JP5099489B2 - Improvement of drought tolerance and production of flowering delay plants using transcription factors - Google Patents
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Description
本発明は、植物の転写因子遺伝子を利用した乾燥ストレスに対して耐性の高い植物の作成方法、花芽形成が遅延した植物の作成方法、さらに乾燥耐性が向上し、かつ花芽形成が遅延した形質転換植物の作成方法、およびこれを用いて得られる植物体、ならびにその利用に関し、主として植物育種分野に属する。 The present invention relates to a method for producing a plant highly resistant to drought stress using a plant transcription factor gene, a method for producing a plant with delayed flower bud formation, and a transformation with improved drought tolerance and delayed flower bud formation. The plant production method, the plant obtained by using the plant, and the use thereof belong mainly to the field of plant breeding.
水不足は、植物にストレスを引き起こし、植物のバイオマス生産性を激減させる。乾燥による栽培植物のバイオマス生産性低下は、深刻な食糧不足や経済的損失といった問題の一因となる。植物の乾燥耐性は、様々な栽培植物において収量の増加、栽培の省力化・省資源化、栽培地域の拡大などに関わる重要な要素である。植物の乾燥耐性の改良によって、このような制限を克服し、植物のバイオマス生産性を向上させることが可能となる。
植物は、本来乾燥条件に対して自身を守る機構を有している。乾燥条件を感知するとシグナル伝達系が活性化し、乾燥への耐性に関係する遺伝子、もしくはそれらの発現を調節する遺伝子の発現が誘導されて適応する。しかし、乾燥条件が過酷であったり、長期にわたる場合には、植物の生理活性が著しく低下し、発達、生育が著しく抑制されたり、枯死に至ったりする。
収穫された果実、野菜や花卉など、土壌から抜き取られた植物個体や植物個体から切り離された器官や組織などの場合には、乾燥ストレスが著しく、短時間でしおれたり、枯死したりするため、様々な栽培植物について経済的な損失の要因となる。
植物の乾燥耐性の改良によって、このような制限を克服し、植物のバイオマス生産性を向上させたり、鮮度保持を延長させたりすることが可能となる。
これまでに、遺伝子組み換え等の技術を用い、浸透圧調整物質の合成能を高めたり、熱ショックタンパク質遺伝子を高発現させることで、植物の乾燥耐性を改良された例が報告されている（非特許文献１）。また、植物が乾燥ストレスなどの環境ストレスにさらされた際に著量に発現するストレス応答性遺伝子に着目し、そのようなストレス応答性遺伝子の発現を誘導するストレス応答性転写因子遺伝子等を用いて乾燥耐性を改良した例はＤＲＥＢ遺伝子など多数報告されている（特許文献２〜６）。そして、傷、低温、重金属によって誘導を受けるストレス応答性転写因子遺伝子の１種であるペチュニア由来のＣ２Ｈ２型ジンクフィンガー転写因子ＺＰＴ２−３遺伝子の場合は、植物に導入して乾燥耐性を付与することができ、かつ導入した植物の生育に悪影響を及ぼさないことが確認されている（特許文献７）が、一般に、環境ストレス応答性の転写因子遺伝子の場合、当該遺伝子を恒常的に過剰発現させた形質転換植物では、生育が不良になるなどの障害が生じる場合が多いことが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、従来ストレス応答性遺伝子の発現を誘導する機能とは直接関係付けられた知見の報告がなかったＢ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子において、植物に導入して乾燥耐性を付与する作用を示す可能性は考えられていなかった。
Water shortage causes stress on plants and drastically reduces plant biomass productivity. Decreased biomass productivity of cultivated plants due to drying contributes to problems such as serious food shortages and economic losses. The drought tolerance of plants is an important factor related to the increase in yield, labor-saving and resource-saving of cultivation, and expansion of cultivation areas in various cultivated plants. By improving the drought tolerance of plants, it is possible to overcome such limitations and improve the biomass productivity of plants.
Plants inherently have a mechanism to protect themselves against dry conditions. When a dry condition is sensed, the signal transduction system is activated, and the expression of genes related to resistance to dryness or genes regulating their expression is induced and adapted. However, when the drying conditions are harsh or for a long time, the physiological activity of the plant is remarkably lowered, the development and growth are remarkably suppressed, or the plant is killed.
In the case of plant individuals extracted from the soil, such as harvested fruits, vegetables and flower buds, and organs and tissues separated from plant individuals, drought stress is remarkable, and it will wither or die in a short time, It causes economic loss for various cultivated plants.
By improving the drought tolerance of plants, it is possible to overcome such limitations, improve the biomass productivity of plants, and extend the maintenance of freshness.
So far, there have been reports of cases where drought tolerance of plants has been improved by improving the ability to synthesize osmotic pressure regulators or by highly expressing heat shock protein genes using technologies such as genetic recombination (non- Patent Document 1). We also focused on stress-responsive genes that are markedly expressed when plants are exposed to environmental stress such as drought stress, and use stress-responsive transcription factor genes that induce the expression of such stress-responsive genes. Many examples of improving the drought tolerance have been reported (Patent Documents 2 to 6). In the case of the C2H2-type zinc finger transcription factor ZPT2-3 gene derived from petunia, which is one of the stress-responsive transcription factor genes induced by wounds, low temperature, and heavy metals, it is introduced into plants to impart drought tolerance In the case of an environmental stress responsive transcription factor gene, the gene was constitutively overexpressed. It has been reported that transformed plants often suffer from problems such as poor growth (Non-patent Document 1). However, B-box type zinc finger transcription factor, which has not been reported in the past, has been reported to have a direct relationship with the function of inducing the expression of stress responsive genes, and may exhibit an effect of imparting drought tolerance when introduced into plants. Sex was not considered.
また、植物のバイオマス生産の観点からみて、花芽形成の時期の制御も重要な課題である。
植物の生活環は、大きく栄養成長相と生殖成長相に分けられる。栄養成長過程では、主に炭酸同化によりバイオマス生産が行われ、植物体が成長する。生殖成長過程では、有性生殖による繁殖のために花芽が形成し、種子を生産する。花芽の形成は、栄養成長から生殖成長への成長相の転換であり、植物生活環の主要な発達プログラムの切り替えである。また、栄養成長期に生産したバイオマスから貯蔵物質に転換し種子・果実等へ蓄積するための代謝的プログラムの切り替えでもある。一年生植物などのように生活環の中で一回だけ繁殖する植物では、花芽形成への切り替えは、同時に個体としての老化への切り替えでもある。したがって、花芽形成の時期の制御は、植物の繁殖戦略にとって重要であり、ほとんどの植物では花芽形成の時期を制御する機構を発達させてきた。このようなことから、多くの栽培植物において、花芽形成の時期を制御することは、植物体としてのバイオマス生産性の向上、種子・果実等の品質および生産性の向上にとって、重要な技術課題である。
花芽形成は、様々な内的および外的要因の制御を受けている。花芽形成に影響を及ぼす外的要因、すなわち環境要因として主要なのは、光周期すなわち日長および温度である。長日条件あるいは短日条件で花芽形成が促進される植物があり、それぞれ長日植物、短日植物と呼ばれている。これに対して、光周期が花芽形成に影響を及ぼさない中性植物もある。花芽形成の外的要因としての温度の影響としては、低温への暴露である。これによって、春化と呼ばれる過程によって花芽形成が促進される。花芽形成の内的要因は、植物の発達状態による花芽形成の制御機構である。ほとんどの植物種は、幼若な期間には花芽形成が抑制されており、植物体が発達して成熟期にはいることで、花芽の形成が促進される。このような花芽形成の機構は、自律的花芽形成促進経路とも呼ばれている。環境要因依存的花芽形成促進経路と自律的花芽形成促進経路とは、完全に独立な関係ではなく、部分的に共通の経路を通して花芽形成を制御していると考えられている。
さらに、ある種の植物の栽培においては、乾燥ストレスによって未成熟な植物個体において花芽形成が促進されることが知られている。その結果、栽培植物の生産量が低下してしまう。植物に、乾燥耐性と花芽形成遅延の能力を付与することで、このような障害を克服することができる。
いくつかの植物種において、花芽形成に関わる遺伝子が明らかにされている。特にシロイヌナズナにおいては、花芽形成の制御に関与する多くの遺伝子が明らかにされている（非特許文献８）。そのような遺伝子の発現を改良して、花芽形成を促進、もしくは遅延させる試みがなされてきた。これまでに、花芽形成抑制作用を有する不飽和脂肪酸誘導体を有効成分とする花芽形成調整剤（特許文献８）、花芽形成抑制活性タンパク質遺伝子又はそのアンチセンスＤＮＡを用いる花芽形成の制御方法（特許文献９）、ＥＲＦ転写因子ファミリーの花芽形成促進転写因子と機能性ペプチドとの融合タンパク質を用いた花芽形成遅延植物体生産方法（特許文献１０）などが知られている。しかしながら、特許文献１０の方法も転写因子自体の作用で植物に花芽形成抑制を付与したものではない。
From the viewpoint of plant biomass production, control of the timing of flower bud formation is also an important issue.
