JP5066081B2 - Hdac調節アッセイ、調合物および治療学的組成物 - Google Patents
Hdac調節アッセイ、調合物および治療学的組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5066081B2 JP5066081B2 JP2008514116A JP2008514116A JP5066081B2 JP 5066081 B2 JP5066081 B2 JP 5066081B2 JP 2008514116 A JP2008514116 A JP 2008514116A JP 2008514116 A JP2008514116 A JP 2008514116A JP 5066081 B2 JP5066081 B2 JP 5066081B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- appl
- seq
- binding fragment
- hdac
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
。これは、増殖停止、最終分化および/またはがん細胞のアポトーシスを惹起することによって直接的に、および腫瘍の新生血管形成を抑制することによって間接的に、両腫瘍増殖の抑制を含む。
Package,version 9.1(Devreux J.et al.,Nucleic Acid Res.,12,387−395,1984)において利用できるプログラム、例えばプログラムBESTFITおよびGAPが、2種のポリヌクレオチド間の%同一性および2種のペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の%同一性および%類似性を決定するために使用されてもよい。BESTFITは、SmithおよびWaterman(J.Mol.Biol.,147,195−197,1981)の「局部的相同性」アルゴリズムを使用し、そして2種配列間の類似性の最良な単一領域を見出す。BESTFITは、長さの違う2種のポリヌクレオチドまたは2種のペプチドまたはポリペプチド配列を比較するのにより適しており、このプログラムは、より短い配列がより長い配列の一部を表すことを想定する。これに対して、GAPは2種の配列を整列して、NeedlemanおよびWunsch(J.Mol.Biol.,48,443−453,1970)のアルゴリズムにしたがって「最大類似性」を見出す。GAPは、ほぼ同じ長さである配列を比較するのにより適していて、そして整列は全長にわたって期待される。好ましくは、各プログラムで使用されるパラメーター「GAP Weight」および「Length Weight」は、それぞれ、ポリヌクレオチド配列については50および3であり、ポリペプチド配列については12および4である。好ましくは、%同一性および類似性は、比較される2種の配列が任意に整列される場合に決定される。配列間の同一性および/または類似性を決定するための他のプログラムもまた当該技術分野匂い手は既知である、例えばプログラムのBLASTファミリー(Alschul S F et al.,Nucleic Acids Res.,25:3389−3402、1997)。
したがって、第1の実施態様では、本発明は、APPLまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の使用に関していて、ここで、該核酸分子は、APPLおよび関連ペプチドとHDACまたはそのフラグメントとの相互作用の使用をなすアッセイにおける、RNA、DNA、cDNAまたはゲノムDNAのいずれかである。
(a)配列番号:2のアミノ酸配列を含んでなるAPPLをコードしている核酸分子;
(b)APPLをコードしている核酸配列(配列番号:1)を含んでなる核酸分子;
(c)核酸、配列番号:1の1554〜1958を含んでなる、APPLのHDAC結合性フラグメントならびにその同族体をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:3の該フラグメントに対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(d)アミノ酸配列、配列番号:3を含んでなる、APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている核酸分子;
(e)(a)〜(d)のポリヌクレオチドに対して相補的である核酸分子;
(f)(a)〜(d)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続する塩基を含んでなる核酸分子;
(g)(a)〜(d)のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子;または
(h)(a)〜(g)のいずれかのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として退化されるヌクレオチド配列を含んでなる、APPLをコードしている核酸分子:
からなる群から選ばれるメンバーを含んでなる、APPLまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の、本発明によるアッセイにおける使用を包含する。
(a)配列番号:2のアミノ酸配列を有するAPPLをコードしている核酸分子;
(b)APPLをコードしている単離された核酸配列(配列番号:1)を含んでなる核酸分子;
(c)核酸、配列番号:1の1554〜1958ならびにその同族体からなる、APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該同族体は核酸、配列番号:1の1554〜1958に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(d)APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該HDAC結合性フラグメントはアミノ酸配列、配列番号:3を有する;
(e)(a)〜(d)のポリヌクレオチドに対して相補的である核酸分子;
(f)(a)〜(d)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続する塩基を含んでなる核酸分子;
(g)(a)〜(d)のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子;または
(h)(a)〜(g)のいずれかのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として退化されるヌクレオチド配列を含んでなる、APPLをコードしている核酸分子:
からなる群から選ばれるメンバーを含んでなる、APPLまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の、本発明によるアッセイにおける使用を提供することである。
、配列番号:1の1554〜1958からなる。
(a)配列番号:5のアミノ酸配列を含んでなる、HDAC1をコードしている核酸分子;
(b)HDAC1をコードしている、配列番号:4のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子;
