JP5137064B2

JP5137064B2 - Free-living amoeba control agent

Info

Publication number: JP5137064B2
Application number: JP2007218852A
Authority: JP
Inventors: 和明東岸
Original assignee: TAMAGAWA ACADEMY & UNIVERSITY
Current assignee: TAMAGAWA ACADEMY & UNIVERSITY
Priority date: 2007-08-24
Filing date: 2007-08-24
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2027-08-24
Also published as: JP2009051755A

Description

本発明は、抗アメーバ作用を有する自由生活性アメーバ防除剤や、該アメーバ防除剤を有効成分として含有する口腔用・水系用等の自由生活性アメーバ防除組成物に関する。 The present invention relates to a free-living amoeba control agent having an anti-amoebic action and a free-living amoeba control composition for oral cavity or water system containing the amoeba control agent as an active ingredient.

アメーバは原生動物の一種であり、高等動物に寄生して生息する寄生性アメーバと自然界に広く生息する自由生活性アメーバとに大別され、自由生活性アメーバは、赤痢アメーバに代表される寄生性アメーバとは異なり、ヒトに対する健康上の影響はないと考えられてきた。しかし、１９７６年に米国での重症肺炎の集団発生が、空調用冷却塔から飛散した水に含まれていたレジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）による感染症であることが明らかとなったこと、イソチアゾロン系化合物やニトロアルコール系化合物等のレジオネラ属菌用の殺菌剤（特許文献１及び２参照）を水系に添加しても、レジオネラ属菌の除菌に有効でなかったことから、レジオネラ属菌の宿主としての自由生活性アメーバの役割が注目されるようになった。すなわち、ネグレリア（Naegleria）属、アカントアメーバ（Acanthamoeba）属、ハルトマンネラ（Hartmannella）属などのアメーバが、レジオネラ属菌を食胞内に取り込んだ場合、消化を免れたレジオネラ属菌は、食胞内で増殖し、ついには食胞の破裂によりレジオネラ属菌は外界に放散し、新たな宿主へと感染する（非特許文献１参照）。このように、アメーバは、レジオネラ属菌の宿主として重要な役割を果たしており、アメーバと共存しているレジオネラ属菌を効果的に除菌するには、アメーバを殺滅することが考えられる。そこで、水系のアメーバを効果的に防除するために、ヒノキチオール化合物及びグルタルアルデヒド（特許文献１及び２参照）や、ジメチルアミド（特許文献３参照）や、ホスホニウム化合物（特許文献４参照）や、ビス型四級アンモニウム塩（特許文献５参照）を対象水系に添加することを特徴とするアメーバの抑制方法が提案されている。 Amoeba is a kind of protozoa, and it is roughly divided into parasitic amoeba that infests higher animals and free-living amoeba that inhabits the natural world. Free-living amoeba is a parasitic nature represented by dysentery amoeba. Unlike amoeba, it has been thought to have no health effects on humans. However, it was revealed in 1976 that an outbreak of severe pneumonia in the United States was caused by an infection caused by Legionella pneumophila contained in the water splashed from the cooling tower for air conditioning, isothiazolone Even if a bactericidal agent for Legionella spp. (See Patent Documents 1 and 2) such as nitroalcohol compounds and nitroalcohol compounds was not effective for eradication of Legionella spp., Legionella spp. The role of free-living amoeba as a host has come to be noticed. That is, when an amoeba such as the genus Naegleria, Acanthamoeba, or Hartmannella takes Legionella into the phagosome, digestion-free Legionella genus At last, Legionella spp. Are released to the outside world by rupture of the phagosome and infect a new host (see Non-Patent Document 1). As described above, amoeba plays an important role as a host of Legionella, and in order to effectively disinfect Legionella that coexists with Amoeba, it is conceivable to kill Amoeba. Therefore, in order to effectively control water-based amoeba, hinokitiol compounds and glutaraldehyde (see Patent Documents 1 and 2), dimethylamide (see Patent Document 3), phosphonium compounds (see Patent Document 4), bis A method for suppressing amoeba, characterized by adding a type quaternary ammonium salt (see Patent Document 5) to a target aqueous system, has been proposed.

また、近年、ヒト又は動物に感染し、重篤な健康影響を及ぼす自由生活性アメーバについて注目が集まっている。アメーバ性脳炎は、ネグレリア・フォーレリ（N.fowleri）の感染による原発性アメーバ性髄膜脳炎、並びにアカントアメーバ属アメーバ及びバラムチア・マンドリルリス（Balamuthia mandrillaris）による感染による肉芽腫性脳炎に分けることができるが、両病型共に致死的である。また、アメーバ性角膜炎は、コンタクトレンズ装着により生じる角膜上の小さな傷等から、アカントアメーバ属のアメーバが感染することで発症すると考えられ、激しい痛みを伴う角膜潰瘍、混濁、視力障害、さらには失明のおそれもある難治性の疾病であるが（非特許文献１参照）、これらの疾病について簡便で効果的な予防法、治療方法は知られていない。 In recent years, attention has been focused on a free-living amoeba that infects humans or animals and has a serious health effect. Amebic encephalitis can be divided into primary amoebic meningoencephalitis due to infection with N. fowleri and granulomatous encephalitis due to infection with Acanthamoeba amoeba and Balamuthia mandrillaris However, both forms are fatal. In addition, amebic keratitis is thought to develop as a result of infection of an amoeba belonging to the genus Acanthamoeba due to a small wound on the cornea caused by wearing of a contact lens, and is accompanied by severe painful corneal ulcer, opacity, visual impairment, Although it is an intractable disease that may cause blindness (see Non-Patent Document 1), a simple and effective prevention method and treatment method for these diseases are not known.

特開平１１−５７７３７号公報JP-A-11-57737 特開平１１−３１９８４７号公報JP-A-11-319847 特開２００２−１１４６０９号公報JP 2002-114609 A 特開２００２−３０８７１３号公報JP 2002-308713 A 特開２００３−２９０７７８号公報JP 2003-290778 A 八木田健司、泉山信司、生活用水の病原アメーバ汚染とその健康影響−水系環境のアメーバ汚染、モダンメディア５２巻８号１２-１９、２００６Kenji Yakita, Shinji Izumiyama, Pathogenic Amoeba Contamination of Living Water and Its Health Effects-Amoeba Contamination in the Aqueous Environment, Modern Media Vol. 52, No. 8, 12-19, 2006

アメーバの生存及び増殖を抑制するための水系添加剤として提案されている、ヒノキチオール（特許文献１及び２参照）は、コストが高いという問題があり、アルデヒドをベースとする消毒剤（特許文献１及び２参照）は、多くの場合、特に皮膚や呼吸器官の感作反応を惹起するうえに、特有な刺激性の不快臭を有することが多い。また、第四級アンモニウム塩（特許文献５参照）は、濃度の高い水溶液として使用する場合に泡立ちが著しい場合があり、取扱いに不都合を生じる場合があった。 Hinokitiol (see Patent Documents 1 and 2), which is proposed as an aqueous additive for suppressing the survival and growth of amoeba, has a problem of high cost, and an aldehyde-based disinfectant (Patent Documents 1 and 2). 2) often has a specific, unpleasant, unpleasant odor, especially in inducing a sensitization reaction of the skin and respiratory organs. In addition, the quaternary ammonium salt (see Patent Document 5) may cause significant foaming when used as an aqueous solution having a high concentration, which may cause inconvenience in handling.

また、原発性アメーバ性髄膜脳炎は、世界で１８０例以上の報告があるが、生存例は５例に過ぎず、生存例に投与された国内承認薬はすべて保険適応外である。アカントアメーバ角膜炎についても、使用されている国内承認薬は保険適応外である（寄生虫症薬物治療の手引き、改訂第６．０版、厚生労働科学研究費補助金・ヒューマンサイエンス振興財団政策創薬総合研究事業―「熱帯病・寄生虫症に対する稀少疾病治療薬の輸入・保管・治療体制の開発研究」班）。 In addition, more than 180 cases of primary amoebic meningoencephalitis have been reported worldwide, but only 5 cases have survived, and all domestically approved drugs administered to those cases are not covered by insurance. Also for Acanthamoeba keratitis, the domestic approved drug used is not covered by insurance (parasitic disease treatment guide, revision 6.0, subsidy for welfare labor science research fund, human science promotion foundation policy creation Drug Research Project-“Development and research of import / storage / treatment system for rare diseases for tropical diseases and parasitic diseases”).

