によって、ethyl acetoacetateが４０−７６％の光学純度のethyl(S)-3-hydroxybutanoate に還元され、さらに、Halobacterium halobiumの休止菌体によって、Ｓ体が選択的に加水分解されて、光学純度８８％のethyl(R)-3-hydroxybutanoate が得られることが報告されている。 In Ehrler and Seebach, Helvetica Chimmica Acta, 72, 793-799 (1989), ethyl acetoacetate is reduced to 40-76% optical purity ethyl (S) -3-hydroxybutanoate by resting cells of Halobacterium halobium. Furthermore, it has been reported that S-form is selectively hydrolyzed by resting cells of Halobacterium halobium to obtain ethyl (R) -3-hydroxybutanoate having an optical purity of 88%.
酵素を用いる光学分割法について：
酵素は立体選択的に反応を触媒することが良く知られており、最近ではアクリルアミド等に固定化された商品が安価に出回っている。固定化された酵素を用いれば、酵素の繰り返し使用が容易であり、コスト上も有利となる。酵素を用いる光学分割は以前より研究されている。それらの例を以下に示す。
About optical resolution using enzymes:
Enzymes are well known to catalyze reactions stereoselectively, and recently, products immobilized on acrylamide or the like are available at low cost. If an immobilized enzyme is used, it is easy to use the enzyme repeatedly, which is advantageous in terms of cost. Optical resolution using enzymes has been studied for some time. Examples of these are shown below.
Klibanovらにより、有機溶媒中でリパーゼ（豚膵臓由来）を用いる不斉エステル交換反応が見いだされ (A. M. Klibanov et al., J. Am. Chem. Soc. 1985, 106, 7072-7076)、２級アルコールの光学分割に利用されるようになった。 Klibanov et al. Found an asymmetric transesterification reaction using lipase (derived from porcine pancreas) in an organic solvent (AM Klibanov et al., J. Am. Chem. Soc. 1985, 106, 7072-7076). It was used for optical resolution of alcohol.
例えば、特開昭６２−１６６８９８号公報には、有機溶媒を添加せず、反応させるエステル（トリグリセリド）と２級アルコールとの溶液にリパーゼ(Pseudomomas菌由来）を加えて、不斉エステル交換反応により２級アルコールを光学分割する方法が開示されている。 For example, in Japanese Patent Laid-Open No. 62-166898, an lipase (derived from Pseudomomas) is added to a solution of an ester (triglyceride) and a secondary alcohol to be reacted without adding an organic solvent, and an asymmetric transesterification reaction is performed. A method for optical resolution of secondary alcohols is disclosed.
不斉エステル交換反応が平衡反応であることが問題であることから、反応させるエステルの種類としてビニルエステルを用いる方法が開発されている(B. Mainllard et al., Tetrahedron Lett., 1987, 28, 953および Gunter E. Jeromin et al., Tetrahedron Lett., 1991, 32, 7021) 。このビニルエステルを用いる反応では、不斉エステル交換で生成する物質がアセトアルデヒドであり、アセトアルデヒドは求核性が小さく逆反応が起きないため、不可逆反応となり平衡反応でなくなっている。 Since the problem is that the asymmetric transesterification reaction is an equilibrium reaction, a method using vinyl ester as a kind of ester to be reacted has been developed (B. Mainllard et al., Tetrahedron Lett., 1987, 28, 953 and Gunter E. Jeromin et al., Tetrahedron Lett., 1991, 32, 7021). In the reaction using this vinyl ester, the substance produced by asymmetric transesterification is acetaldehyde. Since acetaldehyde has a low nucleophilicity and does not cause a reverse reaction, it becomes an irreversible reaction and is not an equilibrium reaction.
J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1998, p1459 には、種々の２級アルコールとビニルアセテートをPseudomonas sp. のエステル加水分解酵素（リパーゼ）存在下で立体選択的にアシル転移し、逆にラセミ体の酢酸エステルを立体選択的に加水分解することが示されている。そして、得られた粗生成物をＳｉＯ2 のカラムで分離し、光学的に高い純度の２級アルコールが得られることが示されている。 In J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1998, p1459, various secondary alcohols and vinyl acetate were stereoselectively acyl-transferred in the presence of ester hydrolase (lipase) of Pseudomonas sp. Shows the stereoselective hydrolysis of the racemic acetate. It is shown that the obtained crude product is separated with a column of SiO 2 to obtain a secondary alcohol with optically high purity.
特開平１４−１７１９９４号公報には、光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステル（ＴＨＦＡＥ）あるいはその酸（ＴＨＦＡ) の生物化学的な方法として、微生物や動物由来のエステル分解酵素をＴＨＦＡＥに作用させ、立体選択的な加水分解により残存する該光学活性ＴＨＦＡＥと生成する該光学活性ＴＨＦＡに分割する方法が開示されている。しかし、ＴＨＦＡＥのアルキル側鎖の種類によってはその立体選択性が影響されると共に、その立体選択性が低く、そして得られる光学活性体の収率も低い。 In JP-A-14-171994, as a biochemical method of optically active tetrahydrofuran-2-carboxylic acid alkyl ester (THFAE) or its acid (THFA), a microorganism or animal-derived esterolytic enzyme is allowed to act on THFAE. A method of dividing the optically active THFAE remaining by stereoselective hydrolysis into the optically active THFA produced is disclosed. However, depending on the type of alkyl side chain of THFAE, its stereoselectivity is affected, its stereoselectivity is low, and the yield of the optically active substance obtained is also low.
特開平１１−７５８８９号公報には、ラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸を酵素と接触させ、立体特異的加水分解反応を利用することで、光学活性α−トリフルオロメチル乳酸を得る方法が開示されている。 Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-75889 discloses a method for obtaining optically active α-trifluoromethyl lactic acid by contacting racemic α-trifluoromethyl lactic acid with an enzyme and utilizing a stereospecific hydrolysis reaction. ing.
これらの従来の方法はいずれも、工程が複雑でありコストアップとなる。そのため、高価な医薬原料の製造に主として用いられている。より簡便な光学分割法が求められる。 In any of these conventional methods, the process is complicated and the cost is increased. Therefore, it is mainly used for the production of expensive pharmaceutical raw materials. A simpler optical resolution method is required.
ところで、バイオマスから乳酸を発酵法によって製造する方法は次の通りである。植物から得られるグルコース等の糖質を乳酸菌や、リゾプス等のカビ等の微生物を用いて乳酸発酵させて乳酸とする。この乳酸発酵の際には、生成した乳酸によって発酵液中のｐＨが低下すると微生物の活性が低下するので、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、アンモニア等の塩基で中和しながら、発酵を進める。そのため、発酵法により得られる乳酸は、乳酸のカルシウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩等の乳酸塩の形態である。 By the way, the method for producing lactic acid from biomass by fermentation is as follows. Sugars such as glucose obtained from plants are lactic acid fermented using lactic acid bacteria or microorganisms such as fungi such as Rhizopus to give lactic acid. In this lactic acid fermentation, since the activity of microorganisms is reduced when the pH in the fermentation liquor is lowered due to the produced lactic acid, the fermentation is carried out while neutralizing with a base such as calcium hydroxide, calcium carbonate, sodium hydroxide or ammonia. To proceed. Therefore, lactic acid obtained by fermentation is in the form of lactate such as calcium salt, sodium salt, ammonium salt of lactic acid.
水酸化カルシウム又は炭酸カルシウムを用いて中和を行うと、発酵液中において乳酸カルシウムが得られる。乳酸カルシウムの場合には、硫酸を用いて乳酸を遊離させ粗乳酸として、粗乳酸を目的に応じてエチル又はメチルエステル化し、乳酸エステルを蒸留する。蒸留された乳酸のエチル又はメチルエステルに水を加えて加水分解して乳酸に変換し、エチル又はメチルアルコールを蒸発させる。この方法は、工程が長い上に、多量の硫酸カルシウムが副生物として生産される。硫酸カルシウムは建材などとしての用途はあるが、副生物が多量に排出されるプロセスは好ましくない。 When neutralization is performed using calcium hydroxide or calcium carbonate, calcium lactate is obtained in the fermentation broth. In the case of calcium lactate, lactic acid is liberated using sulfuric acid to obtain crude lactic acid, which is converted into ethyl or methyl ester according to the purpose, and the lactic acid ester is distilled. Water is added to the distilled ethyl or methyl ester of lactic acid to hydrolyze it to convert it into lactic acid, and the ethyl or methyl alcohol is evaporated. This method requires a long process and produces a large amount of calcium sulfate as a byproduct. Although calcium sulfate is used as a building material, a process in which a large amount of by-products is discharged is not preferable.