(c)核酸、配列番号:4の109〜1047ならびにその同族体を含んでなる、HDAC1のヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:4の該フラグメントに対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(d)アミノ酸配列、配列番号:6を含んでなる、HDACのヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子;
(e)核酸、配列番号:4の235〜336ならびにその同族体を含んでなる、HDAC1のAPPL結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:4の該フラグメントに対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(f)アミノ酸配列、配列番号:7を含んでなる、HDACのAPPL結合性領域をコードしている核酸分子;
(g)(a)〜(f)のポリヌクレオチドに対して相補的である核酸分子;
(h)(a)〜(g)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続する塩基を含んでなる核酸分子;
(i)(a)〜(f)のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子;または
(j)(a)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として退化されるヌクレオチド配列を含んでなる、HDACをコードしている核酸分子:
からなる群から選ばれるメンバーを含んでなる、HDACまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の、本発明によるアッセイにおける使用を包含する。
(a)配列番号:5のアミノ酸配列を有するHDAC1をコードしている核酸分子;
(b)HDAC1をコードしている配列番号:4のヌクレオチド配列からなる核酸分子;(c)核酸、配列番号:4の109〜1047ならびにその同族体からなる、HDAC1のヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:4の該フラグメントに対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(d)アミノ酸配列、配列番号:6を有する、HDACのヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子;
(e)核酸、配列番号:4の235〜336ならびにその同族体からなる、HDAC1のAPPL結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:4の該フラグメントに対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(f)アミノ酸配列、配列番号:7またはその同族体を有する、HDACのAPPL結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:7に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(g)(a)〜(f)のポリヌクレオチドに対して相補的である核酸分子;
(h)(a)〜(f)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続する塩基を含んでなる核酸分子;
(i)(a)〜(f)のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子;または
(j)(a)〜(i)のいずれかのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果として退化されるヌクレオチド配列を含んでなるHDACをコードしている核酸分子:
からなる群から選ばれるメンバーを含んでなる、HDACまたはそのフラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子の、本発明によるアッセイにおける使用を提供することである。
(a)核酸、配列番号:1の1554〜1958ならびにその同族体からなる、APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該同族体は核酸、配列番号:1の1554〜1958に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(b)APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該HDAC結合性フラグメントはアミノ酸配列、配列番号:3を有する;
(c)核酸、配列番号:4の235〜336ならびにその同族体からなる、HDAC1の
APPL結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:4の該フラグメントに対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(d)アミノ酸配列、配列番号:7またはその同族体を有する、HDACのAPPL結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:7に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(e)(a)〜(d)のポリヌクレオチドに対して相補的である核酸分子;
(f)(a)〜(e)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続する塩基を含んでなる核酸分子;または
(g)(a)〜(f)のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子:
からなる群から選ばれる単離され、精製された核酸分子を提供することである。
(a)核酸、配列番号:1の1554〜1958ならびにその同族体からなる、APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該同族体は核酸、配列番号:1の1554〜1958に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(b)APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている核酸分子であって、該HDAC結合性フラグメントはアミノ酸配列、配列番号:3またはその同族体を有し、該同族体は配列番号:3に対して少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98または99%の配列同一性を有する;
(c)核酸、配列番号:4の109〜1047ならびにその同族体からなる、HDAC1のヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:4に対して少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98または99%の同一性を有する;
(d)アミノ酸配列、配列番号:6またはその同族体を有する、HDAC1のヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:6に対して少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98または99%の配列同一性を有する;
