JP5085120B2 - Brain function improver - Google Patents

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Description

本発明は、脳機能改善作用を有する黒霊芝の特定の成分を含有することを特徴とする医薬品、医薬部外品または食品に関する。   The present invention relates to a pharmaceutical, a quasi-drug or a food comprising a specific component of black ganoderma having a brain function improving action.

高齢化社会を迎えた現代において、老人性痴呆患者の増加は大きな社会問題となってきている。痴呆の症状は、人によって様々であるが、共通して見られる症状として、記憶傷害、見当識障害、判断力・思考力・実行機能の低下等が挙げられる。   In today's aging society, the increase in senile dementia patients has become a major social problem. Symptoms of dementia vary from person to person, but common symptoms include memory injury, disorientation, reduced judgment, thinking, and executive function.

痴呆は、その原因によってアルツハイマー型痴呆症と脳血管性痴呆症に大別することができる。例えば、脳血管性痴呆は、脳梗塞によって脳の血管が詰まり、脳の組織が破壊されることによって起こる。そのため、脳血管性痴呆症においては、脳梗塞を起こす原因となった動脈硬化、高血圧、高脂血症、糖尿病等の治療・予防が重要であり、これを通じて痴呆の進行を遅らせる治療方法が採られている。   Dementia can be broadly classified into Alzheimer type dementia and cerebrovascular dementia according to the cause. For example, cerebral vascular dementia occurs when brain blood vessels are clogged by cerebral infarction and brain tissue is destroyed. Therefore, in cerebrovascular dementia, it is important to treat and prevent arteriosclerosis, hypertension, hyperlipidemia, diabetes, etc. that caused cerebral infarction, and treatment methods that delay the progression of dementia through this are taken. It has been.

一方、痴呆患者の多くを占めているといわれるアルツハイマー型痴呆症は、原因が未だはっきりと解明されていないが、その患者には、脳内の神経の伝達物質であるアセチルコリンのレベルの低下が認められることから、コリン作動性神経の機能低下が原因の一つであると考えられている(例えば、非特許文献1参照)。そのため、アルツハイマー型痴呆症においては、アセチルコリンの濃度を高めてコリン作動性神経の機能低下を防ぐことを目的とする治療方法が主流となっている。すなわち、アセチルコリンは、アセチルコリントランスフェラーゼによって合成されて、アセチルコリンエステラーゼにより分解されることにより、一定の濃度に保たれているため、アセチルコリンエステラーゼの活性を阻害してアセチルコリンの分解を抑制し、アセチルコリンの減少を抑える方法である。この方法では、症状を完全に治療することはできないものの、症状を改善したり、症状の進行を遅らせることができることが分かっている。
Neurodegeneration,4,349−356(1995)
On the other hand, the cause of Alzheimer-type dementia, which is said to occupy most dementia patients, has not been clearly elucidated, but the patient has a decreased level of acetylcholine, a neurotransmitter in the brain. Therefore, it is considered that one of the causes is a decrease in the function of cholinergic nerves (see, for example, Non-Patent Document 1). Therefore, in Alzheimer-type dementia, treatment methods aiming at preventing the functional deterioration of cholinergic nerves by increasing the concentration of acetylcholine have become mainstream. In other words, since acetylcholine is synthesized by acetylcholine transferase and decomposed by acetylcholinesterase and maintained at a constant concentration, the activity of acetylcholinesterase is inhibited to suppress acetylcholine degradation and reduce acetylcholine. It is a method to suppress. Although this method cannot completely treat symptoms, it has been found that symptoms can be improved or the progression of symptoms can be delayed.
Neurodegeneration, 4, 349-356 (1995)

現在、アルツハイマー型痴呆症の治療薬として、例えば、タクリン、ドネペジル等のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤が市販されている。   Currently, for example, acetylcholinesterase inhibitors such as tacrine and donepezil are commercially available as therapeutic agents for Alzheimer-type dementia.

しかしながら、上記のタクリン、ドネペジル等のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤は、肝臓毒性や強い副作用を有するため、長期間服用できず、また高価であるという問題があった。   However, the above-mentioned acetylcholinesterase inhibitors such as tacrine and donepezil have problems that they cannot be taken for a long period of time and are expensive because of their liver toxicity and strong side effects.

また、天然物からもアセチルコリンエステラーゼを阻害する成分を探索し、痴呆症の治療を目指す研究がなされている(特許文献1、2)。
特開2006−131589号公報 特開2003−286164号公報
In addition, research has been conducted to search for components that inhibit acetylcholinesterase from natural products and to treat dementia (Patent Documents 1 and 2).
JP 2006-131589 A JP 2003-286164 A

プロリルエンドペプチダーゼはプロリンを含むペプチドのプロリンのカルボキシル側を特異的に切断する酵素で、記憶の固定場所とされている脳の海馬部分に高い活性がみられるほか、動物臓器に広く分布することが知られている(非特許文献2〜4)。また、同様の酵素がフラボバクテリウム属細菌からも発見されている(非特許文献5)。
Science,173,827(1971) Molecular&Cellular Biochemistry,30,111(1980) 日本農芸化学会誌,58,1147(1984) J.Biol.Chem.,255,4786(1980)
Prolyl endopeptidase is an enzyme that specifically cleaves the carboxyl side of proline in peptides containing proline, and has high activity in the hippocampal part of the brain, which is a fixed place of memory, and it is widely distributed in animal organs Is known (Non-Patent Documents 2 to 4). Similar enzymes have also been discovered in Flavobacterium bacteria (Non-Patent Document 5).
Science, 173, 827 (1971) Molecular & Cellular Biochemistry, 30, 111 (1980) Japanese Journal of Agricultural Chemistry, 58, 1147 (1984) J. et al. Biol. Chem. , 255, 4786 (1980)

本酵素は神経伝達物質とされているサブスタンスPやニューロテンシン、記憶に関係していると考えられるTHR(甲状腺刺激ホルモン)やステップスルー型受動的回避学習法で記憶保持活性があるとされている脳内バソプレシンに作用し、不活性化することが知られている(非特許文献6、7)。バソプレシンは腎臓で水分再吸収に働くペプチドホルモンであるが、脳内においては学習、記憶の過程にも関与しており、このホルモンの分解能が不活性化されると記憶保持に障害が現れるといわれている。また、痴呆症患者のバソプレシン量は、正常人のそれより少ないことが知られている(非特許文献8)。
Science,221,1310(1983) Nature,308,276(1984) BIOINDUSTRY,4,788(1987)
This enzyme is said to have memory retention activity in substance P and neurotensin, which are considered to be neurotransmitters, THR (Thyroid Stimulating Hormone), which is thought to be related to memory, and the step-through passive avoidance learning method It is known to act on brain vasopressin and inactivate it (Non-Patent Documents 6 and 7). Vasopressin is a peptide hormone that plays a role in water reabsorption in the kidney, but it is also involved in the learning and memory processes in the brain, and it is said that memory retention is impaired when the resolution of this hormone is inactivated. ing. Moreover, it is known that the amount of vasopressin in patients with dementia is less than that of normal persons (Non-patent Document 8).
Science, 221, 1310 (1983) Nature, 308, 276 (1984) BIOINDUSTRI, 4,788 (1987)