The life cycle of a plant is roughly divided into a vegetative growth phase and a reproductive growth phase. In the vegetative growth process, biomass production is carried out mainly by carbon dioxide assimilation, and plants grow. In the process of reproductive growth, flower buds form and produce seeds for reproduction by sexual reproduction. Flower bud formation is a shift in the growth phase from vegetative growth to reproductive growth and a major developmental program switch in the plant life cycle. It is also the switching of metabolic programs to convert biomass produced during vegetative growth into storage materials and accumulate it in seeds and fruits. In plants that grow only once in the life cycle, such as annual plants, switching to flower bud formation is also switching to aging as an individual. Thus, control of the timing of flower bud formation is important for plant propagation strategies, and most plants have developed mechanisms that control the timing of flower bud formation. For this reason, in many cultivated plants, controlling the timing of flower bud formation is an important technical issue for improving biomass productivity as a plant body and improving the quality and productivity of seeds and fruits. is there.
Flower bud formation is controlled by various internal and external factors. The main external factors that influence flower bud formation, ie, environmental factors, are the photoperiod, ie, day length and temperature. There are plants whose flower bud formation is promoted under long-day conditions or short-day conditions, which are called long-day plants and short-day plants, respectively. In contrast, in some neutral plants, the photoperiod does not affect flower bud formation. The effect of temperature as an external factor in flower bud formation is exposure to low temperatures. This promotes flower bud formation through a process called vernalization. An internal factor of flower bud formation is a control mechanism of flower bud formation according to the developmental state of the plant. In most plant species, flower bud formation is suppressed during the youth period, and flower bud formation is promoted when the plant body develops and enters the mature stage. Such a mechanism of flower bud formation is also called an autonomous flower bud formation promoting pathway. It is thought that the environmental factor-dependent flower bud formation promotion pathway and the autonomous flower bud formation promotion pathway are not completely independent, but partly control flower bud formation through a common pathway.
Furthermore, in the cultivation of certain plants, it is known that flower bud formation is promoted in immature plant individuals by drought stress. As a result, the production amount of cultivated plants decreases. By conferring drought tolerance and the ability to delay flower bud formation on plants, these obstacles can be overcome.
In several plant species, genes involved in flower bud formation have been clarified. In particular, in Arabidopsis thaliana, many genes involved in the control of flower bud formation have been clarified (Non-patent Document 8). Attempts have been made to improve the expression of such genes to promote or delay flower bud formation. So far, a flower bud formation regulator (Patent Document 8) comprising an unsaturated fatty acid derivative having a flower bud formation inhibitory activity as an active ingredient, a flower bud formation control method using a flower bud formation inhibitory protein protein or its antisense DNA (Patent Document) 9) A flower bud formation delayed plant production method using a fusion protein of a flower bud formation promoting transcription factor and a functional peptide of the ERF transcription factor family (Patent Document 10) is known. However, the method of Patent Document 10 also does not impart suppression of flower bud formation to plants by the action of the transcription factor itself.
本発明者らは、以前から植物において有用物質生産やバイオマス生産の効率化に役立つ転写因子遺伝子の探索を目的として、主にシロイヌナズナを用いて、Ｂ−ｂｏｘジンクフィンガー転写因子（以下、ＢＺＦと呼ぶ）の機能解析を進めていた。Ｂ−ｂｏｘ保存配列は、Ｚｎ（亜鉛）との結合性が推定されることから「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガードメイン」と呼ばれているが、Ｃ２Ｈ２型等の他のジンクフィンガードメインのアミノ酸配列との相同性はない。Ｂ−ｂｏｘは最初は動物の転写因子で存在が確認され（非特許文献２）、その後同様のＢ−ｂｏｘを含むジンクフィンガー型転写因子が植物にも存在することが示され（非特許文献３）、Ｂ−ｂｏｘ付近の配列が保存された「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」は、遺伝子ファミリーを形成している（非特許文献４、５）。これら「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」遺伝子のうちＣＣＴドメインを含むタイプの遺伝子はＣＯＬファミリーとよばれ（非特許文献５，６）、いくつかの遺伝子について詳細な機能解析が進んできている。これに対して、ＣＣＴドメインを含まないタイプがＢＺＦファミリーであり、このファミリーに属する遺伝子については、詳細な機能解析に関する報告はほとんどない。そして、「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」遺伝子については、ＢＺＦファミリーのみならず、ＣＯＬファミリーの遺伝子に関しても、植物の乾燥耐性と花芽形成遅延作用とを関連づけた報告はなされていない。またこれまでに、植物の花芽形成を遅延させる作用を示すＢＺＦファミリー転写因子は、知られていない。
本発明は、転写因子遺伝子を利用して、植物の生育に悪影響を与えることなく乾燥耐性を向上させる方法、及び／又は植物の花芽形成を遅延させる方法、及び乾燥耐性が向上した、及び／又は植物の花芽形成を遅延させた、生産性が良い植物を提供することを目的とする。 The present invention uses a transcription factor gene to improve drought tolerance without adversely affecting plant growth and / or a method of delaying flower bud formation and / or drought tolerance has been improved, and / or An object is to provide a plant with good productivity in which flower bud formation is delayed.
本発明者らはシロイヌナズナの「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」のうちのＢＺＦファミリーに属するＢＺＦ１転写因子遺伝子に着目してその機能を検討していく中で、ＢＺＦ１遺伝子をシロイヌナズナに導入して複数のＴ１世代の形質転換植物を作成し、それぞれのＴ１植物について自家受粉による継代によってＴ３世代の植物体を得て、ＢＺＦ１遺伝子が高レベルで発現していることを確認した。Ｔ３世代の植物の形質を野生型植物と詳細に比較することによって、ＢＺＦ１遺伝子が植物に対して乾燥耐性を付与する可能性及び花芽形成を遅延させる可能性があることに気づき、乾燥ストレスに対する耐性及び花芽形成能を詳細に検討した。その結果、形質転換植物が野生型及びコントロール形質転換植物と比較して顕著な乾燥耐性を示し、及び花芽形成の遅延を示し、しかも形態異常や極端な生育不良を示さないことが確認された。複数の形質転換株のＴ３世代において上記の形質が確認されたことから、乾燥耐性の向上及び花成の遅延という形質は、子孫にも安定して受け継がれる形質であると考えられる。
本発明者らはＢＺＦ１遺伝子を植物に遺伝子導入して発現させることにより、植物の乾燥耐性を向上させること、および花芽形成が遅延することを見出し、本発明を完成するに至った。
While the present inventors are focusing on the BZF1 transcription factor gene belonging to the BZF family in the “B-box type zinc finger transcription factor” of Arabidopsis thaliana, the BZF1 gene is introduced into Arabidopsis thaliana. A plurality of T1 generation transformed plants were prepared, and T3 generation plants were obtained by passaging by self-pollination for each T1 plant, and it was confirmed that the BZF1 gene was expressed at a high level. By comparing the traits of T3 generation plants with wild type plants in detail, we noticed that the BZF1 gene may impart drought tolerance to the plant and may delay flower bud formation, and resistance to drought stress And the flower bud formation ability was examined in detail. As a result, it was confirmed that the transformed plant showed remarkable drought tolerance as compared with the wild type and control transformed plants, delayed flower bud formation, and did not show morphological abnormalities or extreme growth defects. Since the above traits have been confirmed in the T3 generation of a plurality of transformants, it is considered that the traits of improved drought tolerance and delayed flowering are traits that are stably inherited by offspring.
