JP5137098B2 - Water-soluble fraction for exerting cytotoxic activity - Google Patents
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Description
本発明は、カズノコからから得られる細胞傷害性活性を作用させるための水溶性画分に関する。 The present invention relates to a water-soluble fraction for effecting cytotoxic activity obtained from Kazano.
従来、生体においては、細胞傷害性活性に関連して形態学的に分類される２種類の細胞死が知られている。一方はプログラムされた細胞死といわれるアポトーシスであり、他方は細胞の壊死（ネクローシス）である。こうした細胞の死は、ウイルス感染の場合を例に挙げれば、感染成立後に生体防御機構が作動してＴ細胞とＢ細胞とが協同的に作用し、ウイルスに感染した細胞を非自己と認識して死滅させるものである。
細胞の壊死は、ウイルス感染のみならず、近年、死亡原因の上位に位置する癌の場合にも起こることが知られている。癌細胞が出現すると、腫瘍細胞の壊死作用を有するＴＮＦ等の生体因子やＮＫ細胞等が作用し、生体の恒常性の維持が図られる（非特許文献１参照）。
一方、動植物に含まれる種々の活性を有する化合物については、植物精油等の主要成分等に関する報告も多く、研究も進んでいる（非特許文献２参照）。また、魚類や介類においても、シガトキシン等を初めとする海産毒については研究が進み、いろいろな報告もなされている（非特許文献３参照）が、腫瘍壊死活性を有する物質を含むかどうかについての報告は少ない。
Cell necrosis is known to occur not only in viral infections, but also in the case of cancer, which is the top cause of death in recent years. When cancer cells appear, biological factors such as TNF having a necrotic effect on tumor cells, NK cells, etc. act to maintain the homeostasis of the living body (see Non-Patent Document 1).
On the other hand, with regard to compounds having various activities contained in animals and plants, there have been many reports on major components such as plant essential oils, and research has been progressing (see Non-Patent Document 2). In addition, in fish and shellfish, marine toxins such as ciguatoxin have been studied and various reports have been made (see Non-Patent Document 3), but whether or not they contain substances having tumor necrosis activity. There are few reports.
生体の恒常性とのバランス上、これらの細胞壊死活性を含む細胞傷害性活性を有する物質の生体内における産生量は限られているため、腫瘍を有している生体そのものから、腫瘍細胞を選択的に攻撃することができる物質を大量に得ることは難しい。 Because of the limited amount of substances that have cytotoxic activity, including cell necrosis activity, in vivo due to the balance with the homeostasis of the living body, select tumor cells from the living body that has the tumor itself. It is difficult to obtain a large amount of material that can be attacked.
しかし、こうした活性を有する化合物は、ウイルス感染や癌の治療においては有用性が高いと考えられており、腫瘍等に対する細胞傷害性活性を有する化合物を、あるまとまった量で定常的に確保することについては、強い要請がある。
本発明の目的は、腫瘍等に対する細胞傷害性活性を有する水溶性画分を提供することを目的とする。
However, compounds having such activity are considered to be highly useful in the treatment of viral infections and cancers, and it is necessary to steadily secure a certain amount of compounds having cytotoxic activity against tumors and the like. There is a strong demand for.
An object of the present invention is to provide a water-soluble fraction having cytotoxic activity against tumors and the like.
本発明の発明者らは、上記のような事情の下で鋭意研究を進め、本発明を完成したもの
である。
すなわち、本発明は、
［１］カズノコに含まれる液体成分を得、前記液体成分を疎水性有機溶媒により抽出して得られた有機溶媒抽出画分を除去することにより得られる前記液体成分に残る水溶性画分であって、
前記カズノコに含まれる液体成分は、
前記カズノコに含まれる液体成分に対しアセトンを添加することにより生じた沈殿物が、前もって除去されていて、
前記疎水性有機溶媒が、ｎ−ヘキサンであり、
肺癌患者由来の癌細胞を用いたハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来細胞、マウス大腸癌由来細胞及びヒト末梢血リンパ球からなる群より選ばれる少なくとも一つに対して細胞傷害性活性を作用させるための、水溶性画分を提供するものであり、
［２］前記水溶性画分の細胞傷害性活性が、カスパーゼ阻害剤の存在下に失活する、上記［１］に記載の水溶性画分を提供するものである。
The inventors of the present invention have made extensive studies under the circumstances as described above, and have completed the present invention.