健康人では脳でのPEPが正常に働いているが、何らかの理由で調節機構がはずれるとバソプレシンが必要以上に分解され、記憶保持に傷害が現れる。従って、本酵素の活性を阻害することによる痴呆症の治療を目指す研究がなされている(特許文献3〜7)。
特許第3148739号 特開2006−28091号公報 特開2006−96709号公報 特開2002−265377号公報 特開2001−64197号公報
In healthy individuals, PEP in the brain works normally, but if the regulatory mechanism is lost for some reason, vasopressin is degraded more than necessary, and memory retention appears injured. Therefore, research aimed at treating dementia by inhibiting the activity of this enzyme has been made (Patent Documents 3 to 7).
Japanese Patent No. 31483939 JP 2006-28091 A JP 2006-96709 A JP 2002-265377 A JP 2001-64197 A

黒霊芝は、担子菌類ヒダナシタケ目サルノコシカケ科マンネンタケ属に属し、マンネンタケの一種である。マンネンタケの代表として、赤霊芝(霊芝)が一般的であり、中国の薬学古書である「神農本草経」に「知恵を増し、忘れなくする」と記載されている(非特許文献9)。また、赤霊芝の長期間投与で学習・記憶機能の増強や保持が認められている(非特許文献10)。しかし、黒霊芝の脳機能改善作用に関しては報告されていない。
難波恒雄著 「原色和漢薬図鑑(下)」 保育社、1980年 和漢医薬学会誌 7,388(1990)
Black ganoderma belongs to the genus Amanentake, a member of the family Basidiomycete, Amanitatake. Red ganoderma (Ganoderma lucidum) is common as a representative of Mannentake, and it is described in Chinese ancient pharmacology book “Shinnohon Honsokei” as “increase wisdom and do not forget” (Non-patent Document 9). . In addition, it has been recognized that learning and memory functions are enhanced and maintained by long-term administration of red ganoderma (Non-patent Document 10). However, no report has been made on the effect of black ganoderma on improving brain function.
Namba Tsuneo "Primary Japanese and Chinese medicine picture book (below)" Childcare, 1980 Journal of the Japan Society for Pharmaceutical Sciences 7,388 (1990)

一般にマンネンタケは、赤霊芝(霊芝)、白霊芝、黄霊芝、紫霊芝、青霊芝の他、黒霊芝(黒芝)があげられ、これらは子実体の色が赤、白、黄、紫、青、黒であることから単純に命名されたものであるが、最近では、黒霊芝は赤霊芝、紫霊芝などと区別して研究されている。例えば、非特許文献2によると、黒霊芝には赤霊芝や紫霊芝に含有する代表的なトリテルペン成分(ガノデリン酸類)は含有されず、味も全く異なると報告されている。以上のことから、黒霊芝の薬効について更に深く研究する余地があった。   In general, there are red ganoderma (ganoderma), white ganoderma, yellow ganoderma, purple ganoderma, blue ganoderma as well as black ganoderma (black turf). Although it is simply named because it is white, yellow, purple, blue and black, recently, black ganoderma has been studied separately from red ganoderma and purple ganoderma. For example, according to Non-Patent Document 2, it is reported that black ganoderma does not contain a typical triterpene component (ganoderic acid) contained in red ganoderma or purple ganoderma and has a completely different taste. From the above, there was room for further research on the medicinal effects of black ganoderma.

また、赤霊芝とは学名も成分も異なる、黒霊芝中に含有する特定成分の脳機能改善効果については従来全く知られていなかった。   Also, the brain function improving effect of a specific component contained in black ganoderma which has a different scientific name and component from red ganoderma has never been known.

本発明は、アセチルコリンエステラーゼおよびプロリルエンドペプチダーゼに対して阻害活性を有する、脳機能改善剤を得ることを目的とする。   An object of the present invention is to obtain a brain function improving agent having inhibitory activity against acetylcholinesterase and prolyl endopeptidase.

この様な事情により、本発明者らは鋭意研究検討した結果、主として黒霊芝に含有する特定成分に非常に高いアセチルコリンエステラーゼ及びプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を示すことを発見し、また実験的痴呆症モデルを用いた動物実験においても、高い記憶学習能改善作用を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。   Under these circumstances, the present inventors have intensively studied and found that specific components mainly contained in black ganoderma have a very high inhibitory action on acetylcholinesterase and prolyl endopeptidase, and experimental dementia. In an animal experiment using a symptom model, it has been found that it has a high memory learning ability improving effect, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明の脳機能改善剤に含まれる黒霊芝の特定成分は、次の事項によって特徴付けられるものである。
(1)赤外吸収スペクトルを測定すると(KBr法)、2925、1700、1600、1455、1170、835cm−1に吸収の極大を示す。
(2)上記黒霊芝の成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、280〜330nmに吸収の極大を示す。
(3)分子内に芳香環を含有する。
(4)本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、主として茶色〜赤褐色を示す。
That is, the specific component of black ganoderma included in the brain function improving agent of the present invention is characterized by the following matters.
(1) When an infrared absorption spectrum is measured (KBr method), absorption maximums are shown at 2925, 1700, 1600, 1455, 1170, and 835 cm −1 .
(2) When the above-mentioned black ganoderma biloba components are dissolved in ethanol and the ultraviolet absorption spectrum is measured, the absorption maximum is shown at 280 to 330 nm.
(3) An aromatic ring is contained in the molecule.
(4) When ethyl acetate is added to this component, the ethyl acetate-soluble solution is colored and mainly brown to reddish brown.

上記のうち、(3)はH、13C−NMR分析により判別可能である。すなわち、溶媒を重メタノール(CDOD)を用いて測定した場合、6〜8ppm(H−NMR)、100〜150ppm(13C−NMR)に芳香族に置換した水素原子のスペクトル吸収が認められる。上記のスペクトル分析値は分析器、手法、ピークの幅広さなどにより、若干数値の誤差がある場合がある。(4)については、本成分約1〜10mgに酢酸エチル1mLを加えることで着色性を判別できる。 Among the above, (3) can be distinguished by 1 H, 13 C-NMR analysis. That is, when the solvent was measured using deuterated methanol (CD 3 OD), spectral absorption of hydrogen atoms substituted with aromatics at 6 to 8 ppm ( 1 H-NMR) and 100 to 150 ppm ( 13 C-NMR) was recognized. It is done. The above spectral analysis values may have some numerical errors depending on the analyzer, method, peak width, and the like. About (4), coloring property can be discriminate | determined by adding 1 mL of ethyl acetate to about 1-10 mg of this component.

また、黒霊芝の特定成分は、定法により加水分解を行うと、ヒドロキシケイヒ酸を遊離する性質がある。例えば、水酸化ナトリウム水溶液などを用いた定法より加水分解でき、HPLCなどで分析することで確認できる。   Moreover, the specific component of black ganoderma has the property of liberating hydroxycinnamic acid when hydrolyzed by a conventional method. For example, it can be hydrolyzed by a conventional method using an aqueous sodium hydroxide solution and can be confirmed by analysis with HPLC or the like.

