JP5147379B2 - Method and apparatus for visualizing melanin distribution - Google Patents
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Description
本発明は、生体組織のメラニン分布を可視化する方法及びその装置に関する。 The present invention relates to a method and apparatus for visualizing melanin distribution in a living tissue.
従来、非侵襲でかつ、細胞レベルの分解能をもつ皮膚内部イメージング法として、共焦点顕微鏡が広く使用されてきた。この共焦点顕微鏡としては、反射型共焦点顕微鏡、例えばVivascope（登録商標）(Lucid社, NY, USA)、及び蛍光共焦点顕微鏡、例えばOptiscan（登録商標）(Optiscan Pty Ltd, Melbourne, Austraria)が市販されている。Vivascopeは830nmの近赤外レーザー光源を持ち、生体からの反射光をイメージングする装置である。細胞内小器官や、特にメラノソーム（メラニン）が高い屈折率(n=1.7)をもち画像に高いコントラストを与える（非特許文献１〜３)。一方、Optiscan（登録商標）は４８８ｎｍのブルーレーザー光源を持ち、フルオレセインナトリウムなどの蛍光物質を塗布あるいは、皮下注射して、生体内の蛍光物質の分布をイメージングする（非特許文献４及び５）。いずれも、ピンホールを用いることで高い空間分解能を実現している。 Conventionally, a confocal microscope has been widely used as a skin internal imaging method that is non-invasive and has cell-level resolution. Examples of the confocal microscope include a reflective confocal microscope such as Vivascope (registered trademark) (Lucid, NY, USA), and a fluorescent confocal microscope such as Optiscan (registered trademark) (Optiscan Pty Ltd, Melbourne, Austraria). It is commercially available. Vivascope is a device that has a 830 nm near-infrared laser light source and images reflected light from a living body. Intracellular organelles, especially melanosomes (melanin) have a high refractive index (n = 1.7) and give high contrast to images (Non-Patent Documents 1 to 3). On the other hand, Optiscan (registered trademark) has a blue laser light source of 488 nm and applies or subcutaneously injects a fluorescent substance such as fluorescein sodium to image the distribution of the fluorescent substance in the living body (Non-patent Documents 4 and 5). In both cases, high spatial resolution is achieved by using pinholes.
Vivascopeは、メラニンによるレーザーの反射光を利用することで、生体内部のメラニン分布の可視化が可能であるとの報告があるが(特許文献１)、実際は、真皮コラーゲン線維、顆粒層、角層などメラニン以外にもさまざまな反射物質が存在し、それらと区別できない。また、メラノソームのサイズは３００〜７００ｎｍであり（非特許文献６）、サイズの小さなメラノソームはイメージングできない。このため、メラニンとそれ以外のものとを判別する際に、精度や信頼性に問題ある。 There is a report that Vivascope can visualize the distribution of melanin inside the living body by using the reflected light of laser by melanin (Patent Document 1), but in fact, dermal collagen fiber, granule layer, stratum corneum, etc. In addition to melanin, there are various reflective materials that cannot be distinguished from them. The size of melanosomes is 300 to 700 nm (Non-patent Document 6), and melanosomes with small sizes cannot be imaged. For this reason, there is a problem in accuracy and reliability when discriminating between melanin and others.
また、最近では、非侵襲、高分解能で生体皮膚内部が観察可能であり、蛍光寿命から物質を特定することが可能である生体２光子励起蛍光顕微鏡、例えば、DermaInspect （JENLAB GMBH, Jena, Germany）が市販されている。この蛍光顕微鏡は、可変波長（７２０ｎｍ〜９３０ｎｍ）フェムト秒レーザー光源を持ち、対物レンズでレーザーを生体中の一点に焦点し、当該焦点に十分な光子が存在する場合のみ非線形過程である２光子励起を起こすという特徴を有している。ここで、２光子励起とは、励起光波長に相当するエネルギーの２倍に相当する励起過程を指す。２光子励起による蛍光を利用することによって、当該蛍光顕微鏡は上述の共焦点顕微鏡とは異なりピンホールを用いずに高分解能のイメージングを実現している。
当該蛍光顕微鏡は、発色団（Chromophore）として生体内の自家蛍光物質を利用するものであり、NAD(P)H、フラビン類（Flavines）、エラスチン（Elastin）、コラーゲン（Collagen）、メラニン（Melanin）、リポスチン（Lipofuscin）等の生体物質の蛍光寿命が測定できることが報告されている(非特許文献７)。
Recently, a living body two-photon excitation fluorescence microscope, such as DermaInspect (JENLAB GMBH, Jena, Germany), which is capable of observing the inside of living body with non-invasive and high resolution and capable of specifying a substance from the fluorescence lifetime. Is commercially available. This fluorescence microscope has a variable wavelength (720 nm to 930 nm) femtosecond laser light source, the laser is focused on a point in the living body with an objective lens, and a two-photon excitation that is a nonlinear process only when sufficient photons are present at the focus It has the feature of causing. Here, two-photon excitation refers to an excitation process corresponding to twice the energy corresponding to the excitation light wavelength. By using fluorescence by two-photon excitation, the fluorescence microscope realizes high-resolution imaging without using a pinhole, unlike the confocal microscope described above.
The fluorescence microscope uses an in-vivo autofluorescent substance as a chromophore, NAD (P) H, flavins, elastin, collagen, melanin It has been reported that the fluorescence lifetime of biological substances such as liposcin can be measured (Non-patent Document 7).
当該蛍光顕微鏡を用いたメラニン測定に関しても、いくつかの報告が挙げられている。
例えば、Teuchnerらは合成メラニンの蛍光特性を減衰曲線を用いて詳細に調べ(非特許文献８)、自家蛍光の減衰曲線を３つの指数係数（exponential curve）でフィッティングすると、τ1＝０．２０ｎｓ（Ａ1／（Ａ1＋Ａ2＋Ａ3）＝０．５６）、τ2＝１．５ｎｓ（Ａ2／（Ａ1＋Ａ2＋Ａ3）＝０．３２）、τ３＝５．８ｎｓ（Ａ2／（Ａ1＋Ａ2＋Ａ3）＝０．１１）であるとの報告がなされている。ここでτ1、τ2、τ3は３つの蛍光寿命、Ａ1、Ａ2、Ａ3はそれら蛍光寿命に対応する振幅を示す。
Several reports have been given regarding melanin measurement using the fluorescence microscope.
For example, Teuchner et al. Examined the fluorescence characteristics of synthetic melanin in detail using an attenuation curve (Non-Patent Document 8), and fitting the autofluorescence decay curve with three exponential curves (τ 1 = 0.20 ns). (A 1 / (A 1 + A 2 + A 3 ) = 0.56), τ 2 = 1.5 ns (A 2 / (A 1 + A 2 + A 3 ) = 0.32), τ 3 = 5.8 ns (A 2 / (A 1 + A 2 + A 3 ) = 0.11) has been reported. Here, τ 1 , τ 2 , and τ 3 indicate three fluorescence lifetimes, and A 1 , A 2 , and A 3 indicate amplitudes corresponding to the fluorescence lifetimes.