したがって、本発明の課題は、安価で、安全性が高く、使用が簡便な自由生活性アメーバ防除剤、病原性自由生活性アメーバに起因する疾病の感染予防又は治療用のアメーバ防除組成物、口腔用・水系用の自由生活性アメーバ防除組成物を提供することにある。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a free-living amoeba control agent that is inexpensive, highly safe and easy to use, an amoeba-controlling composition for preventing or treating infection caused by pathogenic free-living amoeba, oral cavity It is to provide a free-living amoeba control composition for water and water.

本発明者らは、自由生活性アメーバ防除作用を有する化合物を同定するため、土壌から分離したカビを、押麦を主体とする固体培地を用いて培養した後、カビと培地の混合物を１−ブタノールで抽出した合計８００個の試料につき、非病原性アメーバ、ネグレリア・ロバニエンシス（N. lovaniensis）を用いて、ペーパーディスク法により検定したところ、一試料について、阻止円が形成され、抗アメーバ活性を有する化合物の存在が確認され、ＮＭＲを用いてかかる化合物の構造解析を行い、１−リノール酸グリセリドであると同定した。そこで、市販の１−リノール酸グリセリドの標準試薬を用いて、当該化合物の抗自由生活性アメーバ活性を確認し、本発明を完成するに至った。 In order to identify a compound having a free-living amoeba control action, the present inventors cultured mold separated from soil using a solid medium mainly composed of oats, and then mixed the mold and medium mixture with 1-butanol. When a total of 800 samples extracted in (1) were tested by the paper disc method using a non-pathogenic amoeba, N. lovaniensis, a blocking circle was formed for one sample and it had anti-amoeba activity. The presence of the compound was confirmed, and the structure of the compound was analyzed using NMR and identified as 1-linoleic acid glyceride. Then, using the commercially available standard reagent of 1-linoleic acid glyceride, the antifreedom amoeba activity of the said compound was confirmed, and it came to complete this invention.

すなわち本発明は、（１）一般式（I）又は（II）で表される化合物からなる自由生活性アメーバ防除剤； That is, the present invention provides (1) a free-living amoeba control agent comprising a compound represented by the general formula (I) or (II);

（式中、Ｒ¹は、不飽和結合を１〜３個有する炭素数７〜１９のアルケニル基又はアルキニル基を示し、Ｘは、ヒドロキシ基を１〜７個有する炭素数２〜８のヒドロキシアルキルオキシ基、ヒドロキシ基を１〜７個有する炭素数２〜８のヒドロキシアルケニルオキシ基、又は、炭素数２〜８のアミノ酸残基若しくはオリゴペプチド残基を示す。） (In the formula, R ¹ represents a C 7-19 alkenyl group or alkynyl group having 1 to 3 unsaturated bonds, and X represents a C 2-8 hydroxyalkyl having 1 to 7 hydroxy groups. An oxy group, a hydroxyalkenyloxy group having 2 to 8 carbon atoms having 1 to 7 hydroxy groups, or an amino acid residue or oligopeptide residue having 2 to 8 carbon atoms.)

（式中、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、互いに独立して、ヒドロキシ基、又は不飽和結合を１〜３個有する炭素数８〜２０の脂肪酸残基を示す。但し、式中Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４のうち、少なくとも１個が脂肪酸残基であるが、Ｒ^２又はＲ^４のみが脂肪酸残基である場合を除く。）に関する。 (In the formula, R ² , R ³ , and R ⁴ independently represent a hydroxy group or a fatty acid residue having 8 to 20 carbon atoms having 1 to 3 unsaturated bonds. ² , R ³ , and R ⁴ are at least one fatty acid residue, except that only R ² or R ⁴ is a fatty acid residue.

また本発明は、（２）１−ミリストレイン酸グリセリド、１−パルミトレイン酸グリセリド、１−オレイン酸グリセリド、１−リノール酸グリセリド、モノパルミトレイン酸プロピレングリコール、モノオレイン酸プロピレングリコール、モノリノール酸プロピレングリコール、モノオレイン酸キシリトール、モノリノール酸キシリトール、Ｎ−パルミトレオイルグリシン、Ｎ−パルミトレオイルアラニン、Ｎ−オレオイルグリシン、Ｎ−オレオイルアラニン、Ｎ−オレオイルセリン、Ｎ−オレオイルグルタミン酸、Ｎ−リノレオイルグリシン、Ｎ−α−リノレノイルグリシン、Ｎ−γ−リノレノイルグリシン、１，２−ジミリストレオイルグリセロール、１，２−ジパルミトレオイルグリセロール、１，２−ジオレオイルグリセロール、１，２−ジリノレオイルグリセロール、１，２−ジ−α−リノレノイルグリセロール、１，２−ジ−γ−リノレノイルグリセロール、１−ミリストレオイル−２−オレオイルグリセロール、１−オレオイル−２−ミリストレオイルグリセロール、１−パルミトレオイル−２−オレオイルグリセロール、１−オレオイル−２−パルミトレオイルグリセロールから選ばれる前記（１）記載の自由生活性アメーバ防除剤や、（３）自由生活性アメーバが、ネグレリア属、アカントアメーバ属、及びハルトマンネラ属に属する群から選ばれる１又は２種以上のアメーバであることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の自由生活性アメーバ防除剤や、（４）前記（１）〜（３）のいずれか記載の自由生活性アメーバ防除剤を有効成分として含有することを特徴とする自由生活性アメーバ防除組成物に関する。 The present invention also includes (2) 1-myristoleic acid glyceride, 1-palmitoleic acid glyceride, 1-oleic acid glyceride, 1-linoleic acid glyceride, monopalmitoleic acid propylene glycol, monooleic acid propylene glycol, monolinoleic acid propylene glycol , Xylitol monooleate, xylitol monolinoleate, N-palmitoleoylglycine, N-palmitoleoylalanine, N-oleoylglycine, N-oleoylalanine, N-oleoylserine, N-oleoylglutamic acid, N -Linoleoylglycine, N-α-linolenoylglycine, N-γ-linolenoylglycine, 1,2-dimyristoleoylglycerol, 1,2-dipalmitoleoylglycerol, 1,2-diole Oil glycerol, 1, 2-dilinoleoylglycerol, 1,2-di-α-linolenoylglycerol, 1,2-di-γ-linolenoylglycerol, 1-myristoleyl-2-oleoylglycerol, 1-oleoyl- The free-living amoeba control agent according to the above (1) selected from 2-myristoleyl glycerol, 1-palmitoleoyl-2-oleoyl glycerol, 1-oleoyl-2-palmitreoyl glycerol, (3) The free-living amoeba is one or more kinds of amoeba selected from the group belonging to the genus Negrelia, Acanthamoeba, and Hartmannella, the free-living property as described in (1) or (2) above Containing an amoeba control agent or (4) the free-living amoeba control agent according to any one of (1) to (3) as an active ingredient The present invention relates to a free-living amoeba control composition.

自由生活性アメーバが存在している水系中に、本発明の自由生活性アメーバ防除剤を添加することにより、自由生活性アメーバを防除し、病原性自由生活性アメーバに起因する疾病の感染を予防できるほか、アメーバとレジオネラ属細菌が共存している水系において、自由生活性アメーバを宿主としているレジオネラ属細菌を除菌できる。 By adding the free-living amoeba control agent of the present invention to the water system in which free-living amoeba exists, the free-living amoeba is controlled and the infection of diseases caused by pathogenic free-living amoeba is prevented. In addition, in a water system in which amoeba and Legionella bacteria coexist, Legionella bacteria having free-living amoeba as a host can be sterilized.