黒霊芝の特定成分は、以下に示した高速液体クロマトグラフ(HPLC)により確認できる(図1参照)。黒霊芝の特定成分のHPLCチャートを示す。横軸は保持時間(分)、縦軸は強度を示す。本分析によれば、保持時間が約10〜25分の幅広のピーク群が黒霊芝の特定成分である(分析条件により、保持時間、パターンは若干変化することがある)。
(A)カラム:オクタデシル化シリカゲル(内径4.5mm×250mm)
(B)カラム温度:40℃
(C)展開溶媒:0.2%リン酸/0.2%リン酸を含有するアセトニトリルを用い、0.2%リン酸を含有するアセトニトリルを20%〜100%に20分かけて直線的に溶媒を変化させ、100%で25分保持する(計45分分析)。
(D)流速:1mL/分
(E)検出:313nm
(F)試料:10mg/mLのエタノール溶液を0.02mL導入
The specific component of black ganoderma can be confirmed by the high performance liquid chromatograph (HPLC) shown below (see FIG. 1). The HPLC chart of the specific component of black reishi is shown. The horizontal axis represents the retention time (minutes), and the vertical axis represents the intensity. According to this analysis, a broad peak group having a retention time of about 10 to 25 minutes is a specific component of black ganoderma (the retention time and pattern may vary slightly depending on the analysis conditions).
(A) Column: Octadecylated silica gel (inner diameter 4.5 mm × 250 mm)
(B) Column temperature: 40 ° C
(C) Developing solvent: 0.2% phosphoric acid / 0.2% phosphoric acid-containing acetonitrile was used, and 0.2% phosphoric acid-containing acetonitrile was linearly changed from 20% to 100% over 20 minutes. Change solvent and hold at 100% for 25 minutes (total 45 minutes analysis).
(D) Flow rate: 1 mL / min (E) Detection: 313 nm
(F) Sample: 0.02 mL of 10 mg / mL ethanol solution introduced

本発明に用いられる黒霊芝は、マンネンタケ科(Ganodermataceae)、マンネンタケ属(Ganoderma)に属し、学名は、G.atrum、G.japonicum、G.sinenseなどといわれている。また、マンネンタケ属のキノコについては、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」には、黒霊芝(黒芝)のほか、赤霊芝(霊芝)、紫霊芝(紫芝)、青霊芝(青芝)、黄霊芝(黄芝)及び白霊芝(白芝)が存在すると記載されている。黒霊芝は広く中国や日本市場などで流通しているものを用いることができるし、自生品や栽培品を用いても良い。   The black ganoderma used in the present invention belongs to the family Ganodermaaceae and Ganoderma, and the scientific name is G. atrum, G. et al. japonicum, G. et al. It is said to be sinsense. In addition, for mushrooms belonging to the genus Amanita, there are old Chinese pharmacy books, “Honcho Tsuname” and “Shinnohonsoku”, in addition to black ganoderma (Kuroshiba), red ganoderma (ganoderma), purple ganoderma ( Purple turf), blue ganoderma (blue turf), yellow ganoderma (yellow turf) and white ganoderma (white turf) are described. Black reishi can be widely distributed in China, the Japanese market, etc., or it can use native or cultivated products.

なお、黒霊芝は紫霊芝と外観が似ているために紫霊芝として市場に流通していることもある。この場合、例えば、上記の条件で高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析することにより、黒霊芝の特定成分の検出が可能であり、本発明の範囲に属するものとする。   In addition, black ganoderma has a similar appearance to purple ganoderma, so it is sometimes marketed as purple ganoderma. In this case, for example, by performing high performance liquid chromatography (HPLC) analysis under the above conditions, it is possible to detect a specific component of black ganoderma and belongs to the scope of the present invention.

本発明に用いられる黒霊芝は、子実体、菌糸体、天産物、栽培物、培養物などを問わず使用することができる。また、必要に応じてそのままの状態、破砕物、乾燥物などを適宜選択して抽出操作に付することができる。   The black ganoderma used in the present invention can be used regardless of fruiting bodies, mycelium, natural products, cultivated products, cultured products and the like. Moreover, the state as it is, a crushed material, a dried material, etc. can be selected suitably as needed, and it can attach to extraction operation.

本発明の薬効成分の抽出方法の一例として、好ましくは黒霊芝の子実体を溶媒抽出することにより得ることができる。   As an example of the method for extracting medicinal components of the present invention, it can be preferably obtained by solvent extraction of the fruit body of black ganoderma.

抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類(メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−ブタノールなど)、液状多価アルコール(1,3−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなど)、ケトン類(アセトン、メチルエチルケトンなど)、アセトニトリル、エステル類(酢酸エチル、酢酸ブチルなど)、炭化水素類(ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルなど)、エーテル類(エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテルなど)が挙げられる。好ましくは、低級アルコール、ケトン類、アセトニトリル、エステル類などや、これらの含水溶媒が良く、特に好ましくは、安全性の面からエタノール又は含水エタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。また、塩基性下で抽出することも好ましい。   Examples of the solvent to be extracted include water, lower alcohols (methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, etc.), liquid polyhydric alcohols (1,3-butylene glycol, propylene glycol). ), Ketones (acetone, methyl ethyl ketone, etc.), acetonitrile, esters (ethyl acetate, butyl acetate, etc.), hydrocarbons (hexane, heptane, petroleum ether, etc.), ethers (ethyl ether, tetrahydrofuran, propyl ether, etc.) Etc.). Preferably, lower alcohols, ketones, acetonitrile, esters, and the like and water-containing solvents thereof are preferable, and ethanol or water-containing ethanol is particularly preferable from the viewpoint of safety. These solvents may be used alone or in combination of two or more. It is also preferable to extract under basic conditions.

黒霊芝の特定成分をさらに精製する方法として、互いに混合しない溶媒で液・液分配抽出により溶媒分画精製することもできる。   As a method for further purifying specific components of black ganoderma, solvent fraction purification can also be performed by liquid / liquid partition extraction with solvents that are not mixed with each other.

液・液分配抽出に用いる溶媒としては、上記の溶媒を用いることが可能である。例えば、(水又は含水アルコール)・炭化水素系、(水又は含水アルコール)・エーテル系、(水又は含水アルコール)・エステル系、水・ブタノール系などを採用できる。上記にとらわれず、互いに混合しない溶媒系であれば採用できる。好ましくは、溶媒抽出物(固形物)に含水低級アルコールと炭化水素溶媒を加えて抽出し、炭化水素溶媒可溶分を除去した残液にエステル溶媒を加えて抽出することにより黒霊芝の特定成分を精製することができる。また、酸や塩基による分別抽出を行うこともできる。   As the solvent used for liquid / liquid partition extraction, the above-mentioned solvents can be used. For example, (water or water-containing alcohol) / hydrocarbon type, (water or water-containing alcohol) / ether type, (water or water-containing alcohol) / ester type, water / butanol type, etc. can be employed. It is not limited to the above, and any solvent system that does not mix with each other can be adopted. Preferably, extraction is performed by adding water-containing lower alcohol and hydrocarbon solvent to the solvent extract (solid), and adding the ester solvent to the remaining liquid from which the hydrocarbon solvent soluble matter has been removed, to identify black reishi. The components can be purified. Moreover, fractional extraction with an acid or a base can also be performed.