また、Konigらは、メラノーマ組織の蛍光寿命イメージングを行った組織中メラニンクラスターからの自家蛍光の減衰曲線を２つの指数係数（exponential curve）でフィッティングした結果、τ1=30ps〜150psであるとの報告がなされている。また、蛍光波長は青から赤にわたり５９０ｎｍをピークとする（非特許文献９）。人毛髪（黒色）中のメラニンを対象とした研究では、同様の解析で、τ1＝０．２０ｎｓ、τ2＝１．３ｎｓ、Ａ1／Ａ2＝９（Ａ1／（Ａ1＋Ａ2）＝０．９０、Ａ2／（Ａ1＋Ａ2）＝０．１０）であること、また、合成メラニンあるいは母斑（ほくろ）メラノサイトではＡ1／Ａ2＞４（Ａ1／（Ａ1＋Ａ2）＞０．８０）であるとの報告がなされている（非特許文献１０）。
本発明は、生体内メラニンの分布を精度よく可視化する方法及び装置を提供することに関する。 The present invention relates to providing a method and apparatus for accurately visualizing the distribution of melanin in a living body.
生体組織には種々の自家蛍光物質が存在し、また蛍光寿命は発色団（Chromophore）の環境により大きく変化する。また、生体組織は組織変性が起こりやすく、特にメラニンを多く含む組織（毛髪など）でこの現象は多発する。
このため、本来であれば、生体組織中のメラニンの蛍光減衰曲線を求めるためには、レーザパワーに対して細心の注意を払いつつ測定すると同時に、測定後、精度の高いフォンタナマッソン染色法など従来法によるメラニン分布との対比が必要であるが、従来、このような測定や対比はなされていない。従って、信頼性の高い生体メラニン判別法は未だ確立されていないと考えられた。
そこで、本発明者らは、後述したように、生体２光子励起顕微鏡を用いて、メラニンを含む生体サンプルを対象として、意図的にレーザパワーを上げ蛍光強度を明るく変化させて組織変性となった部分を測定したところ、τ1＝０．１３ｎｓ、τ2＝０．５ｎｓ、Ａ1／Ａ2は１０程度の測定値が得られ、この測定値はKonigらの毛髪における報告値（非特許文献１０）とほぼ同じであった。つまり、Konigらは変性した組織を観察した可能性が高いことを見出した。
There are various autofluorescent substances in living tissues, and the fluorescence lifetime varies greatly depending on the environment of the chromophore. In addition, tissue degeneration is likely to occur in living tissues, and this phenomenon occurs frequently in tissues containing a lot of melanin (such as hair).
For this reason, in order to obtain the fluorescence decay curve of melanin in living tissue, measurement is performed with great care for laser power, and at the same time, after measurement, a highly accurate Fontana Masson staining method is conventionally used. Comparison with the melanin distribution by the method is necessary, but such measurement and comparison have not been made conventionally. Therefore, it was considered that a highly reliable biological melanin discrimination method has not yet been established.
Therefore, as described later, the present inventors intentionally increased the laser power and changed the fluorescence intensity brightly to produce a tissue degeneration using a biological two-photon excitation microscope as a target for a biological sample containing melanin. When the portion was measured, τ 1 = 0.13 ns, τ 2 = 0.5 ns, and A 1 / A 2 were about 10 measured values, which were reported in Konig et al. It was almost the same as 10). That is, Konig et al. Found that there was a high possibility of observing denatured tissue.
更に、本発明者らは、生体２光子励起顕微鏡を用いて、メラニンを含むさまざまなサンプルを対象としてメラニン蛍光特性を種々検討した結果、皮膚からの自家蛍光の減衰曲線を２次減衰曲線に近似して、蛍光寿命に係る２つの係数τ1及びτ2と、蛍光寿命に対する振幅に係る２つの係数Ａ1及びＡ2を決定し、Ａ1／Ａ2比を求めた場合に、その値が所定値以上となる蛍光をメラニンからの蛍光と判定でき、これを指標としてメラニン分布を可視化できることを見出した。 Furthermore, the present inventors have examined various melanin fluorescence characteristics for various samples containing melanin using a living body two-photon excitation microscope, and as a result, approximated the decay curve of autofluorescence from the skin to a secondary decay curve. Then, when the two coefficients τ 1 and τ 2 related to the fluorescence lifetime and the two coefficients A 1 and A 2 related to the amplitude with respect to the fluorescence lifetime are determined and the A 1 / A 2 ratio is obtained, the values are It has been found that fluorescence having a predetermined value or more can be determined as fluorescence from melanin, and melanin distribution can be visualized using this as an index.
すなわち、本発明は以下に係るものである。
１）生体組織の所定深度に対してレーザー光を平面的に走査させて照射し該組織からの自家蛍光を受光する装置を用い、生体組織に存在するメラニンの自家蛍光の減衰曲線を２次減衰曲線に近似して、蛍光寿命に係る係数τ1及びτ2と、蛍光寿命に対する振幅に係る係数Ａ1及びＡ2を決定してメラニン分布を可視化する方法であって、Ａ1／Ａ2比に１２〜３３の閾値を設け、当該閾値を超える蛍光をメラニンに起因する蛍光と判別することを特徴とする、生体組織のメラニン分布可視化方法。
That is, the present invention relates to the following.
1) Second-order attenuation of the autofluorescence decay curve of melanin present in a living tissue using a device that scans and irradiates laser light with a predetermined depth of the living tissue and receives autofluorescence from the tissue. A method of visualizing a melanin distribution by determining coefficients τ 1 and τ 2 related to fluorescence lifetime and coefficients A 1 and A 2 related to amplitude with respect to fluorescence lifetime by approximating a curve, the ratio A 1 / A 2 A method for visualizing a melanin distribution in a living tissue, wherein a threshold value of 12 to 33 is provided, and fluorescence exceeding the threshold value is discriminated from fluorescence caused by melanin.
２）生体組織の所定深度に対してレーザー光を平面的に走査させて照射し該組織からの自家蛍光を受光する装置を用い、生体組織に存在するメラニンの自家蛍光の減衰曲線を２次減衰曲線に近似して、蛍光寿命に係る係数τ1及びτ2と、蛍光寿命に対する振幅に係る係数Ａ1及びＡ2を決定してメラニン分布を可視化する皮膚のメラニン分布を可視化する装置であって、Ａ1／Ａ2比に１２〜３３の閾値を設け、当該閾値を超える蛍光をメラニンに起因する蛍光と判別する解析手段を具備することを特徴とする、メラニン分布可視化装置。 2) Second-order attenuation of the autofluorescence decay curve of melanin in living tissue using a device that scans and irradiates laser light with a predetermined depth in the living tissue and receives autofluorescence from the tissue. An apparatus for visualizing a skin melanin distribution by visualizing a melanin distribution by determining coefficients τ 1 and τ 2 related to a fluorescence lifetime and coefficients A 1 and A 2 related to an amplitude with respect to the fluorescence lifetime by approximating a curve A melanin distribution visualization apparatus, comprising an analyzing means for providing a threshold value of 12 to 33 in the A 1 / A 2 ratio and discriminating fluorescence exceeding the threshold value from fluorescence caused by melanin.