The present inventors have found that by introducing the BZF1 gene into a plant and expressing it, the drought tolerance of the plant is improved and flower bud formation is delayed, and the present invention has been completed.
本発明者らは、シロイヌナズナ及びイネの「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」ファミリーに属する転写因子をゲノムデータベースで検索し、それぞれ３１個および３２個を見いだし、分子系統解析および保存ドメイン・モチーフの比較解析を行ってきた（図５，６）。
植物のＢ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子ファミリーは、さらに、Ｂ−ｂｏｘの他にＣＣＴドメインとよばれる保存領域を含むＣＯＬファミリーと、ＣＣＴドメインを含まないＢＺＦファミリーとに大別される。前者のＣＯＬファミリーに属する遺伝子の機能解析は進んでおり、たとえばシロイヌナズナ由来のＣＯＮＳＴＡＮＳ遺伝子は花成促進の機能を有している（非特許文献４，５）。シロイヌナズナゲノムでは、このＣＯＬファミリーの遺伝子は１７個存在することが知られている。後者のＢＺＦファミリーに属する遺伝子については、十分な構造の検討や機能の解明が進んでおらず、ＢＺＦファミリーのうちで構造や機能が検討された例は、（非特許文献６）のＳＴＯ遺伝子を高発現させたシロイヌナズナでは、高塩ストレス条件下で見られるシロイヌナズナの生育抑制のうち、根の伸長抑制のみがやや回復するというものである。シロイヌナズナのＢＺＦファミリーのうち、このＳＴＯ遺伝子はＢ−ｂｏｘを２つもつグループに属しており、ＢＺＦ１遺伝子は、従来詳細な機能解析の報告がなされていないＢ−ｂｏｘを１つしか含まないグループに属する。シロイヌナズナで、当該グループに属する遺伝子はＢＺＦ１遺伝子を含めて４遺伝子あり、ＢＺＦ１と最も高い相同性を示すシロイヌナズナのＢＺＦ２は、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析（非特許文献７）によると、アミノ酸配列全体では４７％の同一性を示す。（以下、本発明において単に「同一性」というとき、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析による「同一性」を指す。なお、「同一性」は、「相同性」ということもある。）
このように、ＢＺＦ２とＢＺＦ１とは、全アミノ酸配列では、それほど類似していないものの、Ｂ−ｂｏｘのアミノ酸配列の保存性が極めて高いので、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析では９５％の同一性を示す。Ｂ−ｂｏｘドメイン以外にもアミノ酸配列の相同性が高い保存モチーフを有しており（図５）、同一のグループに属する。（以下、「ＢＺＦ−Ｉ」グループという。）
具体的には、ＢＺＦ−Ｉグループの転写因子に共通な保存モチーフとしては、以下の３種類がある。
（１）「ＣＭ−１」：配列番号３で表されるアミノ酸配列をコンセンサス配列とする保存モチーフ（Ｂ−ｂｏｘドメインに相当）
（２）「ＣＭ−２」：「ＣＭ−１」モチーフのＣ末端に位置する配列番号４で表されるアミノ酸配列をコンセンサス配列とする保存モチーフ
（３）「ＣＭ−３」：Ｎ末側の富酸性アミノ酸領域とＣ末側の富セリン領域とに挟まれた配列番号５で表されるアミノ酸配列をコンセンサス配列とする保存モチーフ
イネのＢ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子の分子系統解析、及びそのシロイヌナズナとの比較解析により、イネのＢＺＦファミリーにもＢＺＦ１に分子系統上近縁のタンパク質ＯｓＢＺＦ１が存在しており、Ｂ−ｂｏｘドメインと共に、ＢＺＦ１と共通する上記保存モチーフも保存されていることから、同じ「ＢＺＦ−Ｉ」グループに属する（図６）。イネのＯｓＢＺＦ１は、ＢＺＦ１とのアミノ酸配列の相同性は、ＣｌｕｓｔａｌＷ解析によると３１％の同一性であり、配列全体としての相同性はあまり高くない。これに対して、Ｂ−ｂｏｘでは６８％の同一性である。
したがって、ＢＺＦ−Ｉグループに属する転写因子とは、配列番号２のＢＺＦ１タンパク質と３１％以上の同一性を有し、かつ「ＣＭ−１」、「ＣＭ−２」、及び、Ｎ末側の富酸性アミノ酸領域とＣ末側の富セリン領域とに挟まれた「ＣＭ−３」の３つの保存モチーフを有している転写因子であると定義することができる。
一般に、同じファミリーに属し、共通の保存モチーフを持つ転写因子の機能は生物種によらず普遍性があるが、単子葉植物であるイネにも同一グループの転写因子が存在していることからみても、モデル植物であるシロイヌナズナで確認されたＢＺＦ１における植物の乾燥耐性を向上させる機能及び植物の花芽形成抑制作用は、双子葉、単子葉を問わず、植物一般で同様の機能を示すと考えられる。
The present inventors searched the genome database for transcription factors belonging to the "B-box type zinc finger transcription factor" family of Arabidopsis thaliana and rice, and found 31 and 32, respectively, and analyzed molecular phylogeny and conserved domain motifs. A comparative analysis has been performed (FIGS. 5 and 6).
The plant B-box type zinc finger transcription factor family is further roughly divided into a COL family containing a conserved region called CCT domain in addition to B-box and a BZF family not containing CCT domain. Functional analysis of the gene belonging to the former COL family is progressing. For example, the CONSTANS gene derived from Arabidopsis thaliana has a function of promoting flowering (Non-patent Documents 4 and 5). In the Arabidopsis genome, it is known that there are 17 genes of this COL family. Regarding the latter gene belonging to the BZF family, sufficient structural investigation and elucidation of the function have not progressed. Examples of the BZF family whose structure and function have been studied include the STO gene of (Non-patent Document 6). In Arabidopsis thaliana, which is highly expressed, among the suppression of Arabidopsis growth observed under high salt stress conditions, only suppression of root elongation is somewhat recovered. Among the BZF family of Arabidopsis thaliana, this STO gene belongs to a group having two B-boxes, and the BZF1 gene belongs to a group containing only one B-box for which no detailed functional analysis has been reported so far. Belongs. In Arabidopsis thaliana, there are 4 genes including the BZF1 gene, and BZF2 of Arabidopsis thaliana which shows the highest homology with BZF1 is 47% identical in amino acid sequence according to ClustalW analysis (Non-patent Document 7). Showing gender. (Hereinafter, the term “identity” in the present invention refers to “identity” by ClustalW analysis. In addition, “identity” is sometimes referred to as “homology”.)
Thus, although BZF2 and BZF1 are not so similar in the entire amino acid sequence, the conservation of the amino acid sequence of B-box is extremely high, and thus the CrustalW analysis shows 95% identity. In addition to the B-box domain, it has a conserved motif with high amino acid sequence homology (FIG. 5) and belongs to the same group. (Hereinafter referred to as “BZF-I” group.)
Specifically, there are the following three types of conserved motifs common to transcription factors of the BZF-I group.