黒霊芝の特定成分をさらに精製する方法として、黒霊芝抽出物又は上記の溶媒分画物を吸着剤に吸着させ、溶媒により溶出させることにより、特定成分を精製することができる。   As a method for further purifying the specific component of black ganoderma, the specific component can be purified by adsorbing the black ganoderma extract or the above solvent fraction to an adsorbent and eluting it with a solvent.

吸着剤としては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂、イオン交換樹脂、オクタデシル化シリカゲル(ODS)、シリカゲル、セルロース、デキストラン、修飾デキストランなどの吸着剤が挙げられる。中でも、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂やODSが好ましい。   Examples of the adsorbent include adsorbents such as styrene-divinylbenzene synthetic adsorption resin, ion exchange resin, octadecylated silica gel (ODS), silica gel, cellulose, dextran, and modified dextran. Of these, styrene-divinylbenzene synthetic adsorption resin and ODS are preferable.

吸着方法としては、吸着剤をカラムに充填し、これに抽出物の溶液を通す方法や、抽出物の溶液に吸着剤をそのまま混合する方法などがあるが、特に限定されない。   Examples of the adsorption method include, but are not particularly limited to, a method in which an adsorbent is packed in a column and the extract solution is passed through the column, and a method in which the adsorbent is directly mixed with the extract solution.

吸着剤の溶出溶媒としては、各吸着剤の特性により選択できるが、例えば、水、低級アルコール類(メタノール、エタノール、1−プロパノール、2−プロパノール、1−ブタノール、2−ブタノールなど)、液状多価アルコール(1,3−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなど)、ケトン類(アセトン、メチルエチルケトンなど)、アセトニトリル、エステル類(酢酸エチル、酢酸ブチルなど)、炭化水素類(ヘキサン、ヘプタン、石油エーテルなど)、エーテル類(エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテルなど)が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコールなどの溶媒が良く、特に好ましくは、水やエタノールが良い。これらの溶媒は一種でも二種以上を混合して用いても良い。更に、上記溶出溶媒に酸やアルカリを添加してpH調整して用いても良い。   The elution solvent for the adsorbent can be selected depending on the characteristics of each adsorbent, and includes, for example, water, lower alcohols (methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, etc.), liquid many Monohydric alcohol (1,3-butylene glycol, propylene glycol, glycerin, etc.), ketones (acetone, methyl ethyl ketone, etc.), acetonitrile, esters (ethyl acetate, butyl acetate, etc.), hydrocarbons (hexane, heptane, petroleum ether, etc.) ), Ethers (ethyl ether, tetrahydrofuran, propyl ether, etc.). A solvent such as water or a lower alcohol is preferable, and water or ethanol is particularly preferable. These solvents may be used alone or in combination of two or more. Furthermore, the pH may be adjusted by adding acid or alkali to the elution solvent.

上記抽出物や精製物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈
、ろ過、活性炭などによる脱色、脱臭、エタノール沈殿などの処理をして用いても良い。更には、抽出や精製した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥などの処理を行い、乾燥物として用いても良い。
The above extract or purified product may be used as it is, or may be used after treatment such as concentration, dilution, filtration, decolorization with activated carbon, deodorization, ethanol precipitation, etc., if necessary. Further, the extracted or purified solution may be subjected to a treatment such as concentration to dryness, spray drying, or freeze drying, and used as a dried product.

特に好ましい例を挙げると、上記の液・液分配抽出(上記の好ましいとされる溶媒系で抽出)を行なった後、上記の合成吸着樹脂(スチレン−ジビニルベンゼン系、上記の好ましいとされる溶媒で溶出)で精製して黒霊芝の特定成分を精製することができる。   As a particularly preferred example, after performing the above liquid / liquid partition extraction (extraction with the above preferred solvent system), the above synthetic adsorption resin (styrene-divinylbenzene system, the above preferred solvent). The specific components of black ganoderma can be purified by elution).

ただし、黒霊芝の特定成分は、使用目的に応じ、抽出物のままでも良いし、液・液分配抽出や吸着剤による精製を単独又は組み合わせることができる。   However, the specific component of black ganoderma may be used as an extract according to the purpose of use, or liquid / liquid partition extraction and purification with an adsorbent can be used alone or in combination.

本発明の脳機能改善剤には、上記抽出物や吸着剤などによる精製物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、希釈剤を用いることができ、希釈剤としては固体、液体、半固体でもよく、たとえば次のものがあげられる。すなわち、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、香料、保存料、溶解補助剤、溶剤などである。具体的には、乳糖、ショ糖、ソルビット、マンニット、澱粉、沈降性炭酸カルシウム、重質酸化マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、セルロース又はその誘導体、アミロペクチン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、界面活性剤、水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、カカオ脂、ラウリン脂、ワセリン、パラフィン、高級アルコールなどである。   As the brain function improving agent of the present invention, a purified product such as the above extract or adsorbent may be used as it is, and a diluent can be used as long as the effect of the extract is not impaired. May be solid, liquid or semi-solid, for example: That is, excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, fragrances, preservatives, solubilizers, solvents, and the like. Specifically, lactose, sucrose, sorbit, mannitol, starch, precipitated calcium carbonate, heavy magnesium oxide, talc, calcium stearate, magnesium stearate, cellulose or derivatives thereof, amylopectin, polyvinyl alcohol, gelatin, surface activity Agents, water, physiological saline, ethanol, glycerin, propylene glycol, cacao butter, laurin butter, petrolatum, paraffin, higher alcohol and the like.

本発明の脳機能改善剤は、医薬品、医薬部外品または食品のいずれにも用いることができ、その剤形としては、例えば、経口用として散剤、顆粒剤、錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、シロップ剤、丸剤、懸濁剤、液剤、乳剤などである。非経口用として注射液にすることが出来る。また、座薬とすることも出来る。   The brain function improving agent of the present invention can be used for any of pharmaceuticals, quasi drugs, and foods. Examples of the dosage form include powders, granules, tablets, sugar-coated tablets, capsules for oral use, Syrups, pills, suspensions, solutions, emulsions, etc. It can be an injection solution for parenteral use. It can also be a suppository.

本発明の脳機能改善剤の摂取量は、投与形態、使用目的、年齢、体重などによって異なるが黒霊芝の特定成分を含む抽出物や精製物に換算して、0.1〜5,000mg/日、好ましくは1〜500mg/日の範囲で1日1回から数回経口投与できる。もちろん前記したように、投与方法や投与量は種々の条件で変動するので、上記投与範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する場合もある。また、製剤化における脳機能改善剤の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。   The intake of the brain function improving agent of the present invention varies depending on the administration form, purpose of use, age, weight, etc., but is 0.1 to 5,000 mg in terms of an extract or purified product containing specific components of black ganoderma. / Day, preferably 1 to 500 mg / day orally once to several times a day. Of course, as described above, since the administration method and dose vary depending on various conditions, an amount smaller than the above-mentioned administration range may be sufficient, and administration may be performed beyond the range. In addition, the method for adding the brain function improving agent in the formulation may be added in advance or during the production, and may be appropriately selected in consideration of workability.