本発明の自由生活性アメーバ防除剤としては、一般式（I）Ｒ¹−ＣＯ−Ｘ（式中、Ｒ¹は、不飽和結合を１〜３個有する炭素数７〜１９のアルケニル基又はアルキニル基を示し、Ｘは、ヒドロキシ基を１〜７個有する炭素数２〜８のヒドロキシアルキルオキシ基、ヒドロキシ基を１〜７個有する炭素数２〜８のヒドロキシアルケニルオキシ基、又は、炭素数２〜８のアミノ酸残基若しくはオリゴペプチド残基を示す。）、又は、 As the free-living amoeba control agent of the present invention, the general formula (I) R ¹ —CO—X (wherein R ¹ is an alkenyl group having 7 to 19 carbon atoms and an alkynyl group having 7 to 19 carbon atoms) X represents a hydroxyalkyloxy group having 2 to 8 carbon atoms having 1 to 7 hydroxy groups, a hydroxyalkenyloxy group having 2 to 8 carbon atoms having 1 to 7 hydroxy groups, or 2 carbon atoms -8 amino acid residues or oligopeptide residues), or

（式中、Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４は、互いに独立して、ヒドロキシ基、又は不飽和結合を１〜３個有する炭素数８〜２０の脂肪酸残基を示す。但し、式中Ｒ^２、Ｒ^３、及びＲ^４のうち、少なくとも１個が脂肪酸残基であるが、Ｒ^２又はＲ^４のみが脂肪酸残基である場合を除く。）で表される化合物を有効成分とするものであれば特に制限されるものではなく、これら本発明の自由生活性アメーバ防除用化合物の１種又は２種以上を自由生活性アメーバと接触させることにより、自由生活性アメーバを殺滅することにより防除することができる。 (In the formula, R ² , R ³ , and R ⁴ independently represent a hydroxy group or a fatty acid residue having 8 to 20 carbon atoms having 1 to 3 unsaturated bonds. ² , R ³ , and R ⁴ , at least one of which is a fatty acid residue, except that only R ² or R ⁴ is a fatty acid residue.) If it does not restrict | limit in particular, By killing a free-living amoeba by making 1 type, or 2 or more types of these free-living amoeba control compounds of this invention contact with a free-living amoeba It can be controlled.

上記一般式（I）において、不飽和結合を１〜３個有する炭素数７〜１９のアルケニル基又はアルキニル基を示すＲ¹としては、二重結合若しくは三重結合を含むものが好ましく、１〜２個の二重結合、特に１個の二重結合を含むものがより好ましい。かかるＲ^１は、親水基と疎水基との間に適当な距離を維持するため、炭素数７〜１９であることが必要であり、炭素数１３〜１７であるものが好ましく、炭素数１５〜１７であるものがより好ましい。なお、Ｒ^１が、炭素数７〜１９であっても、ステアリン酸などの飽和脂肪酸残基である場合は抗アメーバ活性が確認されない。 In the general formula (I), R ¹ which represents an alkenyl group having 7 to 19 carbon atoms or an alkynyl group having 1 to 3 unsaturated bonds is preferably one containing a double bond or a triple bond. More preferred are those containing one double bond, in particular one double bond. In order to maintain an appropriate distance between the hydrophilic group and the hydrophobic group, R ¹ needs to have 7 to 19 carbon atoms, preferably 13 to 17 carbon atoms, and preferably 15 to 15 carbon atoms. More preferred is 17. Even if R ¹ has 7 to 19 carbon atoms, anti-amoeba activity is not confirmed when it is a saturated fatty acid residue such as stearic acid.

上記一般式（I）におけるＸが、ヒドロキシ基を１〜７個有する炭素数２〜８のヒドロキシアルキルオキシ基、又は、ヒドロキシ基を１〜７個有する炭素数２〜８のヒドロキシアルケニルオキシ基である場合に、これらは、分岐していても、環式部分を含んでも、二重結合、三重結合を含んでいてもよい。具体的には、Ｘとしては、例えばグリセリン残基、プロピレングリコール残基、キシリトール残基、ソルビトール残基を挙げることができ、グリセリン残基やキシリトール残基を好適に例示することができる。 X in the general formula (I) is a hydroxyalkyloxy group having 2 to 8 carbon atoms having 1 to 7 hydroxy groups, or a hydroxyalkenyloxy group having 2 to 8 carbon atoms having 1 to 7 hydroxy groups. In some cases, they may be branched, contain cyclic moieties, contain double bonds, triple bonds. Specifically, examples of X include a glycerin residue, a propylene glycol residue, a xylitol residue, and a sorbitol residue, and preferred examples include a glycerin residue and a xylitol residue.

また、一般式（I）におけるＸが、炭素数２〜８のアミノ酸残基又はオリゴペプチド残基である場合に、かかるアミノ酸残基としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、バリン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、アルギニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン等のα−アミノ酸残基や、β−アラニン、β−チロシン等のβ−アミノ酸残基や、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、γ−アミノ酪酸等のγ−アミノ酸残基や、δ−アミノ吉草酸等のδ−アミノ酸残基や、非天然型のアミノ酸残基などを挙げることができ、また、オリゴペプチド残基としては、グリシル−グリシン、グリシル−アラニン、アラニル−アラニン等のジペプチド残基や、グリシル−グリシル−グリシン、グリシル−グリシル−アラニン等のトリペプチド残基などを挙げることができる。これらの中でも、グリシン残基やセリン残基を好適に例示することができる。 In addition, when X in the general formula (I) is an amino acid residue having 2 to 8 carbon atoms or an oligopeptide residue, examples of the amino acid residue include glycine, alanine, serine, valine, aspartic acid, asparagine. Α-amino acid residues such as glutamic acid, glutamine, lysine, arginine, cysteine, methionine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, β-amino acid residues such as β-alanine, β-tyrosine, and γ-amino-β-hydroxy Examples include γ-amino acid residues such as butyric acid and γ-aminobutyric acid, δ-amino acid residues such as δ-aminovaleric acid, and non-natural amino acid residues. Are dipeptide residues such as glycyl-glycine, glycyl-alanine, alanyl-alanine, and glycyl-glycyl-glycine. Emissions, glycyl - glycyl - like tripeptide residues alanine and the like. Among these, glycine residues and serine residues can be preferably exemplified.

上記一般式（I）で表される化合物として、具体的には、１−ミリストレイン酸グリセリド、１−パルミトレイン酸グリセリド、１−オレイン酸グリセリド、１−リノール酸グリセリド、モノパルミトレイン酸プロピレングリコール、モノオレイン酸プロピレングリコール、モノリノール酸プロピレングリコール、モノオレイン酸キシリトール、モノリノール酸キシリトール、Ｎ−パルミトレオイルグリシン、Ｎ−パルミトレオイルアラニン、Ｎ−オレオイルグリシン、Ｎ−オレオイルアラニン、Ｎ−オレオイルセリン、Ｎ−オレオイルグルタミン酸、Ｎ−リノレオイルグリシン、Ｎ−α−リノレノイルグリシン、Ｎ−γ-リノレノイルグリシン等を挙げることができ、中でも、１−リノール酸グリセリド、１−オレイン酸グリセリド、Ｎ−オレオイルグリシンを特に好適に例示することができる。 Specific examples of the compound represented by the general formula (I) include 1-myristoleic acid glyceride, 1-palmitoleic acid glyceride, 1-oleic acid glyceride, 1-linoleic acid glyceride, monopalmitoleic acid propylene glycol, mono Propylene glycol oleate, propylene glycol monolinoleate, xylitol monooleate, xylitol monolinoleate, N-palmitoleoylglycine, N-palmitoleoylalanine, N-oleoylglycine, N-oleoylalanine, N-ole Examples include oil serine, N-oleoyl glutamic acid, N-linoleoyl glycine, N-α-linolenoyl glycine, N-γ-linolenoyl glycine, among which 1-linoleic acid glyceride, 1- Oleic acid glyceride, N-ole Irugurishin can be particularly preferably exemplified.

上記の一般式（II）においてＲ^２、Ｒ^３、及び／又はＲ^４が不飽和脂肪酸残基である場合に、かかる不飽和脂肪酸残基は、二重結合若しくは三重結合を含むものが好ましく、１〜２個の二重結合、特に１個の二重結合を含むものがより好ましい。かかる不飽和脂肪酸残基として具体的には、ミリストレイン酸残基、パルミトレイン酸残基、オレイン酸残基、リノール酸残基、アルファ−リノレン酸残基、ガンマ−リノレン酸残基、８，１１−イコサジエン酸残基、５，８，１１−イコサトリエン酸残基等を挙げることができ、中でもリノール酸残基、オレイン酸残基を特に好適に例示することができる。なお、炭素数８〜２０であっても、ステアリン酸などの飽和脂肪酸残基である場合は抗アメーバ活性が確認されない。 In the above general formula (II), when R ² , R ³ , and / or R ⁴ is an unsaturated fatty acid residue, the unsaturated fatty acid residue preferably contains a double bond or a triple bond, More preferred are those containing 1 to 2 double bonds, particularly 1 double bond. Specific examples of such unsaturated fatty acid residues include myristoleic acid residues, palmitoleic acid residues, oleic acid residues, linoleic acid residues, alpha-linolenic acid residues, gamma-linolenic acid residues, 8,11. -Eicosadienoic acid residue, 5,8,11-icosatrienoic acid residue and the like can be mentioned, among which linoleic acid residue and oleic acid residue can be particularly preferably exemplified. In addition, even if it is C8-20, when it is saturated fatty acid residues, such as a stearic acid, anti-amoeba activity is not confirmed.