アンモニア水を用いて中和を行うと、発酵液中において乳酸アンモニウムが得られる。特開平６−３１１８８６号公報には、アンモニアでの中和後の反応濃縮液にｎ−ブタノールを加え、ブタノールを還流させながらアンモニアを蒸発させ、乳酸ブチルを合成する。続いて、乳酸ブチルを蒸留し、得られた乳酸ブチルに水を添加して加水分解し、乳酸を得ることが開示されている。この方法では、蒸発捕集したアンモニアを再度、乳酸発酵の中和剤として利用できる。 When neutralization is performed using aqueous ammonia, ammonium lactate is obtained in the fermentation broth. In JP-A-6-31886, n-butanol is added to a reaction concentrate after neutralization with ammonia, and ammonia is evaporated while refluxing butanol to synthesize butyl lactate. Subsequently, it is disclosed that butyl lactate is distilled, and water is added to the obtained butyl lactate for hydrolysis to obtain lactic acid. In this method, the ammonia collected by evaporation can be used again as a neutralizing agent for lactic acid fermentation.
また、国際公開公報ＷＯ０２／０６０８９１には、発酵乳酸を原料とするラクチドの製造方法及びポリ乳酸の製造方法が開示されている。 International Publication WO02 / 060891 discloses a method for producing lactide using fermented lactic acid as a raw material and a method for producing polylactic acid.
上述したように、乳酸発酵では光学的に純粋な乳酸を得ることはできず、より優れた乳酸の光学分割法の開発が望まれる。 As described above, optically pure lactic acid cannot be obtained by lactic acid fermentation, and development of a better optical resolution method for lactic acid is desired.
本発明の目的は、乳酸エステルを光学分割する方法を提供することにある。また、本発明の目的は、前記乳酸エステルを光学分割する方法を用いて、乳酸発酵で得られたＤＬ−乳酸アンモニウムから光学的に純粋なラクチドを製造する方法、及び光学的に純粋なポリ乳酸を製造する方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for optical resolution of lactic acid esters. Another object of the present invention is to provide a method for producing optically pure lactide from DL-ammonium lactate obtained by lactic acid fermentation using an optical resolution method for the lactic acid ester, and optically pure polylactic acid. It is in providing the method of manufacturing.
本発明者らは、乳酸エステルを酵素触媒の存在下で脱アルコール縮合反応させ、乳酸の重合体が得られることを見いだした。この反応は、光学選択的である。本発明者らは、さらに検討し、本発明に到達した。 The present inventors have found that a lactic acid polymer can be obtained by subjecting a lactic acid ester to a dealcoholization condensation reaction in the presence of an enzyme catalyst. This reaction is optically selective. The inventors have further studied and arrived at the present invention.
本発明には以下の発明が含まれる。
（１） Ｌ−乳酸エステル及びＤ−乳酸エステルの混合物と、酵素触媒としてカンジダ属、シュードモナス属及びブルコルデリア属から選ばれる微生物由来のリパーゼとを混合し、
Ｌ−乳酸エステル及びＤ−乳酸エステルのうちのＤ−乳酸エステルを前記酵素触媒の存在下で脱アルコール反応させて重合し、前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体に変換し、
前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体、及びＬ−乳酸エステルを含む反応混合物から、蒸留により、前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体と、前記Ｌ−乳酸エステルとを分離する、
ことを含み、
前記乳酸エステルは、乳酸と炭素数が２以上のアルコールとのエステルである、乳酸エステルを光学分割する方法。
The present invention includes the following inventions.
(1) Mixing a mixture of L-lactic acid ester and D-lactic acid ester with a lipase derived from a microorganism selected from the genus Candida, Pseudomonas and Brucorderia as an enzyme catalyst,
D-lactic acid ester of L-lactic acid ester and D-lactic acid ester is polymerized by dealcoholization reaction in the presence of the enzyme catalyst, and converted to a polymer of lactic acid derived from the D-lactic acid ester,
The lactic acid polymer derived from the D-lactic acid ester and the L-lactic acid ester are separated from the reaction mixture containing the lactic acid polymer derived from the D-lactic acid ester and the L-lactic acid ester by distillation. ,
Including
The method for optically resolving a lactic acid ester, wherein the lactic acid ester is an ester of lactic acid and an alcohol having 2 or more carbon atoms.
（２） 前記乳酸エステルは、乳酸とｎ−ブタノールとのエステル、又は乳酸と iso−ブタノールとのエステルである、上記（１）に記載の乳酸エステルを光学分割する方法。 ( 2 ) The method for optically resolving the lactic acid ester according to (1 ) above, wherein the lactic acid ester is an ester of lactic acid and n-butanol or an ester of lactic acid and iso-butanol .
（３） 脱アルコール反応を加熱条件及び／又は減圧条件で行う、上記（１）又は（２）に記載の乳酸エステルを光学分割する方法。 ( 3 ) The method for optically resolving the lactic acid ester according to (1) or (2) above, wherein the dealcoholization reaction is performed under heating conditions and / or reduced pressure conditions.
（４） 酵素として、固定化された酵素を用いる、上記（１）〜（３）のうちのいずれかに記載の乳酸エステルを光学分割する方法。 ( 4 ) The method of optically resolving the lactic acid ester according to any one of (1) to ( 3 ), wherein an immobilized enzyme is used as the enzyme.
（５） 乳酸発酵で得られたＤＬ−乳酸アンモニウムとアルコールとを反応させ、ＤＬ−乳酸エステルを合成し、
得られたＤＬ−乳酸エステルと、酵素触媒としてカンジダ属、シュードモナス属及びブルコルデリア属から選ばれる微生物由来のリパーゼとを混合し、
Ｌ−乳酸エステル及びＤ−乳酸エステルのうちのＤ−乳酸エステルを前記酵素触媒の存在下で脱アルコール反応させて重合し、前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体に変換し、
前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体、及びＬ−乳酸エステルを含む反応混合物から、蒸留により、前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体と、前記Ｌ−乳酸エステルとを分離し、
分離された前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体を環化解重合させて、前記Ｄ−乳酸エステルに由来する光学的に純粋なラクチドを得るか、及び／又は
分離された前記Ｌ−乳酸エステルから光学的に純粋なラクチドを得る、
ことを含み、
前記アルコールとして、炭素数が２以上のアルコールを用いる、ラクチドの製造方法。
分離された前記Ｌ−乳酸エステルから光学的に純粋なラクチドを得るには、前記Ｌ−乳酸エステルを重合させてオリゴマーとし、オリゴマーを環化解重合すればよい。
(5) DL-ammonium lactate obtained by lactic acid fermentation is reacted with alcohol to synthesize DL-lactic acid ester,
Mixing the obtained DL-lactic acid ester with a lipase derived from a microorganism selected from the genus Candida, Pseudomonas and Brucorderia as an enzyme catalyst,
D-lactic acid ester of L-lactic acid ester and D-lactic acid ester is polymerized by dealcoholization reaction in the presence of the enzyme catalyst, and converted to a polymer of lactic acid derived from the D-lactic acid ester,
A lactic acid polymer derived from the D-lactic acid ester and the L-lactic acid ester are separated from the reaction mixture containing the lactic acid polymer derived from the D-lactic acid ester and the L-lactic acid ester by distillation. ,
The polymer of lactic acid derived from the separated D-lactic acid ester is cyclized and depolymerized to obtain an optically pure lactide derived from the D-lactic acid ester, and / or the separated L-lactic acid Obtaining an optically pure lactide from an ester,
Including
A method for producing lactide, wherein an alcohol having 2 or more carbon atoms is used as the alcohol.
In order to obtain optically pure lactide from the separated L-lactic acid ester, the L-lactic acid ester may be polymerized into an oligomer, and the oligomer may be cyclized and depolymerized.
（６） 前記アルコールとして、ｎ−ブタノール、又は iso−ブタノールを用いる、上記（５）に記載のラクチドの製造方法。 ( 6 ) The method for producing lactide according to ( 5 ) above , wherein n-butanol or iso-butanol is used as the alcohol.