本発明を用いれば、生体組織を傷つけることなく、生体組織内の所定深度に存在するメラニンをより精度よく簡便に可視化することができる。 By using the present invention, melanin existing at a predetermined depth in a living tissue can be visualized more accurately and easily without damaging the living tissue.
本発明において、生体組織の所定深度に対してレーザー光を平面的に走査させて照射すると共に該組織からの自家蛍光を受光する装置としては、例えば、図１に示す光学系を備えた、生体２光子励起蛍光顕微鏡装置１（以下、顕微鏡装置ともいう。）が挙げられる。具体的には、例えば、Dermalnspect（登録商標：JenLab GmbH Jena社）が挙げられ、当該顕微鏡装置１には、フェムトセカンドレーザー光源２、同期用光検出素子３、レーザーパワー減衰器４、レーザーパワー検出素子５、シャッター６、高速ガルバノスキャナー７、ビームエキスパンダー８、ビームスプリッター９、Ｚ軸微動用ピエゾ素子１０、対物レンズ１１、サンプル固定器１２、フィルター１３、フォトンカウンター１４が備えられている。 In the present invention, as a device that irradiates and scans a laser beam in a plane with respect to a predetermined depth of a living tissue and receives autofluorescence from the tissue, for example, a living body including the optical system shown in FIG. An example is a two-photon excitation fluorescence microscope apparatus 1 (hereinafter also referred to as a microscope apparatus). Specific examples include Dermalnspect (registered trademark: JenLab GmbH Jena). The microscope apparatus 1 includes a femtosecond laser light source 2, a synchronizing light detection element 3, a laser power attenuator 4, and a laser power detection. An element 5, a shutter 6, a high-speed galvano scanner 7, a beam expander 8, a beam splitter 9, a Z-axis fine movement piezo element 10, an objective lens 11, a sample fixing device 12, a filter 13, and a photon counter 14 are provided.
当該顕微鏡装置１は、フェムトセカンドレーザー光源２を備え、この光源２は、平均出力100ｍＷ以上、パルス幅３００ｆｓ以下のレーザー光（ＩＲ光）を出力する能力を有する。 波長可変型（７２０ｎｍ〜９３０ｎｍ）、平均出力２．５Ｗ、パルス幅８０ｆｓ以下、モードロック周波数８０ＭＨｚがより好ましい。当該光源２の波長は、生体組織による光吸収、散乱の少ない７００ｎｍ〜１０００ｎｍが好ましく、生体組織に存在するメラニンを十分に励起でき（より短波長がよい）、かつ、生体皮膚へのダメージを最小限にとどめるため（より長波長がよい）７５０〜８５０ｎｍがより好ましい。 The microscope apparatus 1 includes a femtosecond laser light source 2, and the light source 2 has an ability to output laser light (IR light) having an average output of 100 mW or more and a pulse width of 300 fs or less. A wavelength variable type (720 nm to 930 nm), an average output of 2.5 W, a pulse width of 80 fs or less, and a mode lock frequency of 80 MHz are more preferable. The wavelength of the light source 2 is preferably 700 nm to 1000 nm with less light absorption and scattering by living tissue, can sufficiently excite melanin existing in living tissue (shorter wavelength is better), and minimizes damage to living skin. 750 to 850 nm is more preferable in order to keep it to the limit (the longer wavelength is better).
この光源２から照射されたレーザー光は、サンプル固定器１２の上に固定された生体組織のＸ−Ｙ平面状を走査するための高速ガルバノスキャナー７を通過し、ビームスプリッター９で反射し、対物レンズ１１によって、生体組織、例えば皮膚組織の所定の深度に対して一点に集光される。 The laser light emitted from the light source 2 passes through a high-speed galvano scanner 7 for scanning the XY plane of the biological tissue fixed on the sample fixing device 12, is reflected by the beam splitter 9, and is reflected by the objective. The lens 11 collects light at one point with respect to a predetermined depth of a living tissue, for example, skin tissue.
生体からの自家蛍光強度は小さく励起レーザーパワーは０．１ｍＷ以上が望ましい。
強いエネルギーの励起光を生体組織に照射すると突然、生体組織からの蛍光強度が強くなる場合があり、輝度の明るく変化した部分の蛍光特性（寿命）はメラニン蛍光と区別がつかない場合があることから（試験例２参照）、励起レーザーパワーは、最小限に抑えることが好ましく、２０ｍＷ以下に制限するのが好ましい。
また、励起レーザーパワーはメラニンの密度の高い抜去毛球部のＦＬＩＭ（Fluorescence Life Time Imaging）をとる場合１ｍＷ以下、直接レーザーに暴露される皮膚表面近傍で８ｍＷ以下、メラニンの比較的多い露光部表皮基底層で１０ｍＷ以下が望ましい。
The intensity of autofluorescence from the living body is small, and the excitation laser power is preferably 0.1 mW or more.
When the living tissue is irradiated with strong energy excitation light, the fluorescence intensity from the living tissue may suddenly increase, and the fluorescence characteristics (lifetime) of the brightly changed portion may not be distinguishable from melanin fluorescence. (See Test Example 2), the excitation laser power is preferably suppressed to a minimum and is preferably limited to 20 mW or less.
In addition, the excitation laser power is 1 mW or less when FLIM (Fluorescence Life Time Imaging) of the extracted hair bulb portion where the density of melanin is high, 8 mW or less near the skin surface directly exposed to the laser, and the exposed portion epidermis with relatively high melanin 10 mW or less is desirable for the base layer.
そして、生体組織に存在するメラニンから発生した自家蛍光は、対物レンズ１１、ビームスプリッター９を通過して、フォトンカウンター１４によって検出される。
検出の際の波長は、できるだけ多くのフォトンを検出するために、フィルター等により制限しないほうが良いが、生体組織に存在するメラニン以外の物質からメラニンの自家蛍光と誤認されやすい光が発生するおそれがある場合には、この誤認されやすい光を除くため、ビームスプリッター９とフォトカウンター１４との間にバンドパスフィルターのようなフィルター１３を設置することが好ましい。
例えば、生体組織中にコラーゲンが存在する可能性がある場合には、生体組織においてコラーゲン分子から生体第２高調波発生光（ＳＨＧ光）が発生し、このＳＨＧ光はメラニンの自家蛍光と誤認されるおそれがあることから、このＳＨＧ光を除くためバンドパスフィルター（４５０±４０ｎｍ）をフィルター１３として設置することが好ましい。
Then, autofluorescence generated from melanin present in the living tissue passes through the objective lens 11 and the beam splitter 9 and is detected by the photon counter 14.
In order to detect as many photons as possible, it is better not to limit the wavelength at the time of detection by a filter or the like. However, there is a risk that light other than melanin present in living tissue is likely to be mistaken for autofluorescence of melanin. In some cases, it is preferable to install a filter 13 such as a band-pass filter between the beam splitter 9 and the photo counter 14 in order to remove the light that is easily misidentified.
For example, when there is a possibility that collagen exists in the living tissue, living body second harmonic generation light (SHG light) is generated from the collagen molecule in the living tissue, and this SHG light is mistaken for autofluorescence of melanin. Therefore, it is preferable to install a bandpass filter (450 ± 40 nm) as the filter 13 in order to remove this SHG light.