上記一般式（II）で表される化合物として、具体的には、１，２−ジミリストレオイルグリセロール、１，２−ジパルミトレオイルグリセロール、１，２−ジオレオイルグリセロール、１，２−ジリノレオイルグリセロール、１，２−ジ−α−リノレノイルグリセロール、１，２−ジ−γ−リノレノイルグリセロール、１−ミリストレオイル−２−オレオイルグリセロール、１−オレオイル−２−ミリストレオイルグリセロール、１−パルミトレオイル−２−オレオイルグリセロール、１−オレオイル−２−パルミトレオイルグリセロール等を挙げることができる。 Specific examples of the compound represented by the general formula (II) include 1,2-dimyristoleoyl glycerol, 1,2-dipalmitoleoyl glycerol, 1,2-dioleoyl glycerol, 1,2 -Dilinoleoylglycerol, 1,2-di-α-linolenoylglycerol, 1,2-di-γ-linolenoylglycerol, 1-myristoleyl-2-oleoylglycerol, 1-oleoyl-2 -Myristoleoyl glycerol, 1-palmitoleoyl-2-oleoyl glycerol, 1-oleoyl-2-palmitreoyl glycerol and the like.

また、本発明の上記の一般式（I）又は（II）で表される化合物は、市販品を用いることができるほか、化学的に常法により合成することもできるが、実施例で示すように、カビ等の微生物を培養し、培養物から抽出・単離することによっても作製することができる。上記の一般式（I）又は（II）で表される化合物の単離、精製は、例えば、シリカゲル多孔性吸着樹脂カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなどを用いることにより行うことができる。単離された化合物の構造は、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル及び¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル、可視光線吸収スペクトル、ＵＶ吸収スペクトル、反射スペクトル、Ｘ線結晶等の公知の分析手段により確認することができるがこれらに制限されない。 In addition, the compound represented by the above general formula (I) or (II) of the present invention can be a commercially available product or can be chemically synthesized by a conventional method, but as shown in the examples. In addition, it can also be produced by culturing microorganisms such as molds and extracting and isolating them from the culture. Isolation and purification of the compound represented by the above general formula (I) or (II) is performed by using, for example, silica gel porous adsorption resin column chromatography, reverse phase column chromatography, thin layer chromatography, or the like. be able to. The structure of the isolated compound can be confirmed by known analytical means such as ¹ H-NMR spectrum and ¹³ C-NMR spectrum, visible light absorption spectrum, UV absorption spectrum, reflection spectrum, and X-ray crystal. Not limited to.

アメーバは、単細胞生物で、基本的に鞭毛や繊毛を持たず、仮足で運動する原生生物に属する肉質虫類の俗称であり、水系環境中など自然界に広く生息する自由生活性アメーバと、ヒトの腸管など高等生物に寄生して生息する寄生性アメーバに大別されるが、本発明のアメーバ防除剤の対象となるのは、他の生物に依存（共生や寄生）することなく、独立して生活することができる性質を備えた自由生活性の病原性又は非病原性のアメーバである。かかる自由生活性アメーバとしては、例えば、ネグレリア属、アカントアメーバ属、ヴァンネラ属、ハルトマンネラ属、ヴァルカンフィア属、バラムチア属のアメーバを挙げることができ、好ましくは、ネグレリア属、ハルトマンネラ属、アカントアメーバ属のアメーバを挙げることができる。なお、自由生活性アメーバの生活様式は、細菌等を捕食し活発に増殖する栄養体のステージと、栄養体が、乾燥や、栄養状態の悪化などの要因で被嚢し、休眠状態となるシストのステージがあるが、本発明のアメーバ防除剤は、栄養体のステージのアメーバに適用することが好ましい。 Amoeba is a unicellular organism that has basically no flagella or cilia, and is a common name for carnivorous protozoa belonging to protozoa that move with temporary legs, and is a free-living amoeba that inhabits the natural world, such as in an aquatic environment, and humans It is roughly divided into parasitic amoeba inhabiting higher organisms such as the intestinal tract, but the object of the amoeba control agent of the present invention is independent without depending on other organisms (symbiosis and parasitism). It is a free-living pathogenic or non-pathogenic amoeba with the ability to live in Examples of such free-living amoeba include amoebae of the genus Negrelia, Acanthamoeba, Vannella, Hartmannella, Valcampia, and Balamthia, and preferably Negrelia, Hartmannella, Acanthamoeba Mention may be made of the genus Amoeba. The life style of a free-living amoeba consists of a vegetative stage that prey on bacteria and actively proliferate, and a cyst that is encapsulated due to factors such as dryness and deterioration of nutritional condition and becomes dormant. However, it is preferable that the amoeba control agent of the present invention is applied to the amoeba of the vegetative stage.

本発明の自由生活性アメーバ防除組成物としては、上記本発明の自由生活性アメーバ防除剤を有効成分として含むものであれば特に制限されず、本発明の自由生活性アメーバ防除剤や自由生活性アメーバ防除組成物は、自由生活性アメーバ自体の殺滅作用や、レジオネラ属菌、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、好酸菌などの宿主としての自由生活性アメーバを殺滅することにより、間接的にレジオネラ属菌を死滅させる殺菌作用を有することから、病原性自由生活性アメーバに直接起因する疾病、例えば、ネグレリア・フォーレリに起因する原発性アメーバ性髄膜脳炎、アカントアメーバ属のアメーバに起因する肉芽種性アメーバ性脳炎やアメーバ性角膜炎の感染予防又は治療に有用であり、また、間接的にレジオネラ属菌、大腸菌Ｏ１５７、好酸菌などに起因する疾病、例えば、レジオネラ・ニューモフィラに起因する在郷軍人病、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７に起因する出血性大腸炎の感染予防に有用である。 The free-living amoeba control composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains the free-living amoeba control agent of the present invention as an active ingredient, and the free-living amoeba control agent or free-living property of the present invention. The amoeba-controlling composition can indirectly inhibit Legionella by killing free-living amoeba itself or killing free-living amoeba as a host such as Legionella spp., Enterohemorrhagic Escherichia coli O157, and eosinophilic bacteria. Since it has a bactericidal action to kill the genus fungus, diseases directly caused by pathogenic free-living amoeba, for example, primary amoebic meningoencephalitis caused by Negrelia forerelli, granuloma species caused by amoeba of the genus Acanthamoeba It is useful for the prevention or treatment of infectious amebic encephalitis and amebic keratitis infection, and indirectly, Legionella spp., Escherichia coli O157, Diseases caused such as bacteria, e.g., Legionnaires' disease caused by Legionella pneumophila, are useful in preventing infection of hemorrhagic colitis due to enterohemorrhagic E. coli O157.

本発明の自由生活性アメーバ防除剤に溶解剤、分散剤、安定化剤等を配合して、プール、浴槽、冷却循環水などに使用される本発明の水系用アメーバ防除組成物とすることができる。対象水系に対して、例えば、本発明の防除剤（化合物）濃度が１〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０〜２００ｍｇ／Ｌの範囲になるように添加し、添加方法については特に制限はなく、対象水系に対して数日から１ヶ月程度間隔で添加してもよく、あるいは水系中の濃度を一定以上に維持するように、連続的に添加してもよい。本発明の自由生活性アメーバ防除化合物を含有する水を系内に循環させることにより、水系中のアメーバを殺滅するとともに、間接的に系内のレジオネラ属菌や大腸菌を併せて殺菌することができる。 The free-living amoeba control agent of the present invention may be blended with a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, and the like to form an aqueous amoeba control composition of the present invention used for pools, bathtubs, cooling circulating water, and the like. it can. For example, added to the target aqueous system so that the concentration of the control agent (compound) of the present invention is in the range of 1 to 1000 mg / L, preferably 10 to 500 mg / L, more preferably 50 to 200 mg / L. There is no particular limitation on the method, and it may be added to the target aqueous system at intervals of several days to about one month, or may be added continuously so as to maintain the concentration in the aqueous system at a certain level or higher. By circulating water containing the free-living amoeba control compound of the present invention in the system, the amoeba in the water system can be killed, and the Legionella spp. it can.

