JP5167466B2 - 感染性細菌における自己溶解を誘導するための方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、患者における細菌感染症の蔓延防止および治療のための方法に関する。本発明は、好ましい態様において、細菌細胞間コミュニケーションの過程に関与するアシルホモセリンラクトンシグナル伝達分子に対する親和性および特異性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様受容体分子に基づく治療法を提供する。このような分子と結合させることより、これらの受容体を、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）における環境感知および毒性に関与する分子の細胞外濃度を調節するために用いることができ、そうすることで、細菌集団における急速な細胞死（自己溶解）の過程を誘導することができる。

発明の背景
今日、病院で治療を受ける患者の死亡および疾病の主な原因の一つは、院内感染に起因するものである。このような感染症に対する感受性は、患者の受診の理由となった原疾患の結果であることもあれば、免疫抑制療法の結果であることも、または重大な皮膚損傷（例えば、熱傷）を引き起こす傷害の結果であることもある。症例の最も高い割合で原因となっている細菌は、緑膿菌である。これはヒトの日和見病原体の典型である。この細菌は免疫低下状態にない組織を感染させることはほとんどないが、組織が何らかの様式で免疫低下状態になれば、感染させない組織はほどんどない。これは比較的少数の種からなるものの、ヒトの健康に対して深刻な脅威を与えるため、本明細書ではこれ以後、感染性細菌の代表例として用いるが、これは本発明の領域（scope）または範囲（extent）をいかなる形でも限定するものではない。

緑膿菌（Ps. aeruginosa）は、特に重症熱傷の患者ならびに免疫抑制状態にある癌およびAIDSの患者において、尿路感染症、呼吸器系感染症、皮膚炎、軟部組織感染症、菌血症および種々の全身感染症の原因となる日和見病原体である。緑膿菌によって起こる呼吸器感染症は、ほぼ例外なく、下気道が易感染状態にある個体または全身防御機構が不全状態にある個体で起こる。原発性肺炎は慢性肺疾患およびうっ血性心不全の患者で起こる。菌血症性肺炎は一般に、化学療法を受けている好中球減少性癌の患者で起こる。ムコイド型緑膿菌による嚢胞性線維症患者の下気道コロニー形成は頻度が高く、治療は不可能ではないにしても困難である。これは主として免疫低下状態の患者において菌血症を引き起こす。素因となる状態には、血液悪性腫瘍、AIDSに関連した免疫不全症、好中球減少症、糖尿病および重症熱傷が含まれる。シュードモナス（Pseudomonas）菌血症の大部分は、病院および老人ホームにおける院内感染として起こり、院内感染によるグラム陰性菌血症全体のうち約25％を占める。

この細菌は、外膜LPSによってもたらされる透過性障壁のために多くの抗生物質に対して自然耐性を有することが知られており、このため、特に危険で恐ろしい病原体である。また、これはバイオフィルムの形態で表面にコロニーを形成する傾向があるため、細胞に治療濃度の抗生物質が透過しなくなる。その自然な生息環境は土壌であり、桿菌、放線菌および糸状菌に付随して生存しているため、これは天然に存在する種々の抗生物質に対する耐性を獲得している。さらに、シュードモナス属細菌は抗生物質耐性プラスミドを耐性因子（R因子）および耐性伝達因子（RTF）の両方として保持しており、これらの遺伝子を形質導入および接合という細菌プロセスによって伝達することができる。シュードモナス属に対して有効な抗生物質はフルオロキノン、ゲンタマイシンおよびイミペネムを含めて少数しかなく、これらの抗生物質でさえもすべての菌株に有効なわけではない。ゲンタマイシンとカルベニシリンとの併用は急性緑膿菌感染症の患者に有効なことが報告されている。抗生物質によるシュードモナス感染症の治療が無効であることは嚢胞性線維症患者で最も顕著に示されており、その事実上すべてが最終的には、耐性が非常に強いために治療が不能な菌株に感染する。抗生物質耐性のため、臨床分離株の感受性試験が必須である。

緑膿菌は通常、土壌および水から、さらには植物および動物の表面から単離することができる。これは生息地にかかわらず世界中でみられるため、極めて「普遍的な」細菌である。これは時にヒトの正常細菌叢の一部として存在するが、院外の健康な個体におけるコロニー形成の頻度は比較的低い（推定値は解剖学的な位置により0〜24％の範囲）。院内ではこれは食品、流し、蛇口、モップ、呼吸機器手術器具にコロニーを形成することが知られている。コロニー形成は通常、緑膿菌による感染症の前に起こるが、この病原体は環境に普遍的に存在するため、その正確な伝染源および伝染様式はしばしば不明である。臨床的理由から感染症が疑われる集中治療下の患者のうち、感染原が特定できない者は50％にも上る。現在、世界中で毎日1,400例が緑膿菌のために集中治療室（ICU）で死亡しており、これは死因として最大である。

緑膿菌は主として院内病原体である。CDCによれば、米国の病院における緑膿菌感染症の総発生率は平均約0.4％であり（退院1000例当たり4例）、この細菌は院内病原体のうち分離される頻度が4番目に高く、院内感染全体のうち10.1％を占める。全体的には、これは院内肺炎例の16％、後天性尿路感染の12％、手術創感染の8％および血流感染の10％の原因である。好中球減少性癌の患者および骨髄移植患者などの免疫低下患者は緑膿菌の日和見感染に罹りやすく、死亡報告例の30％の原因である。また、これは人工呼吸器関連肺炎の38％、AIDS患者の死亡の50％の原因でもある。熱傷患者における緑膿菌感染は近年減少しているが、これは治療法の改善および食事内容の変化による。しかし、死亡率は依然として高く、熱傷患者の二次感染による死亡全体のうち60％を占める。

緑膿菌の多能性の1つの理由は、それが、エラスターゼ、LasAプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ラムノリピド、IV型線毛を介したトゥイッチング運動（twitching motility）、ピオベルジン（Williams et al., 1996、Stintzi et al., 1998、Glessner et al., 1999）、ピオシアニン（Brint & Ohman, 1995、Reimmann et al., 1997）ならびに細胞毒性レクチンPA-IおよびPA-II（Winzer et al., 2000）を含む、多様なビルレンス決定因子を生じることにある。これらのビルレンス決定因子の多くは、クオラムセンシングによる細胞密度依存的な様式で、遺伝子レベルで調節されることが知られている。緑膿菌は少なくとも2種類のクオラムセンシング系、すなわちlas系およびrhl（vsm）系を有し、これらはそれぞれLuxRI相同体であるLasRI（Gambello & Iglewski, 1991）およびRhlRI（VsmRI）によって構成される（Latifi et al., 1995）。LasIは3-オキソ-C12-HSLの合成を導き（Passador et al., 1993、Pearson et al., 1994）、一方、RhlIはC4-HSLの合成を導く（Winson et al., 1995）。las系およびrhl系は、las系がRhlRに対する転写制御を行うという階層として存在すると考えられている（Williams et al., 1996、Pesci et al., 1997）。転写活性化因子LasRは3-オキソ-C12-HSLとともに働いて、ビルレンス決定因子であるエラスターゼ、LasAプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼおよび外毒素A（Gambello & Iglewski, 1991、Toder et al., 1991、Gambello et al., 1993、Pearson et al., 1994）ならびにlasIをコードする遺伝子の発現を調節する。エラスターゼはコラーゲン、IgG抗体およびIgA抗体、補体を分解することができ、肺粘膜への細菌の付着を促す。アルカリプロテアーゼとの組み合わせにより、これはγインターフェロン（INF）および腫瘍壊死因子（TNF）の不活性化も引き起こす。LasIは3-オキソ-C12-HSLの合成を導き、これはLasRとともにlasIプロモーターと結合して正のフィードバックループ系を形成する。RhlR転写活性化因子は、そのコグネイトAHL（C4-HSL）とともに、rhlAB（ラムノリピド）、lasB、aprA、RpoS、シアニド、ピオシアニンならびにレクチンPA-IおよびPA-IIの発現を調節する（Ochsner et al., 1994、Brint & Ohrnan, 1995、Latifi et al., 1995、Pearson et al., 1995、Winson et al., 1995、Latifi et al., 1996、Winzer et al., 2000）。これらはLasR／3-オキソ-C12-HSLがrhlRを調節する階層的な様式で存在するため（Latifi et al., 1996、Pesci et al., 1997）、この2つの系はいずれも上記のビルレンス決定因子すべての調節に必要である。