検出された自家蛍光のデータに基づき自家蛍光減衰曲線を作成し、当該蛍光減衰曲線（τ）を下記式で示される二次減衰関数に近似して、蛍光寿命に関する４つのパラメータ（蛍光寿命（τ1、τ2）、蛍光寿命に対する振幅（Ａ1、Ａ2））を決定する。 An autofluorescence decay curve is created based on the detected autofluorescence data, the fluorescence decay curve (τ) is approximated to a secondary decay function represented by the following formula, and four parameters (fluorescence lifetime (τ 1 , τ 2 ), and the amplitude for the fluorescence lifetime (A 1 , A 2 )).
上記パラメータの算出は、例えば、SPCImage2.8（Becker & Hickl GmbH）等の解析ソフトウェアを用いて行うことができる。 The calculation of the parameters can be performed using analysis software such as SPCImage2.8 (Becker & Hickl GmbH).
次いで、決定されたＡ1とＡ2に基づき、Ａ1／Ａ2比を算出し、当該Ａ1／Ａ2比が、当該Ａ1／Ａ2比に対して設定されている１２〜３３の閾値を超える自家蛍光をメラニンに起因する蛍光と判別される。
後記実施例に示すように、メラニンの蛍光特性は、τ1成分がτ2成分より短く（τ1の平均が１２０±１９ｐｓ、τ2の平均１１００±４０１ｐｓ）、Ａ1／Ａ2比が大きい（１４〜３３（平均：２４±７）という特徴を有する（表１）。また、正常な組織において、メラニン以外の生体成分からＡ1／Ａ2＞１２の蛍光特性は観察されない。
Next, based on the determined A 1 and A 2 , the A 1 / A 2 ratio is calculated, and the A 1 / A 2 ratio is set to 12 to 33 with respect to the A 1 / A 2 ratio. Autofluorescence exceeding the threshold is discriminated from fluorescence caused by melanin.
As shown in the examples described later, in the fluorescence characteristics of melanin, the τ 1 component is shorter than the τ 2 component (the average of τ 1 is 120 ± 19 ps, the average of τ 2 is 1100 ± 401 ps), and the A 1 / A 2 ratio is large. (14 to 33 (average:. 24 has a feature that ± 7) (Table 1) in addition, in normal tissues, fluorescence properties of a 1 / a 2> 12 from the biological components other than melanin is observed.
閾値を１２〜３３に設定すれば、強いエネルギーの励起光を生体組織に照射した場合あるいは生体組織の一点に長時間照射した場合に出現する、メラニンの存在の有無に関わらず生体組織から発せられる強い自家蛍光と、メラニンからの自家蛍光との分離が可能であり、また、組織が損傷（細胞死）した場合に出現するメラニンと似た蛍光寿命を持つ自家蛍光物質、例えば、傷害を受けたケラチノサイトからの自家蛍光とメラニンからの自家蛍光を分離することが可能である（試験例２）。
また、閾値（Ａ1／Ａ2）を２０に設定すれば、３Ｄ培養皮膚組織切片において、そのイメージング画像は、メラニン顆粒の染色法として知られているフォンタナマッソン染色による染色像と一致した。
よって、メラニンからの蛍光の閾値として、１２〜３３を設定することができ、係る閾値を超える蛍光をメラニンに起因する蛍光と判断し、生体皮膚、毛髪、細胞等の生体組織に対して、メラニン分布のインビボでの可視化が可能となる。
If the threshold is set to 12 to 33, it is emitted from the living tissue regardless of the presence or absence of melanin that appears when the living tissue is irradiated with excitation light of strong energy or when one point of the living tissue is irradiated for a long time. It is possible to separate strong autofluorescence from autofluorescence from melanin, and autofluorescent substances that have a fluorescence lifetime similar to that of melanin that appears when tissues are damaged (cell death), such as injured It is possible to separate autofluorescence from keratinocytes and autofluorescence from melanin (Test Example 2).
When the threshold value (A 1 / A 2 ) was set to 20, the imaging image in the 3D cultured skin tissue section coincided with a stained image by Fontanamasson staining, which is known as a staining method for melanin granules.
Therefore, 12 to 33 can be set as the threshold value of the fluorescence from melanin, and the fluorescence exceeding the threshold value is determined to be the fluorescence caused by melanin, and the melanin is applied to living tissues such as living skin, hair and cells. Visualization of the distribution in vivo is possible.
一般的に蛍光寿命曲線を構成する４つのパラメータτ1、Ａ1、τ2、Ａ2の算出には、１０００カウント以上のピークフォトン数（蛍光強度）が必要とされる。一方で、生体組織のダメージを低減するために励起パワーをできるだけ小さく抑えることが求められる。
表１からの各試料のメラニン蛍光寿命から求めたτ1＝９７ｐｓ〜１６２ｐｓ及びτ2＝５０３ｐｓ〜１５９８ｐｓを下記式のごとく、τ1、τ2を固定値にすると、より少ないピークフォトン数で曲線近似が可能でありる。
Generally, the calculation of four parameters τ 1 , A 1 , τ 2 , and A 2 constituting the fluorescence lifetime curve requires a peak photon number (fluorescence intensity) of 1000 counts or more. On the other hand, it is required to keep the excitation power as small as possible in order to reduce damage to living tissue.
When τ 1 = 97 ps to 162 ps and τ 2 = 503 ps to 1598 ps obtained from the melanin fluorescence lifetime of each sample from Table 1 are set to the following formulas, and τ 1 and τ 2 are fixed values, a curve with a smaller number of peak photons is obtained. Approximation is possible.
すなわち、本発明おいては、自家蛍光の減衰曲線を上記式によって、カーブフィッティングし、Ａ1／Ａ2比を求め、その閾値に基づきメラニンに起因する蛍光と判別し、この結果をメラニン分布のイメージングするのが最適である。 That is, in the present invention, the autofluorescence decay curve is curve-fitted according to the above formula, the A 1 / A 2 ratio is obtained, the fluorescence caused by melanin is determined based on the threshold value, and this result is determined as the melanin distribution. It is best to image.
本発明の方法で判別する生体組織としては、ヒトやイヌ、ネコ、マウス、ラット、サル等の非ヒト動物及びこれら由来のものであれば特に制限されないが、ヒト及びヒト由来のものが好ましい。ヒト及びヒト由来のものとしては、白色人種、黄色人種又は黒色人種のいずれのものでもよいが、黄色人種又は黒色人種のものが好ましい。
また、判別する生体組織の部位としては、メラニンが組織内に存在する部位であればよく、例えば、皮膚、毛髪、毛包、培養細胞等が挙げられる。
The biological tissue discriminated by the method of the present invention is not particularly limited as long as it is derived from non-human animals such as humans, dogs, cats, mice, rats, monkeys, and the like, but those derived from humans and humans are preferable. As a thing derived from a human and a human, any of a white race, a yellow race, or a black race may be sufficient, but the thing of a yellow race or a black race is preferable.
Moreover, as a site | part of the biological tissue which discriminate | determines, what is necessary is just a site | part in which melanin exists in a structure | tissue, For example, skin, hair, a hair follicle, a cultured cell etc. are mentioned.