本発明の自由生活性アメーバ防除剤に増粘剤、乳化剤、中和剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、香料、油脂類等を適宜配合して、外用うがい・洗口剤などに使用される本発明の口腔用アメーバ防除組成物や、洗浄・消毒用アメーバ防除組成物とすることができる。口腔用アメーバ防除組成物における本発明の防除剤（化合物）濃度を、１０〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０〜２００ｍｇ／Ｌの範囲とすることにより、口腔内の病原性自由生活性アメーバを殺滅することができる。また、トイレ洗浄・消毒剤、浴槽洗浄・消毒剤、皿洗い機用洗浄・消毒剤、洗濯用洗浄・消毒剤、コンタクトレンズ洗浄・消毒剤などの洗浄・消毒用アメーバ防除組成物における本発明の防除剤（化合物）濃度を、１〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０〜２００ｍｇ／Ｌの範囲とすることにより、対象環境のアメーバを殺滅するとともに、間接的にレジオネラ属菌や大腸菌を併せて殺菌することができる。 Thickeners, emulsifiers, neutralizers, preservatives, stabilizers, wetting agents, fragrances, fats and oils, etc. are appropriately blended with the free-living amoeba control agent of the present invention and used for gargles and mouthwashes for external use. The amoeba control composition for oral cavity of the present invention and the amoeba control composition for cleaning and disinfection can be obtained. By controlling the concentration of the control agent (compound) of the present invention in the oral amoeba control composition in the range of 10 to 500 mg / L, preferably 50 to 200 mg / L, the pathogenic free-living amoeba in the oral cavity is killed. can do. Also, the present invention in amoeba control composition for cleaning / disinfecting such as toilet cleaning / disinfecting agent, bathtub cleaning / disinfecting agent, dishwasher cleaning / disinfecting agent, laundry cleaning / disinfecting agent, contact lens cleaning / disinfecting agent, etc. The concentration of the agent (compound) is in the range of 1 to 1000 mg / L, preferably 10 to 500 mg / L, more preferably 50 to 200 mg / L, thereby killing amoeba in the target environment and indirectly Legionella. It can be sterilized together with genus bacteria and E. coli.

発明の自由生活性アメーバ防除剤に賦形剤、増粘剤、乳化剤、中和剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、香料、油脂類等を適宜配合して、病原性自由生活性アメーバに直接起因する疾病の感染予防又は治療用アメーバ防除組成物とすることができる。かかる感染予防又は治療用組成物の投与形態としては、経口投与、点眼投与、経皮投与を挙げることができる。さらに、飲食品に添加することにより感染予防用の機能性飲食品とすることができる。また、投与量や投与回数は、患者の症状、体重等に応じて適宜決定することができるが、通常成人１日当たり、本発明の防除剤（化合物）を１００ｍｇ〜１ｇを投与することが好ましい。 The free-living amoeba control agent of the present invention is appropriately mixed with excipients, thickeners, emulsifiers, neutralizing agents, preservatives, stabilizers, wetting agents, fragrances, fats and oils, etc. It can be set as the amoeba control composition for the infection prevention or treatment of the disease caused directly by this. Examples of the administration form of the composition for preventing or treating infection include oral administration, eye drop administration and transdermal administration. Furthermore, it can be set as the functional food-drinks for infection prevention by adding to food-drinks. Moreover, although a dosage and the frequency | count of administration can be suitably determined according to a patient's symptom, a body weight, etc., it is preferable to administer 100 mg-1g of control agents (compound) of this invention per normal adult day.

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.

［抗アメーバ活性を有する化合物のスクリーニング］
（カビの分離）
カビの分離は、文献（G.W.Claus. 1973. Understanding Microbes. W.H.Freeman and Company,NewYork）記載の方法により分離した。すなわち、日本各地をはじめ町田市郊外の山林、玉川大学構内等から採取した土壌１ｇを、１０ｍＬの無菌水に懸濁させた後、ポテトデキストロース寒天培地によりおよそ８００種類のカビを分離した。 [Screening of compounds having anti-amoeba activity]
(Mold separation)
The mold was separated by the method described in the literature (GWClaus. 1973. Understanding Microbes. WHFreeman and Company, New York). That is, 1 g of soil collected from various places in Japan, from the forests in the suburbs of Machida City, the campus of Tamagawa University, etc. was suspended in 10 mL of sterile water, and then approximately 800 types of mold were separated using a potato dextrose agar medium.

土壌から分離したおよそ８００種類のカビを、押麦を主体とする固体培地を用いて２８℃にて２週間培養し、培養物を得た。固体培地は、ビタミン類が無添加の押麦２０ｇを１２１℃で２０分滅菌した後、別途同条件で滅菌したＹＴＰ液２０ｍＬを加えて、よく混合して調製した。なお、ＹＴＰ液は、酵母エキス（Difco社製）９ｇと酒石酸ナトリウム（ワコーケミカル社製）４．５ｇとリン酸一カリウム（ワコーケミカル社製）４．５ｇとを水１Ｌに溶解して調製した。 Approximately 800 types of molds separated from the soil were cultured at 28 ° C. for 2 weeks using a solid medium mainly composed of oats to obtain a culture. The solid medium was prepared by sterilizing 20 g of oats to which no vitamins were added at 121 ° C. for 20 minutes, and separately adding 20 mL of YTP solution sterilized under the same conditions and mixing well. The YTP solution was prepared by dissolving 9 g of yeast extract (Difco), 4.5 g of sodium tartrate (Wako Chemical) and 4.5 g of monopotassium phosphate (Wako Chemical) in 1 L of water. .

培養後に上記培養物２０ｇに対して、１−ブタノールを５０ｍＬ加え、１−ブタノール層を回収し、エヴァポレーター（EYELA社製）で１−ブタノールを蒸発させて１−ブタノール抽出物を得た。１−ブタノール抽出物をメタノールに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ(製品名：シリカゲル60、関東化学株式会社製）にかけて、エチルアセテートで溶出、分画し、８００個の試料を得た。 After culture, 50 mL of 1-butanol was added to 20 g of the above culture, the 1-butanol layer was recovered, and 1-butanol was evaporated by an evaporator (manufactured by EYELA) to obtain a 1-butanol extract. The 1-butanol extract was dissolved in methanol, subjected to silica gel column chromatography (product name: silica gel 60, manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.), eluted and fractionated with ethyl acetate, and 800 samples were obtained.

（大腸菌塗布寒天培地の調製方法）
細菌検査用寒天(Difco社製）を濃度が１．５％(ｗ／ｖ)となるように滅菌イオン交換水に溶かし、１２１℃、１５分間の滅菌後、滅菌シャーレ（直径９ｃｍ）に１５〜２０ｍＬ分注して寒天平板を作製した。次いで、別途、標準寒天平板培地(Nutrient agar、Difco社製）で培養した大腸菌（K12DH1）を適当な量採取し、滅菌イオン交換水に懸濁して濃厚な大腸菌懸濁液を作製し、これを６０℃にて、１時間加熱処理した後、滅菌イオン交換水で６６０ｎｍの吸光度が０．５となるよう希釈した。かかる希釈液０．３ｍＬを上記寒天平板の全面に塗布して、大腸菌が寒天の表面に固定される程度に乾燥させ、大腸菌塗布寒天培地を調製した。 (Preparation method of E. coli coated agar medium)
Agar for bacterial examination (Difco) was dissolved in sterile ion-exchanged water so that the concentration was 1.5% (w / v), sterilized at 121 ° C. for 15 minutes, and then placed in a sterile petri dish (diameter 9 cm) with 15 to 15 An agar plate was prepared by dispensing 20 mL. Separately, an appropriate amount of E. coli (K12DH1) cultured on a standard agar plate medium (Nutrient agar, manufactured by Difco) is collected and suspended in sterilized ion-exchanged water to prepare a concentrated E. coli suspension. After heat treatment at 60 ° C. for 1 hour, it was diluted with sterilized ion-exchanged water so that the absorbance at 660 nm was 0.5. The diluted solution (0.3 mL) was applied to the entire surface of the agar plate and dried to such an extent that Escherichia coli was fixed on the surface of the agar to prepare an Escherichia coli-coated agar medium.

