JP5108530B2 - ＡＲＩＤ３ｂを標的とした神経芽腫の治療剤 - Google Patents

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Description

本発明は、ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質を含有する神経芽腫の治療剤に関する。
神経芽腫は主に５歳以下の小児において多発し、乳幼児の固形腫瘍の中では最も頻度が高い疾患である。神経芽腫に関連した遺伝子の特徴としてはＭＹＣＮオンコジーンの増幅、染色体１ｐの欠失などが知られている。特に、１歳以上の患者で、腫瘍の進行度が高い症例や上記ＭＹＣＮオンコジーンの増幅、染色体１ｐの欠失を有する症例の多くでは、現在の治療法が有効ではない。１９８０年代半ばに、ＭＹＣＮオンコジーンの増幅（約２０％の症例において見られる）と神経芽腫との関係が示唆されたが、それ以来、神経芽腫に特異的かつ確実に重要な機能を担っている分子に関する報告はなく、腫瘍の分子メカニズムについてはほとんど解明されていない。神経芽腫の治療方法の確立は急務であるが、このことが新たな治療法の開発を妨げる主な原因となっていた（非特許文献１）。
本発明者らは、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞の試験管内分化システムを用いた、中胚葉系細胞、間葉系細胞の分化誘導に関する研究の過程で、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体分子と類似の発現パターンを示す機能不明分子ＡＲＩＤ３ｂのノックアウト（ＫＯ）マウスを作製した。このＫＯマウスにおいて神経堤細胞由来と考えられるＰＤＧＦＲα陽性の頭部間葉系細胞がほとんど消失していたことから、この分子が間葉系細胞の分化、増殖、維持に必須の分子であることを見出した。このＡＲＩＤ３ｂ分子はＡＴ ｒｉｃｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎというＤＮＡ結合モチーフを有する分子群に属するタンパク質をコードする遺伝子であり、ＡＲＩＤ３ａと称する別の遺伝子とともにサブ・ファミリーを形成している。ヒトＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子はクローン化されており、ＡＲＩＤ３ｂは網膜芽細胞腫遺伝子産物（Ｒｂ）に結合するタンパク質であることが示されているが（非特許文献２）、その機能は不明であった。
Brodeur, G.M. et al., Nature Reviews Cancer, 3:203-216 (2003) Numata, S. et al., Cancer Res., 59:3741-3747 (1999)
本発明の目的は、神経芽腫の治療剤を提供することにある。
本発明者らは、上記ＫＯマウスを用いた研究などにおいて、ＡＲＩＤ３ｂ分子が頭部間葉系細胞において発現しており、その生存に重要であることを見出した。さらに本発明者らは、ＡＲＩＤ３ｂ分子が神経芽腫の細胞株において高頻度で発現していること、細胞の癌化に関与していることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、
［１］ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質を含有する、神経芽腫の治療剤；
［２］ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質がＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである［１］の治療剤；
［３］ＡＲＩＤ３ｂ阻害活性を測定する工程を包含する、ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質のスクリーニング方法；
［４］ＡＲＩＤ３ｂ阻害活性が、ＡＲＩＤ３ｂの発現を阻害する活性である、［３］の方法；
［５］ＡＲＩＤ３ｂ阻害活性が、ＡＲＩＤ３ｂの作用を阻害する活性である、［３］の方法；
［６］ＡＲＩＤ３ｂを阻害する工程を包含する、神経芽腫の抑制方法；
［７］ＡＲＩＤ３ｂの阻害を、ＡＲＩＤ３ｂの発現を阻害することによって行う、［６］の方法；
［８］ＡＲＩＤ３ｂの阻害を、ＡＲＩＤ３ｂの作用を阻害することによって行う、［６］の方法；
［９］細胞におけるＡＲＩＤ３ｂの発現量を測定する工程を包含する、神経芽腫の診断方法；
［１０］細胞におけるＭＹＣＮの発現量を測定する工程をさらに含む、［９］の方法；
［１１］ＡＲＩＤ３ｂの発現を改変した細胞；
［１２］ＡＲＩＤ３ｂの発現を改変した動物；
［１３］ＡＲＩＤ３ｂに対する抗体、又はＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列にアニール可能なオリゴヌクレオチドを少なくとも含む、神経芽腫の判定用キット；
［１４］上記オリゴヌクレオチドがＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列から選択される１５〜１００ヌクレオチドの連続した配列を含む、［１３］のキット；および
［１５］さらにＭＹＣＮに対する抗体、又はＭＹＣＮをコードする遺伝子もしくはその相補配列にアニール可能なオリゴヌクレオチドを含む、［１３］のキット、
に関する
本発明により、ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質を含有する神経芽腫の治療剤が提供される。
神経芽腫細胞株におけるＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの発現を示す図である。 各種癌細胞株におけるＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの発現を示す図である。 ＡＲＩＤ３ｂの強制発現が増殖能に及ぼす影響を示す図である。 ＡＲＩＤ３ｂの強制発現がコロニー産生能に及ぼす影響を示す図である。 ＡＲＩＤ３ｂの強制発現がコロニー産生能に及ぼす影響を示す図である。 細胞移植後の免疫不全マウスの生存率を示す図である。 ＡＲＩＤ３ｂの強制発現が初代培養細胞の癌化に及ぼす影響を示す図である。 ＡＲＩＤ３ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの神経芽腫細胞株の増殖に及ぼす影響を示す図である。 ＡＲＩＤ３ｂに対するｓｉＲＮＡの神経芽腫細胞株の増殖に及ぼす影響を示す図である。 アンチセンスオリゴヌクレオチドによる増殖抑制とアポトーシスの誘導との関係を示す図である。
本明細書において神経芽腫とは、神経細胞へ分化する未分化細胞（神経芽細胞）の悪性腫瘍をいう。また、本明細書において神経芽腫細胞株とは、神経芽腫由来であって神経芽腫の特徴を示す細胞株をいう。神経芽腫細胞株の例としてはＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＴＧＷ、ＣＨＰ−１２６、ＮＢＬＳ、ＩＭＲなどが挙げられる。
ＡＲＩＤ３ｂタンパク質（ＡＲＩＤ３ｂ分子）は、ＡＴ ｒｉｃｈ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎというＤＮＡ結合モチーフを有する分子群に属し、網膜芽細胞腫遺伝子産物（Ｒｂ）に結合するタンパク質であり、ＡＲＩＤ３遺伝子は血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体分子と類似の発現パターンを示す。例えば、ヒト由来ＡＲＩＤ３ｂタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、非特許文献２に記載されており、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＮＭ＿００６４６５の下で登録されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６４６５から得られるヒトＡＲＩＤ３ｂ遺伝子のヌクレオチド配列のうちコード領域の配列を配列番号８に、それによってコードされるアミノ酸配列を配列番号９に示す。
神経芽腫細胞株においてＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの発現量が上昇していること、ＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡにアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどを作用させることによって神経芽腫細胞株の増殖が抑制され、悪性度が低下することが本発明者らによって示された。従って、少なくとも一部の神経芽腫にはＡＲＩＤ３ｂの発現が関与しており、ＡＲＩＤ３ｂを阻害することによってこのような神経芽腫を治療することができると考えられる。神経芽腫の病期は、進行の程度を表す神経芽腫国際分類（ＩＮＳＳ）によりＩ期、ＩＩａ期、ＩＩ（ＩＩｂ）期、ＩＩＩ期、ＩＶ期、ＩＶｓ期に分類されているが、ＡＲＩＤ３ｂの発現とＩＶ期との相関が見られることから、ＡＲＩＤ３ｂの阻害は特にＩＶ期の神経芽腫に有効である可能性がある。さらに、初代培養線維芽細胞においてＡＲＩＤ３ｂを強制発現させることによって正常細胞が癌化されることから、ＡＲＩＤ３ｂの阻害は神経芽腫以外の癌の治療にも有効である可能性がある。
１つの実施態様において、本発明は、ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質を含有する神経芽腫の治療剤、ＡＲＩＤ３ｂ阻害活性を測定する工程を包含するＡＲＩＤ３ｂ阻害物質のスクリーニング方法、およびＡＲＩＤ３ｂを阻害する工程を包含する神経芽腫の抑制方法を提供する。本明細書においてＡＲＩＤ３ｂ阻害物質とは、ＡＲＩＤ３ｂ阻害活性を有する物質をいう。ここで、ＡＲＩＤ３ｂ阻害活性は、ＡＲＩＤ３ｂの発現を阻害する活性、またはＡＲＩＤ３ｂの作用を阻害する活性のいずれでもよい。