（７） 上記（４）又は（５）に記載のラクチドの製造方法で得られた光学的に純粋なラクチドを開環重合させて光学的に純粋なポリ乳酸を得る、ポリ乳酸の製造方法。 ( 7 ) A method for producing polylactic acid, wherein the optically pure lactide obtained by the method for producing lactide according to ( 4 ) or ( 5 ) is subjected to ring-opening polymerization to obtain optically pure polylactic acid.
本発明によれば、Ｌ−乳酸エステル及びＤ−乳酸エステルの混合物に酵素触媒を作用させ、用いる酵素触媒に応じて、Ｌ−乳酸エステル及びＤ−乳酸エステルのうちのいずれか一方の乳酸エステルを前記酵素触媒の存在下で脱アルコール反応させて重合させ、前記いずれか一方の乳酸エステルに由来する乳酸の重合体に変換する。酵素を触媒として用いるので、光学選択的に反応が起こり、前記いずれか他方の乳酸エステルは重合しない。また、反応条件は温和であり製造上好ましい。一方の乳酸の重合体と、他方の未反応の乳酸エステルとは容易に分離できる。このようにして、本発明によれば、簡便且つ温和な操作で乳酸エステルを光学分割することができる。 According to the present invention, an enzyme catalyst is allowed to act on a mixture of L-lactic acid ester and D-lactic acid ester, and either one of L-lactic acid ester and D-lactic acid ester is selected according to the enzyme catalyst used. In the presence of the enzyme catalyst, it is subjected to a dealcoholization reaction and polymerized to be converted into a polymer of lactic acid derived from one of the lactic acid esters. Since an enzyme is used as a catalyst, the reaction occurs optically and the other lactic acid ester does not polymerize. The reaction conditions are mild and preferable in production. One lactic acid polymer and the other unreacted lactic acid ester can be easily separated. Thus, according to the present invention, a lactic acid ester can be optically resolved by a simple and gentle operation.
本発明によれば、前記乳酸エステルを光学分割する方法を用いて、乳酸発酵で得られたＤＬ−乳酸アンモニウムから光学的に純粋なラクチドを製造する方法、及び光学的に純粋なポリ乳酸を製造する方法が提供される。得られるポリ乳酸は、高い結晶性を有する。 According to the present invention, a method for producing optically pure lactide from DL-ammonium lactate obtained by lactic acid fermentation using an optical resolution method for the lactic acid ester, and optically pure polylactic acid are produced. A method is provided. The resulting polylactic acid has high crystallinity.
本発明において、まず、Ｌ−乳酸エステル及びＤ−乳酸エステルの混合物と、酵素触媒とを混合する。光学分割すべき乳酸エステルは、化学合成された乳酸を原料として合成されたものであってもよく、又はバイオマスから乳酸を発酵法によって製造する際の乳酸アンモニウムから合成されたものであってもよい。 In the present invention, first, a mixture of L-lactic acid ester and D-lactic acid ester is mixed with an enzyme catalyst. The lactic acid ester to be optically resolved may be synthesized using chemically synthesized lactic acid as a raw material, or may be synthesized from ammonium lactate when lactic acid is produced from biomass by fermentation. .
乳酸発酵はよく知られている。植物から得られる糖質、例えば、トウモロコシ、米、キャッサバなどのデンプンを加水分解して得られたグルコース、セルロースを硫酸や加圧熱水で加水分解して得られたグルコース； サトウキビやビートから得られたシュークロース； ヘミセルロースから得られたキシロース、アラビノース等の糖質を、乳酸菌や、リゾプス等のカビ等の微生物を用いて乳酸発酵させる。この乳酸発酵液のｐＨが低下すると微生物の活性が低下するので、アンモニア水又はアンモニアで中和しながら、発酵を進めると、乳酸アンモニウムが得られる。 Lactic acid fermentation is well known. Carbohydrates obtained from plants, for example, glucose obtained by hydrolyzing starch such as corn, rice, cassava, glucose obtained by hydrolyzing cellulose with sulfuric acid or pressurized hot water; obtained from sugarcane and beet Sucrose obtained; Carbohydrates such as xylose and arabinose obtained from hemicellulose are subjected to lactic acid fermentation using microorganisms such as lactic acid bacteria and fungi such as Rhizopus. When the pH of the lactic acid fermentation liquor is lowered, the activity of microorganisms is lowered. Therefore, when the fermentation is advanced while neutralizing with ammonia water or ammonia, ammonium lactate is obtained.
乳酸アンモニウムにアルコールを反応させると、乳酸とアルコールとのエステルが得られる。この際に用いるアルコールは特に限定されないが、炭素数が４以上のアルコールが好ましい。エタノールを用いると、エタノールの常圧での沸点が７８℃と低いため反応温度を高くすることができず、乳酸アンモニウムとエタノールとの反応性は低く収率も低い。このため、エタノールを用いると、加圧条件下での反応が必要となる。炭素数が４以上のアルコールとしては、例えば、次の段落で挙げられているものを用いるとよい。 When alcohol is reacted with ammonium lactate, an ester of lactic acid and alcohol is obtained. The alcohol used in this case is not particularly limited, but an alcohol having 4 or more carbon atoms is preferable. When ethanol is used, since the boiling point of ethanol at normal pressure is as low as 78 ° C., the reaction temperature cannot be increased, and the reactivity between ammonium lactate and ethanol is low and the yield is low. For this reason, when ethanol is used, a reaction under a pressurized condition is required. As the alcohol having 4 or more carbon atoms, for example, those listed in the next paragraph may be used.
本発明においては、光学分割すべき乳酸エステルとして、乳酸と炭素数が２以上のアルコールとのエステルを用いることが好ましく、乳酸と炭素数が４以上のアルコールとのエステルを用いることがより好ましい。炭素数が４以上のアルコールとの乳酸エステルは、アルコール由来部分が疎水的であり、疎水性酵素触媒存在下での脱アルコール反応が起こりやすい。乳酸エステルとして、乳酸と炭素数が４以上１２以下のアルコールとのエステルがより好ましく、このようなアルコールとしては、直鎖状又は分枝状であってもよく、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、２−エチルヘキサノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール等の一価アルコールが挙げられる。乳酸と炭素数が４以上６以下のアルコールとのエステル、すなわち、乳酸ブチル、乳酸ペンチル、乳酸ヘキシルがより好ましい。特に、乳酸ｎ−ブチルが好ましい。また、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール等の二価アルコールとのジエステルの使用も考えられる。 In the present invention, as a lactic acid ester to be optically resolved, an ester of lactic acid and an alcohol having 2 or more carbon atoms is preferably used, and an ester of lactic acid and an alcohol having 4 or more carbon atoms is more preferably used. The lactic acid ester with an alcohol having 4 or more carbon atoms has a hydrophobic alcohol-derived portion, and a dealcoholization reaction easily occurs in the presence of a hydrophobic enzyme catalyst. As the lactic acid ester, an ester of lactic acid and an alcohol having 4 to 12 carbon atoms is more preferable. Such an alcohol may be linear or branched, butanol, pentanol, hexanol, heptanol. Monohydric alcohols such as octanol, 2-ethylhexanol, nonanol, decanol, undecanol, and dodecanol. Ester of lactic acid and alcohol having 4 to 6 carbon atoms, that is, butyl lactate, pentyl lactate and hexyl lactate are more preferable. In particular, n-butyl lactate is preferable. The use of diesters with dihydric alcohols such as 1,4-butanediol, 1,5-pentanediol, and 1,6-hexanediol is also conceivable.
ブタノールを使用すると、ブタノールと水とが二層に分かれるため、ディーンスターク型蒸留装置を用いて、縮合水を系外に除去することによって、反応を進めることができるからである。還流下にモレキュラーシーブを用いれば、二層に分離しないエタノール、メタノールとも乳酸エステルを合成することはできる。 This is because when butanol is used, butanol and water are separated into two layers, and the reaction can be advanced by removing condensed water from the system using a Dean-Stark distillation apparatus. If molecular sieves are used under reflux, lactic acid esters can be synthesized with ethanol and methanol that are not separated into two layers.
発酵液中には、金属やタンパクなど酵素を阻害したり失活させる物質が含まれている。従って、発酵法によって得られた乳酸アンモニウムから合成された粗乳酸エステルを通常、蒸留する。蒸留後の乳酸エステルに酵素触媒を作用させ光学分割を行う。 The fermented liquid contains substances that inhibit or deactivate enzymes such as metals and proteins. Therefore, the crude lactic acid ester synthesized from ammonium lactate obtained by fermentation is usually distilled. Optical resolution is carried out by allowing an enzyme catalyst to act on the lactate after distillation.