（ペーパーディスク法による検定）
供試アメーバとしてネグレリア・ロバニエンシス（非病原性）を用いた。ネグレリア・ロバニエンシスの栄養体(濃度：２×１０^８個／ｍＬ)０．５ｍＬを大腸菌塗布寒天培地上に塗布した。上記８００個の試料のそれぞれについて、（１）希釈なし、（２）１／１０の濃度にメタノールで希釈、（３）１／５０の濃度にメタノールで希釈、の３種類の濃度で、ペーパーディスクに含浸させ、該３種類のペーパーディスクをネグレリア・ロバニエンシスを撒いた大腸菌塗布寒天培地に載置した後、３７℃にて２４時間培養した。本実験で用いたネグレリア・ロバニエンシスは、Ａｑ／９／１／４５Ｄという分離株で、国立感染症研究所寄生動物部より分与されたものである。 (Examination by paper disk method)
Negrelia rovaniensis (non-pathogenic) was used as a test amoeba. 0.5 mL of Negrelia rovaniensis nutrients (concentration: 2 × 10 ⁸ cells / mL) was applied on an agar medium coated with E. coli. For each of the above 800 samples, a paper disc was used in three different concentrations: (1) undiluted, (2) diluted to 1/10 concentration with methanol, and (3) diluted to 1/50 concentration with methanol. The three kinds of paper discs were placed on an agar medium coated with Escherichia coli coated with Negrelia rovaniensis and cultured at 37 ° C. for 24 hours. Negrelia rovaniensis used in this experiment is an Aq / 9/1 / 45D isolate, which was distributed from the Parasite Department of the National Institute of Infectious Diseases.

８００個の試料のうち、７９９個の試料においては、培養後、ネグレリア・ロバニエンシスが大腸菌をえさに増殖して白濁していたが、１個の試料においては、ペーパーディスクの周囲に、図１のような阻止円が出現し、抗アメーバ活性が認められた。抗アメーバ活性を認めた試料は、カビＦ１５５７株（未同定）の培養抽出物由来のものであった。図１における（１）〜（３）は、（１）希釈なし、（２）１／１０の濃度に希釈、（３）１／５０の濃度に希釈した場合における阻止円の程度を示したものである。 Among the 800 samples, in 799 samples, Negrelia rovaniensis grew after E. coli and became cloudy after culturing, but in one sample, around the paper disk, FIG. An inhibition circle like this appeared and anti-amoeba activity was observed. The sample in which the anti-amoeba activity was observed was derived from a culture extract of mold F1557 strain (unidentified). (1) to (3) in FIG. 1 show the extent of the inhibition circle when (1) no dilution, (2) diluted to 1/10 concentration, and (3) diluted to 1/50 concentration. It is.

（活性物質の単離精製）
抗アメーバ活性を認めたＦ１５５７株由来の試料を、薄層クロマトグラフ用シリカゲルを用いて調整した薄層板にスポットし、エチルアセテート：クロロホルム混合液（３：１）を展開溶媒として展開した。Ｒｆ値０．２５、０．５７、０．７７〜０．８７付近にスポットを認めた（図３（１）参照）。 (Isolation and purification of active substances)
A sample derived from the F1557 strain that showed anti-amoeba activity was spotted on a thin layer plate prepared using silica gel for thin layer chromatography, and developed using an ethyl acetate: chloroform mixture (3: 1) as a developing solvent. Spots were observed in the vicinity of Rf values of 0.25, 0.57, and 0.77 to 0.87 (see FIG. 3 (1)).

抗アメーバ活性を認めた上記試料について、別途シリカゲルカラムにかけて、エチルアセテート：クロロホルム（３：２）で分画、溶出した。各画分につき、上記と同様のペーパーディスク法を行い、抗アメーバ活性を有することを確認した画分を、薄層クロマトグラフ用シリカゲルを用いて調整した薄層板にスポットし、ジクロロメタン：メタノール混合液（９：１）を展開溶媒として展開した。Ｒｆ値０．５付近に幅広いスポットを認めた（図３（２）参照）。 About the said sample which recognized anti-amoeba activity, it applied to the silica gel column separately, and fractionated and eluted with ethyl acetate: chloroform (3: 2). For each fraction, the same paper disc method as described above was performed, and the fraction confirmed to have anti-amoeba activity was spotted on a thin layer plate prepared using silica gel for thin layer chromatography, and dichloromethane: methanol mixed. The liquid (9: 1) was developed as a developing solvent. A wide spot was observed around an Rf value of 0.5 (see FIG. 3 (2)).

抗アメーバ活性を認めた上記試料について、さらにＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０（Amercham、Biosciences社製）を充填したカラムに添加され、メタノール：クロロホルム（９：１）溶液で溶出し、各画分につき、ペーパーディスク法を行い、抗アメーバ活性を有することを確認した画分を、薄層クロマトグラフ用シリカゲルを用いて調整した薄層板にスポットし、エチルアセテート：クロロホルム混合液（３：１）を展開溶媒として展開した。Ｒｆ値０．２５付近にスポットを認めた（図３（３）参照）が、これは（図３（１））のＲｆ値０．２５におけるスポットとＲｆ値が一致するものであった。（図３（１））で、抗アメーバ活性を認めた試料は、Ｆ１５５７株（未同定）由来であった。 The above-mentioned sample showing anti-amoeba activity was added to a column packed with Sephadex LH20 (Amercham, manufactured by Biosciences) and eluted with a methanol: chloroform (9: 1) solution, and a paper disk method was performed for each fraction. The fractions confirmed to have anti-amoeba activity were spotted on a thin layer plate prepared using silica gel for thin layer chromatography, and developed using an ethyl acetate: chloroform mixture (3: 1) as a developing solvent. Spots were observed near the Rf value of 0.25 (see FIG. 3 (3)), which was the same as the spot at the Rf value of 0.25 in (FIG. 3 (1)). In FIG. 3 (1), the sample that showed anti-amoeba activity was derived from the F1557 strain (unidentified).

（活性物質の構造解析）
Ｆ１５５７株由来の抗アメーバ活性物質（図３（３）参照）の構造解析は、ＮＭＲスペクトル（製品名：ＧＸ−２７０及びＬＡ４００Ｔ、日本電子株式会社製）により行った。抗アメーバ活性化合物の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルと¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルとを図４に示す。ＮＭＲスペクトル構造解析により抗アメーバ活性物質は、１−リノール酸グリセリド（図５参照）であることを同定した。 (Structural analysis of active substances)
The structural analysis of the anti-amoeba active substance derived from the F1557 strain (see FIG. 3 (3)) was performed by NMR spectrum (product names: GX-270 and LA400T, manufactured by JEOL Ltd.). FIG. 4 shows the ¹ H-NMR spectrum and ¹³ C-NMR spectrum of the anti-amoeba active compound. NMR spectral structure analysis identified the anti-amoeba active substance as 1-linoleic acid glyceride (see FIG. 5).

（抗アメーバ活性化合物の市販標準品との比較）
単離精製した抗アメーバ活性化合物と、構造解析に基づいて同定した物質の市販標品（１−リノール酸グリセリド、Sigma社製）とのアメーバ活性を、ペーパーディスク法で比較した。図６の結果からわかるように、単離精製した活性物質と、構造解析に基づいて同定した物質の市販標品との間に有意な差はなかった。したがって、以後の実験を、市販標品を用いて行うこととした。 (Comparison with commercial standard of anti-amoeba active compound)
The amoeba activity between the isolated and purified anti-amoeba active compound and the commercially available standard substance (1-linoleic acid glyceride, manufactured by Sigma) identified based on the structural analysis was compared by the paper disk method. As can be seen from the results in FIG. 6, there was no significant difference between the isolated and purified active substance and the commercial preparation of the substance identified based on the structural analysis. Therefore, it was decided to carry out the subsequent experiments using commercially available samples.