本明細書において発現は、遺伝子からｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を包含し、本発明による発現の阻害は、転写レベルおよび翻訳レベルのいずれかでの発現の阻害を含む。従って、ＡＲＩＤ３ｂの発現を阻害する活性を有するＡＲＩＤ３ｂ阻害物質は、ＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの転写、ＡＲＩＤ３ｂタンパク質の翻訳の阻害をする任意の物質である。
ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質としては、ＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどが挙げられる。あるいは、ＡＲＩＤ３ｂ遺伝子の転写調節系に作用してＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの転写を阻害する物質を本発明に使用することができる。このような物質は、例えば、ＡＲＩＤ３ｂ発現細胞株を試験物質で処理し、ＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの量またはＡＲＩＤ３ｂタンパク質の量を低下させる物質、当該細胞株の増殖を抑制する物質などを選択することによって得ることができる。ＡＲＩＤ３ｂ発現細胞株としては、上記のような神経芽腫細胞株や、下記のようなＡＲＩＤ３ｂの発現を改変した細胞を使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、リボザイムの取得方法は当該分野において公知であり、当業者は例えば上記のヒトＡＲＩＤ３ｂ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいてこれらを容易に得ることができる。
ＡＲＩＤ３ｂタンパク質はＲｂに結合することが知られている。また、ＡＲＩＤ３ｂの高発現によって、神経芽腫細胞株の悪性度が増加することが、増殖能、コロニー産生能の上昇を指標として本発明者らによって示された。従って、ＡＲＩＤ３ｂの作用を阻害する活性は、ＡＲＩＤ３ｂタンパク質のＲｂへの結合能や、細胞の増殖能の抑制などによって確認することができる。例えば、ＡＲＩＤ３ｂタンパク質またはＲｂに結合してＡＲＩＤ３ｂタンパク質のＲｂへの結合を阻害する物質をＡＲＩＤ３ｂ阻害物質として使用することができる。従って、ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質として、常法によって得られたＡＲＩＤ３ｂタンパク質に対する抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメントなどを含む）を用いることができる。
本発明の神経芽腫の抑制方法は、ＡＲＩＤ３ｂを阻害する工程を包含する。この方法は、例えばＡＲＩＤ３ｂタンパク質の機能の研究、神経芽腫の発症メカニズムの解明などに有効である。ＡＲＩＤ３ｂの阻害は上記のようにＡＲＩＤ３ｂの発現または作用を阻害することによって行われ、例えばＡＲＩＤ３ｂ阻害物質のインビボまたはインビトロにおける添加または投与によって実施される。対象としては、哺乳動物（ヒトを含むまたは含まない）、哺乳動物由来の細胞が挙げられる。
別の実施態様において、本発明は、細胞におけるＡＲＩＤ３ｂの発現量を測定する工程を包含する神経芽腫の診断方法を提供する。上記のように、少なくとも一部の神経芽腫にはＡＲＩＤ３ｂの発現が関与しているので、ＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡまたはその翻訳産物（ＡＲＩＤ３ｂタンパク質）の量を測定し、正常細胞における量と比較して高いＡＲＩＤ３ｂの発現によって神経芽腫を特徴付けることができる。ＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの量の測定は、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲなど当該分野において公知の方法を用いて実施することができる。これらの方法で使用する検出用プローブ、増幅用プライマーなどは、例えば、配列番号８に示すヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。またＡＲＩＤ３ｂタンパク質の量の測定は、例えば、配列番号９に示すアミノ酸配列を有するＡＲＩＤ３ｂタンパク質またはその一部に対して常法に従って作製した抗体を使用したＥＬＩＳＡや免疫組織染色など当該分野で公知の方法を使用して実施することができる。ＡＲＩＤ３ｂおよびＭＹＣＮの各種腫瘍における発現を調べた結果、ＡＲＩＤ３ｂおよびＭＹＣＮオンコジーン両方の発現が検出される場合に神経芽腫と判定される可能性が高いことが示されている。従って、ＡＲＩＤ３ｂに加えてＭＹＣＮの発現量を測定することによって、より正確に神経芽腫を診断できる可能性がある。ＭＹＣＮの発現量は、ＭＹＣＮオンコジーンの転写産物（ＭＹＣＮ ｍＲＮＡ）または翻訳産物（ＭＹＣＮタンパク質）の量を決定することによって測定することができる。また、上記のようにＡＲＩＤ３ｂの発現とＩＶ期の神経芽腫との相関が見られることから、ＡＲＩＤ３ｂの発現量を測定することによって神経芽腫の病期を診断することができる可能性がある。