触媒として用いる酵素としては、カルボン酸エステル加水分解酵素（ＥＣ３．１．１）が好ましい。カルボン酸エステル加水分解酵素（ＥＣ３．１．１）はエステラーゼ（ＥＣ３．１）の一種である。カルボン酸エステル加水分解酵素のなかでも、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）が特に好適である。またクチナーゼ（ＥＣ３．１．１）も好適である。 As the enzyme used as a catalyst, carboxylic ester hydrolase (EC 3.1.1) is preferable. Carboxylic ester hydrolase (EC 3.1.1) is a kind of esterase (EC 3.1). Of the carboxylate ester hydrolases, lipase (EC 3.1.1.3) is particularly suitable. Cutinase (EC 3.1.1) is also suitable.
また、本発明において、固定化された酵素を用いてもよい。固定化酵素は、繰り返し使用できる点や、生成した乳酸重合体との分離が容易である点において好ましい。固定化担体としては、公知の各種のものを用いるとよく、例えば、ポリアクリルアミド、珪藻土、セルロース、ビーズ、セラミック等が挙げられる。その他の酵素の固定化法としては、酵素をゲルに封じ込める包括固定化法、酵素を半透明のポリマー被膜により被覆するマイクロカプセル法、酵素の表面をポリエチレングリコールや糖脂質で修飾して安定化する表面修飾法等である（川上ら、Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 85, No.2, 240-242, 1998 ; 今村ら、特開平７−８７９７４）。さらに、メソポーラスシリカに固定化することにより、リパーゼの光学分割能が向上するという報告もある（特開２００２−９５４７１号公報）。さらに本発明は、精製された酵素のみに限定されず、菌体の破砕液や無細胞抽出液を用いて行うことも可能である。 In the present invention, an immobilized enzyme may be used. The immobilized enzyme is preferable in that it can be used repeatedly and can be easily separated from the produced lactic acid polymer. As the immobilization carrier, various known ones may be used, and examples thereof include polyacrylamide, diatomaceous earth, cellulose, beads, and ceramics. Other enzyme immobilization methods include a global immobilization method in which the enzyme is contained in a gel, a microcapsule method in which the enzyme is coated with a translucent polymer film, and the enzyme surface is modified with polyethylene glycol or glycolipid for stabilization. Surface modification method, etc. (Kawakami et al., Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 85, No. 2, 240-242, 1998; Imamura et al., JP-A-7-87974). Further, there is a report that the optical resolution of lipase is improved by immobilization on mesoporous silica (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-95471). Furthermore, this invention is not limited only to the refined enzyme, It can also be performed using the crushing liquid of a microbial cell, or a cell-free extract.
微生物としては、カンジダ(Candida) 属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas ）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、キトロバクター（Citrobacter ）属、リゾプス（Rhizopus）属、ムッコール（Mucor)属、およびフミコラ（Humicola）属に属する細菌またはこれらの微生物が含有する酵素が挙げられる。 The microorganisms include Candida, Bacillus, Pseudomonas, Enterobacter, Citrobacter, Rhizopus, Mucor, and Humicola ( Humicola) bacteria or enzymes contained in these microorganisms may be mentioned.
本発明においてエステル加水分解酵素としては、市販のものを使用することができる。微生物により生産される酵素としては、代表的なものとして、例えば、ノボノルディスク社製アルカラーゼ (Bacillus属由来) 、ノボノルディスク社製デュラザイム (Bacillus属由来) 、ノボノルディスク社製エスペラーゼ (Bacillus属由来) 、ノボノルディスク社製サビナーゼ (Bacillus属由来) 、ノボノルディスク社製ニュートラーゼ (Bacillus属由来) 、ノボノルディスク社製リポラーゼ (Humicola属由来) 、ノボノルディスク社製フラボザイム (Aspergillus 属由来) 、ナガセ生化学工業社製ビオプラーゼコンク (Bacillus属由来) 、ナガセ生化学工業社製デナチームＡＰ及びＡＰ−１５（共にAspergillus 属由来）、ナガセ生化学工業社製リパーゼ２Ｇ(Pseudomonas属由来) 、天野製薬社製リパーゼＰ(Pseudomonas属由来) 、天野製薬社製リパーゼＰＳ(Pseudomonas属由来) 、天野製薬社製ニューラーゼＦ(Rhizopus 属由来) 、天野製薬社製リパーゼＭＦＬ、天野製薬社製リパーゼＭ(Mucor属由来) 、天野製薬社製リパーゼＡＹ(Candida属由来) 、天野製薬社製リパーゼＡ(Aspergillus属由来) 、天野製薬社製リパーゼＭ−ＡＰ−１０、旭化成工業社製ＬＰ−０１５−Ｓ等の酵素等が挙げられ、動物起源のエステル加水分解酵素としては、ブタあるいはウシ由来のパンクレアチン、トリプシン等が挙げられる。 In the present invention, a commercially available ester hydrolase can be used. Representative examples of enzymes produced by microorganisms include, for example, Novalordisk's Alcalase (derived from the genus Bacillus), Novonordisk's durazyme (derived from the genus Bacillus), Novonordisk's Esperase (derived from the genus Bacillus) ), Novonordisk sabinase (from Bacillus genus), Novonordisk neutrase (from Bacillus genus), Novonordisk lipolase (from Humicola genus), Novonordisk flavozyme (from Aspergillus genus) ), Nagase Seikagaku Co., Ltd. Biolase Conk (derived from the genus Bacillus), Nagase Seikagaku Corporation Denateam AP and AP-15 (both from the genus Aspergillus), Nagase Seikagaku Corporation lipase 2G (derived from the genus Pseudomonas) Lipase P manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd. (derived from the genus Pseudomonas), lipase PS manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd. (derived from the genus Pseudomonas), Amano Pharmaceutical Co., Ltd. Newase F (from Rhizopus genus), Amlipa lipase MFL, Amano lipase M (Mucor genus), Amano lipase AY (from Candida genus), Amano lipase A (Aspergillus genus) Origin), enzymes such as lipase M-AP-10 manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd., LP-015-S manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd. Etc.
その他、市販の固定化酵素としては、例えば、カンジダ アンタルチカ (Candida antartica)由来のリパーゼをポリアクリルアミドに固定化したノボノルディスク社のノボザイム４３５、ブルコルデリア セパシア(Burkholderia cepacia)由来のリパーゼをセラミックに固定化した天野エンザイム社のリパーゼＰＳ−Ｃ「アマノ」Ｉ等が挙げられる。
また、最近では組替えにより、酵母表層にリパーゼを連結させる方法も開発されており（特開２００４−１９４５５９号公報）、これを用いることもできる。
Other examples of commercially available immobilized enzymes include, for example, Novo Nordisk novazyme 435 in which lipase derived from Candida antartica is immobilized on polyacrylamide, and lipase derived from bulcorderia cepacia is immobilized on ceramic. Amano Enzyme's Lipase PS-C “Amano” I and the like.
Recently, a method of linking lipase to the surface of yeast by recombination has been developed (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-194559), and this can also be used.
酵素触媒を混合した後、Ｌ−乳酸エステル及びＤ−乳酸エステルのうちのいずれか一方の乳酸エステルを前記酵素触媒の存在下で脱アルコール縮合反応させて重合させ、前記いずれか一方の乳酸エステルに由来する乳酸の重合体に変換する。 After mixing the enzyme catalyst, any one of L-lactic acid ester and D-lactic acid ester is subjected to a dealcoholization condensation reaction in the presence of the enzyme catalyst to polymerize the lactic acid ester. Converts to a polymer of lactic acid derived from it.