本発明の新規な黒霊芝の特定成分を含有する脳機能改善剤は、脳機能改善作用が非常に高かった。   The brain function improving agent containing the specific component of the new black ganoderma of the present invention has a very high brain function improving action.

本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる抽出物の製造例、本発明の処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量の部とは重量部をし、%は重量%を示す。 In order to describe the present invention in detail, examples of production of the extract used in the present invention, formulation examples of the present invention, and experimental examples are given as examples, but the present invention is not limited thereto. The part of the amount shown in the examples means part by weight, and% means% by weight.

製造例1 黒霊芝の熱水抽出物
黒霊芝子実体の乾燥物100gに2Lの精製水を加え、95〜100℃で2時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮後、凍結乾燥して、黒霊芝の熱水抽出物を5.4g得た。
Production Example 1 Black Lingzhi Hot Water Extract Add 2 L of purified water to 100 g of dried black reishi fruit bodies, extract at 95-100 ° C. for 2 hours, filter, concentrate the filtrate, and freeze-dry As a result, 5.4 g of a hot water extract of black ganoderma was obtained.

製造例2 黒霊芝の50%エタノール抽出物
黒霊芝子実体の乾燥物100gに精製水1L及びエタノール1Lを加え、常温で7日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して黒霊芝の50%エタノール抽出物を2.9g得た。
Production Example 2 50% Ethanol Extract of Black Reishi Shiba Add 1L of purified water and 1L of ethanol to 100g of dried Kuro Reishi fruiting bodies, extract at room temperature for 7 days, filter, concentrate the filtrate and freeze-dry As a result, 2.9 g of 50% ethanol extract of black ganoderma was obtained.

製造例3 黒霊芝のエタノール抽出物
黒霊芝子実体の乾燥物1Kgにエタノール15Lを加え、常温で7日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、黒霊芝のエタノール抽出物1を20g得た。
Production Example 3 Black Ganoderma Ethanol Extract Add 1 L of black ganoderma fruit body to 15 kg of ethanol, extract at room temperature for 7 days, filter and concentrate the filtrate to dryness. 20 g of extract 1 was obtained.

製造例4 黒霊芝のカラム精製物1
製造例1の黒霊芝子実体の熱水抽出物10.0gを精製水に溶解し、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂500mLを充填したカラムに通液した。次いで、精製水、10、20、50、80、90、100%エタノール各1Lで溶出させた後、それぞれを濃縮乾固した。黒霊芝の特定成分は、80%以上のエタノール画分に多く含まれており、80%以上のエタノール画分をまとめ、黒霊芝のカラム精製物を約0.40g得た。
Production Example 4 Purified Column of Black Reishi 1
10.0 g of the hot water extract of the black reishi fruit body of Production Example 1 was dissolved in purified water and passed through a column filled with 500 mL of a styrene-divinylbenzene synthetic adsorption resin. Subsequently, after eluting with 1 L each of purified water, 10, 20, 50, 80, 90, and 100% ethanol, each was concentrated to dryness. The specific components of black ganoderma are contained in a large amount in the ethanol fraction of 80% or more, and the ethanol fractions of 80% or more were collected to obtain about 0.40 g of purified column product of black ganoderma.

製造例5 黒霊芝の溶媒分画精製物
製造例3の黒霊芝のエタノール抽出物2.00gをエタノール350mLに溶解し、同容量の精製水とヘキサンを加えて抽出した。水層部分を1/2に濃縮し、同容量の酢酸エチルを加えて抽出した後、濃縮乾固し、ヘキサン画分0.84g、酢酸エチル画分0.56g、水画分0.60g得た。このうち、酢酸エチル画分を黒霊芝の溶媒分画精製物とする。
Production Example 5 Purified Solvent Fraction of Black Ganoderma 2.00 g of Kuro Ganoderma Ethanol Extract of Production Example 3 was dissolved in 350 mL of ethanol and extracted with the same volume of purified water and hexane. Concentrate the aqueous layer to ½, extract by adding the same volume of ethyl acetate, extract and concentrate to dryness to obtain 0.84 g of hexane fraction, 0.56 g of ethyl acetate fraction, and 0.60 g of water fraction. It was. Among these, the ethyl acetate fraction is used as a purified solvent fraction of Kuro Reishi.

製造例6 黒霊芝のHPLC精製物
製造例3の黒霊芝のエタノール抽出物0.50gを分取HPLCにより精製し、黒霊芝のHPLC精製物を0.21g得た。なお、HPLCの分画範囲は、「0019」段落に記載の範囲とした。
<HPLC分画条件>
(A)充填剤:ODS(内径20mm×長さ250mm)
(B)展開溶媒
0.2%リン酸/0.2%リン酸を含有するアセトニトリルを用い、0.2%リン酸を含有するアセトニトリルを20%から100%を20分かけて直線的に溶媒を変化させ、100%で25分保持する。
(C)流速:10mL/分
(D)検出:350nm
Production Example 6 Purified HPLC Product of Black Ganoderma 0.50 g of Kuro Ganoderma Ethanol Extract of Production Example 3 was purified by preparative HPLC to obtain 0.21 g of purified Kuro Ganoderma HPLC. The HPLC fraction range was the range described in the paragraph “0019”.
<HPLC fractionation conditions>
(A) Filler: ODS (inner diameter 20 mm x length 250 mm)
(B) Developing solvent Using acetonitrile containing 0.2% phosphoric acid / 0.2% phosphoric acid, acetonitrile containing 0.2% phosphoric acid is linearly solvent from 20% to 100% over 20 minutes. And hold at 100% for 25 minutes.
(C) Flow rate: 10 mL / min (D) Detection: 350 nm

製造例7 黒霊芝のカラム精製物2
製造例3の黒霊芝のエタノール抽出物2.0gをエタノール350mLに溶解し、同容量の精製水とヘキサンを加えて抽出した。水層部分を1/2に濃縮し、同容量の酢酸エチルを加えて抽出した後、濃縮乾固し、酢酸エチル画分0.56gを得た。これを50%エタノールに溶解し、スチレン−ジビニルベンゼン系の合成吸着樹脂100mLを充填したカラムに通液した。次いで、精製水、10、20、50、80、90、100%エタノール各1Lを溶出させた後、80%以上のエタノール画分をまとめ、黒霊芝のカラム精製物2を0.24g得た。
Production Example 7 Purified Column 2 of Black Reishi
2.0 g of the ethanol extract of Black Reishi in Production Example 3 was dissolved in 350 mL of ethanol and extracted by adding the same volume of purified water and hexane. The aqueous layer portion was concentrated to 1/2, extracted with the same volume of ethyl acetate, and then concentrated to dryness to obtain 0.56 g of an ethyl acetate fraction. This was dissolved in 50% ethanol and passed through a column packed with 100 mL of a styrene-divinylbenzene synthetic adsorption resin. Next, after eluting 1 L each of purified water, 10, 20, 50, 80, 90, and 100% ethanol, 80% or more ethanol fractions were combined to obtain 0.24 g of Kuro Reishi column purified product 2. .