さらに別の実施態様において、本発明はＡＲＩＤ３ｂの発現を改変した細胞およびＡＲＩＤ３ｂの発現を改変した動物を提供する。神経芽腫細胞株および初代培養細胞においてＡＲＩＤ３ｂの発現を増強する（強制発現させる）ことによって細胞の悪性度が増加し、初代培養細胞が不死化することが本発明者らによって見出された。従って、細胞におけるＡＲＩＤ３ｂの発現を人為的に改変することによって細胞の悪性度を改変することができる。ここで発現の改変は、本来の発現量に比較して低下させることもしくは上昇させること、または本来とは異なる発現調節を可能にすることなどをいう。ＡＲＩＤ３ｂの発現の改変は、例えば、ＡＲＩＤ３ｂタンパク質発現用のベクターの導入、ＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡに対するアンチセンス発現用ベクターの導入、宿主細胞が有するＡＲＩＤ３ｂ遺伝子の発現調節領域の変更などによって実施することができる。発現ベクターの構築、細胞への導入などこれらの操作に使用される組換えＤＮＡ技術は当該分野において公知である。また、ＡＲＩＤ３ｂの発現を改変した生殖細胞または体細胞から常法に従ってトランスジェニック動物、クローン動物などを作製することによって、ＡＲＩＤ３ｂの発現を改変した動物を得ることができる。このような細胞、動物は、ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質のスクリーニング、ＡＲＩＤ３ｂタンパク質の機能の研究、神経芽腫の発症メカニズムの解明などに有用である。
さらなる実施態様において、本発明はＡＲＩＤ３ｂに対する抗体、又はＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列にアニール可能なオリゴヌクレオチドを少なくとも含む、神経芽腫の判定用キットを提供する。このキットは、上記神経芽腫の診断方法に使用することができる。ＡＲＩＤ３ｂに対する抗体としては上記のような抗体を用いることができる。検出または増幅の対象となるＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列の形態に限定はないが、転写レベルでの発現に基づいて神経芽腫を判定するためにはｍＲＮＡであることが好ましい。ＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列にアニール可能なオリゴヌクレオチドは、検出用プローブまたは増幅用プライマーのいずれであってもよく、またＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物（キメラオリゴヌクレオチド）であってもよい。オリゴヌクレオチドがＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列に特異的にアニール可能であれば、当該オリゴヌクレオチドの長さは限定されず、例えば、ＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列から選択される１０ヌクレオチド以上、好ましくは１５ヌクレオチド以上、より好ましくは２０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは２５ヌクレオチド以上であり、かつ５００ヌクレオチド以下、好ましくは２００ヌクレオチド以下、より好ましくは１００ヌクレオチド以下、さらに好ましくは５０ヌクレオチド以下の連続した配列を含む。例えば、ＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列から選択される１５〜１００ヌクレオチドの連続した配列を含むオリゴヌクレオチドを好適に使用することができる。オリゴヌクレオチドのＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列へのアニーリング（ハイブリダイゼーション）の条件は当該分野において公知であり、例えば、J. Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressなどに記載されている。本発明のキットはさらにＭＹＣＮに対する抗体、又はＭＹＣＮをコードする遺伝子もしくはその相補配列にアニール可能なオリゴヌクレオチドを含んでもよい。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