乳酸エステルの脱アルコール縮合反応は、適切な反応温度、適切な減圧条件にて行うとよい。反応温度は、用いる酵素の至適温度により定められる。減圧は縮合により生成したアルコールを反応系外へ除去するために行う。すなわち、減圧度は、当該温度で除去しようとするアルコールの蒸気圧以下かつ基質である乳酸エステルの蒸気圧以上とする必要があり、通常は、当該温度で除去しようとするアルコールの蒸気圧よりも低い圧力かつ基質である乳酸エステルの蒸気圧よりも高い圧力とする。具体的には、加熱温度としては、用いる酵素の至適温度を考慮して、例えば６０〜９０℃程度、減圧度としては、乳酸ブチルの脱ブタノール縮合反応の場合、例えば５〜８０ｍｍＨｇ程度とするとよい。反応時間は、特に限定されることはなく、重縮合の進行を考慮して定めるとよい。例えば３０分間〜７２時間、２時間〜４８時間。もちろん、これらよりも長い反応時間としてもよい。 The dealcohol condensation reaction of the lactic acid ester may be performed at an appropriate reaction temperature and an appropriate reduced pressure condition. The reaction temperature is determined by the optimum temperature of the enzyme used. The reduced pressure is used to remove the alcohol produced by the condensation out of the reaction system. That is, the degree of decompression needs to be equal to or lower than the vapor pressure of the alcohol to be removed at the temperature and equal to or higher than the vapor pressure of the lactic acid ester as the substrate. The pressure is low and higher than the vapor pressure of the lactate ester as a substrate. Specifically, considering the optimum temperature of the enzyme to be used, the heating temperature is, for example, about 60 to 90 ° C., and the reduced pressure is, for example, about 5 to 80 mmHg in the case of butyl lactate debutanol condensation reaction. Good. The reaction time is not particularly limited and may be determined in consideration of the progress of polycondensation. For example, 30 minutes to 72 hours, 2 hours to 48 hours. Of course, a longer reaction time may be used.
用いる酵素の量は特に限定されるものではないが、乳酸エステルの１００質量部に対して、例えば５〜２００質量部、好ましくは１０〜１２０質量部程度とするとよい。用いる酵素の触媒活性や、乳酸エステル中のアルキル基の長さ等を考慮して、適宜定めるとよい。 The amount of the enzyme to be used is not particularly limited, but is, for example, about 5 to 200 parts by mass, preferably about 10 to 120 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the lactic acid ester. It may be determined appropriately in consideration of the catalytic activity of the enzyme used, the length of the alkyl group in the lactic acid ester, and the like.
乳酸エステルの脱アルコール縮合反応における酵素の触媒作用については、次のように考えられる。酵素中に含まれているセリン残基(Ser) の−ＯＨ基、又はトレオニン残基(Thr) の−ＯＨ基が、乳酸エステルのカルボニル基に求核付加し、脱アルコールによりアシル中間体(acyl intermediate) が生成する。このアシル中間体は活性エステル様であり、このアシルカルボニル基は、別の乳酸エステルの−ＯＨ基の求核付加を受けやすく、酵素が脱離して、乳酸エステル２分子から脱アルコール縮合した乳酸の二量体モノエステルが生成する。さらに、この反応が繰り返されることにより、乳酸の多量体モノエステルが得られる。リパーゼのような疎水性酵素との親和性を考慮すると、乳酸エステルは、炭素数が４以上の疎水的なアルコールとの乳酸エステルであることが有利である。反応スキームを示す。 The enzyme catalytic action in the dealcoholization condensation reaction of lactic acid ester is considered as follows. The -OH group of the serine residue (Ser) or the -OH group of the threonine residue (Thr) contained in the enzyme is nucleophilically added to the carbonyl group of the lactate ester, and the acyl intermediate (acyl intermediate) is removed by dealcoholization. intermediate) is generated. This acyl intermediate is like an active ester, and this acylcarbonyl group is susceptible to nucleophilic addition of the -OH group of another lactate ester, and the enzyme is eliminated, resulting in the dealcoholization of lactic acid that has been dealcoholized from two lactate ester molecules. Dimer monoesters are formed. Furthermore, by repeating this reaction, a multimeric monoester of lactic acid is obtained. Considering the affinity with a hydrophobic enzyme such as lipase, the lactic acid ester is advantageously a lactic acid ester with a hydrophobic alcohol having 4 or more carbon atoms. The reaction scheme is shown.
酵素の触媒作用の特徴として、基質特異性が挙げられる。すなわち、用いる酵素に応じて、乳酸エステルの特定の光学異性体（Ｄ体又はＬ体）のみが基質となり得る。そのため、ラセミ体の乳酸エステルを用いた場合であっても、Ｌ−乳酸エステル及びＤ−乳酸エステルのうちのいずれか一方の乳酸エステルのみが、酵素触媒作用により脱アルコール縮合反応して重合する。前記いずれか他方の乳酸エステルは、未反応のまま存在している。このような光学選択的な乳酸の重合反応は、化学触媒では得られない利点である。 A characteristic of the catalytic action of the enzyme is substrate specificity. That is, depending on the enzyme used, only a specific optical isomer (D-form or L-form) of lactic acid ester can be a substrate. Therefore, even when a racemic lactic acid ester is used, only one of the L-lactic acid ester and the D-lactic acid ester undergoes a dealcoholization condensation reaction by an enzyme catalyst to polymerize. The other lactic acid ester is present unreacted. Such an optically selective polymerization reaction of lactic acid is an advantage that cannot be obtained with a chemical catalyst.
次に、前記いずれか一方の乳酸エステルに由来する乳酸の重合体、及びいずれか他方の乳酸エステルを含む反応混合物から、前記いずれか一方の乳酸エステルに由来する乳酸の重合体と、前記いずれか他方の乳酸エステルとを分離する。一方の乳酸の重合体と他方の未反応の乳酸エステルとは、分子量等の種々の特性が異なるので容易に分離できる。例えば、沸点の差を利用して、蒸留により分離することができる。 Next, a lactic acid polymer derived from one of the lactic acid esters, and a lactic acid polymer derived from any one of the lactic acid esters from a reaction mixture containing the other lactic acid ester, Separate the other lactic acid ester. One lactic acid polymer and the other unreacted lactic acid ester can be easily separated because they have different characteristics such as molecular weight. For example, it can be separated by distillation utilizing the difference in boiling points.
このようにして、本発明によれば、簡便且つ温和な操作で乳酸エステルを光学分割することができる。 Thus, according to the present invention, a lactic acid ester can be optically resolved by a simple and gentle operation.
本発明の方法で光学分割された乳酸エステル、あるいは乳酸の重合体（オリゴマーないしはポリマー）の光学純度は非常に高い。従って、光学純度の高い乳酸エステル、あるいは乳酸の重合体（オリゴマーないしはポリマー）を用いて、光学純度の高いラクチドを製造することができ、さらに、光学純度の高いラクチドを用いて光学純度の高いポリ乳酸を製造することができる。得られるポリ乳酸は、高い結晶性を有する。 The optical purity of the lactic acid ester or lactic acid polymer (oligomer or polymer) optically resolved by the method of the present invention is very high. Accordingly, a high optical purity lactide can be produced using a high optical purity lactic acid ester or a polymer (oligomer or polymer) of lactic acid, and a high optical purity lactide can be produced using a high optical purity lactide. Lactic acid can be produced. The resulting polylactic acid has high crystallinity.
本発明によれば、前記乳酸エステルを光学分割する方法を用いて、乳酸発酵で得られたＤＬ−乳酸アンモニウムから光学純度の高いラクチドを一貫的に製造する方法、及び光学純度の高いポリ乳酸を一貫的に製造する方法が提供される。 According to the present invention, a method for consistently producing lactide having high optical purity from DL-ammonium lactate obtained by lactic acid fermentation using a method for optically resolving the lactic acid ester, and polylactic acid having high optical purity are obtained. A consistent manufacturing method is provided.
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further more concretely, this invention is not limited to these Examples.
［実験例１：光学選択性］
１．Ｄ−乳酸ブチルの重縮合
Ｄ−乳酸（ＰＵＲＡＣ社製）１８０ｇとｎ−ブタノール（関東化学製、特級）１４８ｇを混合し、１１０℃に加熱してエステル化させ、生成した水を反応系外へ除去した。その後、真空ポンプを用いて反応系を減圧し、乳酸ブチルを減圧蒸留した。このようにして、Ｄ−乳酸ｎ−ブチルを調製した。
[Experimental Example 1: Optical selectivity]
1. Polycondensation of D-butyl lactate 180 g of D-lactic acid (manufactured by PURAC) and 148 g of n-butanol (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd., special grade) are mixed and heated to 110 ° C. for esterification. Removed. Thereafter, the reaction system was depressurized using a vacuum pump, and butyl lactate was distilled under reduced pressure. In this way, D-n-butyl lactate was prepared.