（１−リノール酸グリセリドのネグレリア・ロバニエンシスに対する作用の確認）
１−リノール酸グリセリドは、ペーパーディスク法によりネグレリア・ロバニエンシスに対して、抗アメーバ活性を示すことが判明したが、かかる抗アメーバ活性が、（１）殺アメーバ活性、（２）忌避活性のいずれかであるかを確認するため、１−リノール酸グリセリドをスライドガラス上でネグレリア・ロバニエンシスに作用させた。ネグレリア・ロバニエンシスの栄養体（生細胞）は、１−リノール酸グリセリドの添加により、細胞が球形に変形した変形栄養体（生細胞）や、中身の粒子が流出して、小顆粒の集合体に変化した破壊栄養体（死細胞）が観察された（図７参照）。また、図８に示すように顕微鏡観察を行い、アメーバの細胞膜が破壊されている様子を観察した。１−リノール酸グリセリドの添加により、図８−（Ａ）に示す球形に変形した栄養体（生細胞）は、図８−（Ｂ）に示す矢印の部分で細胞膜の破壊がはじまり、図８−（Ｃ）に示す矢印の部分から内容物が漏出し、図８−（Ｄ）では漏出した内容物が拡がっている。以上のことから、１−リノール酸グリセリドがネグレリア・ロバニエンシスに対して、細胞膜破壊作用を有するものと結論した。 (Confirmation of the action of 1-linoleic acid glyceride on Negrelia rovaniensis)
1-linoleic acid glyceride was found to exhibit anti-amoeba activity against Negrelia rovaniensis by the paper disk method, and this anti-amoeba activity is either (1) amoeba activity or (2) repellent activity. 1-linoleic acid glyceride was allowed to act on Negrelia rovaniensis on a glass slide. Negrelia Rovaniensis nutrients (live cells) are transformed into spherical deformed nutrients (live cells) by adding 1-linoleic acid glyceride, and the contents of the particles flow out into aggregates of small granules. Changed destructive nutrients (dead cells) were observed (see FIG. 7). In addition, as shown in FIG. 8, a microscopic observation was performed to observe how the amoeba cell membrane was broken. Due to the addition of 1-linoleic acid glyceride, the trophic body (live cells) deformed into a spherical shape shown in FIG. 8- (A) begins to break down the cell membrane at the portion indicated by the arrow shown in FIG. 8- (B). The content leaks from the arrow part shown to (C), and the leaked content has expanded in FIG. 8- (D). From the above, it was concluded that 1-linoleic acid glyceride has a cell membrane disrupting action against Negrelia robaniensis.

さらに、１-リノール酸グリセリドのネグレリア・ロバニエンシスに対する作用を、一般に生死細胞を判定に用いることができる非殺菌的色素トリパンブルーと組み合わせて、細胞の生死と形態の変化を同時に観察した。１−リノール酸グリセリドの終濃度を１００μｇ／ｍＬとした。１−リノール酸グリセリドの添加により変化した各細胞の形態を図９に示す。また、各細胞の形態につき、経時的に示したグラフを図１０に示す。栄養体（生細胞）（trophozoites(alive)）と変形栄養体（生細胞）（spherically changed cells(alive)）が経時的に減少し、破壊された細胞の割合が増加した。破壊栄養体（死細胞）（destructed cells(burst marks)と、栄養体（死細胞）(trophozoites(dead))と、変形栄養体（死細胞）（spherically changed cells(dead)）との合計は、２時間後に約９０％に達した。以上の試験結果により、１−リノール酸グリセリドが、抗アメーバ活性として、殺アメーバ活性を有するものと結論した。 In addition, the effect of 1-linoleic acid glyceride on Negrelia rovaniensis was combined with the non-bactericidal dye trypan blue, which can generally be used for determination of viable cells, and cell viability and morphological changes were observed simultaneously. The final concentration of 1-linoleic glyceride was 100 μg / mL. The morphology of each cell changed by the addition of 1-linoleic acid glyceride is shown in FIG. In addition, FIG. 10 shows a graph showing the shape of each cell over time. Nutrients (viable cells) (trophozoites (alive)) and deformed nutrients (live cells) (spherically changed cells (alive)) decreased over time, and the proportion of destroyed cells increased. The sum of destructed cells (burst marks), nutrients (dead cells) (trophozoites (dead)), and deformed nutrients (dead cells) (spherically changed cells (dead)) About 90% was reached after 2 hours Based on the above test results, it was concluded that 1-linoleic acid glyceride has an amoeba activity as an anti-amoeba activity.

［１−リノール酸グリセリドの他のアメーバに対する作用の確認］
１−リノール酸グリセリド（１００μｇ／ｍＬ）の作用をネグレリア・ロバニエンシス（図１１（ａ）参照）とハルトマンネラ属ＨＴ−１（図１１（ｂ）参照）の間で比較した。ネグレリア・ロバニエンシスでの細胞破壊作用よりも弱いながらも、１−リノール酸グリセリドのハルトマンネラ属ＨＴ−１に対する、殺アメーバ活性が認められた。 [Confirmation of action of 1-linoleic acid glyceride on other amoeba]
The effect of 1-linoleic acid glyceride (100 μg / mL) was compared between Negrelia rovaniensis (see FIG. 11 (a)) and Hartmannella HT-1 (see FIG. 11 (b)). Although it was weaker than the cell destruction action in Negrelia rovaniensis, the amoeba activity of 1-linoleic acid glyceride against Hartmannella HT-1 was observed.

［１−オレイン酸グリセリドの作用の確認］
不飽和脂肪酸エステルである１−オレイン酸グリセリド（図１２（ａ）参照）についても、ネグレリア・ロバニエンシスに対する作用の確認を行った。結果を図１３に示す。ネグレリア・ロバニエンシスに対するアメーバ細胞破壊作用及び殺アメーバ活性は、１−リノール酸グリセリドとほぼ同程度の結果だった。 [Confirmation of action of 1-oleic acid glyceride]
The action on 1-oleic acid glyceride (see FIG. 12 (a)), which is an unsaturated fatty acid ester, was also confirmed for Negrelia and rovaniensis. The results are shown in FIG. The effects of amoeba cell destruction and amebicidal activity on Negrelia rovaniensis were almost the same as those of 1-linoleic acid glyceride.

［１−オレイン酸グリセリドの他のアメーバに対する作用の確認］
１−オレイン酸グリセリド（１００μｇ／ｍＬ）の作用をネグレリア・ロバニエンシス（図１４（ａ）参照）とハルトマンネラ属ＨＴ−１（図１４（ｂ）参照）の間で比較した。１−オレイン酸グリセリドによるネグレリア・ロバニエンシスの細胞破壊作用よりも弱いながらも、ハルトマンネラ属ＨＴ−１では１１０分経過するまでに約４０％の細胞が破壊され、殺アメーバ活性が認められた。 [Confirmation of action of 1-oleic acid glyceride on other amoeba]
The effect of 1-oleic glyceride (100 μg / mL) was compared between Negrelia rovaniensis (see FIG. 14 (a)) and Hartmannella HT-1 (see FIG. 14 (b)). Although it was weaker than the cell-destructing action of Negrelia rovaniensis by 1-oleic acid glyceride, about 40% of cells were destroyed by 110 minutes by Hartmannella HT-1, and amebicidal activity was observed.

［比較例１］
比較例として、飽和脂肪酸エステルである、１−ステアリン酸グリセリド（図１２（ｂ）参照）を用いてネグレリア・ロバニエンシスに対する作用の確認を行ったが、細胞破壊作用は全く認められなかった。 [Comparative Example 1]
As a comparative example, 1-stearic acid glyceride (see FIG. 12 (b)), which is a saturated fatty acid ester, was used to confirm the action against Negrelia rovaniensis, but no cell destruction action was observed.

［比較例２］
比較例として、遊離脂肪酸であって、シス型二重結合を２つ有するリノール酸（図１５（ａ）参照）、シス型二重結合を１つ有するオレイン酸（図１５（ｂ）参照）、及び飽和脂肪酸であるステアリン酸（図１５（ｃ）参照）を用いてネグレリア・ロバニエンシスに対する作用の確認を行ったが、いずれもほとんど細胞破壊作用は認められなかった。図１６は、ネグレリア・ロバニエンシスに対するリノール酸の抗アメーバ活性を示すグラフである。オレイン酸及びステアリン酸についても同様にほとんど細胞破壊作用は認められなかった。 [Comparative Example 2]
As a comparative example, a free fatty acid, linoleic acid having two cis-type double bonds (see FIG. 15 (a)), oleic acid having one cis-type double bond (see FIG. 15 (b)), In addition, the action on Negrelia and rovaniensis was confirmed using stearic acid (see FIG. 15 (c)), which is a saturated fatty acid, but almost no cell destructive action was observed. FIG. 16 is a graph showing the anti-amoeba activity of linoleic acid against Negrelia rovaniensis. Similarly, oleic acid and stearic acid showed almost no cell destruction action.