５つの神経芽腫細胞株についてＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの発現を調べた。神経芽腫細胞株としては、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）、ＴＧＷ（Iwasaki, I. et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 49:438-444 (2002)）、ＣＨＰ−１２６（Schlesinger, H.R. et al., Cancer Res., 36:3094-3100 (1976)）、ＮＢＬＳ、ＩＭＲ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２７）を使用した。さらにコントロールとしてＫ５６２（慢性骨髄性白血病、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）を使用した。神経芽腫細胞株の培養には４５％ダルベッコ最小必須培地（Ｄ−ＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、４５％Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＪＲＬ社）からなる培地を使用し、その他の細胞株には９０％Ｄ−ＭＥＭおよび１０％ＦＢＳからなる培地を使用した。それぞれの細胞株から常法に従ってＲＮＡを抽出し、ヒトＡＲＩＤ３ｂ ＤＮＡ（配列番号８）をプローブとしてノーザンブロットハイブリダイゼーションを実施した。同様にアクチン ｍＲＮＡの検出も実施した。結果を図１Ａに示す。図１Ａに示すように、ＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの発現レベルは細胞株により変動したが、全ての神経芽腫細胞株においてＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの発現を示す約４．２ｋｂｐのバンドが観察された。
同様に神経芽腫以外の癌細胞株についてＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの発現を調べた。細胞株としては、ＨＬ−６０（急性前骨髄球性白血病、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）、ＨｅＬａ Ｓ３（子宮頸癌、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．２）、Ｋ−５６２（慢性骨髄性白血病、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）、ＭＯＬＴ−４（急性リンパ性白血病、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８２）、Ｒａｊｉ（Ｌ３、バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８６）、ＳＷ４８０（大腸癌、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２８）、Ａ５４９（肺癌、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）およびＧ−３９１（黒色腫）を使用した。結果を図１Ｂに示す。慢性骨髄性白血病株であるＫ−５６２および大腸癌細胞株であるＳＷ４８０においてはＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの発現を示す約４．２ｋｂｐのバンドが観察されたが、他の細胞株では発現は認められず、上記の神経芽腫細胞株に比較して発現頻度は低かった。
以上の結果から、ＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの神経芽腫細胞株において有意に発現されていることが示された。
ＡＲＩＤ３ｂの強制発現が細胞のインビトロにおける悪性度に及ぼす影響を、増殖能およびコロニー産生能を指標として調べた。ヒトＡＲＩＤ３ｂ ＤＮＡ（配列番号８）を挿入したレトロウイルスを構築した。使用したレトロウイルスはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から市販されているＭＳＣＶ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６３４４０１）に含まれるレトロウイルスにおいて薬剤耐性遺伝子部分をＩＲＥＳ ＧＦＰに置換したものである。この組換えレトロウイルスを、上記実施例１においてＡＲＩＤ３ｂの発現が認められ、ＭＹＣＮオンコジーンの増幅が見られないことが知られている神経芽腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙに感染させて、ＡＲＩＤ３ｂを強制的に発現させ、細胞数を経時的に測定した。結果を図２Ａに示す。図中、◆はＡＲＩＤ３ｂ ＤＮＡを挿入したレトロウイルスを感染させた場合の結果を、■はＤＮＡを挿入していないベクターを感染させた場合の結果を示す。図２Ａに示すように、強制発現させた細胞は、強制発現をさせていない細胞に比較して高い増殖能を示した。