That is, the present invention
[1] A water-soluble fraction remaining in the liquid component obtained by obtaining a liquid component contained in casserole and removing the organic solvent extraction fraction obtained by extracting the liquid component with a hydrophobic organic solvent. And
The liquid component contained in the casserole is
The precipitate produced by adding acetone to the liquid component contained in the casserole has been removed in advance,
The hydrophobic organic solvent is n-hexane;
In order to act cytotoxic activity on at least one selected from the group consisting of a hybridoma using cancer cells derived from lung cancer patients, human colon cancer-derived cells, mouse colon cancer-derived cells and human peripheral blood lymphocytes, Providing a water-soluble fraction,
[2] The water-soluble fraction according to the above [1] , wherein the cytotoxic activity of the water-soluble fraction is inactivated in the presence of a caspase inhibitor.
本発明によれば、カズノコから細胞傷害性活性を作用させるための水溶性画分を得ることができる。
According to the present invention, it is possible to obtain a water-soluble fraction for causing cytotoxic activity to act from Kasoko .
まず、本発明の水溶性画分の抽出に使用する魚類の卵について説明する。
前記魚類は、ニシンである。
また本発明に使用する魚類の卵としては、ニシンの卵であるカズノコを使用することが、一定の質の材料を容易に入手できることからさらに好ましい。
First, fish eggs used for extraction of the water-soluble fraction of the present invention will be described.
The fish is a herring .
Further, as fish eggs used in the present invention, it is more preferable to use casserole which is a herring egg because a material of a certain quality can be easily obtained.
上記の魚類の卵から、後述する細胞傷害性活性を作用させるための水溶性画分を抽出するにあたっては、最初に前記卵から液体成分を得る。
前記液体成分を得る手段としては、例えば、前記卵を破砕して破砕液としてから不溶物を除く手段等が挙げられる。
なお、前記液体成分とは前記卵を破砕して得られるものであり、０℃を超える温度において流動性を有するものをいう。
In extracting the water-soluble fraction for effecting the cytotoxic activity described later from the fish egg, a liquid component is first obtained from the egg.
Examples of means for obtaining the liquid component include means for crushing the egg to form a crushed liquid and then removing insolubles.
The liquid component is obtained by crushing the egg and has fluidity at a temperature exceeding 0 ° C.
この破砕は、水や溶媒を加えて実施してもよいが、特に水や溶媒を加えることなく、所定量の魚類の卵を秤量し、容器中で、フードプロセッサー、ホモジナイザー等を使用して行うことができる。こうした破砕器具の中でも、フードプロセッサーを使用すると破砕効率が高い。
ついで得られた破砕液から不溶物を除く。
前記不溶物を除く手段としては、例えば、遠心分離や濾過等の手段を挙げることができる。
例えば、前記破砕液に対し前記遠心分離を行うことにより、上清を得ることができる。得られた上清に対し、さらに超遠心分離を行うことが好ましい。
上記遠心分離および超遠心分離を行うときの温度は、１〜１０℃の範囲が好ましく、さらに好ましくは２〜５℃の温度範囲である。
この様にして前記液体成分として前記上清を得ることができる。
This crushing may be performed by adding water or a solvent, but without adding water or a solvent, a predetermined amount of fish eggs are weighed and used in a container using a food processor, a homogenizer, or the like. be able to. Among these crushing devices, crushing efficiency is high when a food processor is used.
Subsequently, insoluble matters are removed from the obtained crushed liquid.
Examples of means for removing the insoluble matter include means such as centrifugation and filtration.
For example, the supernatant can be obtained by performing the centrifugation on the crushed liquid. It is preferable to perform ultracentrifugation on the obtained supernatant.
The temperature at the time of performing the above centrifugation and ultracentrifugation is preferably in the range of 1 to 10 ° C, more preferably in the temperature range of 2 to 5 ° C.
In this way, the supernatant can be obtained as the liquid component.
次に、前記液体成分と親水性有機溶媒とを混合することにより生じた沈殿物を除去する。
前記液体成分と親水性有機溶媒とを混合する方法に限定はなく、例えば、前記液体成分を親水性有機溶媒に添加する方法、前記親水性有機溶媒を前記液体成分に添加する方法、両者を同時に混合する方法等を採用することができる。
前記液体成分と親水性有機溶媒とを混合し十分に撹拌した後、超遠心分離を行うことにより沈殿物を分離することができ、前記親水性有機溶媒を含む液体画分を得ることができる。
Next, the precipitate produced by mixing the liquid component and the hydrophilic organic solvent is removed.
The method of mixing the liquid component and the hydrophilic organic solvent is not limited. For example, the method of adding the liquid component to the hydrophilic organic solvent, the method of adding the hydrophilic organic solvent to the liquid component, and both A mixing method or the like can be employed.
After the liquid component and the hydrophilic organic solvent are mixed and sufficiently stirred, the precipitate can be separated by performing ultracentrifugation, and a liquid fraction containing the hydrophilic organic solvent can be obtained.