上記の手法を用いるメラニン分布の解析は、生体組織の所定の深部に対してレーザー光を平面的に走査させて照射し、生体組織に存在するメラニンを励起させ、このメラニンから発生する自家蛍光を受光して自家蛍光の減衰曲線を作成し、自家蛍光の減衰曲線を二次減衰曲線に近似して、蛍光寿命に関する４つのパラメータ（蛍光寿命（τ1、τ2）、蛍光寿命に対する振幅（Ａ1、Ａ2））が算出された後、以下のようなプログラムを構築してコンピュータに実行させることによって行われる（図２のフローチャート参照）。 The analysis of melanin distribution using the above method is to irradiate a predetermined depth of a living tissue by scanning a laser beam in a plane to excite melanin existing in the living tissue, and to detect autofluorescence generated from this melanin. By receiving light, an autofluorescence decay curve is created, the autofluorescence decay curve is approximated to a secondary decay curve, and four parameters relating to the fluorescence lifetime (fluorescence lifetime (τ 1 , τ 2 ), amplitude with respect to the fluorescence lifetime (A 1 , A 2 )) are calculated, and the following program is constructed and executed by the computer (see the flowchart in FIG. 2).
１）Ａ1／Ａ2比を求める（ステップ１）
２）Ａ1／Ａ2比の値が上述の所定の閾値を超えるか否かを判断する（ステップ２：ＹＥＳ／ＮＯ）。
３）Ａ1／Ａ2比が上述の所定の閾値を越える場合には、メラニンに起因する蛍光と判別する（ステップ２：ＹＥＳ，ステップ３）。一方、Ａ1／Ａ2比が所定の閾値を超えない場合には、メラニン以外の物質に起因する蛍光と判別する（ステップ２：Ｎｏ，ステップ４）。
1) Find the A 1 / A 2 ratio (step 1)
2) It is determined whether or not the value of the A 1 / A 2 ratio exceeds the above-described predetermined threshold value (step 2: YES / NO).
3) When the A 1 / A 2 ratio exceeds the above-mentioned predetermined threshold, it is determined that the fluorescence is caused by melanin (step 2: YES, step 3). On the other hand, if the A 1 / A 2 ratio does not exceed the predetermined threshold, it is determined that the fluorescence is caused by a substance other than melanin (Step 2: No, Step 4).
尚、ステップ３及び４において、メラニンに起因する蛍光として判別されたデータと、メラニン以外の物質として判別されたデータとを、それぞれ異なる色調データに変換し、更にメラニンとメラニン以外の物質とにイメージングしてディスプレイやプリンタ等に出力することも可能である。 In Steps 3 and 4, the data discriminated as fluorescence caused by melanin and the data discriminated as a substance other than melanin are converted into different tone data, and further imaged into melanin and a substance other than melanin. It is also possible to output to a display, a printer or the like.
本発明のメラニン分布可視化装置は、上述した生体組織の所定深度に対してレーザー光を平面的に走査させて照射すると共に生体組織からの自家蛍光を受光する装置（光学顕微鏡部）と、蛍光寿命に関する４つのパラメータ（蛍光寿命（τ1、τ2）、蛍光寿命に対する振幅（Ａ1、Ａ2））の算出、メラニンの判別及びメラニン分布の可視化等の処理を行う解析部並びにメラニン分布の２次元又は３次元の画像を出力する等の入出力部を備え、これら各部はバスで相互に接続されている。 The melanin distribution visualization apparatus of the present invention includes a device (optical microscope unit) that receives and emits autofluorescence from a living tissue while irradiating the above-described predetermined depth of the living tissue with laser light in a plane. 4 parameters (fluorescence lifetimes (τ 1 , τ 2 ), amplitudes with respect to fluorescence lifetimes (A 1 , A 2 )), an analysis unit for processing such as melanin discrimination and melanin visualization, and melanin distribution 2 An input / output unit for outputting a three-dimensional or three-dimensional image is provided, and these units are connected to each other via a bus.
この解析部には、記憶部及び記憶部に格納されたプログラムに従って実行するＣＰＵ等が備えられている。
この記憶部には、例えば、ＣＤ、ＤＶＤ及びハードディスク等の磁気的、光学的記録媒体又は半導体メモリで構成される不揮発性の記憶媒体が備えられている。
この記憶部には、メラニンの分布の判別及びレーザー光を走査した範囲におけるメラニン分布の２次元又は３次元画像生成並びに装置全体の動作に係る各種機能を実現するためのプログラムと、当該プログラムの実行に使用されるデータとを記憶しており、当該プログラムはＣＰＵによって実行される。
なお、この記憶部には、蛍光寿命に係る係数τ1及びτ2と、蛍光寿命に対する振幅に係る係数Ａ1及びＡ2を算出し、算出されたパラメータに基づき２次元又は３次元画像生成できるソフトウェア、たとえばSPCImage2.8（Becker & Hickl GmbH）を格納していてもよい。
The analysis unit includes a storage unit and a CPU that executes the program according to a program stored in the storage unit.
The storage unit includes a non-volatile storage medium including a magnetic or optical recording medium such as a CD, a DVD, and a hard disk, or a semiconductor memory.
The storage unit includes a program for realizing various functions relating to the determination of the distribution of melanin, the generation of a two-dimensional or three-dimensional image of the melanin distribution in a range scanned with laser light, and the operation of the entire apparatus, and the execution of the program The data used for the storage is stored, and the program is executed by the CPU.
In this storage unit, coefficients τ 1 and τ 2 related to the fluorescence lifetime and coefficients A 1 and A 2 related to the amplitude with respect to the fluorescence lifetime can be calculated, and a two-dimensional or three-dimensional image can be generated based on the calculated parameters. Software such as SPCImage2.8 (Becker & Hickl GmbH) may be stored.
入出力部は、キーボード、プリンタ、液晶ディスプレイ等の表示画面等を備えており、キーボード等により入力されたデータを解析部に送信したり、また解析部で算出・判別されたデータに基づきメラニン分布の２次元又は３次元画像を生成してプリンタや表示画面等に出力する。 The input / output unit has a display screen such as a keyboard, printer, liquid crystal display, etc., and sends data input from the keyboard etc. to the analysis unit, and also distributes melanin based on the data calculated and discriminated by the analysis unit Are generated and output to a printer, a display screen, or the like.