<製造例6及び7のスペクトル解析>
赤外吸収スペクトル解析
製造例6の黒霊芝のHPLC精製物及び製造例7の黒霊芝のカラム精製物2をKBr法で赤外吸収スペクトルを測定した。その結果、3294、2926、1698、1604、1456、1169、823cm−1に吸収の極大を示した。
紫外吸収スペクトル分析
製造例6の黒霊芝のHPLC精製物及び製造例7の黒霊芝のカラム精製物2の5mgを100mLのエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定した。その結果、295.3nmに吸収の極大を示した。
NMRスペクトル分析
製造例6の黒霊芝のHPLC精製物及び製造例7の黒霊芝のカラム精製物2を用い、定法によりH、13C−NMR分析した結果、6.6〜7.6ppm(H−NMR)、100〜150ppm(13C−NMR)にスペクトル吸収を認め、芳香環の存在が確認された。なお、溶媒は重メタノール(CDOD)を用いた。
溶液の色
製造例6の黒霊芝のHPLC精製物及び製造例7の黒霊芝のカラム精製物2の10mgに5mLの酢酸エチルを加えた。酢酸エチル可溶分を濾過した後、溶液の色を目視にて確認した。その結果、溶液の色は、赤褐色を示した。
<Spectral analysis of Production Examples 6 and 7>
Infrared absorption spectrum analysis Infrared absorption spectra were measured by the KBr method for the purified product of Kuro Reishi in Preparation Example 6 and the purified product of Kuro Reishi column in Preparation Example 7. As a result, the absorption maximum was shown at 3294, 2926, 1698, 1604, 1456, 1169, and 823 cm −1 .
Ultraviolet Absorption Spectrum Analysis 5 mg of the purified product of black reishi from Production Example 6 and the purified product of black reishi from Production Example 7 was dissolved in 100 mL of ethanol, and the ultraviolet absorption spectrum was measured. As a result, the maximum of absorption was shown at 295.3 nm.
NMR spectrum analysis As a result of 1 H, 13 C-NMR analysis by a conventional method using the HPLC purified product of Kuro Reishi in Production Example 6 and the purified product of Kuro Reishi in Production Example 7, 6.6 to 7.6 ppm Spectral absorption was observed at ( 1 H-NMR), 100 to 150 ppm ( 13 C-NMR), and the presence of an aromatic ring was confirmed. Note that deuterated methanol (CD 3 OD) was used as the solvent.
Color of Solution 5 mL of ethyl acetate was added to 10 mg of the HPLC purified product of Black Reishi in Preparation Example 6 and the purified product of Black Reishi in Preparation Example 7. After the ethyl acetate soluble component was filtered, the color of the solution was visually confirmed. As a result, the color of the solution was reddish brown.

比較製造例1 赤霊芝の熱水抽出物
赤霊芝子実体の乾燥物100gに2Lの精製水を加え、95〜100℃で2時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮後、凍結乾燥して、赤霊芝の熱水抽出物を6.0g得た。
Comparative Production Example 1 Red Ganoderma Hot Water Extract To 100 g of dried red ganoderma fruit body, 2 L of purified water was added, extracted at 95-100 ° C. for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated and frozen. After drying, 6.0 g of hot water extract of red ganoderma was obtained.

比較製造例2 赤霊芝の溶媒分画精製物
製造例5の黒霊芝を赤霊芝に変えて同様に行い、酢酸エチル画分(溶媒分画精製物)を0.64g得た。
Comparative Production Example 2 Purified Solvent Fraction of Red Ganoderma The same procedure was carried out except that the black ganoder of Production Example 5 was replaced with red ganoderma turf to obtain 0.64 g of ethyl acetate fraction (purified solvent fraction).

本発明の脳機能改善剤は、処方例として下記の製剤化を行うことができる。   The brain function improving agent of the present invention can be formulated as the following formulation examples.

処方例1 散剤
処方 配合量
1.黒霊芝のHPLC精製物(製造例6) 20部
2.乾燥コーンスターチ 30
3.微結晶セルロース 50
[製法]成分1〜3を混合し、散剤とする。
Formulation Example 1 Powder Formulation Formulation 1. 1. Purified HPLC product of Kuro Reishi (Production Example 6) 20 parts Dried corn starch 30
3. Microcrystalline cellulose 50
[Manufacturing method] Components 1 to 3 are mixed to form a powder.

処方例2 錠剤
処方 配合量
1.黒霊芝のカラム精製物2(製造例7) 5部
2.乾燥コーンスターチ 25
3.カルボキシメチルセルロースカルシウム 20
4.微結晶セルロース 40
5.ポリビニルピロリドン 7
6.タルク 3
[製法]成分1〜5を混合し、次いで10%の水を結合剤として加えて、押出し造粒後乾燥する。成形した顆粒に成分6を加えて混合し打錠する。1錠0.52gとする。
Formulation Example 2 Tablet formulation Formulation amount 1. Purified column 2 of Kuro Reishi (Production Example 7) 5 parts Dried corn starch 25
3. Carboxymethylcellulose calcium 20
4). Microcrystalline cellulose 40
5. Polyvinylpyrrolidone 7
6). Talc 3
[Manufacturing method] Components 1 to 5 are mixed, then 10% water is added as a binder, dried after extrusion granulation. Ingredient 6 is added to the molded granules, mixed and compressed into tablets. One tablet is 0.52 g.

製造例3 錠菓
処方 配合量
1.黒霊芝のエタノール抽出物(製造例3) 1.5部
2.乾燥コーンスターチ 50.0
3.エリスリトール 40.0
4.クエン酸 5.0
5.ショ糖脂肪酸エステル 3.4
6.香料 0.1
[製法]成分1〜4を混合し、10%の水を結合剤として加え流動層増粒する。成形した顆粒に成分5及び6を加えて混合し打錠する。1粒1.0gとする。
Production Example 3 Tablet Confection Formulation Ethanol extract of black reishi (Production Example 3) 1.5 parts Dried corn starch 50.0
3. Erythritol 40.0
4). Citric acid 5.0
5. Sucrose fatty acid ester 3.4
6). Fragrance 0.1
[Production Method] Components 1 to 4 are mixed, and 10% water is added as a binder to increase the size of the fluidized bed. Ingredients 5 and 6 are added to the formed granules, mixed and compressed into tablets. One tablet is 1.0 g.