［比較例３］
比較例として、高級アルコールである、リノレイルアルコール（図１７（ａ）参照）、オレイルアルコール（図１７（ｂ）参照）、オクタデカノール（図１７（ｃ）参照）を用いてネグレリア・ロバニエンシスに対する作用の確認を行ったが、いずれもほとんど活性を示さなかった。図１８は、ネグレリア・ロバニエンシスに対するリノレイルアルコールの抗アメーバ活性を示すグラフである。オレイルアルコール及びオクタデカノールについても、同様にほとんど活性を示さなかった。 [Comparative Example 3]
As a comparative example, linoleyl alcohol (see FIG. 17 (a)), oleyl alcohol (see FIG. 17 (b)), and octadecanol (see FIG. 17 (c)), which are higher alcohols, were used for Negrelia and Rovaniensis. Although the action was confirmed, none showed any activity. FIG. 18 is a graph showing the anti-amoeba activity of linoleyl alcohol against Negrelia rovaniensis. Similarly, oleyl alcohol and octadecanol showed almost no activity.

不飽和脂肪酸アミドである、Ｎ−オレオイルグリシン（図１９参照）では、破壊作用はあまり強くはないが、変形球形死細胞の割合が高く、死滅作用が１−リノール酸グリセリドより早い時間で現れた（図２０参照）。 N-oleoylglycine, which is an unsaturated fatty acid amide (see FIG. 19), is not so strong in destruction, but has a high proportion of deformed spherical dead cells, and the killing action appears earlier than 1-linoleic acid glyceride. (See FIG. 20).

（結論）
脂肪酸エステル及び脂肪酸アミドにおいて、抗アメーバ作用を呈する場合があるが、この場合、脂肪酸エステル及び脂肪酸アミドの脂肪酸は不飽和脂肪酸である必要がある。顕微鏡観察の結果より、細胞膜を破壊していることは明らかであるが、より以上の詳細は不明である。 (Conclusion)
Fatty acid esters and fatty acid amides may exhibit an anti-amoebic action. In this case, the fatty acids of the fatty acid esters and fatty acid amides need to be unsaturated fatty acids. From the result of microscopic observation, it is clear that the cell membrane is destroyed, but more details are unknown.

抗アメーバ活性を検出した試料におけるペーパーディスクの阻止円の様子を示す図である。希釈なし（１）、１／１０の濃度に希釈（２）、１／５０の濃度に希釈（３）、した場合の阻止円である。It is a figure which shows the mode of the inhibition circle | round | yen of the paper disc in the sample which detected anti-amoeba activity. This is a blocking circle in the case of no dilution (1), dilution to 1/10 concentration (2), and dilution to 1/50 concentration (3). 抗アメーバ活性を有する物質の単離精製のフローチャートを示した図である。It is the figure which showed the flowchart of isolation and purification of the substance which has antiamoeba activity. 抗アメーバ活性を有する物質の単離精製過程における薄層クロマトグラフィーの図である。抗アメーバ活性を認めたＦ１５５７株由来の試料を、展開した図（１）、２回目の展開図（２）、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ２０カラムにより分画した試料の展開図（３）である。It is a figure of the thin layer chromatography in the isolation and purification process of the substance which has anti-amoeba activity. FIG. 4 is a developed view (1), a second developed view (2), and a developed view (3) of a sample fractionated with a Sephadex LH20 column, from a sample derived from the F1557 strain that has recognized anti-amoeba activity. Ｆ１５５７株由来の抗アメーバ活性物質の、¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルと¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。It is a figure which shows the < ¹ > H-NMR spectrum and < ¹³ > C-NMR spectrum of the anti-amoeba active substance derived from F1557 strain. １−リノール酸グリセリドの化学構造を示す図である。It is a figure which shows the chemical structure of 1-linoleic acid glyceride. Ｆ１５５７株の培養抽出物から単離精製した１−リノール酸グリセリドと、１−リノール酸グリセリドの市販標品の抗アメーバ活性を、ペーパーディスク法で比較した結果を示す図である。It is a figure which shows the result of having compared the anti-amoeba activity of 1-linoleic acid glyceride isolated and purified from the culture extract of F1557 strain | stump | stock, and the commercial sample of 1-linoleic acid glyceride by the paper disc method. １−リノール酸グリセリドをネグレリア・ロバニエンシスに、スライドガラス上で作用させた様子を示す図である。It is a figure which shows a mode that 1-linoleic acid glyceride was made to act on a glass slide to Negrelia robaniensis. 顕微鏡観察により、アメーバの細胞膜が破壊されていく様子を示す図である。It is a figure which shows a mode that the cell membrane of an amoeba is destroyed by microscopic observation. トリパンブルーを用いた、１−リノール酸グリセリドのネグレリア・ロバニエンシスに対する作用を示す図である。栄養体（生細胞）（Ａ）、変形栄養体（生細胞）（Ｂ）、栄養体（死細胞）（Ｃ）、変形栄養体（死細胞）（Ｄ）、破壊栄養体（死細胞）（Ｅ）を示す。It is a figure which shows the effect | action with respect to Negrelia lovaniensis of 1-linoleic acid glyceride using trypan blue. Nutrient (live cell) (A), deformed nutrient (live cell) (B), nutrient (dead cell) (C), deformed nutrient (dead cell) (D), destructive nutrient (dead cell) ( E). １−リノール酸グリセリドのネグレリア・ロバニエンシスに対する作用を各細胞の形態として、経時的に示したグラフを示す。The graph which showed the effect | action with respect to Negrelia lovaniensis of 1-linoleic acid glyceride as a form of each cell with time is shown. ネグレリア・ロバニエンシス（ａ）とハルトマンネラ属ＨＴ−１（ｂ）に対する１−リノール酸グリセリドの作用を示す図である。It is a figure which shows the effect | action of 1-linoleic acid glyceride with respect to Negrelia robaniensis (a) and Hartmannella genus HT-1 (b). １−オレイン酸グリセリド（ａ）、１−ステアリン酸グリセリド（ｂ）の構造式を示す図である。It is a figure which shows structural formula of 1-oleic acid glyceride (a) and 1-stearic acid glyceride (b). １−オレイン酸グリセリドのネグレリア・ロバニエンシスに対する作用を示す図である。It is a figure which shows the effect | action with respect to Negrelia lovaniensis of 1-oleic acid glyceride. ネグレリア・ロバニエンシス（ａ）とハルトマンネラ属ＨＴ−１（ｂ）に対する１−オレイン酸グリセリド作用を示す図である。It is a figure which shows the 1-oleic-acid glyceride effect | action with Negrelia rovaniensis (a) and Hartmannella genus HT-1 (b). リノール酸（ａ）、オレイン酸（ｂ）、ステアリン酸（ｃ）の構造式を示す図である。It is a figure which shows structural formula of a linoleic acid (a), an oleic acid (b), and a stearic acid (c). リノール酸のネグレリア・ロバニエンシスに対する作用を示す図である。It is a figure which shows the effect | action with respect to Negrelia rovaniensis of linoleic acid. リノレイルアルコール（ａ）、オレイルアルコール（ｂ）、オクタデカノール（ｃ）の構造式を示す図である。It is a figure which shows structural formula of linoleyl alcohol (a), oleyl alcohol (b), and octadecanol (c). リノレイルアルコールのネグレリア・ロバニエンシスに対する作用を示す図である。It is a figure which shows the effect | action with respect to Negrelia rovaniensis of linoleyl alcohol. Ｎ−オレオイルグリシンの構造式を示す図である。It is a figure which shows the structural formula of N-oleoylglycine. Ｎ−オレオイルグリシンのネグレリア・ロバニエンシスに対する作用を示す図である。It is a figure which shows the effect | action with respect to Negrelia lovaniensis of N-oleoylglycine.

Claims

1 - oleic acid glyceride, 1-linoleic glyceride and N- oleoyl glycinate down or we freely living amoebae control agent that is selected.

Free-living amoeba, Naegleria spp., Acanthamoeba spp., And free-living amoebae control agent of claim 1 Symbol mounting, characterized in that one or more of amoebic selected from the group belonging to Hartmann Nera genus.

Claim 1 or free-living amoebae control composition, characterized by containing as an active ingredient the free-living amoebae control agent according to any one of 2.