さらに最近では、緑膿菌のクオラムセンシング系に関与する別のクラスのシグナル分子が同定されている。これらは4-ヒドロキシ-2-アルキルキノリン（HAQ）を基にした一群の関連分子であり、その多くは抗菌活性を示す。2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノリンは1959年に初めて同定され、後に特性決定がなされて（Pesci et al, 1999）、クオラムセンシングにおける役割からPQS（シュードモナスキノロンシグナル）と命名されている。その後の研究により、緑膿菌によって合成されて分泌される一連のHAQの構造が判明しており、その一部は細胞間コミュニケーション系とも関連づけられている。これらの一つである2-ヘプチル-4-ヒドロキシキノリン（HHQ）は増殖期の細胞によって分泌されて隣接細胞によって取り込まれ、増殖期後期／定常期早期の時点でPQSに変換されて、その後に定常期全体を通じてシグナル分子として放出される（Deziel et al., 2004）。これは、ピオシアニンおよびエラスターゼといったクオラムセンシングによって調節されるいくつかの病原因子の産生と同時期に起こる（Diggle et al., 2003）。PQSの関与の確認は、増殖期早期の時点での増殖培地への外因性PQSの添加がこれらの病原因子の早期産生を引き起こしたという観察所見によって得られた。外因性PQSレベルのピークが定常期後期に認められるという事実は、これが細胞密度感知には関与していないことを示唆する。

PQSの活性は、前述した緑膿菌のクオラムセンシング系と密接なつながりがある。その合成はlasおよびrhlの両方によって調節され、前者はPQSの誘導の原因となり、後者の系はPQSを抑制することができる（McGrath et al. 2004）。さらに、PQS産生が、他の系によって産生されるAHLシグナル分子、すなわち3-オキソ-C12-HSLおよびC4-HSLの比に依存することも見いだされた。PQSは病原因子であるエラスターゼの産生を刺激し、rhlI（これは続いてC4-HSLシンターゼをコードする）の発現を誘導することもできる（McKnight et al., 2000）。さらに、PQSの生物活性はRhlRの存在にも依存し（Pesci et al., 1999）、このため、これはクオラムセンシングの階層的調節の重要な構成要素であるとみられている。

緑膿菌によって引き起こされる最も重篤な臨床的病態の一つは、嚢胞性線維症（CF）罹患者の破壊性慢性肺感染症である。ほぼすべての患者の肺が3歳までに感染している（Burns et al., 2001）。CF患者の免疫系は細菌を排除することができず、広範囲の組織損傷および気道閉塞を伴う慢性疾患の発現が起こり、そのために患者の大半が最終的には死亡する。緑膿菌による肺感染症の成立および持続は、他のクオラムセンシングにより調節される他の病原因子の誘導に加えて、かなり以前からバイオフィルム表現型の発生と関連づけられている（Singh et al., 2000）。クオラムセンシングシグナルは感染マウスのCF肺で直ちに検出される（Wu et al., 2000）。他にも影響はあるが、肺での緑膿菌による、詳細に特性が解明されているAHLシグナル伝達分子の産生は、抗体応答のアイソタイプ比およびサイトカインレベルを調節することにより、宿主免疫応答に直接影響を及ぼしうる（Wu et al., 2004）。

緑膿菌の臨床分離株PA01から作り出された変異体に関する最近の研究により、細胞密度の高い条件下で自己溶解（プログラム細胞死）を起こす株が同定された（D'Argenio et al., 2002）。多数のこれらの株の詳細な分析により、そのすべてが、PQSクオラムセンシングシグナルの過剰産生を引き起こす変異を含むことが判明した。分泌PQSのレベルを低下させる第2の変異をその後に導入すると、野生型表現型が回復し（すなわち、自己溶解が防止されるか大きく減少した）、このことから観察された細胞死におけるPQSの関与が裏付けられた。（Guina et al., 2003）は、緑膿菌によるPQSの産生を、マグネシウム制限培地中での増殖によっても誘導しうることを報告している。他のストレス応答遺伝子の発現と総合して考えると、低マグネシウム下でのPQS合成は飢餓に対する応答を示している。これらの条件は宿主の肺環境で認められるものと類似していると考えられ、病原因子の誘導は宿主免疫系との闘いにおいて細菌を支援すると考えられる。すべてではないが大半の細胞が死滅したという、D'Argenio et al.によって観察された自己溶解作用は、PQSの過剰な（調節性ではない）産生に起因し、有害条件に対する極度の応答を模している可能性がある。このような状況では、少数の生存を可能とするためにその数を著しく減らすことは、細菌にとって有益であると考えられる（D'Argenio et al., 2002）。

緑膿菌感染症の治療または予防のための治療法を開発するためにさまざまな多くのアプローチが活発に進められている。あるものは広範囲にわたることを意図しており、またあるものは特定の種類のシュードモナス感染症を対象にしている。従来の経路に沿ったものには、ワクチン（例えば、米国特許第6,309,651号に記載されたものなど）、およびグラム陰性菌に対して有効と考えられるが主として緑膿菌に対して作用するように設計され、エアロゾル吸入によって投与される新たな抗生物質（SLIT）の開発が含まれる。現在研究が進められているさらにもう1つの観察所見は、最適以下の（sub-optimal）増殖抑制濃度で投与された抗生物質エリスロマイシンが、緑膿菌の血球凝集素、溶血素、プロテアーゼおよびアシル-ホモセリンラクトンを同時に抑制し、このため持続的な緑膿菌感染症の治療に適用しうる可能性があることである。両親媒性ペプチドを含むクリーム製剤も、熱傷または他の重篤な皮膚創傷の感染を予防する手段として検討されている。米国特許第6,309,651号も、緑膿菌のPcrV病原性タンパク質に対する抗体が感染に対する防御を与える可能性があることを開示している。

また、病原性を制御する手段としてのホモセリンラクトンレベルの調節にもある程度関心が寄せられている。ある種の藻類は、いくつかの陸生植物と同じように、アシル-ホモセリンラクトンの競合阻害物質、例えばフラノン（Manefield, 1999）を産生することが示されている。これらの化合物はAHLシグナル分子をその受容体タンパク質から移動させ、AHLバイオアッセイ法におけるアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる（Tepletski et al., 2000）。AHL濃度を低下させるために用いられる他の方法には、AHLの分解および抗体によるAHLの捕捉を触媒するオートインデューサー（autoinducer）不活性化酵素（AiiA）の開発が含まれる（WO 2004／014423）。