(e)核酸、配列番号:4の235〜336ならびにその同族体からなる、HDAC1のAPPL結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:4の該フラグメントに対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%
の同一性を有する;
(f)アミノ酸配列、配列番号:7またはその同族体を有する、HDACのAPPL結合性領域をコードしている核酸分子であって、該同族体は配列番号:7に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(g)(a)〜(f)のポリヌクレオチドの少なくとも15個の連続する塩基を含んでなる核酸分子;または
(h)(a)〜(f)のポリヌクレオチド分子に対して緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子:
からなる群から選ばれる単離され、精製された核酸分子を含んでなるベクターを提供することである。
本発明はまた、APPLおよび関連ペプチドとHDAC酵素との相互作用の使用をなすアッセイにおけるHDAC酵素またはそのフラグメントの使用に関していて、該ポリペプチドは、本発明による単離され、精製された核酸分子によってコードされている。
(a)アミノ酸配列、配列番号:5またはその同族体を有する、単離され、精製されたHDAC1タンパク質であって、該同族体は配列番号:5に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(b)アミノ酸配列、配列番号:6またはその同族体を有する、単離され、精製されたAPPL結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号:6に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(c)アミノ酸配列、配列番号:7またはその同族体を有する、単離され、精製されたAPPL結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号:7に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
からなる群から選ばれるHDAC1酵素またはそのAPPL結合性フラグメントの1つの実施態様にある。
ii)APPLから誘導され、そしてHDACへの結合の可能な単離されたポリペプチド;
iii)アミノ酸配列、配列番号:3またはその同族体を含んでなる、APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号:3に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
からなる群から選ばれる。
(a)アミノ酸配列、配列番号:6またはその同族体を有する、単離され、精製されたAPPL結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号:6に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(b)アミノ酸配列、配列番号:7またはその同族体を有する、単離され、精製されたAPPL結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号:7に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(c)アミノ酸配列、配列番号:3またはその同族体を有する、APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている単離され、精製されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号:3に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
からなる群から選ばれる、単離され、精製されたポリペプチドを提供することである。
R.and Milstein C.,Nature(1975)256,495−497によって記述されているような既知の技術にしたがって製造されてもよい。
(a)該タンパク質に対する抗体によって結合可能なエピトープを含んでなるポリペプチドを提供し;
(b)抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で該ポリペプチドと生物サンプルをインキュベートし;そして
(c)該ポリペプチドを含んでなる抗体−抗原複合体が形成されたか否かを決定すること;を含むことができる。
本発明のアッセイは、生物学的活性または結合性タンパク質について化合物をスクリーニングする当該技術分野において一般に既知の多くの形式において計画することができる。
a)HDAC酵素またはそのフラグメントを含有する給源を、
i)APPLまたはAPPL関連タンパク質、
ii)該試験化合物
とともにインキュベートし;そして
b)酵素に結合されたAPPLまたはAPPL関連タンパク質の量に及ぼす試験化合物の影響を測定すること:
を含んでなる、HDAC酵素を結合することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法を提供する。
a)HDAC1またはそのフラグメントを含有する給源を、
i)APPLまたはAPPL関連タンパク質、
ii)該試験化合物
とともにインキュベートし;そして
b)酵素に結合されたAPPLまたはAPPL関連タンパク質の量に及ぼす試験化合物の影響を測定すること:
を含んでなる、HDAC1酵素を結合することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法を提供する。
(a)アミノ酸配列、配列番号:5またはその同族体を有する、単離され、精製されたHDAC1タンパク質であって、該同族体は配列番号:5に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(b)アミノ酸配列、配列番号:6またはその同族体を有する、単離され、精製されたAPPL結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号:6に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(c)アミノ酸配列、配列番号:7またはその同族体を有する、単離され、精製されたAPPL結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号:7に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
からなる群から選ばれる。
a)APPL結合性領域を含有する給源を、
i)APPLまたはAPPL関連タンパク質、
ii)該試験化合物
とともにインキュベートし;そして
b)結合性領域に結合されたAPPLまたはAPPL関連タンパク質の量に及ぼす試験化合物の影響を測定すること:
を含んでなる、APPLまたはAPPL関連タンパク質と、APPL結合性領域との相互作用を調節することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法を提供する。
(a)アミノ酸配列、配列番号:6またはその同族体を有する、単離され、精製されたAPPL結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号:6に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