試験例１：メラニン蛍光特性の検討
（１）生体２光子励起蛍光顕微鏡
生体組織中にメラニンを多く含むと思われる以下のサンプルａ）〜ｄ）のヒト皮膚、ヒト皮膚由来、ヒト毛球のヒト由来サンプル４種、メラニンが存在しない３Ｄ培養皮膚のサンプルｅ）について、生きたままの試料の蛍光寿命を生体２光子励起蛍光顕微鏡（DermaInspect JENLAB GMBH, Jena, Germany）を用いて測定した。
サンプル：
ａ）３Ｄ培養皮膚（MEL-300（Mat Tek Corporation アジア人種由来メラノサイト含）
ｂ）培養メラノサイト（黒人由来 入手先 クラボウ）
ｃ）人前腕しみ部表皮メラニンキャップ（日本人健康男性前腕部）
ｄ）抜去毛の毛根部（日本人健康男性頭部より抜去）
ｅ）３Ｄ培養皮膚（EPI-200（Mat Tek Corporation メラノサイト無）入手先 クラボウ）
Test Example 1: Examination of Melanin Fluorescence Characteristics (1) Biological Two-Photon Excitation Fluorescence Microscope Human skin of the following samples a) to d) that are considered to contain a lot of melanin in living tissue, human skin origin, human hair bulb human The fluorescence lifetime of the living sample was measured using a living body two-photon excitation fluorescence microscope (DermaInspect JENLAB GMBH, Jena, Germany) for 4 samples derived from the sample e) of 3D cultured skin without melanin.
sample:
a) 3D cultured skin (including MEL-300 (Mat Tek Corporation Asian melanocytes)
b) Cultured melanocytes (Black-source source: Kurabo Industries)
c) Human forearm spot skin melanin cap (Japanese healthy male forearm)
d) Hair root of extracted hair (extracted from Japanese healthy male head)
e) 3D cultured skin (EPI-200 (Mat Tek Corporation without melanocytes) from Kurabo Industries)
測定条件としては、励起波長は７６０ｎｍ、８００ｎｍ、走査範囲は２００μｍ四方（場合により１００μｍ四方）、レーザーによる損傷を防ぐため、レーザーのパワーはメラニンを含有する組織に対しては１ｍＷ〜１０ｍＷの範囲であった。サンプルａ）、ｃ）、ｅ）は表面を水でぬらし、カバーグラスを乗せカバーグラスを介して測定した。サンプルｂ）は培養チャンバー（ガラスベースデッシュ（旭テクノグラス））にメラノサイトを播種したのち、培地（Ｍｅｄｉｕｍ２５４（クラボウ））でチャンバー内を満たし、培養チャンバー底面のカバーグラスを介して測定した。サンプルｄ）は抜去直後にスライドグラス上のＰＢＳ（−）に浸し、そのままカバーグラスで覆い、カバーグラスを介して測定した。
各試料から得られたデータに基づき、ソフトウェアSPCImage2.8（Becker & Hickl GmbH）により、自家蛍光減衰曲線を二次減衰曲線にフィッティングして蛍光寿命を構成する４つのパラメータのτ1、Ａ1、τ2、Ａ2を求めた。
Measurement conditions include excitation wavelengths of 760 nm and 800 nm, scanning range of 200 μm square (in some cases 100 μm square), and laser power in the range of 1 mW to 10 mW for tissues containing melanin. there were. Samples a), c), and e) were measured through a cover glass with the surface wetted with a cover glass. Sample b) was seeded in a culture chamber (glass base dish (Asahi Techno Glass)), filled with the medium (Medium 254 (Kurabo)), and measured through a cover glass on the bottom of the culture chamber. Sample d) was immersed in PBS (-) on a slide glass immediately after removal, covered with a cover glass as it was, and measured through the cover glass.
Based on the data obtained from each sample, the software SPCImage2.8 (Becker & Hickl GmbH) fits the autofluorescence decay curve to a quadratic decay curve to form four parameters τ 1 , A 1 , τ 2 and A 2 were determined.
（２）従来法（フォンタナマッソン染色）
３Ｄ培養皮膚（MEL-300（Mat Tek Corporation アジア人種由来））の１０μｍ厚の凍結組織切片を作成し、蛍光寿命イメージングを取得後、定法に従いフォンタナマッソン染色（（月間）MEDICAL TECHNOLOGY 別冊 染色法のすべて P54 医歯薬出版株式会社発行（１９８８））を行い比較した。染色試薬として、フォンタナマッソン染色用フォンタナアンモニア銀（武藤化学株式会社）を使用した。
(2) Conventional method (Fontana Masson staining)
After preparing a frozen tissue section of 10μm thickness of 3D cultured skin (MEL-300 (Mat Tek Corporation derived from Asian race)) and acquiring fluorescence lifetime imaging, Fontanamasson staining ((monthly) MEDICAL TECHNOLOGY separate volume All were published and compared on P54 published by Ishiyaku Shuppan Publishing Co., Ltd. (1988). As a staining reagent, Fontana ammonia silver for Fontana Masson staining (Muto Chemical Co., Ltd.) was used.
（３）結果
表１に示すように、生体２光子励起蛍光顕微鏡により求められた各試料のτ1成分は９７ｐｓから１６２ｐｓ（平均１２０ｐｓ）、τ2成分は５０３ｐｓから１５９８ｐｓ（平均１１００ｐｓ）であり、各試料により異なった。
(3) Results As shown in Table 1, the τ 1 component of each sample determined by a biological two-photon excitation fluorescence microscope is 97 ps to 162 ps (average 120 ps), and the τ 2 component is 503 ps to 1598 ps (average 1100 ps). Different for each sample.
3Ｄ培養皮膚（EPI-200、メラノサイトなし）からの蛍光と比較して、メラニンを含有する皮膚及び毛球部のサンプルは、τ1成分が短く、Ａ1／Ａ2の比が大きいという特徴を持つことを明らかにした（表１）。
このことから、τ1やＡ1／Ａ2を指標とした場合、精度よく、信頼性の高いメラニンの判別方法の確立及びそれを基にしたメラニンの可視化の可能性が示された。
更に、今回求められたτ1やＡ1／Ａ2について検討をした。
今回求められたτ1は、従来の報告(Ehlers A, Riemann I, Stark M, Konig K.，Microsc Res Tech. 2007 Feb;70(2):154-61)をほぼ再現した値と考えられる。
しかし、従来Ａ1／Ａ2＝９（Ａ1／（Ａ1＋Ａ2）＝０．９０）あるいはＡ1／Ａ2＞４（Ａ1／（Ａ1＋Ａ2）＞０．８０）( Ehlers A, Riemann I, Stark M, Konig K., Microsc Res Tech. 2007 Feb;70(2):154-61)）と報告されているが、今回求められたＡ1／Ａ2はより大きく１４＜Ａ1／Ａ2＜３３であった。
この理由として、従来の報告では、励起レーザーによる皮膚変性の可能性が考えられた。さらに、以下の試験例２を行い、更にメラニンの判別方法について検討を行った。
Compared with fluorescence from 3D cultured skin (EPI-200, no melanocytes), skin and hair bulb samples containing melanin are characterized by a short τ 1 component and a large A 1 / A 2 ratio. (Table 1).
From this, when τ 1 or A 1 / A 2 was used as an index, the establishment of a highly reliable and reliable melanin discrimination method and the possibility of visualization of melanin based on it were shown.
Furthermore, τ 1 and A 1 / A 2 obtained this time were examined.
The τ 1 obtained this time is considered to be a value that almost reproduces the conventional report (Ehlers A, Riemann I, Stark M, Konig K., Microsc Res Tech. 2007 Feb; 70 (2): 154-61).
However, conventional A 1 / A 2 = 9 (A 1 / (A 1 + A 2 ) = 0.90) or A 1 / A 2 > 4 (A 1 / (A 1 + A 2 )> 0.80) (Ehlers A, Riemann I, Stark M, Konig K., Microsc Res Tech. 2007 Feb; 70 (2): 154-61)), but A 1 / A 2 obtained this time is larger than 14 < It was a 1 / a 2 <33.