(1) “CM-1”: a conserved motif (corresponding to a B-box domain) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 as a consensus sequence
(2) “CM-2”: a conserved motif in which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 located at the C-terminus of the “CM-1” motif is a consensus sequence (3) “CM-3”: N-terminal side A conserved motif having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 sandwiched between an acidic amino acid region and a C-rich serine region as a consensus sequence Molecular phylogenetic analysis of a rice B-box type zinc finger transcription factor, and its According to comparative analysis with Arabidopsis thaliana, BZF1 also has a protein OsBZF1 closely related to BZF1 in the BZF family of rice, and the conserved motif in common with BZF1 is conserved along with the B-box domain. It belongs to the same “BZF-I” group (FIG. 6). Rice OsBZF1 has 31% identity in amino acid sequence with BZF1 according to ClustalW analysis, and the homology as a whole sequence is not so high. In contrast, the B-box has 68% identity.
Therefore, a transcription factor belonging to the BZF-I group has 31% or more identity with the BZF1 protein of SEQ ID NO: 2, and “CM-1”, “CM-2”, and N-terminal wealth. It can be defined as a transcription factor having three conserved motifs of “CM-3” sandwiched between an acidic amino acid region and a C-terminal serine-rich region.
In general, the functions of transcription factors belonging to the same family and having a common conserved motif are universal regardless of the species, but the same group of transcription factors exist in rice, which is a monocotyledonous plant. However, BZF1 confirmed in Arabidopsis thaliana as a model plant has the function of improving the drought tolerance of plants and the suppression of flower bud formation in plants, regardless of whether they are dicotyledonous or monocotyledonous. .
本発明は、植物の乾燥耐性を高めるため、及び／又は花芽形成を遅延させるためのＢＺＦ−Ｉ転写因子遺伝子の利用に関するものであり、以下に記載の発明を提供するものである。
〔１〕 ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを有効成分として含む、植物の乾燥耐性を向上させるための、及び／又は花芽形成を遅延させるための薬剤。
〔２〕 ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡもしくは当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターが導入された形質転換植物細胞又は組織であって、当該細胞又は組織を再生することで、乾燥耐性が向上した、及び／又は花芽形成が遅延した形質転換植物を得ることができる、形質転換植物細胞又は組織。
〔３〕 ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを用いて形質転換されたことを特徴とする、乾燥耐性が向上した、及び／又は花芽形成が遅延した、形質転換植物又はその部分。
〔４〕 形質転換植物が、ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ、又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを用いて形質転換された植物の子孫あるいはクローンである、前記〔３〕に記載の形質転換植物又はその部分。
〔５〕 形質転換植物又はその部分が、植物個体、種子、植物器官、植物組織、又は植物細胞である、前記〔３〕又は〔４〕に記載の形質転換植物又はその部分。
〔６〕 ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを用いて形質転換することを特徴とする、植物の乾燥耐性を向上させるための、及び／又は植物の花芽形成を遅延させるための、植物の形質転換方法。
〔７〕 ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡ又は当該組換えＤＮＡが挿入されたベクターを用いて形質転換された植物を、さらに、自家受粉、交配法、もしくは細胞融合法によりその子孫を得るか、又は当該形質転換植物の部分を用いてそのクローンを得ることを特徴とする、前記〔６〕に記載の植物の形質転換方法。
The present invention relates to the use of the BZF-I transcription factor gene to increase drought tolerance of plants and / or to delay flower bud formation, and provides the invention described below.
[1] Recombinant DNA containing DNA encoding a BZF-I transcription factor, or a vector having the recombinant DNA inserted as an active ingredient, for improving drought tolerance of plants and / or flower bud formation Drug to delay.
[2] A transformed plant cell or tissue into which a recombinant DNA containing DNA encoding a BZF-I transcription factor or a vector into which the recombinant DNA has been introduced has been introduced, by regenerating the cell or tissue. A transformed plant cell or tissue capable of obtaining a transformed plant having improved drought tolerance and / or delayed flower bud formation.
[3] Improved drought tolerance, characterized by being transformed with a recombinant DNA containing DNA encoding a BZF-I transcription factor, or a vector into which the recombinant DNA has been inserted, and / or A transformed plant or a part thereof in which flower bud formation is delayed.
[4] The transformed plant is a recombinant DNA containing a DNA encoding a BZF-I transcription factor, or a progeny or clone of a plant transformed with a vector into which the recombinant DNA is inserted [ [3] A transformed plant or a part thereof according to [3].
[5] The transformed plant or part thereof according to [3] or [4] above, wherein the transformed plant or part thereof is a plant individual, seed, plant organ, plant tissue, or plant cell.
[6] For improving drought tolerance of plants, characterized by transforming with a recombinant DNA containing DNA encoding a BZF-I transcription factor or a vector into which the recombinant DNA has been inserted, and A method for transforming a plant for delaying flower bud formation in the plant.
[7] Recombinant DNA containing DNA encoding the BZF-I transcription factor or a plant transformed with a vector into which the recombinant DNA has been inserted is further subjected to self-pollination, mating, or cell fusion. The method for transforming a plant according to [6] above, wherein the offspring is obtained or the clone is obtained using a part of the transformed plant.
本発明により、乾燥耐性が向上した形質転換植物が提供される。また、本発明により、花芽形成が遅延した形質転換植物が提供される。さらに、本発明により、乾燥耐性が向上し、かつ花芽形成が遅延した形質転換植物が提供される。花芽形成の遅延によって、植物バイオマス生産の増大が可能となる。乾燥耐性の向上によって、または乾燥耐性の向上と共に花芽形成が遅延することによって、環境ストレス条件下での植物生産の効率化と、栽培の省力化と節水化、栽培地域の拡大等が可能となり、また、栽培植物の植物個体、もしくはその有用部分の寿命の延長と収量の増加が可能となる。また、植物の生産性が向上することで、植物体内で合成・蓄積される種々の有用物質の生産性の向上にも有効である。さらに、収穫後の寿命の延長あるいは鮮度の保持が向上することが可能となる。 According to the present invention, a transformed plant having improved drought tolerance is provided. The present invention also provides a transformed plant with delayed flower bud formation. Furthermore, the present invention provides a transformed plant having improved drought tolerance and delayed flower bud formation. Delayed flower bud formation can increase plant biomass production. By improving drought tolerance or delaying flower bud formation with improved drought tolerance, it becomes possible to increase the efficiency of plant production under environmental stress conditions, save labor and save water, expand the cultivation area, etc. Further, it is possible to extend the life and increase the yield of the plant individual of the cultivated plant, or useful parts thereof. Further, the improvement of plant productivity is effective in improving the productivity of various useful substances synthesized and accumulated in the plant body. Furthermore, it is possible to extend the life after harvesting or to maintain the freshness.
１．本発明において「植物の乾燥耐性が向上する」とは、対象植物の乾燥に対する耐性を野生型の植物と比較して向上させることをいう。植物の乾燥耐性は、実施例２に示したように、本発明の遺伝子を用いて形質転換した植物を、コントロール（ＧＵＳ）遺伝子を用いて形質転換した植物及び野生型の植物と共に栽培した後、水やりを一定期間停止し、再度水やりを開始した後の生存率を調べることにより評価することができる。 1. In the present invention, “to improve the drought tolerance of plants” means to improve the drought tolerance of target plants as compared to wild-type plants. As shown in Example 2, the drought tolerance of the plant was determined by cultivating a plant transformed with the gene of the present invention together with a plant transformed with the control (GUS) gene and a wild type plant. Evaluation can be made by examining the survival rate after stopping watering for a certain period and starting watering again.