(b)アミノ酸配列、配列番号:7またはその同族体を有する、単離され、精製されたAPPL結合性フラグメントであって、該同族体は配列番号:7に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
からなる群から選ばれる。
i)HDAC1酵素またはそのAPPL結合性フラグメントを、配列番号:2によってコードされたアミノ酸配列を含んでなる標識されたAPPL関連タンパク質、好ましくは配列番号:3からなるヨウ素化APPL関連タンパク質とともにインキュベートし;
ii)インキュベーション混合液に試験化合物を添加し;そして
iii)HDAC1酵素またはそのAPPL結合性フラグメントに結合される標識されたAPPL関連ペプチドの量に及ぼす試験化合物の影響を測定すること:
を含んでなる、HDAC1酵素を結合することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法を提供する。
基質を用いて調査される。HDACの活性/活性化を測定するアッセイは、一般に、当該技術分野においては既知であり、なかんずく、基質としての放射能標識または蛍光標識されたアセチル化ヒストンおよび以下の実施例4において与えられるような標識されたアセチル基の遊離の測定を含む。
a)HDACまたはその機能性フラグメントを、該試験化合物とともにインキュベートし;
b)HDAC酵素の活性に及ぼす試験化合物の影響を測定し:そして
c)この影響を、APPLまたはAPPL関連タンパク質の結合におけるHDAC酵素の活性と比較すること;
を含んでなる、HDACの活性を調節することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法を提供する。
a)アミノ酸配列、配列番号:5またはその同族体を有するHDAC1であって、該同族体は配列番号:5に対して少なくとも70、80、85、90、95、97、98または99%の同一性を有する;
b)HDAC1の機能性フラグメント;または
c)アミノ酸配列、配列番号:6またはその同族体を有するHDAC1のヒストンデアセチラーゼ・ドメインであって、該同族体は配列番号:6に対して少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98または99%の配列同一性を有する;
からなる群から選ばれる。
a)APPLまたはAPPL誘導体によるHDAC上の結合部位の構造を探査し;
b)結合においてAPPLリガンドと相互作用するHDACタンパク質の結合部位において接触する原子を同定し;
c)HDAC酵素の活性を調節するように、(b)において同定された原子と相互作用する試験化合物を設計し;そして
d)該設計された試験化合物をHDACまたはその機能性フラグメントと接触させて、HDAC活性を調節する該化合物の能力を測定すること;
によって、HDACのアゴニストまたはアンタゴニストの構造に基づくまたは合理的な設計のための方法において使用されてもよいことは、当業者によって容易に評価できる。
(a)APPL結合部位の三次元構造を系統的に表す分子造形技術を用い;
(b)試験化合物とAPPL結合部位の三次元構造との間の適合化操作を実施するコンピューター手段を使用し;そして
(c)該適合化操作の結果を分析して試験化合物とAPPL結合部位の三次元構造との会合を定量化すること;
を含む。
一般に、アゴニストまたはアンタゴニストは、前述されたような疾病に対する治療的および予防的目的のために使用されてもよい。化合物は、種々の起源、例えば細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび自然生産物混合物から同定されてもよい。そのように同定されたアゴニストまたはアンタゴニストは、場合によっては受容体ポリペプチドの、天然または改変ペプチド、リガンド、酵素などであってもよく;または、それらの構造的または機能的模倣物であってもよい(参照、Coligan et al.,Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991))。
がん)、膵臓がん(例えば、外分泌膵臓がん腫のような膵臓がん腫)、結腸がん(例えば、結腸腺がんおよび結腸腺腫のような結腸直腸がん腫)、後生的疾病を含む前立腺がん、リンパ様系統の造血性腫瘍(例えば、急性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫)、骨髄性白血病(例えば、急性骨髄性白血病(AML))、甲状腺胞状がん、脊髄異形成症候群(MDS)、間葉原発の腫瘍(例えば、線維肉腫および横紋筋肉腫)、黒色腫、奇形がん、神経芽細胞腫、膠腫、皮膚の良性腫瘍(例えば、角化棘細胞腫)、乳がん(例えば、後生的乳がん)、腎臓がん、卵巣がん、膀胱がんおよび表皮がんである。
当な用量は、0.01mg/kg〜300mg/kg体重、特に5mg/kg〜150mg/kg体重、なおより特に2mg/kg〜100mg/kg体重の範囲である。しかしながら、利用される種々の化合物および種々の投与経路の異なる効力の観点から、必要な用量における幅広い変化が期待される。例えば、経口投与は、静脈内注射によるよりも高い用量を必要とすることが予期されるであろう。これらの用量レベルにおける変化は、当該技術分野では周知であるように、最適化のための標準の経験的慣例手段を用いて調節することができる。一般に、細胞増殖性障害、例えばアテローム性動脈硬化、再狭窄およびがんを処置するための治療作用物として投与されるHDACモジュレーターの量は、担当する医者によってケース・バイ・ケースで決定される。
新規なHDAC1会合タンパク質を同定するために、酵母ツーハイブリッド・スクリーニング(two−hybrid screen)が、ヒト脳のcDNAライブラリーに対するバイト(bait)として全長HDAC1を用いて実施された。これにより、既にAPPL7またはDIP13α8、細胞のシグナル伝達において重要な機能を発揮するであろうアダプタータンパク質、として記述されている、PTBドメインを含有するタンパク質のフラグメント(aa489−639)の同定がもたらされた。同定されたAPPLのフラグメント(aa489−639)は、APPLのPTBドメイン(aa500−634)と完全に重複し、そしてさらにAPPL−PTBと呼ばれる。
HDAC1とAPPLのフラグメント(アミノ酸489−639)との間の相互作用が真核細胞においてもまた起きるか否かを決定するために、一連の同時免役沈降アッセイがHEK239細胞において実施された。図1Aに示されるように、APPL−PTBは、両タンパク質が過発現された場合(列4)、HDAC1と同時免役沈降された。複合体はHDAC1過発現の不在下では検出されなかったので、この相互作用は特異的である(図1A、列2−4)。逆免役沈降、すなわちAPPL−PTBの逆免役沈降もまた、HDAC1の同時免役沈降をもたらした(データ未掲載)。APPLのPTBドメイン単独がHDAC1と有効な同時免役沈降を既に示したという事実は、このドメインが相互作用のために十分であることを示す。PTBドメインは、リン酸化NPXpYモチーフ、HDAC1には存在しないモチーフと相互作用することが初めて見出された。しかしながら、近年の公表物は、PTB結合がNPXpYモチーフ12,13には厳密には依存しないことを示している。