現在開発中の治療法には、潜在的な問題および限界が数多く存在する。ワクチンが有効な治療法であるか否かはまだ証明されていない。緑膿菌は宿主抗体によるオプソニン作用に対して効果的な防御を行う広範なムコイド性莢膜を生成し、このことは抗シュードモナス抗体の血清価が高い持続感染患者の存在によって示される。オートインデューサー模倣体の使用は、受容体結合部位に対してAHLと効果的に拮抗するために必要な大部分のものの濃度、および副作用の可能性によって制限される。シュードモナス属および他の細菌によって放出されるAHLが、ヒトの生理機能に対してさまざまな直接効果を及ぼすことはよく知られている。これらには、WO 01／26650に記載されたようなヒスタミン放出の阻害が含まれる。WO 01／74801は、AHLがリンパ球増殖を阻害し、単球およびマクロファージによるTNF-αの分泌をダウンレギュレートし、それによって全般的な免疫抑制物質としても作用しうることを記載している。このため、競合的AHL模倣体の使用を伴う治療法には、患者の免疫系のダウンレギュレーションを引き起こすという危険がある。これは一般に望ましくなく、免疫低下状態の患者では特にそうである。抗生物質の使用は、この細菌（および他のもの）が抗生物質に対する耐性を獲得する著しい能力を考えれば、せいぜい短期的な戦略と見なすことができる。

緑膿菌の病原性が明らかに多因子性であることは、病原因子が多数あること、およびこの細菌と関係のある疾患が広範囲に及ぶことによって明確に示されている。組織への侵入および播種のために必要な細胞外病原因子の多くは、ホモセリンラクトンを基にしたシグナル分子およびPQSシグナル分子、ならびに特定の転写活性化タンパク質がかかわる細胞間シグナル伝達系によって制御される。これらの調節系により、緑膿菌が、協調的な細胞密度依存的な様式でビルレント形態をとること、および宿主防御機構を克服することが可能になる。これらは、必須栄養素が乏しい条件下で、細菌の集団を調節するため、特に、残った細菌が生存上有利となるように細菌数を減少させるためにも用いられる。自己溶解を誘導するためにこのような細胞シグナル伝達を妨げることは、緑膿菌によって引き起こされる疾病および死亡を減らすために有望な治療アプローチである。

有害な副作用がなく、しかも近い将来のうちに病原性細菌によって回避される可能性が低い方法により、HSLおよび病原性に関与する他の細菌細胞シグナル伝達分子の濃度を調節する効果的な手段を開発することには需要が存在する。細菌、特に緑膿菌を死滅させることができ、細菌細胞を直接には攻撃せず、そのため耐性株が生じる可能性の低い組成物または化合物は、CFなどの病態の治療にかなり有益であると考えられる。本発明はこのような組成物を提供する。

発明の概要
本発明は、細菌細胞シグナル伝達分子の細胞外濃度を調節することにより、病原性細菌である緑膿菌の数を減らすための方法を提供する。ラクトン由来細胞シグナル分子の選択的除去（結合または分解）により、緑膿菌の急速な細胞死（または自己溶解）を誘発するAHLシグナル分子とPQSシグナル分子との比の不均衡を生じさせる。または、PQSを単独で、または抗AHL受容体と併用して投与することもできる。他の殺菌性治療法は細菌に直接作用して死滅を引き起こすが、本発明は、高い集団密度を持続することができない環境を模倣し、そうすることで細菌細胞数の急減を誘導するために、細胞外シグナル伝達分子を標的とする。このため、治療法に対して耐性のある菌株が出現する可能性ははるかに低いと考えられる。

本発明の第1の局面によれば、グラム陰性菌の集団の自己溶解を引き起こす方法であって、グラム陰性菌の集団の環境におけるホモセリンラクトン（HL）シグナル分子とキノロンシグナル（QS）シグナル分子との比の不均衡を生じさせるために、グラム陰性菌によって分泌されるラクトンシグナル分子またはラクトン由来シグナル分子に対する抗体を集団に対して投与することを含む方法が提供される。

グラム陰性菌は、アクチノバチルス-アクチノミセテムコミタンス（Actinobacillus actinomycetemcomitans）、アシネトバクター-バーマニー（Acinetobacter baumannii）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ブルセラ属菌（Brucella sp.）、カンピロバクター属菌（Campylobacter sp.）、カプノシトファガ属菌（Capnocytophaga sp.）、カルジオバクテリウム-ホミニス（Cardiobacterium hominis）、エイケネレラ-カロデンス（Eikenella corrodens）、野兎病菌（Francisella tularensis）、軟性下疳菌（Haemophilus ducreyi）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター-ピロリ菌（Helicobacter pylori）、キンゲラ-キンガエ（Kingella kingae）、レジオネラ菌（Legionella pneumophila）、パスツレラ-ムルトシダ（Pasteurella multocida）、シトロバクター属菌（Citrobacter sp.）、エンテロバクター属菌（Enterobacter sp.）、大腸菌（Escherichia coli）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、プロテウス属菌（Proteus sp.）、腸炎菌（Salmonella enteriditis）、チフス菌（Salmonella typhi）、霊菌（Serratia marcescens）、シゲラ属菌（Shigella sp.）、エルシニア-エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）、ペスト菌（Yersinia pestis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、モラクセラ-カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ベイヨネラ属菌（Veillonella sp.）、フラギリス菌（Bacteroides fragilis）、バクテロイデス属菌（Bacteroides sp.）、プレボテラ属菌（Prevotella sp.）、フソバクテリウム（Fusobacterium sp.）、鼠咬症スピリルム（Spirillum minus）、エロモナス属菌（Aeromonas sp.）、プレシオモナスシゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ-ブルニフィカス（Vibrio vulnficus）、アシネトバクター属菌（Acinetobacter sp.）、フラボバクテリウム属菌（Flavobacterium sp.）、緑膿菌、セパシア菌（Burkholderia cepacia）、バークホルデリア-シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）、キサントモナス-マルトフィラ（Xanthomonas maltophilia）またはステノトロフォモナス-マルトフィラ（Stenotrophomonas maltophila）であってよい。1つの好ましい態様において、グラム陰性菌は緑膿菌である。

ホモセリンラクトン（HL）シグナル分子は以下からなる群より選択される式を有するホモセリンラクトン分子であることが好適である。

式中、nは0〜12であってよい。

一般式（I）のホモセリンラクトン分子は、n＝0の場合はN-ブタノイル-L-ホモセリンラクトン（BHL）であってよく、n＝8の場合はN-ドデカノイル-L-ホモセリンラクトン（dDHL）であってよく、またはn＝10の場合はn-テトラデカノイル-L-ホモセリンラクトン（tDHL）であってよい。

一般式（II）のホモセリンラクトン分子は、n＝8の場合はN-(-3-オキソドデカノイル)-L-ホモセリンラクトン（OdDHL）であってよく、またはn＝2の場合はN-(-3-オキソヘキサノイル)-L-ホモセリンラクトン（OHHL）であってよい。

一般式（III）のホモセリンラクトン分子は、n＝0の場合はN-(3-ヒドロキシブタノイル)-L-ホモセリンラクトン（HBHL）であってよい。

ラクトンシグナル分子は任意のアシル-ホモセリンシグナル分子であってよく、好ましくはOdDHLおよび／またはBHLである。

キノロンシグナル（QS）シグナル分子は、一般式（IV）：

の分子であってよい。
式中、nは1〜7であってよく、
R₁は＝O、または-Hであってよく、
R₂は-OHまたは-Hであってよく、かつ
R₃は-Hであってよい、または代替的には、芳香環がさらに不飽和性である場合は窒素原子（N）は非置換性であってよい。

一般式（IV）のキノロンシグナル分子は、

2-アシル-3-ヒドロキシ-4-キノロン
であることが好適である。

QS分子は、シュードモナスキノロンシグナル（PQS）または2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノロン

2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノロン
であることが好ましい。

本発明の1つの態様において、グラム陰性細菌は緑膿菌であってよく、細菌シグナル分子の比は、式（I）のアシル-ホモセリンラクトン（AHL）シグナル分子とシュードモナスキノロンシグナル（PQS）分子とのものであってよい。

ますます多くの細菌種がさまざまな低分子量シグナル分子を用いて細菌間コミュニケーションを行うことが明らかになっている。グラム陰性菌は主としてN-アシルホモセリンラクトンを用いる。これは共通のホモセリンラクトン環構造を有する一群の化合物であり、側鎖の長さおよび構造の点ではさまざまである。この群の中には、アシル-ホモセリンラクトン、3-オキソ-ホモセリンラクトンおよび3-ヒドロキシ-ホモセリンラクトンという3つのクラスがある。個々の種は複数のクラスの要素を産生し、それらに反応することができる。緑膿菌は、N-ブチリル-ホモセリンラクトン（BHL）、3-オキソ-ドデカノイル-ホモセリンラクトン（OdDHL）、およびシュードモナスキノロンシグナルである2-ヘプチル3-ヒドロキシ-4キノロン（PQS）を用いる。

細胞はこれらの分子を、細胞密度の低い条件下ではシグナル分子の濃度もそれに対応して低いというように、局所的な細胞密度を判定するための手段として用いる。細胞密度が高ければ、局所的なシグナル分子濃度も高い。この濃度が閾値レベルに達すると、これは宿主における毒性および病態発現に関与する遺伝子の転写を誘導する。

細菌シグナル伝達分子は、その探索が行われたあらゆる生物で発見されつつある。これはあらゆる種に適用されうる普遍的な系であるように思われる。その主な違いは、すべてのグラム陰性（gram -ve）細菌はホモセリンラクトンを基にした分子を用い、グラム陽性（gram +ve）細菌は（修飾された）低分子量ペプチドを用いることにある。緑膿菌はAHLおよびPQSという2つのシグナル分子を用いるグラム陰性菌の一例である。

この分野でのこれまでの研究は、認識されるが機能はしない（すなわち、病原性スイッチングを行わない）ものでシグナル分子を模倣すること、またはさまざまな受容体系を遮断することに注力してきた。これらの方法の欠点は主として、模倣体または遮断物に対する耐性が生じうること、および「真の」シグナル分子が依然としてそこに存在し、結合を巡って競合すると考えられることである。さらに、いくつかの細菌シグナル伝達分子、例えばアシルホモセリンラクトンはそれ自体が病原因子であり、宿主（すなわち、患者）の免疫抑制を直接引き起こす恐れがある。

本発明は、細胞それ自体ではなく、肝心のシグナル分子を標的とする抗体を用いる方法を提供する。このアプローチは、細菌が自らが攻撃されていることを認識せず、単にそれらが単独で存在しているものと検知すると考えられる点で、これまでのすべての取り組みを上回る枢要かつ重要な利点を有する。耐性に対する選択圧は全く存在しないと考えられる。本発明のこれらの局面は、プログラム細胞死の内因性システムを誘導することによって細菌の死滅を生じさせうるという点でさらに有益である。細菌細胞を直接には標的としない殺菌性治療は、既存の薬物療法とは大きく異なる。

本発明による抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。ポリクローナル抗体は、抗原を動物に注入して、適した動物宿主（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギまたはサル）における産生を賦活することによって産生させることができる。必要であればアジュバントを抗原とともに投与してもよい。続いて抗体を、抗原との結合により、または以下に述べるようにして精製することができる。モノクローナル抗体はハイブリドーマから産生させることが可能である。これらは、不死化細胞系を作製する目的で、骨髄腫細胞および所望の抗体を産生するBリンパ球細胞を融合させることによって形成させることができる。これはよく知られたKohler & Milstein法である（Nature 256 52-55 (1975)）。

特定のタンパク質と結合するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製するための方法は、現在、当技術分野では十分に開発されている。それらは標準的な免疫学のテキスト、例えばRoitt et al, 「Immunology」第二版（1989）、Churchill Livingstone， Londonで考察されている。

完全な抗体に加えて、本発明は、抗原との結合が可能なその誘導体も含む。したがって、本発明は、抗体断片および合成構築物を含む。抗体断片および合成構築物の例は、Dougall et alにより、Tibtech 12 372-379（September 1994）に示されている。抗体断片には、例えば、Fab断片、F(ab')₂断片およびFv断片が含まれる（Roitt et al［前記］参照）。Fv断片を改変して、一本鎖Fv（scFv）分子として知られる合成構築物を作製することができる。これは、分子の安定性に寄与するV_H領域およびV_L領域を共有結合させるペプチドリンカーを含む。本発明はこのため、一本鎖抗体またはscAbも範囲に含む。

その他の合成構築物にはCDRペプチドが含まれる。これらは抗原結合決定基を含む合成ペプチドである。ペプチド模倣体を用いることもできる。これらの分子は通常、CDRループの構造を模しており、抗原と総合作用する側鎖を含む、立体配座が限定された環状有機物である。合成構築物にはキメラ分子も含まれる。したがって、例えば、ヒト化（または霊長類化）抗体またはその誘導体も本発明の範囲に含まれる。ヒト化抗体の一例は、ヒトフレームワーク領域を有するが、齧歯類の超可変領域を有する抗体である。合成構築物には、抗原結合性に加えて何らかの望ましい特性を備えた分子を提供する共有結合部分を含む分子も含まれる。例えば、この部分は、標識（例えば、蛍光標識または放射性標識などの検出可能な標識）または薬学的活性のある物質であってよい。

抗細菌シグナル分子抗体を作製するためには、標的分子または適した誘導体を2つの異なる担体分子（タンパク質）と結合させることが好ましいが、単一の複合分子種を用いることもできる。細菌シグナル分子は一般に、インビボで免疫応答を賦活させるには、または抗体ライブラリーから高親和性抗体を選択するための抗原の源として直接用いるためには小さすぎる。細胞シグナル伝達分子（以下では「抗原」と称する）に対して特異的な抗体の選択は、好ましい態様において、特異的結合対（sbp）の最初のメンバーのレパートリー（ライブラリー）、例えば、糸状バクテリオファージの表面に提示された抗体のライブラリーを用いて行われる。受容体のライブラリーからの特異的な受容体の選択を可能にする任意の他のシステムも本発明の方法に適用可能である。代替的な態様においては、シグナル分子特異的クローンを、抗原結合体を接種した動物から作製した、抗体を分泌する一連のハイブリドーマ細胞系から選択することができる。一般的な例示の目的には、ファージ粒子の表面に提示された抗体結合部位のライブラリーの例が用いられる。

適した担体分子（これはタンパク質、ペプチドまたは任意の天然化合物もしくは合成化合物のいずれでもよい）または材料と結合させた抗原を含む結合体（以下では「結合体-1」と称する）を、「イムノチューブ（immunotube）」またはマイクロタイタープレートなどの適した固体支持体上に固定化し、コーティングされなかった表面を乾燥粉乳などの非特異的ブロッキング剤でブロッキングする。適した結合体分子には、ウシ血清アルブミン（BSA）、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシチログロブリン（TG）、オブアルブミン（Ova）などのタンパク質、またはビオチンなどの非タンパク質が非制限的に含まれうる。結合体分子の選択に関する唯一の制約は、それが何らかの様式で固定化可能であって、免疫処置のためには免疫応答を誘発する程度に十分に大きいことである。