処方例4 飲料
処方 配合量
1.黒霊芝の溶媒分画精製物(製造例5) 0.05部
2.ステビア 0.05
3.リンゴ酸 5.0
4.グリセリン脂肪酸エステル 0.5
5.香料 0.1
6.水 94.3
[製法]成分1〜5を成分6の一部の水に撹拌溶解する。次いで、成分6の残りの水を加えて混合する。
Formulation Example 4 Beverage Formulation Purified solvent fraction of Kuro Reishi (Production Example 5) 0.05 part2. Stevia 0.05
3. Malic acid 5.0
4). Glycerin fatty acid ester 0.5
5. Fragrance 0.1
6). Water 94.3
[Manufacturing method] Components 1 to 5 are stirred and dissolved in a part of the water of component 6. The remaining water of component 6 is then added and mixed.

次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例を挙げる。 Next, experimental examples will be given to explain the effects of the present invention in detail.

実験例1 アセチルコリンエステラーゼ阻害試験
アセチルコリンエステラーゼ(以下AChEという)の活性阻害作用を試験した。AChE阻害活性の測定は、酵素にラット脳のホモジネート、基質にアセチルチオコリンを使用し、AChEの作用により基質から遊離されるチオコリンにDTNB(5,5−dithio−bis(2−nitro benzonic acid))を反応させることで生じるTNB(5−チオ−2−ニトロ安息香酸)の吸光度を412nmで測定する方法で行った。
Experimental Example 1 Acetylcholinesterase inhibition test The activity inhibitory action of acetylcholinesterase (hereinafter referred to as AChE) was tested. Measurement of AChE inhibitory activity uses rat brain homogenate as an enzyme, acetylthiocholine as a substrate, and DTNB (5,5-dithio-bis (2-nitrobenzonic acid) as thiocholine released from the substrate by the action of AChE. ) Was reacted by measuring the absorbance of TNB (5-thio-2-nitrobenzoic acid) at 412 nm.

50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0、以下リン酸緩衝液とする)0.54mLにAChEを0.05mL、各々DMSO(ジメチルスルホキシド)に溶解した試料0.01mL、2.5mMヨウ化アセチルチオコリンのリン酸緩衝溶液を0.2mL、1.5mM DTNBのリン酸緩衝溶液を0.2mL加え37℃で反応させ、1分毎の412nmの吸光度の傾き(SX)を算出した。   0.05 mL of AChE dissolved in 0.54 mL of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0, hereinafter referred to as phosphate buffer), 0.01 mL each sample dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide), 2.5 mM acetylthioiodide 0.2 mL of choline phosphate buffer solution and 0.2 mL of 1.5 mM DTNB phosphate buffer solution were added and reacted at 37 ° C., and the slope of absorbance at 412 nm per minute (SX) was calculated.

AChEの代わりにリン酸緩衝液0.01mLを用いて、上記と同様に反応を行い、吸光度の傾き(SXB)を算出した。   The reaction was performed in the same manner as described above using 0.01 mL of phosphate buffer instead of AChE, and the absorbance gradient (SXB) was calculated.

試料溶液の代わりにDMSO 0.01mLを用いて、上記と同様に反応を行い、吸光度の傾き(SC)を算出した。   The reaction was performed in the same manner as described above using 0.01 mL of DMSO instead of the sample solution, and the absorbance gradient (SC) was calculated.

試料溶液の代わりにDMSO 0.01mL、AChEの代わりにリン酸緩衝液0.01mLを用いて、上記と同様に反応を行い、吸光度の傾き(SB)を算出した。   The reaction was carried out in the same manner as above using 0.01 mL of DMSO instead of the sample solution and 0.01 mL of phosphate buffer instead of AChE, and the absorbance gradient (SB) was calculated.

各試料のAChE阻害率の評価は、得られた各々の傾きから、下記式により算出した。

AChE阻害率(%) = [1−(SX−SXB)/(SC−SB)] x 100
Evaluation of the AChE inhibition rate of each sample was calculated from the obtained slopes by the following formula.

AChE inhibition rate (%) = [1- (SX-SXB) / (SC-SB)] x 100

その結果、表1に示すように、黒霊芝の特定成分に他の熱水や、エタノール抽出物と比べて高いアセチルコリンエステラーゼ阻害活性が認められた。   As a result, as shown in Table 1, high specific acetylcholinesterase inhibitory activity was recognized as compared with other hot water and ethanol extracts as specific components of black ganoderma.

Figure 0005085120
Figure 0005085120

実験例2 プロリルエンドペプチダーゼ阻害試験
プロリルエンドペプチダーゼ(以下、PEPという。)の活性阻害作用を試験した。PEP阻害活性の測定は、酵素にフラボバクテリウム属(Flavobacterium
meningoseepticum)由来のPEP、基質にZ−Gly−Pro−pNAを使用し、PEPのエステラーゼ作用により、基質から遊離されるp−NA(パラニトロアニリン)の吸光度を410nmで測定する方法で行った。本測定法に用いた各試料の終濃度は0.2mg/mLとした。
Experimental Example 2 Prolyl Endopeptidase Inhibition Test The activity inhibitory action of prolyl endopeptidase (hereinafter referred to as PEP) was tested. The measurement of PEP inhibitory activity was carried out using the enzyme Flavobacterium (Flavobacterium).
PEP derived from meningoseepticum) and Z-Gly-Pro-pNA as a substrate were used, and the absorbance of p-NA (paranitroaniline) released from the substrate was measured at 410 nm by the esterase action of PEP. The final concentration of each sample used in this measurement method was 0.2 mg / mL.

0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)1.0mLに、各々40%ジオキサン溶液に溶解した試料0.125mLと2mM Z−Gly−Pro−pNA 0.125mLを加え、30℃で5分間プレインキュベーションした。5分後に、0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液に溶解したPEP(0.175U/mL)0.1mLを加え、10分間の反応を実施した。その後、2.0mLのTriton X−100溶液により反応を停止さえ、410nmの吸光度を測定した。   To 0.1 mL of 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), 0.125 mL of a sample dissolved in a 40% dioxane solution and 0.125 mL of 2 mM Z-Gly-Pro-pNA are added, and the mixture is added at 30 ° C. for 5 minutes. Preincubated. After 5 minutes, 0.1 mL of PEP (0.175 U / mL) dissolved in 0.05 M sodium phosphate buffer was added, and the reaction was carried out for 10 minutes. Thereafter, the reaction was stopped with 2.0 mL of Triton X-100 solution, and the absorbance at 410 nm was measured.

PEP阻害率の評価は、上記の操作(A)の他に、(B)Aのコントロールのために酵素反応前にTriton X−100溶液を加え、(C)サンプル溶液の代わりに40%ジオキサン溶液を用いて測定し、(D)Cのコントロールのために酵素反応前にTritonX−100溶液を加える、各々の段階での吸光度の測定値を下式に代入することにより算出した。

PEP阻害活性(%)=[(C−D)−(A−B)]/(C−D)×100
In addition to the above operation (A), the PEP inhibition rate was evaluated by adding (B) Triton X-100 solution before the enzymatic reaction for control of A, and (C) 40% dioxane solution instead of the sample solution. (D) The Triton X-100 solution was added before the enzyme reaction for the control of C, and the calculated value of the absorbance at each stage was substituted into the following equation.