上記の細胞によって形成されたコロニー（直径２ｍｍより大）を計数した。結果を図２Ｂおよび図２Ｃに示す。図２Ｂおよび図２Ｃに示すように、ベクターのみの場合に比較してＡＲＩＤ３ｂを強制発現された場合に、コロニー産生能が有意に増加した。
さらに、上記の細胞をそれぞれ別々に免疫不全マウスの皮下に移植し、移植後のマウスの生存率を経時的に測定することによって、インビボにおける悪性度を調べた。結果を表すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を図３に示す。図３に示すように、ベクターのみの場合では試験期間にわたってマウスの死亡はほとんど観察されなかった。一方、ＡＲＩＤ３ｂを強制発現させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を移植した免疫不全マウスについては、短期間（約２０日）の間に死亡が確認された。
以上の結果から、ＡＲＩＤ３ｂの強制発現によって神経芽腫細胞株のインビトロおよびインビボにおける悪性度が増加することが示された。
ＡＲＩＤ３ｂの強制発現が初代培養細胞の癌化に及ぼす影響を、継代培養の際の老化・不死化を指標として調べた。実施例２で使用したヒトＡＲＩＤ３ｂ ＤＮＡを挿入したレトロウイルスを、胎仔から分離したマウス初代培養線維芽細胞に感染させた。初代培養線維芽細胞の培養には９０％Ｄ−ＭＥＭおよび１０％ＦＢＳからなる培地を使用した。２〜３日毎に、細胞をダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄後、０．０５％（ｗ／ｖ）トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてディッシュから剥離し、５倍希釈して継代した。継代時に細胞を計数した。結果を図４に示す。図中、◆はＡＲＩＤ３ｂ ＤＮＡを挿入したレトロウイルスを感染させた場合の結果を、■はＤＮＡを挿入していないベクターを感染させた場合の結果を示す。図４に示すように、ベクターのみを感染させた初代培養線維芽細胞の場合、継代回数が８回以上になると老化によると考えられる分裂の停止およびそれに伴う細胞死が見られ、さらなる継代が困難となった。一方、ＡＲＩＤ３ｂを強制発現させた初代培養線維芽細胞の場合、レトロウイルス導入当初ではベクターのみのコントロールに比較して低い増殖能が見られたが、その後増殖能が上昇し、３ヶ月以上の維持培養が可能であった。
以上の結果から、ＡＲＩＤ３ｂの強制発現によって、初代培養細胞の老化が抑制されて不死化がもたらされ、癌化が促進されることが示唆された。
神経芽腫細胞株におけるＡＲＩＤ３ｂ発現抑制の増殖に及ぼす影響を調べた。
神経芽腫細胞株として実施例１においてＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡの低い発現が確認されたＣＨＰ−１２６Ｓを使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＲＩＤ３ｂ ＡＳ１（ＡＳ１、配列番号１）、ＡＲＩＤ３ｂ ＡＳ３（ＡＳ３、配列番号２）およびＡＲＩＤ３ｂ ＡＳ５（ＡＳ５、配列番号３）を合成した。また、コントロールとしてＡＳ５のセンス配列をランダムに組み換えたオリゴヌクレオチドＡＲＩＤ３ｂ ＡＳ５ ｓｃｒａｍｂｌｅ−１（ｓｃｒａｍｂｌｅ−１、配列番号４）およびＡＲＩＤ３ｂ ＡＳ５ ｓｃｒａｍｂｌｅ−２（ｓｃｒａｍｂｌｅ−２、配列番号５）を合成した。それぞれのオリゴヌクレオチドの合成には部分的に２'−Ｏ，４'−Ｃ−メチレン架橋核酸（2'-O,4'-C-methylene bridged nucleic acid (BNA)）を使用した。また、ｓｉＲＮＡとしてＡＲＩＤ３ｂ ＲＮＡｉ（５）Ｓ（センス）（配列番号６）およびＡＲＩＤ３ｂ ＲＮＡｉ（５）Ａ（アンチセンス）（配列番号７）をそれぞれ合成した後アニーリングさせた。
１００μｌの培地中３×１０４個の細胞を９６ウェルプレートに播種した。２４時間後にいずれかのオリゴヌクレオチド０．２μｇまたはＰＢＳ（モック）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）中で製造業者の説明書に従って導入した。２４時間後に培地を通常の神経芽細胞用培地に交換し、４倍希釈して３日間培養した。３日間の培養後に培養液と等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ７５７１）を加え１０分間室温で放置後、Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｌｕｍａｔ ＬＢ ９５０７ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｎｏｌｏｇｙ）で吸光度を測定した。オリゴ導入前の細胞のＡＴＰ値と３日間培養後のＡＴＰ値との比で増殖比（ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｉｏ）を導出した。同様の増殖実験は、細胞数を顕微鏡下で計測しても行える。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた実験の結果を図５Ａに示す。図５Ａに示すように、神経芽腫細胞株ＣＨＰ−１２６にＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ５を導入した場合、モックやコントロールとしてのｓｃｒａｍｂｌｅ−１、ｓｃｒａｍｂｌｅ−２に比較して有意な増殖の抑制が観察された。特にＡＳ５はいずれの細胞株の増殖も抑制した。また、同様の実験はアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＲＩＤ３ｂ ＡＳ１（ＡＳ１、配列番号１）、ＡＲＩＤ３ｂ ＡＳ３（ＡＳ３、配列番号２）でも行える。