前記親水性有機溶媒は、アセトンである。 The hydrophilic organic solvent is acetone.
前記親水性有機溶媒の使用量は、前記液体成分の１０体積％〜２００体積％の範囲であることが好ましく、５０体積％〜１５０体積％の範囲であればさらに好ましい。 The amount of the hydrophilic organic solvent used is preferably in the range of 10% by volume to 200% by volume of the liquid component, and more preferably in the range of 50% by volume to 150% by volume.
次に前記液体画分に含まれる親水性有機溶媒を除去する。
前記親水性有機溶媒を除去する方法としては、例えば、常圧下もしくは減圧下において蒸留操作を行う方法等を挙げることができる。
この様にして、前記液体画分に含まれる親水性有機溶媒を除去することにより、可溶性画分を得ることができる。
Next, the hydrophilic organic solvent contained in the liquid fraction is removed.
Examples of the method of removing the hydrophilic organic solvent include a method of performing a distillation operation under normal pressure or reduced pressure.
In this manner, a soluble fraction can be obtained by removing the hydrophilic organic solvent contained in the liquid fraction.
次に前記可溶性画分と有機溶媒とを混合し、この混合液を良く撹拌した後、両者を分液し、有機溶媒層、すなわち有機溶媒抽出画分を除去する。この操作により、細胞傷害性活性を作用させるための水溶性画分を得ることができる。
この有機溶媒による抽出操作は一回もしくは二回以上繰り返すことができるが、この操作は二〜三回繰り返すことが好ましい。
前記可溶性画分と有機溶媒とを混合する方法は、先に説明した前記液体成分と親水性有機溶媒とを混合する方法の場合と同様である。
Next, the soluble fraction and the organic solvent are mixed and the mixed solution is thoroughly stirred, and then the two are separated to remove the organic solvent layer, that is, the organic solvent extraction fraction. By this operation, a water-soluble fraction for exerting cytotoxic activity can be obtained.
This extraction operation with an organic solvent can be repeated once or twice or more, but this operation is preferably repeated 2-3 times.
The method for mixing the soluble fraction and the organic solvent is the same as the method for mixing the liquid component and the hydrophilic organic solvent described above.
前記有機溶媒としては、水と分液できる疎水性有機溶媒を挙げることができ、この様な疎水性有機溶媒は、ｎ−ヘキサンである。 Examples of the organic solvent include a hydrophobic organic solvent that can be separated from water, and such a hydrophobic organic solvent is n-hexane.
前記疎水性有機溶媒の使用量は、前記可溶性画分の１０体積％〜２００体積％の範囲であることが好ましく、５０体積％〜１５０体積％の範囲であればさらに好ましい。 The amount of the hydrophobic organic solvent used is preferably in the range of 10% by volume to 200% by volume, and more preferably in the range of 50% by volume to 150% by volume.
次に本発明における細胞傷害性活性は、肺癌患者由来のリンパ球細胞とリンパ腫細胞であるＮＡＴ−３０細胞とを融合して作製したハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来細胞、マウス大腸癌由来細胞、ヒト末梢血リンパ球等の一種もしくは二種以上に対するものであることが好ましい。
ここで、肺癌患者由来のリンパ球細胞とリンパ腫細胞であるＮＡＴ−３０細胞とを融合して作製したハイブリドーマとしては、ＨＢ４Ｃ５、ＨＦ１０Ｂ４等を挙げることができる。ＨＢ４Ｃ５を使用することが、培養及び細胞活性の測定が容易であるという理由から好ましい。
Next, the cytotoxic activity in the present invention is a hybridoma prepared by fusing lymphocyte cells derived from lung cancer patients and NAT-30 cells which are lymphoma cells, human colon cancer-derived cells, mouse colon cancer-derived cells, human peripheral cells. It is preferable for one or more blood lymphocytes.
Here, examples of hybridomas produced by fusing lymphocyte cells derived from lung cancer patients and NAT-30 cells, which are lymphoma cells, include HB4C5 and HF10B4. It is preferable to use HB4C5 because it is easy to measure culture and cell activity.
前記ヒト大腸癌由来細胞としては、Ｃｏｌｏ−２０１、ＬｏＶｏ、Ｃａｃｏ−２、ＬＳ１８０等を挙げることができる。Ｃｏｌｏ−２０１、及びＣａｃｏ−２からなる群より選ばれる少なくとも一つの株化細胞を使用することが、培養が容易であることから好ましく、Ｃｏｌｏ−２０１を使用することがさらに好ましい。 Examples of the human colon cancer-derived cells include Colo-201, LoVo, Caco-2, and LS180. It is preferable to use at least one cell line selected from the group consisting of Colo-201 and Caco-2 because culture is easy, and it is more preferable to use Colo-201.