特異的結合対（sbp）の最初のメンバーのライブラリー（「ライブラリー」）を、固定化した結合体に対して適用し、結合体-1を認識するsbpメンバーが結合するのに十分な時間にわたってインキュベートする。結合体を認識しないファージをストリンジェントな洗浄によって除去する。結合したまま残ったファージを、例えばトリエチルアミンまたは他の適した試薬により、中性pHに戻すための緩衝液中に溶出させる。続いて、回収したファージ粒子を大腸菌などの適した宿主生物に感染させ、選択した各メンバーの数を増幅するために培養し、それによって第2の「強化」ライブラリーを作製する。続いてこの工程を強化ライブラリーを用いて繰り返し、第2の担体タンパク質と結合した抗原（結合体-2）を認識するファージ-抗体（「ファージ」）を選択する。

必要に応じてこれをさらに数回行い、選択工程を遊離型の抗原を認識するsbpメンバーの選択が優先されるように変更する。ファージを、最初は結合体-1を用い、次は結合体-2（入手可能な場合）というように以後のそれぞれの回で交互に用いて、以前に記載されたように抗原結合体に対して選択する。結合したファージを、遊離抗原または小型で可溶性の選択可能な部分、例えばビオチンと結合させた抗原の溶液とともに、結合型の抗原に対してより親和性の高いsbpメンバーが固定化された結合体から解離するのに十分な時間にわたってインキュベートすることによって溶出させる。遊離抗原によって溶出したファージを大腸菌細胞に感染させて増幅および再選択を行い、固定化された抗原と結合したままのものは廃棄する。または、好ましさは落ちるものの、結合体と結合するすべての抗体を、例えば低pHを用いて溶出させることもできる。

それぞれの回の選択で選ばれた個々の（モノクローナル）ファージクローンを、所望の結合特性に関してスクリーニングする。これは、必要条件に応じて、SPR（表面プラスモン共鳴）およびELISA（固相酵素免疫アッセイ法）などの技法を含む、当業者に知られた種々の方法によって行うことができる。選択基準には、結合体を形成させた誘導体の存在下で、遊離した可溶型の抗原と選好的に結合する能力が含まれると考えられる。

本発明の好ましい態様において、抗体は未処理のヒト抗体ファージディスプレイライブラリーから作製される（McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990；およびWO 92／01047における記載の通り）。このため、抗体を診断用または透析用の試薬として用いることに加えて、患者への投与のために用いることも可能と考えられる。また別の態様において、ライブラリーを、AHLと適した担体分子との1つまたは複数の結合体による前免疫処置を行った動物から構築することもできる。さらにもう1つの選択肢は、上記の通りに免疫処置を行った動物からのハイブリドーマ細胞系の作製である。後者の2つの場合には、例えば、宿主動物-ヒトキメラ抗体を作製すること、または適した抗体フレームワークスカフォールドへのCDRグラフトによる「ヒト化」により、結果として得られる抗体の免疫原性を低下させるための段階を取り入れることが好ましい。適用しうる他の方法には、抗体内部のT細胞エピトープと考えられるものを同定し、その後にこれらを位置指定変異誘発法などによって除去すること（脱免疫化（de-immunisation））が含まれると考えられる。さらにもう1つの態様において、異なるクラスのヒト免疫グロブリン（IgG、IgAなど）からの定常領域を含むように抗体を作製し、動物細胞において完全な抗体分子として産生させることもできる。特に、これらのアプローチは抗体を治療的に用いる場合に望ましい。分泌性IgAアイソタイプ抗体の使用は、例えば、嚢胞性線維症患者の緑膿菌感染症の治療において鼻腔内／エアロゾル適用が想定される場合には、好ましいと思われる。

本発明に関して、抗体はモノクローナル性でもポリクローナル性でもよい。抗体はヒト抗体でもヒト化抗体でもよい。Fab、F(ab').sup.2（F(ab')₂とも表記される）、FvまたはscFvなどの抗体断片または誘導体を用いることもでき、Huston et al.（Int. Rev. Immunol. 10: 195-217, 1993）によって記載されたような一本鎖抗体（scAb）、ドメイン抗体（dAbs）、例えば単一ドメイン抗体、または抗体に類似した単一ドメイン抗原結合性受容体を用いることもできる。抗体のほかに、抗体断片および免疫グロブリン様分子、ペプチド模倣体または非ペプチド性模倣体を、抗体の結合活性を模倣し、細胞外での細菌シグナル分子の比、好適にはAHLシグナル分子とPQSシグナル分子との比を調節することによって細菌細胞の溶解（急速な細胞死）を誘導するために設計することもできる。

本発明のある特定の好ましい態様において、抗体はscAb、特にXL1-Blue G3H5、G3B12、G3G2および／またはG3H3と命名された大腸菌クローンから得られるscAbである。これらのクローンは、ブダペスト条約の条項に従ってNCIMB（Aberdeen, UK）に2003年3月18日に寄託されており、アクセッション番号は以下の通りである：G3H5はNCIMB-41167として寄託され、G3B12はNCIMB-41168として寄託され、G3G2はNCIMB-41169として寄託され、G3H3はNCIMB-41170として寄託されている。これらの菌株は、100μg／mlアンピシリン、選択的には12.5μg／mlテトラサイクリンおよび／または1％グルコースを添加したLB培地などの適した増殖培地中において、37℃大気中という標準的な条件下で培養することができる。

抗体G3B12を本明細書ではHap 2と称し、抗体G3G2を本明細書ではHap 5と称する。

適した抗体の調製後に、一般的に利用可能ないくつかの技法のいずれかにより、それを単離または精製することができる（例えば、「Antibodies: A Laboratory Manual）」、Harlow and Lane eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)）。一般的に適した技法には、ペプチドもしくはタンパク質アフィニティーカラム、HPLCもしくはRP-HPLC、プロテインAもしくはプロテインGカラムによる精製、またはこれらの技法の組み合わせが含まれる。組換え抗体は標準的な方法に従って調製し、ELISA、ドットブロットアッセイ法などの一般的に利用可能な手順を用いて特異性に関してアッセイすることができる。

本発明の方法は、実際には細菌を直接には標的とせずに、すなわち、細胞外シグナル伝達分子を標的とすることにより、細菌集団における数の激減を誘導することができる手段を提供する。このようなアプローチは前例がない。本発明は、細菌による耐性の発生を招くことのない、細菌感染症に対するアプローチを提供する。

本発明の第2の局面によれば、被験者におけるグラム陰性菌の感染症の治療のための方法であって、グラム陰性菌環境におけるホモセリンラクトン（HL）シグナル分子とキノロンシグナル（QS）シグナル分子との比の不均衡を生じさせるために、グラム陰性菌によって分泌されるラクトンシグナル分子またはラクトン由来シグナル分子に対する抗体を被験者に投与することを含む方法が提供される。治療は予防的でもよく、または既存の状態に関するものでもよい。

このような方法において、抗体は、医学の分野で公知である技法に従って、例えば、有効成分を無菌条件下で担体、希釈剤または添加剤と混合することにより、製剤化することができる。

薬学的組成物は、任意の適した経路による投与、例えば、経口的（口腔内または舌下を含む）、直腸内、鼻内、局所適用（口腔内、舌下または経皮的を含む）、腟内または避腸的（皮下、筋肉内、静脈内または皮内を含む）経路による投与に適合させることができる。このような組成物は、薬学の技術分野で知られた任意の方法により、例えば、有効成分を無菌条件下で担体または添加剤と混合することにより、調製することができる。

経口投与用に適合化された薬学的組成物は、カプセル剤または錠剤などの離散的な単位；粉剤または顆粒剤；液剤、シロップ剤または懸濁剤（水性もしくは非水性の液体；または食用になる発泡体もしくはホイップ；またはエマルションの状態で）として提供することができる。