For this reason, in the previous report, the possibility of skin degeneration by the excitation laser was considered. Furthermore, the following Test Example 2 was performed, and a method for discriminating melanin was further examined.
試験例２
メラニンの自家蛍光と区別すべき生体光信号とメラニンのイメージングの最適化について以下のとおり検討を行った。
（１）生体組織においてコラーゲン分子から特異的に生体第２高調波発生光（ＳＨＧ光）が発生する場合があるので、この点について本装置について検討を行った。
ＳＨＧ光は、物質の構造非中心対称性に起因する非線形光学現象の１つで、蛍光現象とは異なるものである(T. Yasui, Y. Tohno, and T. Araki, Appl. Opt., Vol. 43, pp. 2861-2867 (2004).； T. Yasui, Y. Tohno, and T. Araki, J. Biomed. Opt., Vol. 9, No. 2, pp. 259-264 (2004).)。
本装置では、励起波長８００ｎｍ付近でコラーゲン由来のＳＨＧ強度が最も高まる。励起波長８００ｎｍの場合、波長４００ｎｍのＳＨＧ光が蛍光寿命の短い蛍光（メラニン）として誤って検出されるおそれがある。また、メラニン分布と組織、細胞の形態を同時に観察するために、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の蛍光（蛍光波長４５０ｎｍ〜４７０ｎｍ）も検出することが望ましい。そこで、ＳＨＧ光（４００ｎｍ）を排除し、かつ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の蛍光（蛍光波長のピークが４５０ｎｍ）が検出可能である、バンドパスフィルター（４５０±４０ｎｍ）をフォトンカウンター検出器前に設置した。
Test example 2
We examined the optimization of biological light signals and melanin imaging that should be distinguished from autofluorescence of melanin as follows.
(1) Biological second harmonic generation light (SHG light) may be generated specifically from collagen molecules in biological tissue, and this apparatus was examined in this regard.
SHG light is one of the nonlinear optical phenomena caused by the non-centrosymmetrical structure of matter, and is different from fluorescence phenomenon (T. Yasui, Y. Tohno, and T. Araki, Appl. Opt., Vol. 43, pp. 2861-2867 (2004) .; T. Yasui, Y. Tohno, and T. Araki, J. Biomed. Opt., Vol. 9, No. 2, pp. 259-264 (2004). ).
In this apparatus, the SHG intensity derived from collagen is highest at an excitation wavelength of about 800 nm. When the excitation wavelength is 800 nm, SHG light having a wavelength of 400 nm may be erroneously detected as fluorescence (melanin) having a short fluorescence lifetime. It is also desirable to detect fluorescence derived from NAD (P) H (fluorescence wavelength: 450 nm to 470 nm) in order to simultaneously observe melanin distribution and tissue and cell morphology. Therefore, a band-pass filter (450 ± 40 nm) capable of detecting SHG light (400 nm) and detecting NAD (P) H-derived fluorescence (fluorescence wavelength peak is 450 nm) in front of the photon counter detector. installed.
（２）強いエネルギーの励起光を生体組織に照射する、あるいは、生体組織の一点に長時間照射すると突然、生体組織からの蛍光強度が強くなる場合があるので、この点について本装置について検討を行った。
図３中の矢印が変化した部分である。皮膚表面近く（角層）をレーザーパワー１０ｍＷで走査中にこの現象が起きた。輝度の明るく変化した部分の蛍光特性（寿命）を調べると、τ1＝１３４ｐｓ（Ａ1＝０．９１）、τ2＝１５８８ｐｓ（Ａ2＝０．０９）、Ａ1／Ａ2＝１０程度であり、この輝点のτ1はメラニン蛍光のτ1とほぼ同じであった。
このように、意図的にレーザパワーを上げ蛍光強度を明るく変化させた部分では、τ1＝０．１３ｎｓ、τ2＝０．５ｎｓ、Ａ1／Ａ2は１０程度であり、Konigらの毛髪における報告値（非特許文献１０）とほぼ同じである。長期間強いエネルギーを照射すると生体組織が組織変性されるため、Konigらの報告は変性した組織を観察した可能性が高い。
一般に、表皮基底層で作られたメラニンは角化に伴い分解され、正常部位の角層からはごく微量、あるいは検出されないと考えられ、出現した輝点はメラニンではない。よって、この現象が起きた場合τ1を指標としたメラニンイメージングはできないことは明らかである。
しかし、メラニンからの蛍光の閾値として、Ａ1／Ａ2＝１２〜３３を設定すれば、この輝点とメラニン蛍光を分離することが可能である。
(2) When the living tissue is irradiated with strong excitation light or when a point on the living tissue is irradiated for a long time, the fluorescence intensity from the living tissue may suddenly increase. went.
The arrow in FIG. 3 is a changed part. This phenomenon occurred during scanning near the skin surface (horny layer) with a laser power of 10 mW. When the fluorescence characteristics (lifetime) of the brightly changed portion are examined, τ 1 = 134 ps (A 1 = 0.91), τ 2 = 1588 ps (A 2 = 0.09), and A 1 / A 2 = 10 or so. in and, tau 1 of this bright spot was almost the same as tau 1 of melanin fluorescence.
Thus, in the part where the laser power is intentionally increased and the fluorescence intensity is brightly changed, τ 1 = 0.13 ns, τ 2 = 0.5 ns, A 1 / A 2 is about 10, and the hair of Konig et al. Is almost the same as the reported value (Non-Patent Document 10). The body tissue is denatured when irradiated with strong energy for a long period of time, so the report by Konig et al.
In general, melanin produced in the basal layer of the epidermis is decomposed with keratinization, and it is considered that only a trace amount or no detection is detected from the stratum corneum at the normal site, and the bright spot that appears is not melanin. Therefore, it is clear that melanin imaging using τ 1 as an index is not possible when this phenomenon occurs.
However, if A 1 / A 2 = 12 to 33 is set as the threshold value of fluorescence from melanin, it is possible to separate this bright spot from melanin fluorescence.
蛍光信号が弱くパワーが落とせない場合は、Ａ1／Ａ2を指標としてメラニンイメージングするのが良いと考えられた。
このようなサンプルの変化を避けるためには、励起パワーはメラニンの密度の高い抜去毛球部のＦＬＩＭ（Fluorescence Life Time Imaging）をとる場合１ｍＷ以下、直接レーザーに暴露される皮膚表面近傍で８ｍＷ以下、メラニンの比較的多い露光部表皮基底層で１０ｍＷが望ましい。
When the fluorescence signal was weak and the power could not be reduced, it was considered that melanin imaging should be performed using A 1 / A 2 as an index.
In order to avoid such changes in the sample, the excitation power is 1 mW or less when FLIM (Fluorescence Life Time Imaging) of the extracted hair bulb portion with high melanin density is taken, and 8 mW or less near the skin surface directly exposed to the laser. 10 mW is desirable for the exposed part epidermis basal layer having a relatively large amount of melanin.