前記マウス大腸癌由来細胞としては、Ｃｏｌｏｎ−２６、ＲＫＯ−Ｅ６、ＣＴ２６、ＣＬ２５等を挙げることができる。Ｃｏｌｏｎ−２６を使用することが、ｉｎ ｖｉｖｏ（動物実験）において効果を検討することが容易であることから好ましい。 Examples of the mouse colon cancer-derived cells include Colon-26, RKO-E6, CT26, and CL25. It is preferable to use Colon-26 because it is easy to examine the effect in vivo (animal experiment).
また、上記のような株化細胞以外に、ヒト末梢血リンパ球細胞に対して、細胞傷害性活性を有するものであってもよい。 Moreover, in addition to the above established cell lines, those having cytotoxic activity against human peripheral blood lymphocyte cells may be used.
前記細胞傷害性活性を作用させるための水溶性画分は、トリプシン等のタンパク質分解酵素により処理した場合であっても、前記細胞傷害性活性を保持するものが好ましい。
The water-soluble fraction for causing the cytotoxic activity to act is preferably one that retains the cytotoxic activity even when treated with a proteolytic enzyme such as trypsin.
また前記細胞傷害性活性を作用させるための水溶性画分は、温度１００℃、２０分間の加熱処理により前記細胞傷害性活性を保持するものが好ましい。
The water-soluble fraction for causing the cytotoxic activity to act is preferably one that retains the cytotoxic activity by heat treatment at a temperature of 100 ° C. for 20 minutes.
さらに、前記細胞傷害性活性を作用させるための水溶性画分に含まれる化合物は、分子量５０〜１０００の範囲のものが好ましく、１００〜１０００の範囲であればさらに好ましい。
Furthermore, the compound contained in the water-soluble fraction for effecting the cytotoxic activity preferably has a molecular weight in the range of 50 to 1000, more preferably in the range of 100 to 1000.
また前記細胞傷害性活性を作用させるための水溶性画分は、アポトーシス誘導において発現されるカスパーゼの阻害剤の存在下に細胞傷害性活性が消失するものが好ましい。
前記カスパーゼ阻害剤は公知であり、市販品を入手し使用することができる。
The water-soluble fraction for causing the cytotoxic activity to act is preferably one that loses the cytotoxic activity in the presence of an inhibitor of caspase expressed in the induction of apoptosis.
The caspase inhibitor is known, and a commercially available product can be obtained and used.
以下に、本発明の前記細胞傷害性活性を作用させるための水溶性画分を得るための手順を、魚類の卵としてカズノコを、有機溶媒としてｎ−ヘキサン、親水性有機溶媒としてアセトンを用い、細胞傷害性活性についてマウス大腸ガン細胞Ｃｏｌｏｎ２６を用いた場合を例に挙げて説明する。
操作の手順については図１のフローチャートに示した通りである。
In the following, the procedure for obtaining the water-soluble fraction for causing the cytotoxic activity of the present invention to be used, casserole as a fish egg, n-hexane as an organic solvent, acetone as a hydrophilic organic solvent, The cytotoxic activity will be described by taking as an example the case of using mouse colon cancer cell Colon26.
The operation procedure is as shown in the flowchart of FIG.
カズノコを、秤量して遠心可能なチューブにとり、例えば、フードプロセッサーを用いて破砕し、破砕液を得る。この破砕液を低速で遠心分離し、不溶物を除去した後に超遠心分離し、液体成分として上清を得る。 Kazunoko is weighed and taken into a centrifuge tube, and crushed using, for example, a food processor to obtain a crushed liquid. The crushed liquid is centrifuged at a low speed to remove insoluble matters and then ultracentrifuged to obtain a supernatant as a liquid component.
遠心分離可能なチューブとしては、例えば、１５ｍＬコニカルチューブ（コーニング社製）、５０ｍＬコニカルチューブ（コーニング社製又はヌンク社製）等を挙げることができる。 Examples of the tube that can be centrifuged include a 15 mL conical tube (manufactured by Corning), a 50 mL conical tube (manufactured by Corning or Nunk), and the like.
得られた上清に、４℃に冷却したアセトンを等量加えて、一夜静置することにより沈殿物を析出させる。一夜静置した後、超遠心分離して沈殿物を除き、上清を回収する。なお、上清が複数層に分かれる場合には、各層ごとに回収する。
続いて前記上清からアセトンを減圧下に留去することにより可溶性画分を得ることができる。
An equal amount of acetone cooled to 4 ° C. is added to the obtained supernatant, and the mixture is allowed to stand overnight to precipitate a precipitate. After standing overnight, ultracentrifuge to remove the precipitate and collect the supernatant. When the supernatant is divided into a plurality of layers, the supernatant is collected for each layer.