ｓｉＲＮＡをＣＨＰ−１２６細胞に導入した実験の結果を図５Ｂに示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合と同様に、ＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを導入した場合に有意な増殖抑制効果が観察された。
上記のアンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ５によるＣＨＰ−１２６細胞の増殖抑制効果を、細胞の増殖を示すＤＮＡ染色色素７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）およびアポトーシスを起こした細胞を示すフィコエリトリン結合アネキシン（アネキシン−ＰＥ）で細胞を染色しフローサイトメトリーによって分析することによって調べた。結果を図５Ｃに示す。図５Ｃに示すように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した細胞ではアポトーシスを起こした細胞が増加していた。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる神経芽腫細胞株における増殖抑制効果は、アポトーシスの誘導によって引き起こされており、ＡＲＩＤ３ｂが神経芽腫細胞の増殖に重要な役割を果たしていることが示唆された。
ＡＲＩＤ３ｂおよびＭＹＣＮの各種腫瘍における発現を調べた。発現データをＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress）（Parkinson, H. et al., Nucleic Acids Res., 33(Database issue):D553-555 (2005)）およびＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）（Edgar, R. et al., Nucleic Acids Res., 30:207-210 (2002)）から得た。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ検出コールを、ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｓｕｉｔｅのａｆｆｙモジュールを使用して生データから算出した（http://www.bioconductor.org/）（Gentleman, R.C. et al., Genome Biol., 5:R80 (2004)）。正常群は６０２個の試料から構成された。これらは広範な異なる組織および細胞型から得られたものであるが、本解析においては単一の群として処理した。個々の試料を腫瘍型に従って分類した。それぞれのデータ提供者から入手される情報によって、腫瘍セットの間で腫瘍分類の正確さが左右される可能性がある。「存在（present）」および「わずか（marginal）」のコールを「検出」と判定して発現試料数を計数した。各腫瘍型について計数された陽性（検出）試料数が少なくとも見出される確率を示すために、超幾何分布を使用してｐ値を算出した。ｐ値はその腫瘍型についての陽性試料の比率および試料数の両方に依存する。ｐ値は０〜１の範囲であり、１に近い値は非特異的な発現を、０に近い値は特異的な発現を表す。ｐ値が０．００１９（０．０５÷２６（腫瘍型の数））未満の場合に、有意な関係を示すとした。ＭＹＣＮおよびＡＲＩＤ３ｂの発現を、それぞれプローブセット２０９７５７＿ｓ＿ａｔおよび２１８９６４＿ａｔを使用して調べた。結果を表１に示す。
Figure 0005108530
表１において、ＡＲＩＤ３ｂおよびＭＹＣＮの両方について（表中「ARID3b-MYCN」）のｐ値が０．００１７未満であったのは神経芽腫（neuroblastoma）のみであった。この結果より、ＡＲＩＤ３ｂおよびＭＹＣＮ両方の発現を調べることによって、より正確に神経芽腫の診断ができる可能性が示唆された。