試験管中において、得られたＤ−乳酸ｎ−ブチル２．０ｇに、リパーゼ (Novozyme 435R 、ノボノルディスク社製）０．２ｇを加え、８０℃に加熱し、攪拌子にて反応液を攪拌しながら、２４時間反応させた。反応後、反応物１０ｍｇのサンプリングを行い、このサンプルを５００ＭＨｚ 1ＨＮＭＲ装置（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ）により測定（ＣＤＣｌ3 、ＴＭＳ：テトラメチルシラン）した。 In a test tube, 0.2 g of lipase (Novozyme 435 R , manufactured by Novo Nordisk) was added to 2.0 g of the obtained D-lactic acid n-butyl lactate, heated to 80 ° C., and the reaction solution was stirred with a stir bar. The reaction was allowed to proceed for 24 hours with stirring. After the reaction, 10 mg of the reaction product was sampled, and this sample was measured with a 500 MHz 1 HNMR apparatus (Bruker ARX) (CDCl 3 , TMS: tetramethylsilane).
図１にＤ−乳酸ブチルの重縮合における５００ＭＨｚ 1ＨＮＭＲチャートを示す。各プロトンピークの帰属は図中に示した通りである。
Ｉ（０．９５ｐｐｍ）、Ｈ（１．４２ｐｐｍ）、Ｇ（１．４０ｐｐｍ）、Ｆ（１．６５ｐｐｍ）、Ｅ（２．８１ｐｐｍ）、Ｄ（４．１９ｐｐｍ）、Ｂ（４．２６ｐｐｍ）；
ｉ（０．９３ｐｐｍ）、ｈ，ｈ’（１．５０〜１．６１ｐｐｍ）、ｇ（１．３７ｐｐｍ）、ｆ（１．６５ｐｐｍ）、ｅ（２．８５ｐｐｍ）、ｄ（４．１４ｐｐｍ）、ｂ（４．３６ｐｐｍ）、ａ（５．１３〜５．２５ｐｐｍ）
FIG. 1 shows a 500 MHz 1 HNMR chart in polycondensation of D-butyl lactate. The assignment of each proton peak is as shown in the figure.
I (0.95 ppm), H (1.42 ppm), G (1.40 ppm), F (1.65 ppm), E (2.81 ppm), D (4.19 ppm), B (4.26 ppm);
i (0.93 ppm), h, h ′ (1.50 to 1.61 ppm), g (1.37 ppm), f (1.65 ppm), e (2.85 ppm), d (4.14 ppm), b (4.36 ppm), a (5.13-5.25 ppm)
すなわち、乳酸ブチルのメチン基プロトンのピークＢは４．２６ｐｐｍであるが、重縮合により、ＯＨ末端のメチン基プロトンのピークｂは４．３６ｐｐｍにシフトし、それ以外のメチン基プロトンのピークａは５．２ｐｐｍ付近（５．１３〜５．２５ｐｐｍ）にシフトする。 That is, the peak B of the methine group proton of butyl lactate is 4.26 ppm, but due to polycondensation, the peak b of the methine group proton at the OH end is shifted to 4.36 ppm, and the peak a of the other methine group protons is Shift to around 5.2 ppm (5.13-5.25 ppm).
オリゴマーの５．２ｐｐｍ付近（５．１３〜５．２５ｐｐｍ）のメチン基に帰属するプロトンピークａ、ＯＨ末端のメチン基プロトンのピークｂ（４．３６ｐｐｍ）、及び乳酸ブチルのメチン基プロトンのピークＢ（４．２６ｐｐｍ）の強度より、次のようにして、平均重合度（Degree of polymerization）と転換率（Conversion）を求めた。 Proton peak a attributed to the methine group near 5.2 ppm (5.13 to 5.25 ppm) of the oligomer, peak b (4.36 ppm) of methine group proton at the OH terminal, and peak B of methine group proton of butyl lactate From the intensity of (4.26 ppm), the average degree of polymerization (Degree of polymerization) and the conversion rate (Conversion) were determined as follows.
平均重合度：ピークｂの積分値Ｈb を１とした時のピークａの積分値Ｈa を求め、ピークａの積分値Ｈa に１を加えた値である。すなわち、
平均重合度＝（Ｈa ＋Ｈb ）／Ｈb ＝（Ｈa ／Ｈb ）＋１
転換率（％）＝［（Ｈa ＋Ｈb ）／（Ｈa ＋Ｈb ＋ＨB ）］×１００
ここで、ＨB は、ピークＢの積分値を表す。
Average degree of polymerization: The integrated value Ha of peak a when the integrated value Hb of peak b is 1, and the value obtained by adding 1 to the integrated value Ha of peak a. That is,
Average degree of polymerization = (Ha + Hb) / Hb = (Ha / Hb) +1
Conversion rate (%) = [(Ha + Hb) / (Ha + Hb + HB)] × 100
Here, HB represents the integral value of the peak B.
1ＨＮＭＲ測定結果から、Ｈa ＝１．４、Ｈb ＝１．０、ＨB ＝２．７となり、平均重合度：２．４、転換率：４７％であった。 From the results of 1 HNMR measurement, Ha = 1.4, Hb = 1.0, HB = 2.7, average degree of polymerization: 2.4, conversion rate: 47%.
２．Ｄ，Ｌ−乳酸ブチルの重縮合
試験管中において、Ｄ，Ｌ−乳酸ｎ−ブチル（関東化学製）２．０ｇに、リパーゼ (Novozyme 435R 、ノボノルディスク社製）０．２ｇを加え、８０℃に加熱し、攪拌子にて反応液を攪拌しながら、２４時間反応させた。反応後、反応物１０ｍｇのサンプリングを行い、このサンプルを５００ＭＨｚ 1ＨＮＭＲ装置（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ）により測定（ＣＤＣｌ3 、ＴＭＳ：テトラメチルシラン）した。
2. Polycondensation of D, L-butyl lactate In a test tube, 0.2 g of lipase (Novozyme 435 R , manufactured by Novo Nordisk) was added to 2.0 g of D, L-n-butyl lactate (manufactured by Kanto Chemical). The mixture was heated to 80 ° C. and reacted for 24 hours while stirring the reaction solution with a stir bar. After the reaction, 10 mg of the reaction product was sampled, and this sample was measured with a 500 MHz 1 HNMR apparatus (Bruker ARX) (CDCl 3 , TMS: tetramethylsilane).
図２にＤ，Ｌ−乳酸ブチルの重縮合における５００ＭＨｚ 1ＨＮＭＲチャートを示す。 1ＨＮＭＲ測定結果から、Ｈa ＝１．１、Ｈb ＝１．０、ＨB ＝３．３となり、平均重合度：２．１、転換率：３９％であった。 FIG. 2 shows a 500 MHz 1 HNMR chart in the polycondensation of D, L-butyl lactate. From the results of 1 HNMR measurement, Ha = 1.1, Hb = 1.0, HB = 3.3, average polymerization degree: 2.1, conversion rate: 39%.
３．Ｌ−乳酸ブチルの重縮合
試験管中において、Ｌ−乳酸ｎ−ブチル（アルドリッチ社製）２．０ｇに、リパーゼ (Novozyme 435R 、ノボノルディスク社製）０．２ｇを加え、８０℃に加熱し、攪拌子にて反応液を攪拌しながら、２４時間反応させた。反応後、反応物１０ｍｇのサンプリングを行い、このサンプルを５００ＭＨｚ 1ＨＮＭＲ装置（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ）により測定（ＣＤＣｌ3 、ＴＭＳ：テトラメチルシラン）した。その結果、５．２ｐｐｍ付近のメチン基に帰属するプロトンピークは確認されず、すなわち、重合は認められなかった。
3. Polycondensation of L-butyl lactate In a test tube, add 0.2 g of lipase (Novozyme 435 R , manufactured by Novo Nordisk) to 2.0 g of L-lactic acid n-butyl (manufactured by Aldrich) and heat to 80 ° C. The reaction was stirred for 24 hours while stirring the reaction solution. After the reaction, 10 mg of the reaction product was sampled, and this sample was measured with a 500 MHz 1 HNMR apparatus (Bruker ARX) (CDCl 3 , TMS: tetramethylsilane). As a result, a proton peak attributed to a methine group near 5.2 ppm was not confirmed, that is, no polymerization was observed.