２．本発明において「花芽形成が遅延された」とは、対象植物の花芽形成をコントロール（ＧＵＳ）遺伝子を用いて形質転換した植物及び野生型の植物と比較して遅延させることをいう。本発明の花芽形成時期は、花茎が抽苔するまでの本葉の枚数を調べることにより評価することができる。 2. In the present invention, “flower bud formation is delayed” refers to delaying flower bud formation of a target plant as compared to a plant transformed with a control (GUS) gene and a wild-type plant. The flower bud formation time of the present invention can be evaluated by examining the number of true leaves until the flower stem is extracted.
３．「ＢＺＦ−Ｉ転写因子」について：
本発明において、「Ｂ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子」とは、「Ｂ−ｂｏｘ」とよばれる、Ｚｎ（亜鉛）との結合性がある保存配列を有する転写因子であり、各種動植物の幅広い生物種において見出されている転写因子である。
本発明において、「ＢＺＦ−Ｉ転写因子」とは、植物のＢ−ｂｏｘ型ジンクフィンガー転写因子ファミリーのうち、「ＣＯＬファミリー（Ｂ−ｂｏｘの他にＣＣＴドメインを含む）」以外の、ＣＣＴドメインを含まないタイプの「ＢＺＦファミリー」に属するものであり、そのうちで、Ｂ−ｂｏｘ保存領域を１つしか含まないグループであって、かつ図５に示されたＢＺＦ−Ｉグループの保存領域および保存モチーフを有する転写因子である。
Ｂ−ｂｏｘドメインは、「CXXCXXXXXXX(X)CXXXXXXXCXXCXXXXHXXXXXXX(X)H」というシステイン、ヒスチジン骨格を有する保存領域である。本願におけるＢＺＦ−Ｉグループの「ＣＭ−１」モチーフは、図５に示される「CXLCXXXARXYCXXDXAXLCWXCDXXVHGANFLVAXH」という共通配列を有する。「ＣＭ−２」の保存モチーフは、「CXXCXXXTPWXAXGXXLGPTXSXCEXC」という共通配列を有している。「ＣＭ−３」保存モチーフは、「ＮＱＶＶＰ」である。「ＣＭ−３」保存モチーフのＮ末端側に富酸性アミノ酸領域が、「ＣＭ−３」保存モチーフのＣ末端側には富セリン領域が位置する。
典型的にはシロイヌナズナ由来のＢＺＦ１遺伝子であって、たとえば、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡは、本発明において特に好適に用いることができる。
3. About "BZF-I transcription factor":
In the present invention, the “B-box type zinc finger transcription factor” is a transcription factor called “B-box”, which has a conserved sequence having binding property with Zn (zinc), and is a wide variety of organisms of various animals and plants. A transcription factor found in species.
In the present invention, “BZF-I transcription factor” refers to a CCT domain other than “COL family (including CCT domain in addition to B-box)” among plant B-box type zinc finger transcription factor families. A group that does not belong to the “BZF family”, of which only one B-box storage region is included, and the storage region and the storage motif of the BZF-I group shown in FIG. Is a transcription factor.
The B-box domain is a conserved region having a cysteine and histidine skeleton called “CXXCXXXXXXX (X) CXXXXXXXCXXCXXXXHXXXXXXX (X) H”. The “CM-1” motif of the BZF-I group in the present application has a common sequence “CXLCXXXARXYCXXDXAXLCWXCDXXVHGANFLVAXH” shown in FIG. The conserved motif of “CM-2” has a common sequence “CXXCXXXTPWXAXGXXLGPTXSXCEXC”. The “CM-3” conserved motif is “NQVVP”. An acidic amino acid region is located on the N-terminal side of the “CM-3” conserved motif, and a serine-rich serine region is located on the C-terminal side of the “CM-3” conserved motif.
Typically, a BZF1 gene derived from Arabidopsis thaliana, for example, a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 are particularly used in the present invention. It can be used suitably.
また、乾燥耐性を向上させる作用、花芽形成を遅延させる作用、または乾燥耐性と共に花芽形成抑制作用を有するＤＮＡであれば、「配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」も含まれる。典型的には、ＢＺＦ１遺伝子をコードする配列番号１で表された塩基配列情報を利用して適当なプライマー対を設計し、たとえば配列番号６及び７のプライマー対を用いて植物から調製したｍＲＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、得られる増幅ＤＮＡ断片をプローブとして用いて常套手段により調製された植物由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。
また、形質転換植物に乾燥耐性を向上させる作用、花芽形成を遅延させる作用、または乾燥耐性と共に花芽形成抑制作用を付与するＤＮＡであって、配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡも本発明で用いられる。
したがって、本発明の「ＢＺＦ−Ｉ転写因子をコードするＤＮＡ」として典型的には、以下のＤＮＡを包含する。
(a)配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
(b)配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
(c)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
(d)配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
In addition, DNA having a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be used as long as it has an action to improve drought tolerance, an action to delay flower bud formation, or a drought tolerance and a flower bud formation inhibitory action. And DNA that hybridizes under stringent conditions . The Scripture type manner, and design an appropriate primer pair using the nucleotide sequence information represented by SEQ ID NO: 1 which encode BZF1 gene was prepared from a plant using, for example, SEQ ID NO: 6 and 7 primer pairs mRNA Can be obtained by screening a plant-derived cDNA library prepared by conventional means using the amplified DNA fragment as a probe.
Further, it is a DNA that imparts an effect of improving drought tolerance, an effect of delaying flower bud formation to a transformed plant, or an effect of inhibiting flower bud formation together with drought tolerance, and one or several in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which a single amino acid is deleted, substituted or added is also used in the present invention.
Accordingly, the “DNA encoding the BZF-I transcription factor” of the present invention typically includes the following DNAs.
(a) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(b) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(c) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(d) A DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 .
４．形質転換植物の作出方法
上記ＤＮＡを挿入するベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。上記ＤＮＡが挿入されたベクターは、例えば、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法等の当業者に公知の方法によって、植物細胞に導入することができる。本発明の実施例では、典型的なアグロバクテリウム法を用いた。
本発明は、上記ＤＮＡやベクターが導入された形質転換植物細胞から育成または再生された、乾燥耐性が向上した植物体を提供する。本発明における「乾燥耐性が向上した植物体」とは、野生型の植物体と比較して乾燥に対する耐性が人為的に向上されている植物体をいう。
また、本発明は、花芽形成が遅延された植物体を提供する。「花芽形成が遅延された植物体」とは、野生型の植物体と比較して花芽形成が人為的に遅延されている植物体をいう。
さらに、本発明は、乾燥耐性が向上し、かつ花芽形成が遅延された植物体を提供する。
本発明は、上記ＤＮＡが導入された細胞から作出された植物体のみならず、その子孫あるいはクローンをも提供する。一旦、ゲノム内に上記ＤＮＡやベクターが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により子孫あるいはクローンを得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、不定芽、不定胚、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
そして、本発明は、植物の乾燥耐性を向上させるための、又は植物の花芽形成を遅延させるための、及び、植物の乾燥耐性を向上させると共に、植物の花芽形成を遅延させるための形質転換方法を提供する。当該方法は、上記ＤＮＡやベクターを植物細胞に導入する工程および上記ＤＮＡやベクターを導入された細胞から植物体を育成または再生する工程を含むものである。
上記ＤＮＡが挿入されたベクターは、当業者に公知の方法によって、植物細胞に導入することができる。形質転換植物細胞から植物体を育成または再生する工程は、植物の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、シロイヌナズナであればCloughら（Plant J.16:735-743(1998)）の方法、あるいはAkamaら（Plant Cell Reports12:7-11(1992)）の方法が挙げられる。また、イネであればHieiら（Plant J.6:271-281(1994)）あるいはFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett.2:74-75(1985)）の方法を用いることができる。
そして、本発明において「形質転換植物」というとき、上記ＤＮＡを導入して作成した形質転換植物のみならず、当該植物の有性生殖によって得られた種子を生育させた子孫植物、無性生殖、組織培養、細胞培養、細胞融合等により得られた子孫植物あるいはクローン、さらにそれらを継代させて得られる子孫植物のすべてを含む概念である。本発明の実施例では、ＢＺＦ１遺伝子が導入された形質転換植物を自家受粉させて得られた種子を生育させたＴ３世代又はＴ４世代を用いている。
4). Method for producing transformed plant There is no particular limitation on the vector into which the DNA is inserted as long as the inserted gene can be expressed in plant cells. For example, a vector having a promoter (for example, cauliflower mosaic virus 35S promoter) for constitutive gene expression in plant cells or a vector having a promoter inducibly activated by an external stimulus is used. Is also possible. The vector into which the DNA has been inserted is introduced into plant cells by methods known to those skilled in the art, such as the polyethylene glycol method, electroporation (electroporation), Agrobacterium-mediated methods, particle gun methods, and the like. Can do. In the examples of the present invention, a typical Agrobacterium method was used.