公開されているマイクロアレイデータを使用して、神経芽腫の臨床試料におけるＡＲＩＤ３ｂの発現を調べた。本発明者らはMcArdle et al.（Carcinogenesis, 25:1599-1609 (2004)）のデータセットを使用した。これは、このデータが実施例５において上記したＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓから入手可能であり、詳細に報告されており、高度に標準化されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドアレイを使用しており、そのため関係するデータの抽出および他のデータセットとの比較が可能であるからである。２３個の悪性神経芽腫試料について調べた。２個は神経芽腫細胞株であり、他はＩ期（１個）、ＩＩａ期（２個）、ＩＩ期（６個）、ＩＩＩ期（１個）、ＩＶ期（１０個）およびＩＶｓ期（１個）の神経芽腫であった。ＡＲＩＤ３ｂは、２３個中１１個の試料において「存在」または「わずか」のコールに基づき「検出」と判定された。そのうち２個は神経芽腫細胞株であり、１個はＩＩ期の神経芽腫であり、残りの８個はＩＶ期の神経芽腫であった。２個の細胞株を除外すると、２１個中９個（４２．８％）の神経芽腫症例でＡＲＩＤ３ｂの発現が見られた。特に、発現はＩＶ期の腫瘍と関連していた（ＩＶ期については１０個中８個（８０％）、Ｉ〜ＩＩＩ期＋ＩＶｓ期については１１個中１個（９％）、Ｐ＝０．００１８）。この結果より、ＡＲＩＤ３ｂの発現とＩＶ期の神経芽腫との関連が示唆された。
本発明により、ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質を含有する神経芽腫の治療剤が提供される。
SEQ ID NO:1 Antisense oligonucleotide for ARID3b designated as ARID3b AS1; nucleotides 1, 3, 4, 6, 9, 11, 14, 16, 19 and 20 are 2'-O,4'-C-methylene bridged nucleic acids (BNAs)
SEQ ID NO:2 Antisense oligonucleotide for ARID3b designated as ARID3b AS3; nucleotides 2, 4, 5, 8, 10, 11, 13 and 16 are 2'-O,4'-C-methylene bridged nucleic acids (BNAs)
SEQ ID NO:3 Antisense oligonucleotide for ARID3b designated as ARID3b AS5; nucleotides 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13 and 20 are 2'-O,4'-C-methylene bridged nucleic acids (BNAs)
SEQ ID NO:4 Oligonucleotide designated as ARID3b AS5 scramble-1; nucleotides 1, 6, 8, 10, 12, 13, 16 and 18 are 2'-O,4'-C-methylene bridged nucleic acids (BNAs)
SEQ ID NO:5: Oligonucleotide designated as ARID3b AS5 scramble-2; nucleotides 1, 4, 6, 8, 10, 11, 14 and 16 are 2'-O,4'-C-methylene bridged nucleic acids (BNAs)
SEQ ID NO:6 Oligonucleotide designated as ARID3b RNAi(5) S; nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides
SEQ ID NO:7 Oligonucleotide designated as ARID3b RNAi(5) A; nucleotides 20 and 21 are deoxyribonucleotides

Claims (4)

  1. ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質を含有する、神経芽腫の治療剤であって、ＡＲＩＤ３ｂ阻害物質がＡＲＩＤ３ｂ ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである治療剤。
  2. ＡＲＩＤ３ｂに対する抗体、又はＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列にアニール可能なオリゴヌクレオチドを少なくとも含む、神経芽腫の判定用キット。
  3. 上記オリゴヌクレオチドがＡＲＩＤ３ｂをコードする遺伝子もしくはその相補配列から選択される１５〜１００ヌクレオチドの連続した配列を含む、請求項２記載のキット。
  4. さらにＭＹＣＮに対する抗体、又はＭＹＣＮをコードする遺伝子もしくはその相補配列にアニール可能なオリゴヌクレオチドを含む、請求項２記載のキット。
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