（３）組織が損傷（細胞死）した場合もメラニンと似た蛍光寿命を持つ蛍光物質が現れる可能性があるので、この点について本装置について検討を行った。
図４に実験的に皮膚細胞に障害を与えた例を示した。皮膚に微細な針電極を刺した上で電流を流した（電圧９Ｖ）。針電極の穴（図５中のＸ印）付近のケラチノサイトのＦＬＩＭを取得した結果、τ1＝１４３ｐｓ（Ａ1＝０．９２）、τ2＝１８１８ｐｓ（Ａ2＝０．０８）、Ａ1／Ａ2＝１１であった（図５矢印）。
先に述べた強いレーザーを照射した場合と異なり、蛍光強度は低下するが、τ1はメラニンの自家蛍光とほぼ同じレベルに変化した。よって、このような現象が起きた場合もτ1を指標としたメラニンイメージングはできないことを明らかにした。
メラニンからの蛍光の閾値として、Ａ1／Ａ2＝１２〜３３を設定すれば、電流により傷害を受けたケラチノサイトとメラニンを分離することが可能であった。
(3) Since a fluorescent substance having a fluorescence lifetime similar to that of melanin may appear even when the tissue is damaged (cell death), this apparatus was examined in this regard.
FIG. 4 shows an example in which skin cells are experimentally damaged. A fine needle electrode was pierced into the skin and an electric current was applied (voltage 9 V). As a result of acquiring the FLIM of the keratinocytes near the hole (marked X in FIG. 5) of the needle electrode, τ 1 = 143 ps (A 1 = 0.92), τ 2 = 1818 ps (A 2 = 0.08), A 1 / A 2 = 11 (arrow in FIG. 5).
Unlike the case of irradiation with a strong laser as described above, the fluorescence intensity decreased, but τ 1 changed to almost the same level as the autofluorescence of melanin. Therefore, it was clarified that melanin imaging using τ 1 as an index is not possible even when such a phenomenon occurs.
If A 1 / A 2 = 12 to 33 was set as the threshold for fluorescence from melanin, it was possible to separate keratinocytes and melanin that were damaged by current.
以上これまでの検討から、ａ）励起レーザーのパワーは最小限に抑えるべきである、ｂ）τ1より、Ａ1／Ａ2がメラニン蛍光により特異的であることが示唆された。 From the above studies, a) the power of the excitation laser should be minimized, and b) τ 1 suggests that A 1 / A 2 is specific to melanin fluorescence.
従来、自家蛍光の減衰曲線から蛍光寿命曲線を構成するための、４つのパラメータτ1、Ａ1、τ2、Ａ2を求めていたが、これには１０００カウント以上のピークフォトン数（蛍光強度）が必要とされる。一方で、生体組織のダメージを低減するために励起パワーをできるだけ小さく抑えることが求められる。
表１からの各試料のメラニン蛍光寿命から求めたτ1＝１２０ｐｓ（平均値）及びτ2＝１１００ｐｓ（平均値）を上記式（２）のように二次減衰曲線に固定し、これに自家蛍光の減衰曲線をカーブフィッティングし、Ａ1／Ａ2比を求め、Ａ1／Ａ2に閾値を設けてメラニンを判別し、この結果をメラニン分布のイメージングする手法が最適であると考えた。更にτ1、τ2を固定値にすると、より少ないピークフォトン数でカーブフィッティングが可能であることが示唆された。
Conventionally, four parameters τ 1 , A 1 , τ 2 , and A 2 for constructing a fluorescence lifetime curve from an autofluorescence decay curve have been obtained, and this includes a peak photon number (fluorescence intensity of 1000 counts or more). ) Is required. On the other hand, it is required to keep the excitation power as small as possible in order to reduce damage to living tissue.
Τ 1 = 120 ps (average value) and τ 2 = 1100 ps (average value) obtained from the melanin fluorescence lifetime of each sample from Table 1 are fixed to the secondary decay curve as in the above equation (2), It was considered that a technique of imaging the melanin distribution by determining the melanin by curve fitting the fluorescence decay curve, obtaining the A 1 / A 2 ratio, setting a threshold value for A 1 / A 2 , and determining the melanin. Further, it was suggested that when τ 1 and τ 2 were fixed values, curve fitting was possible with a smaller number of peak photons.
試験例３：本発明のメラニン分布可視化方法の精度についての確認試験
従来法でメラニンの判別の精度及び信頼性の高いフォンタナマッソン染色法との比較による、本発明のメラニンイメージングの妥当性の検討を行った。
図５に、３Ｄ培養皮膚１０μｍ厚凍結切片のフォンタナマッソン染色像（黒褐色顆粒がメラニン顆粒）と、上記本発明のメラニン判別方法（閾値２０）によるイメージング画像を示した。メラニンとして判別されたデータを青の色調とし、それ以外と判別されたデータを黄〜こげ茶の色調とした。
イメージング画像中の青い部分の位置と信頼性の高いフォンタナマッソン染色により黒く染色されたメラニン顆粒の位置が一致した。このとき、青い部分はＡ1／Ａ2＞２０の領域であり、Ａ1／Ａ2比とその閾値に基づくメラニンイメージングの妥当性が示された。
また、メラニンからの蛍光の閾値として、Ａ1／Ａ2＝１２〜３３を設定すれば、生体皮膚、毛髪、細胞など幅広い対象に対して、信頼性の高いメラニン分布のｉｎ ｖｉｖｏイメージングが可能であった。
以上のことより、本願発明のメラニンの判別方法によれば、生体組織を傷つけず、簡便に、生体組織中のメラニンを精度よく信頼性の高い判別することができた。
Test example 3: Confirmation test on accuracy of melanin distribution visualization method of the present invention The validity of the melanin imaging of the present invention was compared with the accuracy of melanin discrimination and the highly reliable Fontana Masson staining method by the conventional method. went.
FIG. 5 shows a Fontanamasson-stained image (a black-brown granule is a melanin granule) of a 10 μm-thick frozen section of 3D cultured skin and an imaging image by the melanin discrimination method (threshold 20) of the present invention. The data discriminated as melanin was the blue tone, and the data discriminated as other than that was the yellow to dark brown tone.
The position of the blue part in the imaging image coincided with the position of the melanin granules stained black by the reliable Fontana Masson staining. At this time, the blue portion is the region of A 1 / A 2> 20, the validity of melanin imaging based on the threshold value A 1 / A 2 ratio was shown.
In addition, if A 1 / A 2 = 12 to 33 is set as the threshold of fluorescence from melanin, highly reliable in vivo imaging of melanin distribution is possible for a wide range of subjects such as living skin, hair and cells. there were.
From the above, according to the method for discriminating melanin of the present invention, it was possible to easily and accurately discriminate melanin in a living tissue without damaging the living tissue.
１ 生体２光子励起蛍光顕微鏡装置
２ フェムトセカンドレーザー光源
９ ビームスプリッッター
１１ 対物レンズ
１２ サンプル固定器
１３ フィルター
１４ フォトカウンター
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Living body 2 photon excitation fluorescence microscope apparatus 2 Femtosecond laser light source 9 Beam splitter 11 Objective lens 12 Sample fixing device 13 Filter 14 Photo counter
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