以上のように、 1ＨＮＭＲ測定により、Ｄ−乳酸ブチルを用いた場合、Ｄ，Ｌ−乳酸ブチルを用いた場合には、５．２ｐｐｍ付近にメチン基に帰属するピークａが確認され、重合反応が進行したことが確認された。また、Ｄ−乳酸ブチルを用いた場合の重合度は、Ｄ，Ｌ−乳酸ブチルを用いた場合の重合度よりも高いことが分かった。
一方、Ｌ−乳酸ブチルを用いた場合には、５．２ｐｐｍ付近にメチン基に帰属するピークａは見られず、重合反応は進行しなかった。
As described above, by 1 HNMR measurement, when D-butyl lactate is used, when D, L-butyl lactate is used, a peak a attributed to a methine group is confirmed in the vicinity of 5.2 ppm. Was confirmed to have progressed. Moreover, it turned out that the polymerization degree at the time of using D-butyl lactate is higher than the polymerization degree at the time of using D, L-butyl lactate.
On the other hand, when L-butyl lactate was used, the peak a attributed to the methine group was not observed in the vicinity of 5.2 ppm, and the polymerization reaction did not proceed.
［実験例２：各種乳酸エステルの重縮合］
この実験例においては、表１に示す７種のＤ−乳酸エステル、及び表２に示す７種のＬ−乳酸エステルの重縮合をそれぞれ行った。
[Experimental example 2: polycondensation of various lactic acid esters]
In this experimental example, polycondensation of 7 types of D-lactic acid esters shown in Table 1 and 7 types of L-lactic acid esters shown in Table 2 was performed.
（原料の乳酸エステル）
Ｌ−乳酸エチル、Ｌ−乳酸ｎ−ブチルについては、市販の試薬を用いた。
それ以外の乳酸エステルについては、市販のＬ−乳酸又はＤ−乳酸と、対応するアルコールとを硫酸触媒下に反応させることにより合成したものを用いた。
(Raw lactic acid ester)
A commercially available reagent was used for L-ethyl lactate and L-lactate n-butyl.
About the lactic acid ester other than that, what was synthesize | combined by making commercially available L-lactic acid or D-lactic acid, and corresponding alcohol react under a sulfuric acid catalyst was used.
（各種乳酸エステルの重縮合）
各乳酸エステル２．０ｇを試験管中に入れ、固定化リパーゼ (Novozyme 435R 、ノボノルディスク社製）０．２ｇを加え、攪拌子にて反応液を攪拌しながら、８０℃に加熱し、表１及び表２に示す各圧力下で２４時間反応させた。
(Polycondensation of various lactic acid esters)
2.0 g of each lactic acid ester is put in a test tube, 0.2 g of immobilized lipase (Novozyme 435 R , manufactured by Novo Nordisk) is added, and the reaction solution is stirred with a stir bar and heated to 80 ° C., The reaction was carried out for 24 hours under each pressure shown in Tables 1 and 2.
ここで、表１及び表２に示す各圧力は、各乳酸エステルの酵素触媒反応における適切な減圧条件とされている。ただし、メチルエステルについては、常圧条件である。すなわち、上記の各圧力は、反応温度８０℃において、原料の乳酸エステルはガス化しないが、縮合反応で脱離したアルコールはガス化し反応系外へ除去される圧力条件とされている。 Here, each pressure shown in Table 1 and Table 2 is set as an appropriate pressure reduction condition in the enzyme-catalyzed reaction of each lactic acid ester. However, it is a normal-pressure condition about methyl ester. That is, each of the above pressures is a pressure condition at which the lactic acid ester as a raw material is not gasified at a reaction temperature of 80 ° C., but alcohol desorbed by the condensation reaction is gasified and removed out of the reaction system.
反応後、得られた反応物１０ｍｇのサンプリングを行い、このサンプルを５００ＭＨｚ 1ＨＮＭＲ装置（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲＸ）により測定（ＣＤＣｌ3 、ＴＭＳ：テトラメチルシラン）した。 After the reaction, 10 mg of the obtained reaction product was sampled, and this sample was measured with a 500 MHz 1 H NMR apparatus (Bruker ARX) (CDCl 3 , TMS: tetramethylsilane).
実験例１と同様にして、オリゴマーの５．２ｐｐｍ付近のメチン基に帰属するプロトンピークａの積分値Ｈa 、ＯＨ末端のメチン基プロトンのピークｂ（４．３６ｐｐｍ）の積分値Ｈb 、及び乳酸エステルのメチン基プロトンのピークＢ（４．２６ｐｐｍ）の積分値ＨB より、平均重合度（Degree of polymerization）と転換率（Conversion）を求めた。 In the same manner as in Experimental Example 1, the integral value Ha of the proton peak a attributed to the methine group near 5.2 ppm of the oligomer, the integral value Hb of the peak b (4.36 ppm) of the OH terminal methine group proton, and lactate ester From the integrated value HB of the peak B (4.26 ppm) of methine group protons, the average degree of polymerization and the conversion rate were determined.
さらに、得られた反応物の試料をＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳで質量分析し、反応物に含まれている重合物の分子量を測定した。重合物の最大分子量と、その重合度を求めた。 Furthermore, mass spectrometry was performed for the sample of the obtained reaction material by ESI-TOF-MS, and the molecular weight of the polymer contained in the reaction material was measured. The maximum molecular weight of the polymer and the degree of polymerization were determined.
この際のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定はＢｒｕｃｋｅｒ製の装置を用いて行った。反応物の試料２μｌを溶離液２ｍｌで溶解させ、この溶解液を親水性フィルターを通過させ測定した。溶離液としては、メタノール／水（５０／５０，ｖ／ｖ％）を脱気したものを用いた。 The ESI-TOF-MS measurement at this time was performed using an apparatus manufactured by Brucker. A sample of 2 μl of the reaction product was dissolved in 2 ml of an eluent, and this lysate was measured by passing through a hydrophilic filter. As an eluent, methanol / water (50/50, v / v%) degassed was used.
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定結果の一例として、Ｄ−乳酸ブチル重合物についての結果を図３に示す。以上の結果を表１及び表２に示す。 As an example of an ESI-TOF-MS measurement result, the result about a D-butyl lactate polymer is shown in FIG. The above results are shown in Tables 1 and 2.
以上から、Ｄ−乳酸との各種エステルは、リパーゼ触媒により重合が認められ、これらの中でも、ｎ−ブタノール及び iso−ブタノールとのエステルの重合性が最も高いことが分かった。一方、Ｌ−乳酸との各種エステルでは、リパーゼ触媒による重合は認められなかった。このように、リパーゼ触媒を用いた場合の乳酸エステルの光学選択性が明らかとなった。また、リパーゼ触媒を用いた場合に、種々のＤ−乳酸エステルを原料として使用できることが明らかとなった。 From the above, it was found that various esters with D-lactic acid were polymerized by a lipase catalyst, and among these, the ester polymerization with n-butanol and iso-butanol was the highest. On the other hand, polymerization with a lipase catalyst was not observed in various esters with L-lactic acid. Thus, the optical selectivity of lactate ester when using a lipase catalyst was revealed. Moreover, when a lipase catalyst was used, it became clear that various D-lactic acid ester can be used as a raw material.
［実施例１〜３：光学分割］
（光学分割すべき乳酸エステル）
乳酸ｎ−ブチル（Ｌ体含有量：９０．０４モル％、Ｄ体含有量：９．９６モル％）を用いた。上記特定のＬ体及びＤ体含有量の乳酸ｎ−ブチルは、次のＬ−乳酸ｎ−ブチルとＤ−乳酸ｎ−ブチルとを所定割合で混合して得た。なお、この程度のＤ体混入量のものは、通常、Ｌ−乳酸ｎ−ブチルと称されていることが多い。
[Examples 1-3: Optical resolution]
(Lactic acid ester to be optically resolved)
N-butyl lactate (L-form content: 90.04 mol%, D-form content: 9.96 mol%) was used. The above-mentioned specific L-form and D-form content n-butyl lactate was obtained by mixing the following L-lactate and D-lactate at a predetermined ratio. In addition, the thing of this amount of D body mixing amount is usually called L-lactic acid n-butyl in many cases.
Ｌ−乳酸ｎ−ブチル：
Butyl(S)-(-)lactate （Aldrich Chemical Co.製、純度９８％）
Ｄ−乳酸ｎ−ブチル：
Ｄ−乳酸 （PULAC 製、９０ｗｔ％水溶液）、
１−ブタノール （関東化学製、純度９９．０％）、
硫酸 （関東化学製、純度９７．０〜９８．０％）
を用いて、ディーンスターク装置を用いて合成したもの。
L-Lactic acid n-butyl:
Butyl (S)-(-) lactate (Aldrich Chemical Co., purity 98%)
D-Lactic acid n-butyl:
D-lactic acid (manufactured by PULAC, 90 wt% aqueous solution),
1-butanol (manufactured by Kanto Chemical, purity 99.0%),
Sulfuric acid (Kanto Chemical, purity 97.0-98.0%)
Using the Dean-Stark device.