The present invention provides a plant having improved drought tolerance, grown or regenerated from a transformed plant cell into which the above DNA or vector has been introduced. The “plant having improved drought tolerance” in the present invention refers to a plant having a drought-resistant drought resistance compared to a wild-type plant.
The present invention also provides a plant with delayed flower bud formation. “Plant with delayed flower bud formation” refers to a plant with artificially delayed flower bud formation compared to a wild-type plant.
Furthermore, the present invention provides a plant with improved drought tolerance and delayed flower bud formation.
The present invention provides not only a plant produced from a cell into which the DNA has been introduced, but also its progeny or clone. Once a transformed plant having the above DNA or vector introduced into its genome is obtained, progeny or clones can be obtained from the plant by sexual reproduction, asexual reproduction, tissue culture, cell culture, cell fusion, etc. Is possible. Further, a propagation material (for example, seed, fruit, cut ear, tuber, tuberous root, strain, adventitious bud, adventitious embryo, callus, protoplast, etc.) is obtained from the plant or its progeny or clone, and the plant is based on them. It is also possible to mass-produce the body.
The present invention also relates to a transformation method for improving the drought tolerance of a plant, for delaying flower bud formation of a plant, and for improving the drought tolerance of a plant and delaying the flower bud formation of a plant. I will provide a. The method includes a step of introducing the DNA or vector into a plant cell and a step of growing or regenerating a plant from the cell into which the DNA or vector has been introduced.
The vector having the DNA inserted therein can be introduced into plant cells by methods known to those skilled in the art. The step of growing or regenerating a plant body from the transformed plant cell can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant. For example, for Arabidopsis thaliana, the method of Clough et al. (Plant J. 16: 735-743 (1998)) or the method of Akama et al. (Plant Cell Reports 12: 7-11 (1992)) can be mentioned. For rice, the method of Hiei et al. (Plant J.6: 271-281 (1994)) or Fujimura et al. (Plant Tissue Culture Lett. 2: 74-75 (1985)) can be used.
And in the present invention, when referred to as a “transformed plant”, not only a transformed plant prepared by introducing the above DNA, but also a progeny plant in which seeds obtained by sexual reproduction of the plant are grown, asexual reproduction, It is a concept including all of progeny plants or clones obtained by tissue culture, cell culture, cell fusion, etc., and further progeny plants obtained by subculture them. In the examples of the present invention, the T3 generation or the T4 generation in which seeds obtained by self-pollination of a transformed plant introduced with the BZF1 gene are grown is used.
（実施例１） 遺伝子の植物への導入
遺伝子の単離、遺伝子導入用の組換えベクター及び形質転換植物の作製は、公知の方法で行うことができる。本実施例においては、シロイヌナズナ植物由来のＢＺＦ１のｃＤＮＡを単離し、植物発現ベクターを作製して、アグロバクテリウムを用いてシロイヌナズナに形質転換し、ＢＺＦ１過剰発現形質転換植物を得た。
(Example 1) Introduction of a gene into a plant Isolation of a gene, a recombinant vector for gene introduction, and production of a transformed plant can be performed by known methods. In this example, Arabidopsis thaliana plant-derived BZF1 cDNA was isolated, a plant expression vector was prepared, and Agrobacterium was used to transform Arabidopsis thaliana to obtain a BZF1-overexpressing transformed plant.
（１）ＢＺＦ１遺伝子のクローニング
シロイヌナズナ幼植物体より全ＲＮＡを抽出し、これを鋳型にして、 オリゴ（ｄＴ）を用い、逆転写酵素を作用させて、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。この１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー：5’-CACCATGGGGAAGAAGAAGTGCGAGTTATG-3’(配列番号６)、リバースプライマー：5’-TCAATAAAACGAAGACGACGATGATG-3’(配列番号７)を用いてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡを単離した。ＰＣＲの条件は９８℃３０秒、（９８℃１０秒、５２−７０℃３０秒、７２℃２５秒）×３０サイクル、７２℃１０分の後、４℃で保持した。増幅した断片は、約６５０ｂｐであり、目的の長さであった。ｃＤＮＡのエントリーベクターへのクローニングは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯクローニングキットを用いて行った。マニュアルに従って、フォワードプライマーは、ATGの前にCACC配列を付加したものを用いた。
(1) Cloning of BZF1 gene Total RNA was extracted from Arabidopsis seedlings, and using this as a template, oligo (dT) was used and reverse transcriptase was allowed to act to synthesize single-stranded cDNA. Using this single-stranded cDNA as a template, PCR was carried out using forward primer: 5′-CACCATGGGGAAGAAGAAGTGCGAGTTATG-3 ′ (SEQ ID NO: 6), reverse primer: 5′-TCAATAAAACGAAGACGACGATGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 7), and cDNA was isolated. Released. PCR conditions were 98 ° C. for 30 seconds, (98 ° C. for 10 seconds, 52-70 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 25 seconds) × 30 cycles, 72 ° C. for 10 minutes, and then maintained at 4 ° C. The amplified fragment was about 650 bp and was the desired length. Cloning of the cDNA into the entry vector was performed using the pENTR / D-TOPO cloning kit from Invitrogen. In accordance with the manual, the forward primer with the CACC sequence added before ATG was used.
（２）ＢＺＦ１遺伝子の植物発現ベクターの作成
ＢＺＦ１遺伝子を植物で構成的に発現させるための植物発現ベクターは以下のように作製した。上記（１）で得られたＢＺＦ１遺伝子の完全長ｃＤＮＡを含んだエントリークローンと、発現ベクター（デスティネーションベクターｐＫ２ＧＷ７、Karimiら(2002)Trends in Plant Science;7(5):193-195）を混合し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅｗａｙＰＣＲクローニングシステムのマニュアルに従ってＬＲ反応によりＢＺＦ１遺伝子の完全長ｃＤＮＡを含んだ発現クローンを得た。構築されたＢＺＦ１遺伝子高発現ベクター（ｐＫ２ＧＷ７−Ｐ３５Ｓ：：ＢＺＦ１）は、図１に示すように、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域、本発明のＢＺＦ１ｃＤＮＡをコードするポリヌクレオチドおよびＣａＭＶ３５Ｓターミネーター領域を含む。これを以後のシロイヌナズナへの遺伝子導入に用いた。
(2) Preparation of plant expression vector of BZF1 gene A plant expression vector for constitutively expressing the BZF1 gene in plants was prepared as follows. Entry clone containing the full-length cDNA of BZF1 gene obtained in (1) above and an expression vector (destination vector pK2GW7, Karimi et al. (2002) Trends in Plant Science; 7 (5): 193-195) An expression clone containing the full-length cDNA of the BZF1 gene was obtained by LR reaction according to the manual of Gateway PCR cloning system of Invitrogen. As shown in FIG. 1, the constructed BZF1 gene high expression vector (pK2GW7-P35S :: BZF1) includes a CaMV35S promoter region, a polynucleotide encoding the BZF1 cDNA of the present invention, and a CaMV35S terminator region. This was used for subsequent gene transfer into Arabidopsis thaliana.