PEP inhibitory activity (%) = [(C−D) − (A−B)] / (C−D) × 100

その結果、表2に示すように、黒霊芝の特定成分は他の熱水、エタノール抽出物と比べて高いPEP阻害活性が認められた。   As a result, as shown in Table 2, the specific component of black ganoderma was found to have a higher PEP inhibitory activity than other hot water and ethanol extracts.

Figure 0005085120
Figure 0005085120

実験例3 モリス水迷路試験
本発明についてモリス水迷路試験により記憶・学習改善効果を検討した。
Experimental Example 3 Morris Water Maze Test The memory / learning improvement effect of the present invention was examined by the Morris water maze test.

直径120cm,高さ20cmの水槽に直径5cm,高さ10cmのプラットフォームを設置し、水面がプラットフォームより1cm高くなるようにし、スキムミルクで白濁させたものを用いた。水温を18±1℃となるよう調製し、試験中はすべての位置を固定して行った。   A platform having a diameter of 5 cm and a height of 10 cm was installed in a water tank having a diameter of 120 cm and a height of 20 cm, and the surface of the water was made 1 cm higher than the platform, and was made cloudy with skim milk. The water temperature was adjusted to 18 ± 1 ° C., and all positions were fixed during the test.

水槽の縁の4点を任意に北,南,東,西とし、それぞれの点よりマウスを泳がせ、プラットフォームに到達するまでの時間を最高90秒まで測定した。試行は各方向より1回ずつ計4回行い、その日の試行を終了した。マウスが自力到達した場合はそのまま15秒間静置し、1回の試行を完了した。90秒を越えてもマウスがプラットフォームに到達できない場合は、実験者によりマウスをプラットフォームまで誘導し、その上に15秒間静置させて1回の試行を完了した。4回の試行の間隔は2分間とし、1日4試行の到達時間の平均値を1日のデータとした。   Four points on the edge of the aquarium were arbitrarily designated as north, south, east, and west. The mouse was swam from each point, and the time to reach the platform was measured up to 90 seconds. Trials were performed four times, one from each direction, and the trial for the day was completed. When the mouse reached its own strength, the mouse was left as it was for 15 seconds, and one trial was completed. If the mouse could not reach the platform after 90 seconds, the experimenter guided the mouse to the platform and left it on it for 15 seconds to complete one trial. The interval between the four trials was 2 minutes, and the average value of the arrival times of 4 trials per day was used as the data for one day.

2日間訓練試行を行った後、3日目に薬物を投与せずに試験試行を行い、各群の到達時間および体重の平均を均一にした。4、5日目は試行30分前にスコポラミン(ムスカリン性アセチルコリン受容体拮抗薬)1mg/kgを腹腔内投与し記憶・学習障害を誘発する条件下で試験試行を行い、到達時間の結果から各々の試料の記憶・学習障害改善作用を評価した。試料は蒸留水に懸濁したものを試行60分前に経口投与し、コントロール群については、同量の蒸留水を投与した。   After performing the training trial for 2 days, the trial was performed without administering the drug on the 3rd day, and the arrival time and average body weight of each group were made uniform. On the 4th and 5th days, scopolamine (muscarinic acetylcholine receptor antagonist) 1 mg / kg was intraperitoneally administered 30 minutes before the trial, and the test trial was conducted under conditions that induced memory / learning impairment. The effect of improving the memory / learning disorders of the samples was evaluated. The sample suspended in distilled water was orally administered 60 minutes before the trial, and the same amount of distilled water was administered to the control group.

試験5日目の各々の試料投与による到達時間を表3に示した。その結果、黒霊芝の特定成分は他の熱水、エタノール抽出物と比べて遊泳時間の顕著な短縮が認められた。   Table 3 shows the arrival time for each sample administration on the fifth day of the test. As a result, the specific component of black ganoderma was found to significantly shorten the swimming time compared to other hot water and ethanol extracts.

Figure 0005085120
Figure 0005085120

本発明の脳機能改善剤は、高いアセチルコリンエステラーゼ阻害作用およびプロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を示した。従って、安全で優れた脳機能改善作用を有する医薬品、医薬部外品または食品としての利用が期待される。   The brain function improving agent of the present invention showed high acetylcholinesterase inhibitory action and prolyl endopeptidase inhibitory action. Therefore, it is expected to be used as a pharmaceutical, quasi-drug or food having a safe and excellent brain function improving action.

黒霊芝の特定成分のHPLCチャートを示す。横軸は保持時間(分)、縦軸 は強度を示す。The HPLC chart of the specific component of black reishi is shown. The horizontal axis represents the retention time (minutes), and the vertical axis represents the intensity.

Claims (4)

黒霊芝から抽出され、かつ(1)〜(4)の物性を有する特定成分を含有することを特徴とするアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。
(1)赤外吸収スペクトルを測定すると(KBr法)、2925、1700、1600、1455、1170、835cm−1に吸収の極大を示し、
(2)本成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、280〜330nmに吸収の極大を示し、
(3)分子内に芳香環を含有し、
(4)本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、茶色〜赤褐色を示す。
An acetylcholinesterase inhibitor characterized by containing a specific component extracted from black ganoderma and having the physical properties (1) to (4) .
(1) When the infrared absorption spectrum is measured (KBr method), the absorption maximum is shown at 2925, 1700, 1600, 1455, 1170, 835 cm −1 ,
(2) When this component is dissolved in ethanol and the ultraviolet absorption spectrum is measured, the absorption maximum is shown at 280 to 330 nm.
(3) contains an aromatic ring in the molecule,
(4) When ethyl acetate is added to this component, the ethyl acetate-soluble solution is colored and exhibits brown to reddish brown color.
黒霊芝の溶媒抽出物を含有することを特徴とするアセチルコリンエステラーゼ阻害剤。 An acetylcholinesterase inhibitor comprising a solvent extract of black reishi. 黒霊芝から抽出され、かつ(1)〜(4)の物性を有する特定成分を含有することを特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
(1)赤外吸収スペクトルを測定すると(KBr法)、2925、1700、1600、1455、1170、835cm−1に吸収の極大を示し、
(2)本成分をエタノールに溶解し、紫外吸収スペクトルを測定すると、280〜330nmに吸収の極大を示し、
(3)分子内に芳香環を含有し、
(4)本成分に酢酸エチルを加えたとき、酢酸エチル可溶分の溶液は着色性であり、茶色〜赤褐色を示す。
A prolyl endopeptidase inhibitor characterized by containing a specific component extracted from black ganoderma and having the physical properties (1) to (4) .
(1) When the infrared absorption spectrum is measured (KBr method), the absorption maximum is shown at 2925, 1700, 1600, 1455, 1170, 835 cm −1 ,
(2) When this component is dissolved in ethanol and the ultraviolet absorption spectrum is measured, the absorption maximum is shown at 280 to 330 nm.
(3) contains an aromatic ring in the molecule,
(4) When ethyl acetate is added to this component, the ethyl acetate-soluble solution is colored and exhibits brown to reddish brown color.
黒霊芝の溶媒抽出物を含有することを特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。

A prolyl endopeptidase inhibitor comprising a solvent extract of black reishi.

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