（乳酸エステルの重縮合）
上記乳酸ｎ−ブチル２．０ｇを試験管中に入れ、固定化リパーゼ (Novozyme 435R 、ノボノルディスク社製）０．２ｇを加え、攪拌子にて反応液を攪拌しながら、８０℃に加熱し、７０ｍｍＨｇの圧力下で２４時間反応させて、実施例１の反応混合物を得た。
また、反応時間を４８時間（実施例２）又は７２時間（実施例３）として、実施例２及び実施例３の反応混合物をそれぞれ得た。
(Polycondensation of lactate ester)
Add 2.0 g of the above-mentioned n-butyl lactate into a test tube, add 0.2 g of immobilized lipase (Novozyme 435 R , manufactured by Novo Nordisk), and heat the reaction solution to 80 ° C. with stirring. The reaction mixture was reacted under a pressure of 70 mmHg for 24 hours to obtain a reaction mixture of Example 1.
Moreover, reaction time of 48 hours (Example 2) or 72 hours (Example 3) was obtained, respectively, and the reaction mixtures of Example 2 and Example 3 were obtained.
（蒸留による分離）
得られた各反応混合物（Ｄ−乳酸ｎ−ブチルの重合体と、未反応のＬ−乳酸ｎ−ブチルとを含んでいる）を、１１０℃に加熱、３０ｍｍＨｇに減圧し、さらに３０ｍｍＨｇから徐々に減圧し、最終的には１ｍｍＨｇまで減圧した。留出物をガスクロマトグラフで分析し、留出物中のＬ体純度（Ｌ体含有量）を求めた。
(Separation by distillation)
Each reaction mixture obtained (containing a polymer of D-n-butyl lactate and unreacted L-lactate lactate) was heated to 110 ° C., depressurized to 30 mmHg, and gradually from 30 mmHg. The pressure was reduced and finally reduced to 1 mmHg. The distillate was analyzed with a gas chromatograph, and the L form purity (L form content) in the distillate was determined.
ここで、化学量論的考察を容易にするため、
Ｌ体純度（％）＝１００×［Ｌ］／（［Ｌ］＋［Ｄ］）
を用いている。通常用いられる光学純度（％ｅｅ）とは異なっている。
Here, to facilitate stoichiometric considerations,
L-form purity (%) = 100 × [L] / ([L] + [D])
Is used. It is different from the optical purity (% ee) usually used.
ガスクロマトグラフの分析条件：
装置 ＧＣ−２０１０（島津製作所製）
試料の調製 留出物１０ｍｇをアセトン１０ｍｌに溶解させた。
分析条件
カラム温度 ８０．０℃（恒温）
インジェクション温度 ２００．０℃
検出器温度 ２００．０℃
Gas chromatograph analysis conditions:
Equipment GC-2010 (manufactured by Shimadzu Corporation)
Analysis conditions Column temperature 80.0 ° C (constant temperature)
Injection temperature 200.0 ℃
Detector temperature 200.0 ° C
結果を示す。
実施例１：反応時間２４時間 Ｌ体純度９５．２０％
実施例２：反応時間４８時間 Ｌ体純度９８．２６％
実施例３：反応時間７２時間 Ｌ体純度９８．６１％
Results are shown.
Example 1: Reaction time 24 hours L-form purity 95.20%
Example 2: Reaction time 48 hours L-form purity 98.26%
Example 3:
このように、ＤＬ−乳酸エステルから、光学分割することができることが明らかとなった。 Thus, it was revealed that optical resolution can be performed from DL-lactic acid ester.
上記の乳酸エステルの光学分割法を用いて、乳酸発酵で得られたＤＬ−乳酸アンモニウムから光学純度の高いラクチドを一貫的に製造することができ、さらに、光学純度の高いポリ乳酸を一貫的に製造することができる。図４に、本発明のラクチド製造方法又はポリ乳酸製造方法の工程の概略を示す。図４においては、ＤＬ−乳酸エステルから、酵素反応により、Ｄ−乳酸エステルが重合体を形成する例が示されている。国際公開公報ＷＯ０２／０６０８９１に開示の方法に対して、本発明の方法では、光学純度の高いラクチド又はポリ乳酸が得られることが大きな利点である。 Using the optical resolution method of lactic acid ester described above, lactide with high optical purity can be produced consistently from DL-ammonium lactate obtained by lactic acid fermentation, and polylactic acid with high optical purity can be consistently produced. Can be manufactured. In FIG. 4, the outline of the process of the lactide manufacturing method or polylactic acid manufacturing method of this invention is shown. FIG. 4 shows an example in which D-lactic acid ester forms a polymer from DL-lactic acid ester by enzymatic reaction. Compared to the method disclosed in International Publication No. WO 02/060891, the method of the present invention has a great advantage in that lactide or polylactic acid having high optical purity can be obtained.
Claims (7)
Ｌ−乳酸エステル及びＤ−乳酸エステルのうちのＤ−乳酸エステルを前記酵素触媒の存在下で脱アルコール反応させて重合し、前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体に変換し、
前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体、及びＬ−乳酸エステルを含む反応混合物から、蒸留により、前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体と、前記Ｌ−乳酸エステルとを分離する、
ことを含み、
前記乳酸エステルは、乳酸と炭素数が２以上のアルコールとのエステルである、乳酸エステルを光学分割する方法。 Mixing a mixture of L-lactic acid ester and D-lactic acid ester with a lipase derived from a microorganism selected from the genus Candida, Pseudomonas and Brucorderia as an enzyme catalyst,
D-lactic acid ester of L-lactic acid ester and D-lactic acid ester is polymerized by dealcoholization reaction in the presence of the enzyme catalyst, and converted to a polymer of lactic acid derived from the D-lactic acid ester,
The lactic acid polymer derived from the D-lactic acid ester and the L-lactic acid ester are separated from the reaction mixture containing the lactic acid polymer derived from the D-lactic acid ester and the L-lactic acid ester by distillation. ,
Including
The method for optically resolving a lactic acid ester, wherein the lactic acid ester is an ester of lactic acid and an alcohol having 2 or more carbon atoms.
得られたＤＬ−乳酸エステルと、酵素触媒としてカンジダ属、シュードモナス属及びブルコルデリア属から選ばれる微生物由来のリパーゼとを混合し、
Ｌ−乳酸エステル及びＤ−乳酸エステルのうちのＤ−乳酸エステルを前記酵素触媒の存在下で脱アルコール反応させて重合し、前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体に変換し、
前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体、及びＬ−乳酸エステルを含む反応混合物から、蒸留により、前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体と、前記Ｌ−乳酸エステルとを分離し、
分離された前記Ｄ−乳酸エステルに由来する乳酸の重合体を環化解重合させて、前記Ｄ−乳酸エステルに由来する光学的に純粋なラクチドを得るか、及び／又は
分離された前記Ｌ−乳酸エステルから光学的に純粋なラクチドを得る、
ことを含み、
前記アルコールとして、炭素数が２以上のアルコールを用いる、ラクチドの製造方法。 DL-ammonium lactate obtained by lactic acid fermentation is reacted with alcohol to synthesize DL-lactic acid ester,
Mixing the obtained DL-lactic acid ester with a lipase derived from a microorganism selected from the genus Candida, Pseudomonas and Brucorderia as an enzyme catalyst,
D-lactic acid ester of L-lactic acid ester and D-lactic acid ester is polymerized by dealcoholization reaction in the presence of the enzyme catalyst, and converted to a polymer of lactic acid derived from the D-lactic acid ester,
A lactic acid polymer derived from the D-lactic acid ester and the L-lactic acid ester are separated from the reaction mixture containing the lactic acid polymer derived from the D-lactic acid ester and the L-lactic acid ester by distillation. ,
The polymer of lactic acid derived from the separated D-lactic acid ester is cyclized and depolymerized to obtain an optically pure lactide derived from the D-lactic acid ester, and / or the separated L-lactic acid Obtaining an optically pure lactide from an ester,
Including
A method for producing lactide, wherein an alcohol having 2 or more carbon atoms is used as the alcohol.
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