錠剤または硬ゼラチンカプセル剤のために適した添加剤には、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリン酸またはその塩が含まれる。軟ゼラチンカプセル剤に用いるのに適した添加剤には、例えば、野菜油、蝋状物質、脂肪、半固形状または液状のポリオールなどが含まれる。

液剤およびシロップ剤の調製のために用いうる添加剤には、例えば、水、ポリオールおよび糖が含まれる。懸濁剤の調製のためには、水中油型または油中水型の懸濁液を得るために油（例えば、植物油）を用いることができる。

経皮的投与のために適合化された薬学的組成物は、レシピエントの表皮と密に接触した状態を長期間にわたって維持することを意図した離散的パッチとして提供することができる。例えば、Pharmaceutical Research, 3(6), page 318 (1986)に一般的に記載されたようにして、有効成分をパッチからイオントフォレシス的に送達することができる。

局所適用のために適合化された薬学的組成物は、軟膏、クリーム剤、懸濁剤、ローション剤、粉剤、液剤、ペースト剤、ゲル剤、噴霧剤、エアロゾル剤または油剤として製剤化することができる。眼または他の外部組織、例えば口腔および皮膚の感染症に対しては、組成物を局所用の軟膏またはクリーム剤として適用することが好ましい。軟膏として製剤化する場合には、有効成分をパラフィン基剤または水混和性基剤のいずれかとともに用いることができる。または、有効成分を水中油型クリーム基剤または油中水型基剤とともにクリーム剤として製剤化することもできる。眼に対する局所適用のために適合化された薬学的組成物には、有効成分が適した担体中、特に水性溶媒中に溶解または懸濁化された点眼薬が含まれる。口腔内への局所適用のために適合化された薬学的組成物には、バッカル錠剤、トローチ剤および含嗽剤が含まれる。

直腸内投与のために適合化された薬学的組成物は、坐薬または浣腸剤として提供することができる。

担体が固体である、鼻内投与のために適合化された薬学的組成物には、粒径が例えば20〜500ミクロンの範囲であって、鼻から吸入する様式で、すなわち鼻の近くに保持した粉末容器からの鼻腔を介した急速吸入によって投与される粗末が含まれる。担体が液体である、スプレー式点鼻薬または点鼻薬としての投与のために適した組成物には、有効成分の水溶液または油性溶液が含まれる。

吸入による投与のために適合化された薬学的組成物には、さまざまな種類の定量噴霧加圧噴霧装置、ネブライザーまたは吸入器によって生成される微粒子状物質またはミストが含まれる。

腟内投与のために適合化された薬学的組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、発泡体または噴霧製剤として提供することができる。

避腸的投与のために適合化された薬学的組成物には、水性および非水性の滅菌注射液（これは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図したレシピエントの血液と実質的に等張にする溶質を含みうる）；ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液（これは懸濁剤および増粘剤を含みうる）が含まれる。注射液のために用いうる添加剤には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が含まれる。組成物は、単位投与用または多回投与用の容器、例えば密封したアンプルおよびバイアルとして提供することができ、使用の直前に滅菌液体、例えば注射用の水を添加するのみでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時調製による注射液および懸濁液は、滅菌した粉末、顆粒および錠剤から調製することもできる。

薬学的組成物は、保存料、溶解補助剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、着香料、塩（本発明の物質自体を薬学的に許容される塩の形態で提供することもできる）、緩衝剤、コーティング剤または抗酸化剤を含みうる。それらは、本発明の物質のほかに治療活性のある物質を含んでもよい。

本発明の薬学的組成物の投与量は、治療しようとする疾患または障害、治療しようとする個体の年齢および状態などに応じて幅広い範囲にわたりうると考えられ、医師が最終的には用いるべき適切な投与量を決定すると考えられる。

このような組成物はヒト用にも獣医学用にも製剤化することができる。本出願は、文脈において明白にそれ以外であることが示されない限り、ヒトにも動物にも等しく適用されるものと解釈されるべきである。

本発明の第3の局面によれば、グラム陰性菌の自己溶解を引き起こすのに用いるための、グラム陰性菌によって分泌されるラクトンシグナル分子またはラクトン由来シグナル分子に対する抗体が提供される。

本発明の第4の局面によれば、被験者におけるグラム陰性感染症の治療のための薬剤の調製における、グラム陰性菌によって分泌されるラクトンシグナル分子またはラクトン由来シグナル分子に対する抗体の使用であって、抗体が前記被験者を感染させたグラム陰性菌の自己溶解を引き起こす使用が提供される。処置は予防的でもよく、または既存の状態に関するものでもよい。

抗体は通常、無菌性の薬学的組成物の部分として供給され、これは薬学的に許容される担体を含むことが一般的である。この薬学的組成物は、任意の適した形態であってよい（それを患者に投与する所望の方法に依存する）。

それは単位投与剤形として提供してもよく、一般的には密封容器内にある状態で提供されると考えられ、さらにキットの部分として提供してもよい。このような部分を有するキットは通常（必ずではない）、使用のための指示書を含むと考えられる。これが複数の前記単位投与剤形を含んでもよい。

本発明の方法は、病原体である緑膿菌によって引き起こされる短期的または長期的、急性または慢性の病気／疾患に対して適用することができ、嚢胞性線維症に罹患した患者には特に関心を寄せている。さらに、本発明の方法は特に細菌細胞シグナル伝達分子を対象とし、細菌細胞それ自体は主として対象としていないため、細菌集団に作用して記載した治療に対する耐性を生じさせる選択圧は存在しないと考えられる。

抗体は、感染した患者に対して、細菌感染症を是正および軽減するため、ならびに生存体の病原性を軽減するために投与することができる。これには、嚢胞性線維症患者による、推定寿命を延長させるためのエアロゾル中抗体の吸入が含まれうる。

さらにもう1つの態様において、細胞シグナル伝達分子と免疫原性タンパク質との結合体を、個体または患者に対して、ラクトンシグナル伝達分子に対する免疫応答を賦活させ、中和抗体の産生を引き起こすことを目的として投与することができる。

さらにもう1つの態様において、感染性微生物の病原性および毒性を調節し、プログラム細胞死を誘導することによって細菌量を減らすことを目的として、患者の血液から細菌細胞間シグナル伝達分子を除去するために、代替的な方法を適用することができる。これは、前記ラクトンシグナル分子と結合する他の天然の受容体または天然の受容体を基にした分子を用いて実現することができる。または、分子鋳型を有するポリマー（MIP）などの非天然型受容体を適用することもできる。このクラスの受容体は、薬物（Hart et al., 2000）およびステロイド（Whitcombe et al., 1995；Ramstrom et al., 1996；Rachkov et al., 2000）などの低分子量生体分子と特異的に結合しうることがすでに示されている。

さらにもう1つの態様において、受容体は触媒活性または酵素活性を有し、ラクトン細胞シグナル伝達分子を、もはや標的生物によっては認識されず、PQSシグナル分子がAHL（ラクトン）シグナル分子よりも過剰にあることを感知するような形態に変換することができる。

さらにもう1つの態様において、抗体は、相加的および増強的な治療法および治療管理を提供するために、以上の用途の1つまたは複数を組み合わせたもの、または他の治療法、例えば抗生物質と組み合わせたものに用いられる。

本発明の抗体（または等価物）は、細菌感染症を治療するために投与すること、または感染のリスクが高い者に対する予防的手段として用いることが可能と考えられる。感染がすでに存在する場合には、抗体を単独で、または抗細菌抗体もしくは抗生物質もしくは他の抗微生物療法と組み合わせて投与することができる。抗AHL抗体の投与を他の治療法と併用することにより、治療過程の短縮または治療薬の用量減少が可能となり、それによって耐性発生のリスクを低下させ、患者のコンプライアンスを改善することが可能になる可能性がある。