Subsequently, the soluble fraction can be obtained by distilling off acetone from the supernatant under reduced pressure.
次に可溶性画分に対してｎ−ヘキサンを等量加えて良く混合撹拌し、静置後、ｎ−ヘキサン層を除去する。
この操作を２〜３回繰り返すことにより、水溶性画分を得ることができる。
この様にして目的とする細胞傷害性活性を有する化合物を含む画分（以下、「粗精製画分」ということがある）を得ることができる。
Next, an equivalent amount of n-hexane is added to the soluble fraction, and the mixture is thoroughly mixed and stirred. After standing, the n-hexane layer is removed.
By repeating this operation 2-3 times, a water-soluble fraction can be obtained.
In this way, a fraction containing the desired compound having cytotoxic activity (hereinafter sometimes referred to as “crudely purified fraction”) can be obtained.
上記のようにして得た粗精製画分を試料として、以下の手順に従い、この画分の細胞傷害性活性を測定する。 Using the roughly purified fraction obtained as described above as a sample, the cytotoxic activity of this fraction is measured according to the following procedure.
継代培養した上記のハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来株化細胞、マウス大腸癌由来株化細胞を、それぞれ２〜３日間前培養する。 The subcultured hybridoma, human colon cancer-derived cell line, and mouse colon cancer-derived cell line are each pre-cultured for 2 to 3 days.
ついで、所定の倍率に希釈した上述した粗標品を、所定量であらかじめ用意した大きさのシャーレに分注し、所定量のあらかじめ調製しておいたＩＴＥＳをこのシャーレに所定量ずつ分注する。 Next, the above-mentioned crude preparation diluted to a predetermined magnification is dispensed into a petri dish of a predetermined size in a predetermined amount, and a predetermined amount of ITES prepared in advance is dispensed into the petri dish in a predetermined amount. .
次に、あらかじめ調製したＥＤＲＦ培地を用いて、上述の各細胞を約２×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、これを上記のシャーレそれぞれに、所定量ずつ分注する。 Next, using the EDRF medium prepared in advance, each of the above-mentioned cells is prepared to about 2 × 10 5 cells / mL, and this is dispensed into each of the above petri dishes in a predetermined amount.
細胞の分注を終えた後に、これらのシャーレを５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて約２日〜３日間培養し、各シャーレ中の細胞数（全数）と、生細胞数とを測定し、生存率を求めて細胞傷害性活性とする。 After dispensing the cells, these dishes are cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for about 2 days to 3 days, and the number of cells in each dish (total number) and the number of viable cells are measured. Then, the survival rate is determined as the cytotoxic activity.
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
［カズノコを用いた細胞傷害性活性を作用させるための水溶性画分の調製］
（１−１）材料等
カズノコは、オランダ産の市販品（−２０℃にて冷凍保存されたもの）を購入したものを使用した。
[ Preparation of water-soluble fraction for effecting cytotoxic activity using casserole]
(1-1) Materials, etc. Kazunoko used was purchased from a Dutch product (stored frozen at -20 ° C).
アセトンは和光純薬工業（株）より特級品を購入したものを使用した。また、水は、超純水を蒸留して使用した。マイクロチューブは、容量１，５００μＬのものをアシスト社より購入したものを使用した。 Acetone purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used. Moreover, ultrapure water was distilled and used for water. A microtube having a capacity of 1,500 μL purchased from Assist was used.
（１−２）水溶性画分の調製
図１に示したフローチャートに従い、上述したカズノコ（冷凍重量１０ｇ）を室温で解凍した後に、フードプロセッサーにより破砕し、破砕液約７ｍＬを得た。この破砕液を、４℃、７０，０００ｒｐｍにて６０分間遠心し、不溶物を除去して上清約４ｍＬを得た。
(1-2) Preparation of water-soluble fraction According to the flowchart shown in FIG. 1, the above-mentioned casserole (frozen weight 10 g) was thawed at room temperature and then crushed by a food processor to obtain about 7 mL of a crushed liquid. This crushed liquid was centrifuged at 4 ° C. and 70,000 rpm for 60 minutes to remove insoluble matters, and about 4 mL of supernatant was obtained.
この上清に対し、４℃に冷却した等量のアセトンを加え、４℃にて１２時間静置し、その後、４℃、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心して沈殿を除去した。
続いて減圧下にアセトンを除去することにより可溶性画分を得た。
得られた可溶性画分に対して同じ体積のｎ−ヘキサンを加え、混合液を激しく混合した後、静置した。次に分液によりヘキサン層を除去した。
この操作を２回繰り返すことにより、水溶性画分を得た。この水溶性画分を試験用サンプルとした。
To this supernatant, an equal amount of acetone cooled to 4 ° C. was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 12 hours, and then centrifuged at 4 ° C. and 10,000 rpm for 10 minutes to remove the precipitate.