（３）ＢＺＦ１遺伝子のシロイヌナズナへの導入
上記（２）にて構築した発現ベクターをｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ法により、アグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢＡ４４０４株に導入した。なお遺伝子の導入はコロニーＰＣＲにより確認した。形質転換用シロイヌナズナは、２２℃、連続明条件で栽培し、摘心を行って腋芽の数を増加させた。感染の前日には、蕾を残して、鞘と開花した花は取り除いた。
一方、形質転換したアグロバクテリウムを、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンと２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＹＥＰ培地およびＹＥＢ培地を用いて、２８℃で２４時間程度前培養した後、２７℃で２４時間程度本培養を行った。得られた培養液を集菌し、形質転換用培地に懸濁した。
Ｆｌｏｒａｌ−ｄｉｐ法(Clough and Bent,1998)に従って、蕾を懸濁液に約1分浸した。処理後の植物はラップで乾燥を防ぎ、２２℃連続明条件に一晩おいた後に、土に水を通して懸濁液を希釈した。同条件下でそのまま生育を行い、Ｔ１種子を得た。Ｔ１種子は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＭＳ培地を用いて、２２℃、連続明条件で発芽・生育させることによって選抜を行った。このＴ１植物からＴ２種子を得た。Ｔ２種子は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭＳ培地を用いて、２２℃連続明条件のもとで発芽・生育させることによって選抜を行った。このＴ２植物からＴ３種子、Ｔ３植物からＴ４種子を得た。Ｔ３種子及びＴ４種子は、上記のＴ２種子選抜と同様にカナマイシン選抜を行った。Ｔ３またはＴ４世代の形質転換植物を以下の実験に用いた。
(3) Introduction of BZF1 gene into Arabidopsis thaliana The expression vector constructed in (2) above was introduced into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain by the freeze-thaw method. The introduction of the gene was confirmed by colony PCR. Arabidopsis thaliana for transformation was cultivated under continuous light conditions at 22 ° C., and subjected to pinching to increase the number of buds. The day before the infection, the pods and flowered flowers were removed, leaving the buds.
On the other hand, transformed Agrobacterium was pre-cultured at 28 ° C. for about 24 hours using YEP medium and YEB medium containing 100 μg / ml spectinomycin and 200 μg / ml streptomycin, and then at 27 ° C. for 24 hours. Main culture was performed to a certain extent. The obtained culture broth was collected and suspended in a transformation medium.
According to the Floral-dip method (Clough and Bent, 1998), the soot was immersed in the suspension for about 1 minute. The treated plants were prevented from drying with wraps, and after overnight in 22 ° C. continuous light conditions, the suspension was diluted by passing water through the soil. Growing as it was under the same conditions, T1 seeds were obtained. T1 seeds were selected by germination and growth under continuous light conditions at 22 ° C. using MS medium containing 50 μg / ml kanamycin and 100 μg / ml carbenicillin. T2 seeds were obtained from this T1 plant. T2 seeds were selected by germination and growth under a continuous light condition at 22 ° C. using an MS medium containing 50 μg / ml kanamycin. T3 seeds were obtained from this T2 plant, and T4 seeds were obtained from the T3 plant. T3 seed and T4 seed were subjected to kanamycin selection in the same manner as T2 seed selection described above. Transformed plants of T3 or T4 generation were used for the following experiments.
（４）形質転換植物におけるＢＺＦ１遺伝子の発現
ＢＺＦ１遺伝子を導入した形質転換植物７系統（＃１−３、＃１１−６、＃１２−７、＃１３−３、＃１４−３、＃１５−１、＃１６−７）およびコントロール形質転換植物（ＧＵＳ）及び野生型植物（Ｃｏｌ−０）から全ＲＮＡを抽出し、０．５μｇを鋳型に用い、オリゴ（ｄＴ）,逆転写酵素を作用させて、１本鎖ｃＤＮＡを合成した。この1本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、フォワードプライマー：5’-CACCATGGGGAAGAAGAAGTGCGAGTTATG-3’(配列番号６)、リバースプライマー：5’-TCAATAAAACGAAGACGACGATGATG-3’(配列番号７)を用いてＰＣＲを行った結果を図２に示す。この結果から、形質転換植物７系統すべてが導入遺伝子を高レベルで発現していることが示された
(4) Expression of BZF1 gene in transformed plant Seven transformed plant lines into which BZF1 gene has been introduced (# 1-3, # 11-6, # 12-7, # 13-3, # 14-3, # 15- 1, # 16-7), total RNA was extracted from control transformed plant (GUS) and wild type plant (Col-0), 0.5 μg was used as a template, and oligo (dT) and reverse transcriptase were allowed to act. Single-stranded cDNA was synthesized. Results of PCR using this single-stranded cDNA as a template and forward primer: 5'-CACCATGGGGAAGAAGAAGTGCGAGTTATG-3 '(SEQ ID NO: 6), reverse primer: 5'-TCAATAAAACGAAGACGACGATGATG-3' (SEQ ID NO: 7) It is shown in 2. This result showed that all seven transgenic plants expressed the transgene at a high level.
（実施例２） 形質転換シロイヌナズナ植物の乾燥耐性
ＢＺＦ１形質転換植物（＃１−３）、コントロール形質転換植物（ＧＵＳ）及び野生型植物（Ｃｏｌ−０）を、連続光のもとで、人工土壌で播種後１７日栽培した後、１５日間、灌水を停止して乾燥させた。この後、灌水を再開し、５日後の生存率を調べた。その結果、図３のように、コントロール形質転換植物と野生型植物は灌水停止後１３日〜１５日で植物体地上部はほぼ萎れた状態となり、灌水を再開しても回復せずにそのまま枯死するが、ＢＺＦ１形質転換体は灌水停止後１３日では萎れず、１５日後にやっと地上部が萎れはじめた。その後灌水再開すると回復し、再び正常な生育を示した。これらの結果から、ＢＺＦ１遺伝子を高レベルで発現させることによって、形質転換植物が乾燥耐性を獲得することが示された。また、形質転換植物は生育や形態上の異常は認められないことから、ＢＺＦ１遺伝子の過剰発現は植物の生育等には悪影響を及ぼさないと考えられた。
すなわち、潅水を停止して乾燥させると、ＢＺＦ１形質転換植物は、野生型植物やＧＵＳ形質転換植物に比べると植物体地上部の萎れが遅く、乾燥に対して耐性を示す。また、野生型植物やコントロール形質転換植物の大部分が萎れる乾燥状態で潅水を再開すると野生型植物とコントロール形質転換植物は回復せずにそのまま枯死するが、ＢＺＦ１形質転換体の大部分は回復し、再び正常な生育を示すようになった。
(Example 2) Drought tolerance of transformed Arabidopsis plants BZF1 transformed plant (# 1-3), control transformed plant (GUS) and wild type plant (Col-0) were subjected to artificial soil under continuous light. After sowing, the irrigation was stopped and dried for 15 days. Thereafter, irrigation was resumed, and the survival rate after 5 days was examined. As a result, as shown in FIG. 3, in the control transformed plant and the wild type plant, the above-ground part of the plant body was almost wilted 13 to 15 days after the irrigation was stopped, and it died without being recovered even after the irrigation was resumed. However, the BZF1 transformant did not wilt 13 days after stopping irrigation, and finally the ground part began to wilt 15 days later. After that, when irrigation was resumed, it recovered and showed normal growth again. From these results, it was shown that by expressing the BZF1 gene at a high level, the transformed plant acquires drought tolerance. In addition, since no abnormalities in growth or morphology were observed in the transformed plants, it was considered that overexpression of the BZF1 gene does not adversely affect the growth of plants.