本発明の第2および以後の局面の好ましい特徴には、第1の面のものが準用される。

1つの好ましい態様では、緑膿菌の集団における自己溶解を引き起こす方法であって、緑膿菌の集団の環境におけるアシル-ホモセリンラクトン（AHL）シグナル分子とシュードモナスキノロンシグナル（PQS）シグナル分子の比の不均衡を生じさせるために、緑膿菌によって分泌されるラクトンシグナル分子またはラクトン由来シグナル分子に対する抗体を集団に投与することを含む方法が提供される。

本発明の1つの好ましい態様では、被験者における緑膿菌感染症の治療のための方法であって、緑膿菌の環境におけるアシル-ホモセリンラクトン（AHL）シグナル分子とシュードモナスキノロンシグナル（PQS）シグナル分子との比の不均衡を生じさせるために、緑膿菌によって分泌されるラクトンシグナル分子またはラクトン由来シグナル分子に対する抗体を被験者に投与することを含む方法が提供される。

このような態様において、アシル-ホモセリンラクトン（AHL）シグナル分子はOdDHLおよび／またはBHLであってよい。抗体はscAbであるG3H5、G3B12、G3G2および／またはG3H3であってよい（G3B12を本明細書ではHap 2と称し、抗体G3G2を本明細書ではHap 5と称している）。

植物宿主および動物宿主における関連した用途を非制限的に含む、本発明のその他の目的、特徴および利点は、本発明の明細書および特許請求の範囲を吟味することにより、当業者には明らかになると考えられる。

本明細書中に開示した組成物および方法が、広範囲の生物にわたって、感染に起因する疾患または状態の抑制、是正、治療または診断における用途を有することは、当業者には明らかであると考えられる。本発明の組成物および方法を緑膿菌を参照しながら説明してきたが、本明細書の目的を他の種に対して適用することは当業者の技能の範囲に含まれる。

以下では、本発明を、以下に詳述する非制限的な実施例および図面を参照しながらさらに説明する。

実施例1：抗AHL抗体の作製
未処理のヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを、アシルホモセリンラクトンdDHL（ドデカノイルホモセリンラクトン）の結合体に対してスクリーニングした。手短に述べると、アシル鎖の末端にカルボキシル基を含むdDHLの誘導体を、よく知られた化学的手法を用いて、担体タンパク質であるウシ血清アルブミン（BSA）およびウシチログロブリン（TG）と結合させた。抗体ライブラリーをそれぞれの結合体に対して交互に3回スクリーニング（パニング）し、結合体と結合したファージを単離し、増幅して、以降の回のために用いた。1回目の後には、すべての結合性ファージを回収して増幅した。2回目および3回目の際には、遊離性の可溶性天然型dDHLまたはBHL（ブチル-ホモセリンラクトン）の溶液とのインキュベーションにより、固定化した結合体から結合ファージを溶出させた。3回目によるモノクローナルファージ抗体を、まず両方のAHL結合体および担体タンパク質のみに対する結合に関してスクリーニングした。結合体を形成した抗原のみと結合したクローンを、競合結合ELISAにより、遊離dDHLまたは遊離BHLと結合する能力に関してさらにスクリーニングした。遊離dDHL（Hap 2）および遊離BHL（Hap 5）の存在下でdDHL-結合体に対する結合が阻害された、Hap 2およびHap 5と命名された2種類のクローンが単離された（図1）。

実施例2：緑膿菌の生存度アッセイ法
緑膿菌の臨床分離株PA01を、連続プレート希釈による評価で約5×10⁸個のCFUを含む一晩培養したPA01肉汁培養液50マイクロリットルを腹腔内に注射することにより、雌性BALB／cマウス（Charles River、約30日齢）中で継代した。24時間後に血液試料を後眼窩静脈叢から採取し、PA01分離株を血液培養物から回収した。分離株が緑膿菌であることは、グラム染色、コロニー形態およびピオシアニン産生によって確かめた。細菌のアリコートは-70℃で保存し、必要時に急速解凍して遠心分離により収集して、50マイクロリットルの無菌リン酸緩衝食塩水（PBS）またはHap2抗体を37.5μMの濃度で含む無菌PBS中に再懸濁させた。細菌のアリコートを氷上に置き、PBSによる連続希釈物をさまざまな時点（0分、20分、40分）で血液寒天基礎培地プレートにプレーティングした。プレートを37℃で一晩インキュベートし、各時点での生菌数を決定するためにコロニーを算定した（図2）。

マウスでの継代を行っていない緑膿菌臨床分離株PA14を用いる第2のアッセイ法を開発した。PA14の5ml培養物をLB中にて37℃で一晩増殖させた。L肉汁培地による10^-6までの10倍連続希釈物を作製し、50μLの希釈物を50μLのPBS、抗体Hap2（37.5μM）または抗体Hap5（15μM）に添加した。試料を氷上でさまざまな期間にわたりインキュベートし、その後直ちに脳心臓浸出物寒天プレートにプレーティングして、37℃で一晩インキュベートした。続いてコロニーの数を各プレートに関して算定した（図3）。

実施例3：緑膿菌の肺感染症モデル
緑膿菌の臨床分離株PA01を、連続プレート希釈による評価で約5×10⁸個のCFUを含む一晩培養したPA01肉汁培養液50マイクロリットルを腹腔内に注射することにより、雌性BALB／cマウス（Charles River、約4週齢）中で継代した。24時間後に血液試料を後眼窩静脈叢から採取し、PA01分離株を血液培養物から回収した。分離株が緑膿菌であることは、グラム染色、コロニー形態およびピオシアニン産生によって確かめた。細菌のアリコートは-70℃で保存し、必要時に急速解凍して遠心分離により収集して、無菌リン酸緩衝食塩水（PBS）中に再懸濁させた。PBSによる連続希釈物を、生菌数算定のために血液寒天基礎培地プレートにプレーティングした。プレートを37℃で一晩インキュベートし、生菌数を決定するためにコロニーを算定した。

第1の肺感染実験に関しては、生存および菌血症について1週間の期間にわたりモニターした。1群当たり6匹ずつの成体雌性BALB／cマウス（約4週齢）に、2.5％（v／v）ハロタンを用いて軽い麻酔を施した。無菌PBSまたは抗体を含むPBS中に再懸濁させた1.0×10⁷ CFUという感染量のPA01を総容積50μlとして鼻孔内に投与した。感染量であることは、連続希釈物を生細胞数の算定のために血液寒天基礎培地プレートにプレーティングすることによって確かめた。5つの投与群をモニターした。第1の群はPBSのみの中に再懸濁させたPA01に感染させた。第2の群はPBS中にて37.5μM Hap 2と混合したPA01に感染させた。第3の群はPBS中にて15μM Hap 5と混合したPA01に感染させた。第4の群は抗AHL抗体Hap 2およびHap 5と混合したPA01に感染させた。最後の群はPBSと混合したPA01に感染させ、0.2mgゲンタマイシンの一連の皮下注射を行った（1回目の注射は感染2時間後、その後はs／c追加投与1日2回を3日間）。第2群および第3群に関しては、37.5μM Hap 2または15μM Hap 5抗体を、鼻腔内感染の直前に感染量と混合した（例えば、10μlの細菌に加えて40μlの抗体）。第4群に関しては、10μlの細菌を20μlの37.5μM Hap2および20μlの15μM Hap 5と混合した。

