JP5116150B2 - Hla結合性ペプチド、それをコードするdna断片および組み換えベクター - Google Patents
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Description
本実施形態では、能動学習実験法(特開平11−316754号公報)を用いて得られる仮説により予測された、HLA分子との結合性が、−logKd値に換算して3以上であるアミノ酸配列を含み、8以上11以下のアミノ酸残基からなるペプチドを、HLA結合性ペプチド候補とした。そして結合実験を行った結果、実際にこれらのペプチドがHLA結合性ペプチドであることを確認した。
配列番号1から30の9アミノ酸ペプチド配列を、下記の表1〜3に示す。
また、配列番号1から12の配列は、上述の方法により予測された、HLA−A*2402遺伝子の産物であるHLA−A2402分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号1から12まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号1が、最も結合性が優れると予測される配列である。なお、各配列のHLA−A2402分子との結合性の予測スコアおよび結合実験データの項目の単位は、いずれも−logKd値にて示されている。
また、配列番号13から18の配列は、上述の方法により予測された、HLA−A*0201遺伝子の産物であるHLA−A0201分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号13から18まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号13が、最も結合性が優れると予測される配列である。なお、各配列のHLA−A0201分子との結合性の予測スコアおよび結合実験データの項目の単位は、いずれも−logKd値にて示されている。
また、配列番号19から30の配列は、上述の方法により予測された、HLA−A*0206遺伝子の産物であるHLA−A0206分子との結合性が上位の配列である。なお、配列番号19から30まで結合性の優れる順に並んでいる。すなわち、配列番号19が、最も結合性が優れると予測される配列である。なお、各配列のHLA−A0206分子との結合性の予測スコアおよび結合実験データの項目の単位は、いずれも−logKd値にて示されている。
あるいは、上記のHLA結合性ペプチドは、ヒトHLA−A202分子あるいはヒトHLA−A0206分子に結合するペプチドであってもよい。
あるいは、この構成によれば、日本人種に加えて欧米人種に多いHLA−A2分子に対して結合するペプチドが得られるため、日本人種に加えて欧米人種に特に効果的な治療薬、予防薬などの開発に利用できる。
本実施形態によれば、HLA−A型分子に結合するHLA結合性ペプチドであって、上記のHLA結合性ペプチドに含まれるアミノ酸配列のうち1若しくは2個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されてなるアミノ酸配列を含み、8以上11以下のアミノ酸残基からなるHLA結合性ペプチドが提供される。
本実施形態によれば、上記のHLA結合性ペプチドをコードするDNA配列を含むDNA断片が提供される。本実施形態に係るDNA断片は、特定のDNA配列を含むため、上記のHLA結合性ペプチドを発現可能である。
本実施形態によれば、上記のHLA結合性ペプチドをコードするDNA配列を含む組み換えベクターが得られる。本実施形態に係る組み換えベクターは、特定のDNA配列を含むため、上記のHLA結合性ペプチドを発現可能である。
(実施例)
より具体的には、本実施例の能動学習法では、20種類あるアミノ酸を9個ならべたアミノ酸配列からなるペプチドの設計・合成を、1回の実験あたり20〜30種類分行った。そして、それらのHLA分子との結合の強さ(結合能)の計測を行った。そして、実験結果として、結合能(Kd値)を得た。結合能が高ければ、ワクチンの材料として利用可能なHLA結合性ペプチドの候補とした。
ペプチドは、Fmocアミノ酸を用い、Merrifieldの固相法にて、マニュアル合成をした。脱保護の後、C18カラムを用いて逆相HPLC精製をし、95%以上の純度にした。ペプチドの同定と純度の確認は、MALDI−TOF質量分析にて行った(Voyager DE RP、PerSeptive)。ペプチドの定量は、BSAを標準蛋白質としてMicro BCAアッセイ(Pierce社)にて行った。
HLA−A*2402遺伝子の産物であるHLA−A2402分子へのペプチドの結合能の測定は、HLA−A*2402遺伝子を発現するC1R−A24細胞(熊本大学、滝口雅文教授作製のものを、許可を得て愛媛大学、安川正貴助教授から供与いただいた。)を用いて行った。
HLA−A*0201遺伝子の産物であるHLA−A201分子へのペプチドの結合能の測定は、HLA−A*0201遺伝子を発現する細胞株JY(ATCC(American Type Culture Collection)より入手)を用いて行った。
結合能を測定したいペプチドの段階希釈列に上記JY細胞と精製β2mを加えたのち、氷上で4時間インキュベートした。この時点までに再会合したHLA−A0201分子を、会合型特異的な蛍光標識モノクローナル抗体BB7.2を用いて染色した。
(Udaka et al.,Immunogenetics, 51、 816−828、 2000)に発表した方法にて、解離定数Kd値を算出した。
HLA−A*0206遺伝子の産物であるHLA−A206分子へのペプチドの結合能の測定は、HLA−A*0206遺伝子を発現する、マウスのTAPペプチドトランスポーター欠損細胞であるRAMS細胞に、HLA−A*0206遺伝子のcDNAを発現させた、RA2.6細胞(高知大学にて新たに作成した細胞株)を用いて行った。
その後37℃で3.5時間培養することにより、ペプチドを結合していない空のHLA−A0206分子が変性し、立体構造が失われる。
そこへ、ペプチド結合型HLA−A0206分子を特異的に認識する蛍光標識モノクローナル抗体17A10もしくは17A12を加え、氷上で20分インキュベートし、細胞を染色した。
(Udaka et al.,Immunogenetics, 51、 816−828、 2000)に発表した方法にて、解離定数Kd値を算出した。
その結果、上記表1〜3に示した予測結果および実験結果が得られた。
また、配列番号1から30の配列は、実施形態1で説明した実験計画法により得られる仮説により予測された、HLA−A24分子およびHLA−A2分子との結合性が上位の配列である。
なお、PSAの所定のタンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号31(MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP)に示す。
1. "Decrypting the structure of MHC−I restricted CTL epitopes with complex peptide libraries." Keiko Udaka, Karl−Heinz Wiesmuller, Stefan Kienle, Gunter Jung and Peter Walden. J.Exp.Med. 181, 2097−2108. (1995)
2. "Tolerance to amino acid varidations in peptides binding to the MHC class I protein H−2Kb." Keiko Udaka, Karl−Heinz Wiesmuller, Stefan Kienle, Gunter Jung and Peter Walden. J.Biol.Chem. 270, 24130−24134. (1995)
3. "Self MHC−restricted peptides recognized by all alloreactive T lymphocyte clone." Keiko Udaka, Karl−Heinz Wiesmuller, Stefan Kienle, Gunter Jung and Peter Walden. J.Immunol. 157, 670−678. (1996)
Claims (4)
- HLA−A型分子に結合するHLA結合性ペプチドであって、
配列番号3のアミノ酸配列からなり、ヒトHLA−A2402分子に結合することを特徴とするHLA結合性ペプチド。 - 請求項1に記載のHLA結合性ペプチドをコードするDNA配列を含むことを特徴とするDNA断片。
- 請求項1に記載のHLA結合性ペプチドをコードするDNA配列を含むことを特徴とする組み換えベクター。
- ほ乳類の生体内において、請求項1に記載のHLA結合性ペプチドに変化することを特徴とするHLA結合性ペプチド前駆体。
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