内因性APPLおよびHDAC1が相互作用するか否かを決定するために、本発明者らは、ヒトのMDA−MB−231乳がんおよびA2780卵巣がん細胞におけるAPPLおよびHDAC1の局在を免役細胞化学を用いて研究した。図2は、間期の細胞におけるHDAC1およびAPPLの共局在を示す。APPLの染色は、細胞質に顕著に存在する粒状構造を示し、このことは、またTesta et al7によって既に記述されている。しかしながら、少部分のAPPL小胞は核に局在していて、それらはHDAC1と重複する。内因性APPLおよびHDAC1シグナルの共局在の共焦点3D解析は、核の内側でAPPLおよびHDAC1の明瞭な重複を示した(図2、ピクセル強度グラフ)。これは、タンパク質が、実際に静止状態の細胞において相互作用する可能性をもつことを示す。これらの2種のタンパク質が細胞周期の進行中に如何にして相互作用できるかを評価するために、本発明者らは、有糸分裂中の細胞におけるAPPLおよびHDAC1の局在を評価した(図6)。中期では、HDAC1は染色体の周囲に再組織しているが、一方APPLはより散漫に存在している。後期では、HDAC1は染色体の周囲になお存在している。興味あることには、この特殊な有糸分裂の段階中、APPLは、HDAC1と同じ場所:明確な黄色領域によって明らかなように、分裂しつつある姉妹染色分体の中間において、顕著に局在しているようである。より後期の段階では、両APPLおよびHDAC1はより散漫に発現される。後の終期および細胞質分裂では、APPLおよびHDAC1は再分布する。HDAC1は、この段階では核においてのみ存在しているが、一方APPLは細胞質において顕著に存在しているので、後の終期および細胞質分裂中には重複は検出できなかった。MDA−MB−231細胞における共局在実験は匹敵する結果を示した;APPLは、より粒状に形成され、そして間期におけるMDA−MB−231細胞の核においては、A2780細胞におけるよりも多いAPPLが存在するようである。A2780細胞においては、より多くのHDAC1が細胞質に存在するように見える。間期の細胞における無刺激条件下では、APPLの少部分のみがHDAC1と共に局在するという事実は、同時免役沈降およびHDAC1活性実験が、技術的に意欲をそそられ、そしてAPPLの過発現の拡大(extend)に依存した理由を説明できる。興味あることには、Miaczynska et al.(2004)9は、APPLはHeLa細胞においてEGF刺激により核に移動することを示したが、このことは、EGFシグナル伝達経路の活性化後には、より大量のAPPLおよびHDAC1が相互作用することができることを示唆する。結論として、本発明者らは、内因性APPLおよびHDAC1は明らかに共局在していて、観察される相互作用に関して生理学的関係を強調していると言うことができる。
HDAC1およびAPPLはHEK239細胞において直接相互作用するので、本発明者らは、APPLがHDAC1活性に及ぼす効果をもつか否か疑問に思った。両タンパク質はHEK239細胞において等しく過発現された(図3B)。過発現の48時間後、細胞が溶解され、HDAC1が免役沈降され、そして活性が、[3H]アセチル−標識されたヒストンH4ペプチドからの酢酸の遊離を定量することによって調べられた。注目すべ
きは、過発現されたAPPLの存在下では、等量のHDAC1が免役沈降された(図3B、上部パネル)にもかかわらず、HDAC1活性は約4倍増強された(図3A、条件2と4を比較)。これらの結果は、APPLがHDAC1酵素活性の新規なレギュレーターであることを示す。しかしながら、HDAC1活性がAPPLによって如何にして増強されるかは、今日まだ不明確である。HDAC活性の既知の調節メカニズムに基づけば、これは、コアHDAC−NuRD複合体の安定化および/またはHDAC1翻訳後修飾の強化のいずれかを必要とするであろう。
APPLがHDAC1活性を増強するという本発明者らの仮説をさらに確認するために、ヒストンH3のアセチル化状態が決定された。APPLがHDAC1活性に効果を有する場合は、ヒストンH3のアセチル化レベルがAPPL過発現後に減少すると仮定された。したがって、HEK293細胞がAPPLによりトランスフェクトされ、そして48時間後に細胞がpMACS選択システム(実験操作、参照)を用いてトランスフェクトされた集団について富有化された。総タンパク質抽出物が調製され、そしてウエスタンブロットにおいて分析された。APPL過発現の48時間後、ヒストンH3のアセチル化状態における明らかな減少が模倣対照に比較されて検出でき(図4、列2と4を比較)たが、一方、総H3タンパク質レベルは全列において等しいままであった。また、期待されたように、HDAC1の過発現はH3のアセチル化の減少をもたらし、これは、存在する内因性HDAC1活性の量が律速的であることを示している。両過発現タンパク質の存在は、H3のアセチル化レベルをさらには減少させなかった(図4A、列5)が、H3アセチル化が、この実験においてはHDAC1またはAPPLのみによって既に抑制されていた(図5A、列3および4)ことを注目すべきである。この結果は、APPLがヒストンH3のアセチル化状態を減少させ、これはHDAC1活性の増強と合致していることを示す。
HDAC1活性は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤p21waf1,cip1の低発現レベルを維持する際にきわめて重要である2,11。p21waf1,cip1のプロモーターは、数種のSp1結合部位を含有し、これを介してHDAC1が補充される。本発明者らは、APPLがHDAC1活性を特異的に増強し、そしてH3のアセチル化状態を減少する場合は、p21waf1,cip1タンパク質レベルはAPPL過発現により低下するであろうと仮定した。再び、HEK239細胞がHDAC1および/またはAPPLにより48時間トランスフェクトされた。総タンパク質抽出物が調製され、そしてウエスタンブロットにおいて分析された。APPL過発現された場合、p21waf1,cip1タンパク質レベルにおけるほとんど完全な抑制が、対照に比較されて検出できた(図4B、列1と3を比較)。効果は、p16、その他のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤では検出できなかったので、この効果はp21waf1,cip1について特異的である。観察されたAPPL媒介のp21waf1,cip1の下方調節が内因性HDAC1活性に依存することを確認するために、本発明者らはHDAC1変異体(HDAC1−H141A)を利用した。この変異体では、ヒスチジン141がアラニン残基によって置換され、そして酵素活性における50%の低下を示す(Hassig et al.,PNAS 95;3519−3524、1998)。しかしながら、HDAC1−H141Aは、Sin3Aクロマチン再形成複合体を形成する能力をなお有する。図4Bに図示したように、H141A変異体の同時発現は、APPLによってp21waf1,cip1の抑制を部分的に反転し(列4と6に比較)、p21waf1,cip1のAPPL媒介抑制におけるHDAC1の重要な役割を例証している。
このスクリーニングにおいて、本発明者らは、APPL(PHドメイン、PTBドメインおよびロイシンジッパー・モチーフを含有するアダプタータンパク質)をHDAC1の新規な相互作用因子として同定した。APPLは、またDIP13αとして既知であり、「PHドメイン、PTBドメインおよびロイシンジッパー・モチーフを含有するアダプタータンパク質」7−10を表す。APPLは最初は細胞質タンパク質として記述された7が、それは、近年、EGF9による刺激によって核に移行し、そこでNuRD/Mi2複合体と一時的に相互作用することが報告された。APPLが、細胞周期の調節およびアポトーシスにおいて重要な役割を演じることを示すいくつかの事実がある。第1に、APPLはがん遺伝子Akt2と相互作用することが示された7。第2には、プロ・アポトーシスタンパク質DCC(結腸直腸がんにおいて検出された)と相互作用することが記述された。APPLの過発現はDCC誘導の細胞死を増進する8。第3に、Miaczynskaらは、近年、siRNAを用いるAPPLのノックダウンがDNA合成に抑制効果を有することを示した9。APPLは細胞周期の進行に明らかに影響を与えるけれども、これが起きるメカニズムは現在知られていない。