Subsequently, acetone was removed under reduced pressure to obtain a soluble fraction.
The same volume of n-hexane was added to the obtained soluble fraction, and the mixture was vigorously mixed and then allowed to stand. Next, the hexane layer was removed by liquid separation.
By repeating this operation twice, a water-soluble fraction was obtained. This water-soluble fraction was used as a test sample.
（１−２）試料、試薬等
上記の実施例１で得られた、カズノコから得られた水溶性画分について細胞傷害性活性を検討した。
(1-2) Sample, Reagent, etc. The cytotoxic activity of the water-soluble fraction obtained from Kazunoko obtained in Example 1 was examined.
細胞傷害性活性は、Ｃｏｌｏｎ−２６を後述する条件にて培養し、総細胞数に対する生細胞数（生存率）を指標として評価した。 The cytotoxic activity was evaluated by culturing Colon-26 under the conditions described later and using the number of living cells (survival rate) relative to the total number of cells as an index.
マウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６は、東北大学加齢医学研究所より分与を受けた。Ｃｏｌｏｎ−２６の培養には、２％ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳということがある）を添加したＥＤＲＦ培地を使用した。ＦＢＳは５６℃で３０分間、非動化処理を行っている。
前記ＥＤＲＦ培地を、極東製薬工業（株）より購入して使用した。添加物であるインスリン、トランスフェリン、エタノール及びセレナイトは、シグマ社より購入して使用した。
The mouse colorectal cancer cell line Colon-26 was distributed from Tohoku University Institute of Aging Medicine. For culturing Colon-26, EDRF medium supplemented with 2% fetal bovine serum (hereinafter sometimes referred to as FBS) was used. FBS has been demobilized at 56 ° C. for 30 minutes.
The EDRF medium was purchased from Far East Pharmaceutical Co., Ltd. and used. Additives insulin, transferrin, ethanol and selenite were purchased from Sigma and used.
（１−３）マウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６に対する水溶性画分の細胞傷害性活性の測定
継代培養したマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６を、カズノコから得られた水溶性画分の存在下に５８ｃｍ２のシャーレで２日間培養した後、生存率の測定を行った。
マウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６の細胞の生存率は、ＷＳＲ−８色素還元法（測定波長４５０ｎｍ）またはトリパンプルー色素排除法を用いて実施した。
その結果、図２に示した様に、カズノコから得られた前記水溶性画分の濃度に依存して細胞傷害性活性が認められ、前記ＥＤＲＦ培地の重量に対する前記水溶性画分の重量の割合が１２．５％のときにマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６は完全に死滅した。
(1-3) Measurement of cytotoxic activity of water-soluble fraction against mouse colon cancer cell line Colon-26 Presence of water-soluble fraction obtained from subcultured mouse colon cancer cell line Colon-26 from Kazunoko After culturing in a petri dish of 58 cm 2 for 2 days, the survival rate was measured.
The cell viability of the mouse colon cancer cell line Colon-26 was measured using the WSR-8 dye reduction method (measurement wavelength: 450 nm) or the trypan blue dye exclusion method.
As a result, as shown in FIG. 2, cytotoxic activity was observed depending on the concentration of the water-soluble fraction obtained from Kazunoko, and the ratio of the weight of the water-soluble fraction to the weight of the EDRF medium. The mouse colorectal cancer cell line Colon-26 was completely killed when 12.5%.
実施例１により得られたカズノコから得られた前記水溶性画分を、トリプシンにより処理した。その後、前記水溶性画分に残存する細胞傷害性活性を実施例１の場合と同様に実験を行った。
その結果、図３に示した様に、カズノコから得られた前記水溶性画分の細胞傷害性活性はトリプシンによる処理の影響を全く受けないことが判明した。
The water-soluble fraction obtained from the kazunoko obtained in Example 1 was treated with trypsin. Thereafter, the cytotoxic activity remaining in the water-soluble fraction was tested in the same manner as in Example 1.
As a result, as shown in FIG. 3, it was found that the cytotoxic activity of the water-soluble fraction obtained from Kazunoko was not affected at all by the treatment with trypsin.