感染2時間後の時点で、総容積50μlを尾静脈に直接注射することにより、マウスに対してPBSまたは抗体を含むPBSの静脈内追加投与を行った。

24時間の時点で、BABプレート上での生細胞数算定を用いる菌血症の判定のために、各マウスの尾静脈から1mlのインスリン用シリンジ（12.7mm）を用いて少量の血液を採取した（図4）。Hap2、Hap 2とHap5との混合物、またはゲンタマイシンの投与により、24時間時点での血流内の緑膿菌の生菌レベルは有意に低下した。

実験のエンドポイントを決定するために、感染後168時間にわたって症状（体重、状態、挙動）を頻回にモニターし、マウスが瀕死の状態に至る前または至った直後に屠殺した。各個体が能動的に屠殺された感染後の時期を記録し、「生存」の指標として用いた。7日間の感染プロセスを生き延びた個体は、168時間という裁定下での生存期間を統計分析のために割り当てた（図5、表1）。感染マウスはすべて、感染後の最初の3日間で体重が減少したが、細菌曝露を生き延びた個体はその後回復し、感染1週間後までに体重がベースラインまで戻った。この傾向は抗体またはゲンタマイシンのいずれの投与によっても影響されなかった。マウスの生存期間は、マウスへのHap 5、Hap 2／Hap5またはゲンタマイシンの投与によって有意に延長した。Hap 2投与群およびHap2／5投与群の1匹のマウスは感染症に生き延びた。

（表１）肺感染症モデルにおけるマウスの生存期間

N＝各群6匹であり、^*P＜0.01および+P＜0.05は、示された群の方がPBS陰性対照よりも長いことを表し、S＝感染後に生き延びたことを表す。

実施例4：細菌量に対する抗体の効果
マウス6匹ずつの5つの投与群を上記の通りに感染させ、PBS、PBS＋抗体、またはゲンタマイシンという同一の療法を与えた。2つの時点（12時間および24時間）を、血液中の細菌（図6）、気管支肺胞洗浄（BAL）液（図7）および肺組織（図8）の分析のために選択した。統計学的妥当性を高めるために、血液分析によるデータを生存実験（実施例2）によるものと組み合わせた。この場合、血流内の緑膿菌の生存度は、Hap 2、Hap 5またはゲンタマイシンの投与により有意に低下した。

BAL液および血液中の細菌量は、前と同じくBABプレート上で連続希釈を用いる生細胞数算定によって決定した。感染12時間後の肺気道（BAL液）における緑膿菌の生存度は、マウスへのHap 2、Hap 5またはゲンタマイシンの投与によって有意に低下した。

肺組織中の細菌量は、肺を摘出し秤量して、電気組織ホモジナイザーを用いて5mlの無菌PBS中に均質化し、続いて生細胞数算定のために連続希釈物をBABプレート上にプレーティングすることによって決定した。細菌量の減少に関する同様の傾向が、感染24時間後に調べた肺組織では観察されたが（図8）、細菌量の統計学的に有意な減少が得られたのはHap5群およびゲンタマイシン群のみであった。

すべての結果の幾何平均を算出し、±1平均標準誤差（SEM）とともに表示している。生存アッセイ法は、Mann-Whitney U検定を用いて分析した。他のすべてのデータはStudentのt検定を用いて分析し、P値＜0.05を統計学的に有意とみなした。

引用した参考文献
米国特許文献
第6,309,651号 2001年10月 Frank et al.
その他の特許文献
WO 01／26650 2001年4月 University of Nottingham
WO 01／74801 2001年10月 University of Nottingham
WO 92／0104号 2001年10月 Bonnert et al.
その他の参考文献

遊離dDHLおよびBHLの存在下における、抗AHL一本鎖抗体Hap2およびHap5のdDHL-BSAとの結合に関する競合ELISAをそれぞれ示している。 氷上での40分間にわたる一本鎖抗体Hap2の存在下における、生きた動物中で継代した緑膿菌PA01の劇的な減少を示している。この減少は1.5 log CFU／mlの程度である。 モノクローナル一本鎖抗体Hap2またはHap5の存在下における、動物を用いずに継代した緑膿菌株PA14の生存度を、PBS対照と比較して示している。 生存試験中に感染24時間後に尾部から採取した血流中の生きた緑膿菌の細菌量を示している。感染24時間後の生存度は、マウスに対するHap2抗体、Hap2抗体とHap5抗体との混合物、またはゲンタマイシンの投与によって有意に低下した。N＝各群6匹。*P＜0.01および+P＜0.05は、指定された群の方がPBS陰性対照よりも低いことを表す。破線は、血液における生菌数算定アッセイ法の検出限界を表す。 肺感染症モデルのマウスの生存期間を示している。N＝各群6匹。*P＜0.01および+P＜0.05は指定された群の方がPBS陰性対照よりも長いことを表す。 感染24時間後に尾部から採取した血液中の細菌量を、生存試験および細菌学試験を合わせて示している。N＝各群12匹であり、*P＜0.01および+P＜0.05は、指定された群の方がPBS陰性対照よりも低いことを表す。破線は、血液における生菌数算定アッセイ法の検出限界を表す。 感染12時間後の時点での肺気道（BAL液）からの細菌量を示している。N＝各群6匹。*P＜0.01および+P＜0.05は、指定された群の方がPBS陰性対照よりも低いことを表す。破線は、肺気道における生菌数算定アッセイ法の検出限界を表す。 感染24時間後の時点での肺組織中の細菌量を示している。N＝各群6匹であり、*P＜0.01は、指定された群の方がPBS陰性対照よりも低いことを表す。破線は、肺組織における生菌数算定アッセイ法の検出限界を表す。

Claims (9)

1. 緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の集団の自己溶解を引き起こすインビトロの方法であって、緑膿菌の集団の環境におけるホモセリンラクトン（HL）シグナル分子とキノロンシグナル（QS）シグナル分子との比の不均衡を生じさせるために、緑膿菌によって分泌されるホモセリンラクトンシグナル分子に対する抗体を集団に投与することを含み、ホモセリンラクトン（HL）シグナル分子が、一般式（Ｉ）の式を有する、方法：
   

   

   式（I）
2. 一般式（I）のホモセリンラクトンシグナル分子が、n＝0の場合はN-ブタノイル-L-ホモセリンラクトン（BHL）であり、n＝8の場合はN-ドデカノイル-L-ホモセリンラクトン（dDHL）であり、かつn＝10の場合はn-テトラデカノイル-L-ホモセリンラクトン（tDHL）である、請求項1記載の方法。
3. キノロンシグナル（QS）シグナル分子が、以下の一般式（IV）の分子である、請求項1または2記載の方法：
   

   

   式（IV）
   式中、nが1〜7であり
   R₁が＝O、または-Hであり、
   R₂が-OHまたは-Hであり、かつ
   R₃が-Hである、または代替的には、窒素原子（N）が非置換性である。
4. 一般式（IV）のキノロンシグナルシグナル分子が、
   

   

   2-アシル-3-ヒドロキシ-4-キノロン
   である、請求項3記載の方法。
5. 2-アシル-3-ヒドロキシ-4-キノロンが、2-ヘプチル-3-ヒドロキシ-4-キノロン
   

   

   である、請求項4記載の方法。
6. 細菌シグナル分子の比が式（I）のアシル-ホモセリンラクトン（AHL）シグナル分子とシュードモナス（Pseudomonas）キノロンシグナル（PQS）シグナル分子との比である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
7. 抗体が、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそれらの断片である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
8. 抗体断片が一本鎖抗体断片（scAb）である、請求項7記載の方法。
9. 一本鎖抗体（scAb）が、それぞれNCIMB-41167、NCIMB-41168、NCIMB-41169、NCIMB-41170として寄託されている、G3H5、G3B12、G3G2および／またはG3H3である、請求項8記載の方法。

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