Claims (12)
- APPLまたはAPPL関連タンパク質とHDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントとの相互作用を使用するアッセイであって、
APPLまたはAPPL関連タンパク質が、
i)アミノ酸配列、配列番号:2を含んでなる、APPLをコードしている単離されたポリペプチド;
ii)アミノ酸配列、配列番号:3またはその同族体を含んでなる、APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号:3に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;
からなる群から選ばれ、
HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントが、
i)アミノ酸配列、配列番号:5またはその同族体を含んでなる、HDAC1をコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号:5に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;または
ii)アミノ酸配列、配列番号:6またはその同族体を含んでなる、ヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号:6に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;または
iii)アミノ酸配列、配列番号:7またはその同族体を含んでなる、APPL結合性フラグメントをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号:7に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;
からなる群から選ばれる、上記アッセイ。 - アミノ酸配列、配列番号:7によってコードされた単離され、精製されたAPPL結合性フラグメント。
- 核酸、配列番号:4の235〜336によってコードされたAPPL結合性フラグメントをコードしている単離され、精製された核酸分子。
- 請求項1に記載のアッセイにおける、配列番号1を含んでなる、請求項1に定義されたAPPLまたはAPPL関連タンパク質をコードしている単離され、精製された核酸分子の使用。
- 請求項1に記載のアッセイにおける、配列番号4を含んでなる、請求項1に定義されたHDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメント、をコードしている、単離され、精製された核酸分子の使用。
- HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントを結合することが可能な試験化合物を同定し、かつ得る方法であって、
a)HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントを含有する給源を、
i)APPLまたはAPPL関連タンパク質、
ii)該試験化合物
とともにインキュベートし;そして
b)HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントに結合されたAPPLまたはAPPL関連タンパク質の減少に及ぼす試験化合物の影響を測定すること:
を含んでなり、
APPLまたはAPPL関連タンパク質が、
i)アミノ酸配列、配列番号:2を含んでなる、APPLをコードしている単離されたポリペプチド;
ii)アミノ酸配列、配列番号:3またはその同族体を含んでなる、APPLのHDAC結合性フラグメントをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号:3に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;
からなる群から選ばれ、
HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントが、
i)アミノ酸配列、配列番号:5またはその同族体を含んでなる、HDAC1をコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号:5に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;または
ii)アミノ酸配列、配列番号:6またはその同族体を含んでなる、ヒストンデアセチラーゼ・ドメインをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号:6に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;
iii)アミノ酸配列、配列番号:7またはその同族体を含んでなる、APPL結合性フラグメントをコードしている単離されたポリペプチドであって、該同族体は配列番号:7に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;
からなる群から選ばれる、上記方法。 - 単離され、精製されたHDAC酵素またはAPPL結合性フラグメントが固体支持体に結合される、請求項6に記載の方法であって、HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントが請求項6で定義した通りである、上記方法。
- APPLまたはAPPL関連タンパク質が標識され、そして該標識が、HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントに結合されたAPPLまたはAPPL関連タンパク質の量に及ぼす試験化合物の影響を測定するために使用され、APPLまたはAPPL関連タンパク質が請求項6で定義した通りである、請求項6または7のいずれか1つに記載の方法。
- アッセイが、段階:
a)APPLまたはAPPL関連タンパク質によるHDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメント上のリガンド結合部位の構造を探査し;
b)結合においてAPPLリガンドと相互作用するHDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントのリガンド結合部位において接触する原子を同定し;
c)HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントの活性を調節するように、(b)において同定された原子と相互作用する試験化合物を設計し;そして
d)該設計された試験化合物をHDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントと接触させて、HDAC活性を調節する該化合物の能力を測定すること;
を含んでなる合理的な薬物設計のアッセイであり、
HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントおよびAPPLまたはAPPL関連タンパク質が請求項1で定義した通りである、請求項1に記載のアッセイ。 - HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントの活性を調節することが可能な試験化合物を同定しかつ得る方法であって、
a)HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントを、該試験化合物とともにインキュベートし;
b)HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントの活性に及ぼす試験化合物の影響を測定し:そして
c)この影響を、APPLリガンドまたはAPPL関連タンパク質の結合におけるHDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントの活性と比較すること;を含んでなり、
HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントが、
a)アミノ酸配列、配列番号:5またはその同族体を有するHDAC1であって、該同族体は配列番号:5に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;
b)アミノ酸配列、配列番号:6またはその同族体を有するHDAC1のヒストンデアセチラーゼ・ドメインであって、該同族体は配列番号:6に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;
c)アミノ酸配列、配列番号:7またはその同族体を有するAPPL結合性・ドメインであって、該同族体は配列番号:7に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;
からなる群から選ばれ、
APPLリガンドまたはAPPL関連タンパク質が、
d)アミノ酸配列、配列番号:2を有するAPPLタンパク質;
e)アミノ酸配列、配列番号:3またはその同族体を有するAPPLのHDAC結合フラグメントであって、該同族体は配列番号:3に対して少なくとも90%の配列同一性を有する;
からなる群から選ばれる、上記方法。 - HDAC酵素またはそのAPPL結合性フラグメントに及ぼす試験化合物の影響が、基質として放射能標識または蛍光標識されたアセチル化ヒストンを用い、そして標識されたアセチル基の遊離を測定して調査される、請求項10に記載の方法。
- 基質が放射能標識されたアセチル化ヒストンH4ペプチドである、請求項11に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP05104907.0 | 2005-06-06 | ||
EP05104907 | 2005-06-06 | ||
EP05110148 | 2005-10-28 | ||
EP05110148.3 | 2005-10-28 | ||
PCT/EP2006/062859 WO2006131496A2 (en) | 2005-06-06 | 2006-06-02 | Hdac regulation assays, compounds and therapeutic compositions |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008541749A JP2008541749A (ja) | 2008-11-27 |
JP5066081B2 true JP5066081B2 (ja) | 2012-11-07 |
Family
ID=37387968
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008514116A Active JP5066081B2 (ja) | 2005-06-06 | 2006-06-02 | Hdac調節アッセイ、調合物および治療学的組成物 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1891228B1 (ja) |
JP (1) | JP5066081B2 (ja) |
AU (1) | AU2006256783A1 (ja) |
CA (1) | CA2606293A1 (ja) |
ES (1) | ES2607455T3 (ja) |
WO (1) | WO2006131496A2 (ja) |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1400806A1 (en) * | 2002-09-18 | 2004-03-24 | G2M Cancer Drugs AG | The use of molecular markers for the preclinical and clinical profiling of inhibitors of enzymes having histone deacetylase activity |
WO2005005475A2 (en) * | 2003-07-10 | 2005-01-20 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Appl proteins as rab5 effectors |
-
2006
- 2006-06-02 AU AU2006256783A patent/AU2006256783A1/en not_active Abandoned
- 2006-06-02 EP EP06763480.8A patent/EP1891228B1/en active Active
- 2006-06-02 CA CA002606293A patent/CA2606293A1/en not_active Abandoned
- 2006-06-02 WO PCT/EP2006/062859 patent/WO2006131496A2/en active Application Filing
- 2006-06-02 ES ES06763480.8T patent/ES2607455T3/es active Active
- 2006-06-02 JP JP2008514116A patent/JP5066081B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2606293A1 (en) | 2006-12-14 |
JP2008541749A (ja) | 2008-11-27 |
WO2006131496A2 (en) | 2006-12-14 |
WO2006131496A3 (en) | 2007-02-01 |
AU2006256783A1 (en) | 2006-12-14 |
EP1891228B1 (en) | 2016-09-14 |
EP1891228A2 (en) | 2008-02-27 |
ES2607455T3 (es) | 2017-03-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Qu et al. | Small molecule promotes β-catenin citrullination and inhibits Wnt signaling in cancer | |
He et al. | Imbalance of the reciprocally inhibitory loop between the ubiquitin-specific protease USP43 and EGFR/PI3K/AKT drives breast carcinogenesis | |