That is, when irrigation is stopped and dried, BZF1-transformed plants have a slower wilt of the plant body than wild-type plants and GUS-transformed plants, and are resistant to drying. In addition, when irrigation is resumed in the dry state where most of the wild type plants and control transformed plants are wilted, the wild type plants and control transformed plants die without being recovered, but most of the BZF1 transformants are recovered. Once again, normal growth began.
（実施例３） 形質転換シロイヌナズナ植物の花芽形成の遅延
ＢＺＦ１形質転換植物を、野生型植物（Ｃｏｌ−０）やコントロール形質転換植物（ＧＵＳ）と共に、長日条件で栽培した。図４の（Ａ）は、４９日後の、野生型植物、コントロール形質転換植物、ＢＺＦ１形質転換植物の状態を示す。ＢＺＦ１形質転換植物は、野生型植物（Ｃｏｌ−０）やコントロール形質転換植物と比較して花芽形成が遅延し、一方、展開する本葉は厚みがあり、かつ枚数も野生型植物やコントロール形質転換植物に比べて多くなった。
図４の（Ｂ）は、それぞれの植物における、花茎が抽苔するまでの本葉の枚数を６〜１２個体について調べた結果を示す。ＢＺＦ１形質転換植物の２系統（＃１−３−１、＃１１−６）では、それぞれ平均１８．１枚、及び１３．８枚であるのに対して、野生型植物では平均１０．３枚、コントロール形質転換植物では平均１０．０枚であり、ＢＺＦ１形質転換植物における１．４〜１．８倍程度の本葉の枚数増加を確認した。
(Example 3) Delayed flower bud formation of transformed Arabidopsis plants BZF1 transformed plants were cultivated under long-day conditions together with wild type plants (Col-0) and control transformed plants (GUS). (A) of FIG. 4 shows the state of the wild type plant, the control transformed plant, and the BZF1 transformed plant after 49 days. BZF1-transformed plants have delayed flower bud formation compared to wild-type plants (Col-0) and control-transformed plants, while the developing true leaves are thick and the number of wild-type plants and control-transformed plants Increased compared to plants.
(B) of FIG. 4 shows the result of examining the number of true leaves in each plant until the flower stems are extracted for 6 to 12 individuals. In the two lines of BZF1 transformed plants (# 1-3-1 and # 11-6), the average is 18.1 and 13.8, respectively, whereas in the wild type plant, the average is 10.3 The average number of control transformed plants was 10.0, and an increase in the number of true leaves by about 1.4 to 1.8 times in the BZF1 transformed plants was confirmed.
(実施例４) 形質転換シロイヌナズナ植物の花芽形成のバイオマス生産量の増大
同様に、野生型植物（Ｃｏｌ−０）、コントロール形質転換植物（ＧＵＳ）、ＢＺＦ１形質転換植物（＃１−３−１、＃１１−６）について、長日条件で栽培した植物体を用いて抽苔時の植物体の地上部（花茎を除いた部分）の生重量を測定した。この時期は、およそＳｔａｇｅ６．００〜６．１０(Boyes et al.,Plant Cell,13:1499-1510(2001))の生育段階に相当する。ここで、Ｓｔａｇｅ６．００〜６．１０とは、１番花の開花から最終的に開花した全花の１０％に相当する開花が終了するまでの期間を指す。
図７に示されるように、野生型植物、及びコントロール形質転換植物がそれぞれ０．３０ｇ、及び０．３４ｇであるのに対し、ＢＺＦ１形質転換植物２系統（＃１−３−１、＃１１−６）は、それぞれ１．０３ｇ、及び１．３２ｇであり、ＢＺＦ１形質転換植物では、３〜４倍もの生重量を示した。この結果から、ＢＺＦ１遺伝子の過剰発現により、花芽形成が遅延すると同時にバイオマス生産量が向上することが示された。
(Example 4) Increase in biomass production of flower bud formation of transformed Arabidopsis plants Similarly, wild type plants (Col-0), control transformed plants (GUS), BZF1 transformed plants (# 1-3-1, About # 11-6), the raw weight of the above-ground part (part except a flower stem) of the plant body at the time of mashing was measured using the plant body cultivated on long day conditions. This time corresponds approximately to the growth stage of Stage 6.00 to 6.10 (Boyes et al., Plant Cell, 13: 1499-1510 (2001)). Here, Stage 6.00 to 6.10 indicates a period from the first flowering to the end of the flowering corresponding to 10% of all the flowers finally flowered.
As shown in FIG. 7, the wild-type plant and the control transformed plant are 0.30 g and 0.34 g, respectively, whereas two BZF1 transformed plants (# 1-3-1, # 11- 6) were 1.03 g and 1.32 g, respectively, and the BZF1 transformed plant showed 3 to 4 times as much raw weight. From this result, it was shown that by overexpression of the BZF1 gene, flower bud formation is delayed and biomass production is improved.
本発明のＢＺＦ１遺伝子の発現が高められた形質転換植物では、乾燥耐性が向上し、環境ストレス条件下での植物バイオマス生産の効率化、栽培の省力化と節水化、栽培地域の拡大などが可能となる。乾燥地域の緑化への効果も期待される。また、花芽形成を遅延させることができるので、寿命が延長し、植物バイオマスの生産量の向上が期待される。さらに乾燥耐性の向上と共に花芽形成も遅延させることができるので、寿命が延長し、かつ乾燥ストレスに耐性であることによって、植物バイオマス生産の効率化、栽培の省力化と節水化、栽培地域の拡大などが可能となる。また、より多くの二酸化炭素を同化して、植物バイオマス生産の収量が増加することが期待される。伝統的な農林業における植物生産だけでなく、ビルの屋上や植物工場など人工気象条件における生産効率の増大、栽培の省力化・省資源化にも利用出来る。生産される植物バイオマスの利用の形態としては、伝統的な農林業の生産物の利用の仕方に加え、バイオマス燃料やバイオプラスチックの原料としての利用も考えられる。また、植物体内で合成・蓄積される種々の有用物質の生産性の向上にも有効である。さらに、収穫した植物体や植物体の一部の寿命の延長や鮮度の保持の向上により、商品価値の減少の軽減、輸送や貯蔵コストの低減に利用できる。 In the transformed plant with enhanced expression of the BZF1 gene of the present invention, drought tolerance is improved, and it is possible to improve the efficiency of plant biomass production under environmental stress conditions, save labor and save water, expand the cultivation area, etc. It becomes. The effect on greening in arid areas is also expected. In addition, since flower bud formation can be delayed, the lifespan is extended and the production amount of plant biomass is expected to be improved. In addition, the improvement of drought tolerance and flower bud formation can be delayed, so that the lifespan is extended and resistance to drought stress increases the efficiency of plant biomass production, labor saving and water saving in cultivation, and expansion of cultivation areas. It becomes possible. Also, assimilation of more carbon dioxide is expected to increase the yield of plant biomass production. In addition to plant production in traditional agriculture and forestry, it can be used to increase production efficiency under artificial weather conditions such as the rooftop of buildings and plant factories, and to save labor and resources in cultivation. As a form of utilization of plant biomass to be produced, utilization as a raw material for biomass fuel and bioplastics is conceivable in addition to the use of traditional agricultural and forestry products. It is also effective in improving the productivity of various useful substances synthesized and accumulated in plants. Furthermore, by extending the life span of a harvested plant or part of the plant and improving the maintenance of freshness, it can be used for reducing the reduction in commercial value and reducing transportation and storage costs.
Claims (3)
(a)配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
(b)配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
(c)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
(d)配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。 An agent for improving drought tolerance of a plant and delaying flower bud formation, comprising as an active ingredient a recombinant DNA containing a DNA encoding a BZF-I transcription factor, or a vector into which the recombinant DNA has been inserted. A drug wherein the DNA encoding the BZF-I transcription factor is derived from Arabidopsis and is any one selected from the following (a) to (d) ;
(a) DNA comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(b) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(c) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(d) A DNA encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 .
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