実施例１により得られたカズノコから得られた前記水溶性画分に対して１００℃、２０分間の加熱処理を行った。その後、前記水溶性画分に残存する細胞傷害性活性を実施例１の場合と同様に実験を行った。
その結果、図４に示した様に、カズノコから得られた前記水溶性画分の細胞傷害性活性は加熱処理による処理の影響を全く受けないことが判明した。
The water-soluble fraction obtained from the kazunoko obtained in Example 1 was subjected to a heat treatment at 100 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the cytotoxic activity remaining in the water-soluble fraction was tested in the same manner as in Example 1.
As a result, as shown in FIG. 4, it was found that the cytotoxic activity of the water-soluble fraction obtained from Kazunoko was not affected at all by the heat treatment.
実施例１により得られたカズノコから得られた前記水溶性画分に対して、分子量１０００で分画する限外濾過膜を用いて分画を実施した後、濾液、すなわち分子量１０００以下の成分と、前記水溶性画分とを用いて実施例１の場合と同様に実験を行った。
前記濾液と前記水溶性画分とのそれぞれに含まれる成分濃度（タンパク質に換算した濃度、単位はμｇ／ｍｌ）に対する細胞傷害性活性の効果を測定したところ、図５に示した様に、前記濾液の活性は前記水溶性画分の活性に対して約１０倍上昇しており、前記水溶性画分に含まれる活性因子は分子量１０００以下であることが判明した。
The water-soluble fraction obtained from the casserole obtained in Example 1 was subjected to fractionation using an ultrafiltration membrane fractionated at a molecular weight of 1000, and then the filtrate, that is, a component having a molecular weight of 1000 or less and Using the water-soluble fraction, an experiment was conducted in the same manner as in Example 1.
As shown in FIG. 5, when the effect of the cytotoxic activity on the component concentration (concentration converted to protein, the unit is μg / ml) contained in each of the filtrate and the water-soluble fraction was measured, It was found that the activity of the filtrate was about 10 times higher than that of the water-soluble fraction, and the active factor contained in the water-soluble fraction had a molecular weight of 1000 or less.
実施例１により得られたカズノコから得られた前記水溶性画分に対して、アポトーシス誘導において発現されるＣａｓｐａｓｅの阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（Caspase Inhibitor VI、品番２１９００７、コスモ・バイオ社）を共存させて実施例１の場合と同様の実験を実施した。その結果を図７に示す。
図６のうち、一番左のクロマトグラムは前記水溶性画分およびＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫの双方を含まないもの、中央のクロマトグラムは前記水溶性画分のみを含むもの、一番右のクロマトグラムは前記水溶性画分およびＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫの双方を含む場合のマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６の生存率を示す。
前記水溶性画分の細胞傷害性活性は消失し、マウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６は、前記水溶性画分の存在しないコントロールレベルまで上昇した。
このことから、前記水溶性画分に含まれる化合物の細胞死誘導は、Ｃａｓｐａｓｅ経路によるアポトーシスによるものであることが判明した。
Z-VAD-FMK (Caspase Inhibitor VI, product number 219007, Cosmo Bio Inc.), which is an inhibitor of caspase expressed in the induction of apoptosis, with respect to the water-soluble fraction obtained from Kazunoko obtained in Example 1. ) Were allowed to coexist and the same experiment as in Example 1 was performed. The result is shown in FIG.
In FIG. 6, the leftmost chromatogram does not include both the water-soluble fraction and Z-VAD-FMK, the center chromatogram includes only the water-soluble fraction, and the rightmost chromatogram. Gram shows the survival rate of mouse colon cancer cell line Colon-26 when both the water-soluble fraction and Z-VAD-FMK are contained.
The cytotoxic activity of the water-soluble fraction disappeared, and the mouse colon cancer cell line Colon-26 increased to a control level where the water-soluble fraction did not exist.
From this, it was proved that the cell death induction of the compound contained in the water-soluble fraction was due to apoptosis by the caspase pathway.
生体内で常時発生しているスーパーオキサイドラジカルはガンの発生や様々な疾病の発症に関連があると言われている。
生体内でスーパーオキサイドラジカルの消去に関連している酵素はスーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）であり、このＳＯＤはスーパーオキサイドラジカルを酸素と過酸化水素に変換する。
このＳＯＤ活性に類似するＳＯＤ様活性が実施例１により得られたカズノコから得られた前記水溶性画分が示すかどうかについて検討を行った。
ＳＯＤ様活性の測定に際しては、同人化学社により販売されているＳＯＤ Ａｓｓａｙ
Ｋｉｔ−ＷＳＴを使用した。
その結果、前記水溶性画分は１３．８ｕｎｉｔ／ｍｌという比較的高いＳＯＤ様活性を示した。
しかしながら、１００℃、２０分間の加熱処理によりＳＯＤ様活性は消失したことから、前記水溶性画分の示す細胞傷害性活性因子と、ＳＯＤ様活性因子とは関連性が無いことが判明した。
Superoxide radicals that are constantly generated in the body are said to be related to the development of cancer and various diseases.
The enzyme associated with the elimination of superoxide radicals in vivo is superoxide dismutase (SOD), which converts superoxide radicals into oxygen and hydrogen peroxide.
It was examined whether the SOD-like activity similar to this SOD activity was exhibited by the water-soluble fraction obtained from the casserole obtained in Example 1.
When measuring SOD-like activity, SOD Assay sold by Dojin Chemical Co., Ltd.
Kit-WST was used.
As a result, the water-soluble fraction showed a relatively high SOD-like activity of 13.8 units / ml.
However, since the SOD-like activity disappeared by heat treatment at 100 ° C. for 20 minutes, it was found that the cytotoxic active factor shown in the water-soluble fraction and the SOD-like active factor are not related.
［比較例１］
魚類の卵にはＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）の混入していることが予想される。このＤＨＡによる細胞傷害性活性を測定し、実施例１により得られたカズノコから得られた前記水溶性画分の示す細胞傷害性活性と比較することとした。
ＤＨＡを１００℃、２０分間の条件で加熱処理したところ、図７に示す様に、ＤＨＡの細胞傷害性活性は明らかに低下した。この結果は、ＤＨＡに代表される多価不飽和脂肪酸類が熱により変性し易い事実と合致するものである。
従って、前記水溶性画分の示す細胞傷害性活性は、ＤＨＡに代表される多価不飽和脂肪酸類の示す細胞傷害性活性とは異なるものであることが判明した。
なお、前記水溶性画分の示す細胞傷害性活性と、ＤＨＡに代表される多価不飽和脂肪酸類の示す細胞傷害性活性とは異なることが顕微鏡観察により確認された。
[Comparative Example 1]
It is expected that fish eggs are contaminated with DHA (docosahexaenoic acid). The cytotoxic activity by this DHA was measured and compared with the cytotoxic activity exhibited by the water-soluble fraction obtained from the kazunoko obtained in Example 1.
When DHA was heat-treated at 100 ° C. for 20 minutes, the cytotoxic activity of DHA was clearly reduced as shown in FIG. This result is consistent with the fact that polyunsaturated fatty acids represented by DHA are easily denatured by heat.
Therefore, it was found that the cytotoxic activity exhibited by the water-soluble fraction is different from the cytotoxic activity exhibited by polyunsaturated fatty acids represented by DHA.
It was confirmed by microscopic observation that the cytotoxic activity exhibited by the water-soluble fraction was different from the cytotoxic activity exhibited by polyunsaturated fatty acids represented by DHA.
本発明は、細胞傷害性活性、特に、腫瘍細胞に対する細胞傷害性活性を必要とする医薬品の分野において有用である。 The present invention is useful in the field of pharmaceuticals that require cytotoxic activity, particularly cytotoxic activity against tumor cells.
１ 魚類の卵からの水溶性画分に含まれる化合物が存在する系
２ 魚類の卵からの水溶性画分に含まれる化合物が存在しない系
３ トリプシン処理を行った系
４ トリプシン処理を行なわなかった系
５、９ 加熱処理を行った系
６、１０ 加熱処理を行なわなかった系
７ 限外濾過による濾液による系
８ 限外濾過を行なわなかった系
1 A system in which a compound contained in a water-soluble fraction from fish eggs is present 2 A system in which a compound contained in a water-soluble fraction from fish eggs is absent 3 A system in which trypsin treatment was performed 4 No trypsin treatment was performed
Claims (2)
前記カズノコに含まれる液体成分は、
前記カズノコに含まれる液体成分に対しアセトンを添加することにより生じた沈殿物が、前もって除去されていて、
前記疎水性有機溶媒が、ｎ−ヘキサンであり、
肺癌患者由来の癌細胞を用いたハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来細胞、マウス大腸癌由来細胞及びヒト末梢血リンパ球からなる群より選ばれる少なくとも一つに対して細胞傷害性活性を作用させるための、水溶性画分。 A water-soluble fraction remaining in the liquid component obtained by removing the organic solvent extraction fraction obtained by obtaining a liquid component contained in casserole and extracting the liquid component with a hydrophobic organic solvent,
The liquid component contained in the casserole is
The precipitate produced by adding acetone to the liquid component contained in the casserole has been removed in advance,
The hydrophobic organic solvent is n-hexane;
In order to act cytotoxic activity on at least one selected from the group consisting of a hybridoma using cancer cells derived from lung cancer patients, human colon cancer-derived cells, mouse colon cancer-derived cells and human peripheral blood lymphocytes, Water-soluble fraction.
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