Lu et al. | Structure of the Rpn13-Rpn2 complex provides insights for Rpn13 and Uch37 as anticancer targets | |
Gottlieb et al. | The DNA-dependent protein kinase: requirement for DNA ends and association with Ku antigen | |
KR102511807B1 (ko) | 인간 ezh2의 억제제 및 이의 사용 방법 | |
Carpten et al. | A transforming mutation in the pleckstrin homology domain of AKT1 in cancer | |
Goel et al. | Concerted activation of ETS protein ER81 by p160 coactivators, the acetyltransferase p300 and the receptor tyrosine kinase HER2/Neu | |
Yun et al. | Cdk2-dependent phosphorylation of the NF-Y transcription factor and its involvement in the p53-p21 signaling pathway | |
Krieger et al. | Identification and selected reaction monitoring (SRM) quantification of endocytosis factors associated with Numb | |
Singh et al. | A novel Cas family member, HEPL, regulates FAK and cell spreading | |
Guo et al. | Differential turnover of myosin chaperone UNC-45A isoforms increases in metastatic human breast cancer | |
Tsujii et al. | Retinoblastoma-binding protein 4-regulated classical nuclear transport is involved in cellular senescence | |
JP2010529418A (ja) | Mdm2とプロテアソームの間の結合の検出方法 | |
Dromard et al. | The putative tumor suppressor gene PTPN13/PTPL1 induces apoptosis through insulin receptor substrate-1 dephosphorylation | |
Li et al. | Identification and characterization of nardilysin as a novel dimethyl H3K4-binding protein involved in transcriptional regulation | |
Wong et al. | Phosphorylation of androgen receptor isoforms | |
Park et al. | Mediator kinase disruption in MED12-mutant uterine fibroids from Hispanic women of South Texas | |
Zhu et al. | Targeting TRIM3 deletion-induced tumor-associated lymphangiogenesis prohibits lymphatic metastasis in esophageal squamous cell carcinoma | |
Kurz et al. | Modulation of human DNA topoisomerase IIα function by interaction with 14-3-3ε | |
Hoffmann et al. | Cyclin B1 expression and p53 status in squamous cell carcinomas of the head and neck | |
Costoya et al. | Cyclin-dependent kinase antagonizes promyelocytic leukemia zinc-finger through phosphorylation | |
Li et al. | SENP1-mediated deSUMOylation of JAK2 regulates its kinase activity and platinum drug resistance | |
Mubiru et al. | Alternative spliced variants of the alpha-methylacyl-CoA racemase gene and their expression in prostate cancer | |
Chen et al. | Affinity of synthetic peptide fragments of MyoD for Id1 protein and their biological effects in several cancer cells | |
Lee et al. | DNAJB9 Inhibits p53-dependent oncogene-induced senescence and induces cell transformation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090521 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111122 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120210 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120306 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120605 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120703 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120712 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120807 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120810 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5066081 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150817 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |